CN101923093A - 树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法 - Google Patents
树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法，并将其应用于检测树鼩血浆中总IgG含量。以鼠抗树鼩IgG单克隆抗体包被于酶标板作为捕获抗体，结合待检测树鼩IgG；进而用兔抗树鼩IgG多克隆抗体为二抗，以商品化的羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，通过抗体浓度等多因素条件优化，建立检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法。所建立的方法应用于检测健康树鼩(30只)血浆IgG水平，发现树鼩血浆正常IgG水平为8.6-17.8g/L。树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法的建立，为树鼩作为人类疾病实验动物模型及相关疾病免疫机制的研究提供了必要工具。
Description
技术领域：
本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及检测树鼩IgG的抗体夹心ELISA方法。
背景技术：
树鼩(Tupaia，tree shrew)是一种形似松鼠的小型攀缘型哺乳动物，主要分布于亚洲东南部的热带和亚热带地区，在我国云南、广西、广东和海南等地广泛分布。树鼩体型小，生长繁殖快，易于捕捉、驯养和繁殖成本低，其新陈代谢特点和解剖学一些特点比啮齿类动物更接近人类，很多人把树鼩归到灵长类动物中。随着国内外非人灵长类资源的逐渐减少和实验动物小型化的发展趋势，树鼩作为研究人类相关疾病的可能动物模型受到广泛关注，现已应用于病毒学、脑缺血、神经、糖尿病、心理、血管、肿瘤、寄生虫等方面的研究。
国内外学者用树鼩作为动物模型在病毒学方面的研究和应用已有很多，可以此为基础利用树鼩进行多种病毒感染的发病机理，药物筛选以及疫苗制备和检定的研究，其中研究最多的是肝炎病毒和疱疹病毒。
树鼩作为一种人类疾病实验动物模型有很大的应用前景，尤其是病毒性疾病动物模型，但研究主要局限在通过PCR检测病毒核酸和其它一些生理指标上。抗体水平是疾病检测中重要的指标之一，受研究工具的影响，与树鼩疾病相关抗体的研究很少。抗体方面研究很难实现，树鼩应用于人类疾病，尤其是病毒方面动物模型有很大的阻碍，因此制备树鼩抗体研究工具和建立抗体方法成为目前亟待解决的问题。迄今，现有技术中未见有检测树鼩IgG的方法的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法，用于检测树鼩血浆中总IgG的含量。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法，包括以鼠抗树鼩IgG单克隆抗体为捕获抗体，以兔抗树鼩IgG多克隆抗体为二抗与抗原树鼩IgG结合，以羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，建立检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法。
该方法包括将捕捉抗体即鼠抗树鼩IgG单克隆抗体包被与ELISA板上，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使树鼩IgG与捕捉抗体结合，37℃温育1h；使结合到固相化捕捉抗体上的树鼩IgG与二抗即兔抗树鼩IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h；加入检测抗体即羊抗兔IgG-HRP与兔抗树鼩IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h，来检测树鼩IgG。
该方法中的酶标板为购自Coster公司的96孔单孔可拆式酶标板，包被缓冲液为pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，样品稀释液为pH 7.4的PBS缓冲液，洗涤液为0.05％的PBST缓冲液，商品化的羊抗兔IgG-HRP购自博士德生物工程有限公司。
该方法更具体的步骤包括：
(1)IgG标准曲线的建立：
含1/400鼠抗树鼩IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；2％BSA封闭，200μl/孔，37℃温育2h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，将标准品树鼩IgG稀释成浓度为10.0μg/ml、8.0μg/ml、6.0μg/ml、5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml；同时设阴性对照和空白对照，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树鼩IgG多克隆抗体，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃避光温育15min；加入2M H2SO4终止反应，100μl/孔，用酶标仪测定OD450值；以不同稀释浓度的标准品树鼩IgG含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程；
(2)树鼩血浆中IgG含量检测：
含1/400鼠抗树鼩IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；2％BSA封闭，200μl/孔，37℃温育2h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/5000待检树鼩血浆，不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，将标准品树鼩IgG稀释成浓度为10.0μg/ml、8.0μg/ml、6.0μg/ml、5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，同时设阴性对照和空白对照，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树鼩IgG多克隆抗体，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃避光温育15min；加入2M H2SO4终止反应，100μl/孔，用酶标仪测定OD450值。
本发明的方法可以概括为：
以鼠抗树鼩IgG单克隆抗体为捕获抗体，以兔抗树鼩IgG多克隆抗体为二抗与抗原树鼩IgG结合，以商品化的羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，建立检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法。包括以下步骤：
①将捕捉抗体即鼠抗树鼩IgG单克隆抗体包被与ELISA板上；
②将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使树鼩IgG与捕捉抗体结合；
③使结合到固相化捕捉抗体上的树鼩IgG与二抗即兔抗树鼩IgG多克隆抗体结合；
④加入检测抗体即商品化的羊抗兔IgG-HRP与兔抗树鼩IgG多克隆抗体结合，来检测树鼩IgG。
⑤包被、封闭、兔抗树鼩多抗结合、羊抗兔检测抗体结合、显色、终止等不同环节，进行试剂浓度、反应时间优化，最终建立方法。
⑥从自有种群中选取30只健康树鼩，尾静脉采血，EDTA抗凝获得血浆，用所建立方法，进行血浆中IgG定量检测。
上述三抗体夹心ELISA方法中酶标板为购自Coster公司的96孔单孔可拆式酶标板，包被缓冲液为pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，样品稀释液为pH 7.4的PBS缓冲液，洗涤液为0.05％的PBST缓冲液，商品化的羊抗兔IgG-HRP购自博士德生物工程有限公司。
本发明的积极效果在于：以鼠抗树鼩IgG单克隆抗体为捕获抗体，以兔抗树鼩IgG多克隆抗体为二抗与抗原树鼩IgG结合，以商品化的羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，建立检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法。检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法的建立及其应用，为研究树鼩抗体提供了有力的工具，为树鼩作为人类相关疾病，尤其是人类病毒的实验动物模型建立奠定了基础。
附图说明：
图1为树鼩IgG浓度-OD450值曲线；横坐标为不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，纵坐标为相应的OD450值。
图2为树鼩IgG浓度-OD450值标准曲线；横坐标为不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，纵坐标为相应的OD450值。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不此来限定本发明。
实施例1：
下面本发明的三抗体夹心ELISA方法中使用的酶标板均为购自Coster公司的96孔单孔可拆式酶标板，包被缓冲液为pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，样品稀释液为pH 7.4的PBS缓冲液，洗涤液为0.05％的PBST缓冲液，商品化的羊抗兔IgG-HRP购自博士德生物工程有限公司。
三抗体夹心ELISA方法的建立：
1、方法：
