CN101942452A

CN101942452A - 提高小麦纹枯病抗性的方法

Info

Publication number: CN101942452A
Application number: CN 201010241551
Authority: CN
Inventors: 周淼平; 姚金保; 任丽娟; 杨学明; 马鸿翔
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: CN101942452B

Abstract

本发明涉及一种提高小麦纹枯病抗性的方法，是利用一对特定引物通过PCR方法由拟南芥基因组DNA克隆出拟南芥NPR1基因的克隆片段SEQ ID No：1，并构建拟南芥NPR1基因的表达载体；再通过基因枪法将拟南芥NPR1基因的表达载体导入受体小麦幼胚细胞；经过愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株；然后对转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株；将阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T₂代转基因纯合株系；最后对T₂代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选，获得纹枯病抗性提高的转基因植株。其优点是：与常规的种质培育方法相比，具有针对性强、培育周期短、对重要农艺性状影响小的特点。

Description

提高小麦纹枯病抗性的方法

技术领域

本发明涉及一种增加小麦的纹枯病抗性的方法，属于小麦育种和分子生物学领域。

背景技术

小麦纹枯病，又称麦尖眼点病(Wheat sharp eyespot)，是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Vander hoeven)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)引起的一种重要的世界性土传真菌病害，早在1934年国外即有报道。1973年，我国也发现此病。20世纪80年代以来，随着施肥水平的不断提高，耕作制度的改变和感病品种的大面积推广，纹枯病已成为我国长江流域麦区的主要病害，并逐渐蔓延到黄淮麦区，近年来以鲁、豫、陕、苏、皖等麦区发生较为严重(姚金保，姚国才，杨学明，钱存鸣.中国小麦抗纹枯病育种研究进展.《江苏农业学报》，2007，23(3)：P.248-251)。小麦纹枯病一般病田病株率为10-20％，重病田块可达60-80％以上，由此造成的产量损失严重，轻的减产5-10％，重的减产40％，甚至颗粒无收，并且小麦纹枯病发病越早，损失越重(张会云，陈荣振，冯国华，刘东涛，王静，王晓军，楼辰军，张凤.中国小麦纹枯病的研究现状与展望.《麦类作物学报》，2007，27(6)：P.1150-1153)。

目前，我国小麦纹枯病的防治依然以化学防治为主，化学防治不仅增加农本，而且会造成环境污染，化防的效果还直接受到施药的时期、天气等诸多环境因素的影响。培育并推广小麦纹枯病抗病品种无疑是控制该病害最经济和最有效的途径。但多年的种质材料鉴定研究也发现，在已经筛选的近千份材料中，没有发现对该病害免疫的小麦品种(系)，高抗的材料也较少。对主要纹枯病抗源的抗性遗传和抗病QTL(数量性状位点)分析结果表明，小麦纹枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的数量性状，并且存在复杂的基因互作(汤颋，任丽娟，蔡士宾，吴纪中，陆维忠，陈建民，马鸿翔.小麦ARz抗纹枯病的QTL定位研究.《麦类作物学报》，2004，24(4)：P.11-16；吴纪中，颜伟，蔡士宾，任丽娟，汤颋.小麦纹枯病抗性的主基因+多基因遗传分析.《江苏农业学报》，2005，21(1)：P.6-11；张小村，李斯深，赵新华，范玉顶，李瑞军.小麦纹枯病抗性的QTL分析和抗病基因的分子标记.《植物遗传资源学报》，2005，6(3)：P.276-279；任丽娟，张旭，周淼平，陆维忠，马鸿翔.小麦抗纹枯病和赤霉病QTL定位研究，麦类作物学报，2007，27(3)：P.416-420)。由于遗传方式的复杂，给常规育种带来诸多困难，如周期性强、预见性差等，直接影响了小麦纹枯病抗性改良的进度。

近年来，转基因技术由于周期短、可用的抗性基因多、针对性强等优点，已经成为提高作物抗病能力的新手段。采用这一方法，来自于小麦近缘种中间偃麦草的乙烯反应因子(ERF)基因已经被导入小麦并获得纹枯病抗性显著提高的转基因小麦植株(Chen L，Zhang Z-Y，Liang H-X，Du L-P，Xu H-J and Xin Z-Y.Overexpression of TiERF1 enhances resistance to sharp eyespot in transgenic wheat.Journal of Experimental Botany，2008，59：P.4195-4204)。

NPR1基因(nonexpressor of pathogenesis-related genes)是植物普遍存在的系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)途径中的主要调控基因，其功能定位在SAR信号转导级联反应中的水杨酸(salicylic acid，SA)积累和随后的SAR基因表达之间。研究表明，拟南芥AtNPR1基因编码一个锚蛋白重复序列ANK(Ankyrin Rpeat Domain)和一个BTB/POZ(Broad-Complex，Tramtrack，and Bric-a-brac/Pox virus and Zinc Finger)结构域，这两个结构域参与蛋白质之间的相互作用(Cao H，Glazebrook J，Clarke JD，Volko S and Dong X.The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats，Cell，1997，88：P.57-63)。在非诱导状态下，AtNPR1蛋白通过分子间二硫键形成寡聚体，位于细胞质内。一旦发生SAR诱导，SA的积累使细胞内还原势增加，NPR1寡聚体中的二硫键被还原形成单体，并通过位于NPR1蛋白C-末端的核定位序列的作用，使NPR1单体转移到细胞核内，进而激活PR(如PR-1，PR-2等)基因，最后导致SAR，使植物产生广谱抗性。除SA途径外，NPR1在茉莉酮酸(Jasmonic acid，JA)、乙烯(Ethylene，ET)等信号传导途径以及不依赖SA但依赖ET和JA介导ISR(induced systemic resistance)中也起着重要作用，是调节和平衡不同抗病信号传导途径的关键因子。

研究发现，过量表达NPR1能提高植物对多种病原菌的抗性，(Lin W-C，Lu C-F，Wu J-W，Cheng M-L，Lin Y-M，Yang N-S，Black L，Green SK，Wang J-F and Cheng C-P.Transgenic tomato plants expressing the Arabidopsis NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacterial diseases.Transgenic Res，2004，13：P.567-581)将拟南芥AtNPR1基因导入番茄发现，转基因番茄具有广谱抗性，不仅抗番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)，而且对其他8种重要的热带细菌和真菌病害也产生很高的抗性。转NPR1基因的水稻植株也可以提高对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)的抗性(Chern M，Fitzgerald HA，Canlas PE，Navarre DA and Ronald PC.Overexpression of a Rice NPR1 Homolog Leads to Constitutive Activation of Defense Response and Hypersensitivity to Light.MPMI，2005，18(6)：P.511-520)。

在上述诸多文献中，并没有涉及采用基因工程方法将拟南芥NPR1基因导入普通小麦，提高了小麦的纹枯病抗性。

发明内容

本发明目的在于：针对目前小麦纹枯病抗性种质资源贫乏状况，提供一种采用转基因方法将抗小麦纹枯病病原菌的拟南芥NPR1基因导入感纹枯病的小麦品种，从而提高小麦的纹枯病抗性。

本发明目的是这样实现的：一种提高小麦纹枯病抗性的方法，是通过PCR方法由拟南芥基因组DNA克隆出拟南芥NPR1基因，其特征在于：

a)利用一对引物SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3通过PCR方法由拟南芥基因组DNA克隆出拟南芥NPR1基因的克隆片段SEQ ID NO：1，并构建拟南芥NPR1基因的表达载体；

b)通过基因枪法将拟南芥NPR1基因的表达载体导入受体小麦幼胚细胞；对所述的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株；

c)对转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株；

d)阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T₂代转基因纯合株系；

e)对T₂代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选，获得纹枯病抗性提高的转基因植株。

在本发明中：构建拟南芥NPR1基因的表达载体是指：将上、下游分别附加限制性内切酶SmaI和SacI酶切识别DNA序列的克隆片段SEQ ID NO：1采用SmaI和SacI酶切后，回收2010bp片段；以pAHC25为基础质粒，采用限制性内切酶SmaI和SacI对pAHC25质粒DNA进行酶切，回收7.8Kb左右DNA酶切大片段，以T₄DNA连接酶与回收的附加SmaI和SacI酶切位点的SEQ ID NO：1的2010bp片段连接，转化大肠杆菌，对抗100mg/L氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAC-NPR1即为拟南芥NPR1基因的表达载体。

在本发明中：对转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株是指：对待选植株通过一对引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5进行PCR筛选获得大小为745bp的扩增片段，通过另一对引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7进行PCR筛选获得大小为721bp的扩增片段，对所述的两个扩增片段通过电泳图检测，同时含有拟南芥NPR1基因的这两条扩增片段的植株被确定为阳性转基因植株。

在本发明中：对T₂代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选是指：在小麦拔节期对被测后代采用牙签接菌法接种纹枯病致病菌株R46，于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况，计算株系平均病情指数，根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。

在本发明中：纹枯病发病情况的分级标准是：

0级：无病症；

1级：叶鞘有典型的纹枯病病斑，但不侵茎；

2级：病菌侵人茎秆，病斑宽度环茎不超过茎秆周长的1/2；

3级：病菌侵人茎秆，茎秆上病斑环茎宽度在1/2-3/4茎秆周长之间；

4级：病菌侵人茎秆，茎秆上病斑绕茎秆3/4以上，或茎秆已软腐；

5级：枯孕穗或枯白穗

病情指数按以下公式计算：

病情指数＝[(∑各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100

纹枯病抗性判定标准：病情指数≤20为“高抗”；20＜病情指数≤50为“抗病”；50＜病情指数≤80为“感病”；80＜病情指数≤100为“高感”。

本发明的优点在于：与常规的种质培育方法相比，选取的目的基因对纹枯病病原菌的生长有抑制作用，针对性强；由转化植株到纯合的转基因株系时间短并且对受体亲本的重要农艺性状影响小，培育的周期短、减少对重要农艺性状选育所需的人工经验的依赖性。

附图说明

图1pAHC25的示意图；

图2拟南芥NPR1基因的表达载体的示意图；

图3部分转基因待选植株NPR1基因的PCR检测的电泳图。

具体实施方式

实施例1：

表达载体的构建：

(1)以GenBank U76707.1中的拟南芥NPR1基因的mRNA序列为基础，设计一对引物SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3：

上游引物SEQ ID NO：2为5’ACCCGGGATGGACACCACCATTGAT 3’；

下游引物SEQ ID NO：3为5’AGAGCTCTCACCGACGATGAGAGA 3’。

通过PCR方法由拟南芥基因组DNA克隆出NPR1基因克隆片段SEQ ID NO：1，该基因全长2002bp：

atggacacca ccattgatgg attcgccgat tcttatgaaa tcagcagcac tagtttcgtc 60

gctaccgata acaccgactc ctctattgtt tatctggccg ccgaacaagt actcaccgga 120

cctgatgtat ctgctctgca attgctctcc aacagcttcg aatccgtctt tgactcgccg 180

gatgatttct acagcgacgc taagcttgtt ctctccgacg gccgggaagt ttctttccac 240

cggtgcgttt tgtcagcgag aagctctttc ttcaagagcg ctttagccgc cgctaagaag 300

gagaaagact ccaacaacac cgccgccgtg aagctcgagc ttaaggagat tgccaaggat 360

tacgaagtcg gtttcgattc ggttgtgact gttttggctt atgtttacag cagcagagtg 420

agaccgccgc ctaaaggagt ttctgaatgc gcagacgaga attgctgcca cgtggcttgc 480

cggccggcgg tggatttcat gttggaggtt ctctatttgg ctttcatctt caagatccct 540

gaattaatta ctctctatca ggtatggatt ctcacccact tcatcggact ccttatcaca 600

aaaaacaaaa ctaaatgatc tttaaacatg gttttgttac ttgctgtctg accttgtttt 660

tttatcatca gaggcactta ttggacgttg tagacaaagt tgttatagag gacacattgg 720

ttatactcaa gcttgctaat atatgtggta aagcttgtat gaagctattg gatagatgta 780

aagagattat tgtcaagtct aatgtagata tggttagtct tgaaaagtca ttgccggaag 840

agcttgttaa agagataatt gatagacgta aagagcttgg tttggaggta cctaaagtaa 900

agaaacatgt ctcgaatgta cataaggcac ttgactcgga tgatattgag ttagtcaagt 960

tgcttttgaa agaggatcae accaatctag atgatgcgtg tgctcttcat ttcgctgttg 1020

catattgcaa tgtgaagacc gcaacagatc ttttaaaact tgatcttgcc gatgtcaacc 1080

ataggaatcc gaggggatat acggtgcttc atgttgctgc gatgcggaag gagccacaat 1140

tgatactatc tctattggaa aaaggtgcaa gtgcatcaga agcaactttg gaaggtagaa 1200

ccgcactcat gatcgcaaaa caagccacta tggcggttga atgtaataat atcccggagc 1260

aatgcaagca ttctctcaaa ggccgactat gtgtagaaat actagagcaa gaagacaaac 1320

gagaacaaat tcctagagat gttcctccct cttttgcagt ggcggccgat gaattgaaga 1380

tgacgctgct cgatcttgaa aatagagttg cacttgctca acgtcttttt ccaacggaag 1440

cacaagctgc aatggagatc gccgaaatga agggaacatg tgagttcata gtgactagcc 1500

tcgagcctga ccgtctcact ggtacgaaga gaacatcacc gggtgtaaag atagcacctt 1560

tcagaatcct agaagagcat caaagtagac taaaagcgct ttctaaaacc ggtatggatt 1620

ctcacccact tcatcggact ccttatcaca aaaaacaaaa ctaaatgatc tttaaacatg 1680

gttttgttac ttgctgtctg accttgtttt tttatcatca gtggaactcg ggaaacgatt 1740

cttcccgcgc tgttcggcag tgctcgacca gattatgaac tgtgaggact tgactcaact 1800

ggcttgcgga gaagacgaca ctgctgagaa acgactacaa aagaagcaaa ggtacatgga 1860

aatacaagag acactaaaga aggcctttag tgaggacaat ttggaattag gaaattcgtc 1920

cctgacagat tcgacttctt ccacatcgaa atcaaccggt ggaaagaggt ctaaccgtaa 1980

actctctcat cgtcgtcggt ga 2002

与拟南芥NPR1基因的mRNA序列相比，含2个内含子，分别位于NPR1基因核苷酸序列的562-671位和1612-1721位，克隆片段采用限制性内切酶SmaI和SacI酶切后，回收2010bp片段。

(2)以pAHC25(图1)为基础质粒，采用限制性内切酶SmaI和SacI对pAHC25质粒DNA进行酶切，切除质粒含有的GUS基因，0.8％琼脂糖电泳，回收7.8Kb左右DNA酶切大片段。

(3)将步骤(1)和(2)回收的片段采用T₄DNA连接酶16℃连接过夜(25ul反应体系含1×T₄DNA连接酶缓冲液，质粒大片段0.3pmol，NPR1基因片段0.03pmol，350uT₄DNA连接酶，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(转化方法参照《分子克隆实验指南》第二版，P55-56页，科学出版社，1992)，转化后的大肠杆菌DH5α细胞悬液涂布含100mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒即为pAC-NPR1表达载体(见图2)。

实施例2

表达载体的转化：

以扬麦12为受体，采用基因枪转基因方法将构建的表达载体导入受体小麦幼胚细胞，通过愈伤诱导、植株再生获得转基因待选植株(参照周淼平等，小麦基因枪法转化技术的改进，江苏农业学报，1999，15(1)：62-64)。

待选植株进行分子检测：对待选植株进行PCR筛选，拟南芥NPR1基因的PCR检测分别采用两对引物检测，一对引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为5’GAAGGTAGAACCGCACTC 3’和5’GTCGAATCTGTCAGGGAC 3’，扩增条件：95℃3分钟；94℃1分钟，55℃45秒，72℃45秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟，扩增片段大小为745bp；另一对引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7为5’CGATTCGGTTGTGACTGTTT3’和5’CCCTCGGATTCCTATGGTTG 3’，扩增条件：95℃3分钟；94℃1分钟，55℃45秒，72℃45秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟。扩增片段大小为721bp，检测电泳图见附图3。获得整合并表达拟南芥NPR1基因的阳性转基因植株。

在图3中，

1道为M：DNA分子量标准，条带从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp和500bp。

在2-9道中：

CK+：质粒pAC-NPR1；

CK-：未转基因扬麦12对照；

94和95：均为转基因扬麦12的待选植株。

其中：2-5道为引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5扩增结果；

6-9道为引物SEQ ID NO：6和SEQ ID №：7扩增结果。

通过自交和进一步PCR筛选(重复本实施例的PCR筛选)，获得T₂代转基因纯合株系。

实施例3

纹枯病抗性筛选：

纹枯病致病力菌株R46，江苏省农业科学院植物保护研究所提供。

接种方法：采用牙签接菌法(具体鉴定方法参照蔡士宾等，小麦抗纹枯病种质创新及QTL定位的初步研究，《中国农业科学》，2006，39(5)：P.928-934)。

接种前的准备：将长1.0cM左右的牙签水浸30分钟后，铺于烧杯底部，加入适量PDA培养基，经高温湿热灭菌后，接种具有较强致病力的纹枯菌菌丝块，25℃恒温培养30天，待菌丝密集布满短牙签表面。

筛选过程

小麦拔节期将经上述方法处理的牙签嵌入到小麦植株贴近地面的基部第1～2叶鞘之间，每株系接种15个茎秆，喷雾保湿7天。于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况，计算株系平均病情指数，根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。

病情严重度判定标准如下：0级：无病症；1级：叶鞘有典型的纹枯病病斑，但不侵茎；2级：病菌侵人茎秆，病斑宽度环茎不超过茎秆周长的1/2；3级：病菌侵人茎秆，茎秆上病斑环茎宽度在1/2-3/4茎秆周长之间；4级：病菌侵人茎秆，茎秆上病斑绕茎秆3/4以上，或茎秆已软腐；5级：枯孕穗或枯白穗。

病情指数按以下公式计算：

纹枯病抗性鉴定结果见表1，，在表1中，NPR-3、NPR-5、NPR-6、NPR-7、NPR-11、NPR-16、NPR-19、NPR-26、NPR-31、NPR-35、NPR-36、NPR-37为导入拟南芥NPR1基因的12个T₂代纯合株系。受体对照亲本扬麦12的病情指数为56.4，属感病类型，12个导入拟南芥NPR1基因的T₂代纯合株系的平均病情指数在28.2-48.2之间，都属于抗病类型，表明由于拟南芥NPR1基因的导入，使转基因植株的纹枯病抗性得到提高。

表1扬麦12转基因T₂代纯合株系的纹枯病抗性鉴定结果

以上各实施例不是对本发明的具体限制。

Claims

1.一种提高小麦纹枯病抗性的方法，是通过PCR方法由拟南芥基因组DNA克隆出拟南芥NPR1基因，其特征在于：

c)对转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株；

2.根据权利要求1所述的提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于：构建拟南芥NPR1基因的表达载体是指：将上、下游分别附加限制性内切酶SmaI和SacI酶切识别DNA序列的克隆片段SEQ ID NO：1采用SmaI和SacI酶切后，回收2010bp片段；以pAHC25为基础质粒，采用限制性内切酶SmaI和SacI对pAHC25质粒DNA进行酶切，回收7.8Kb左右DNA酶切大片段，以T₄DNA连接酶与回收的附加SmaI和SacI酶切位点的SEQ ID NO：1的2010bp片段连接，转化大肠杆菌，对抗100mg/L氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAC-NPR1即为拟南芥NPR1基因的表达载体。

3.根据权利要求1所述的提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于：对转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株是指：对待选植株通过一对引物SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5进行PCR筛选获得大小为745bp的扩增片段，通过另一对引物SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7进行PCR筛选获得大小为721bp的扩增片段，对所述的两个扩增片段通过电泳图检测，同时含有拟南芥NPR1基因的这两条扩增片段的植株被确定为阳性转基因植株。

4.根据权利要求1所述的提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于：对T₂代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选是指：在小麦拔节期对被测后代采用牙签接菌法接种纹枯病致病菌株R46，于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况，计算株系平均病情指数，根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。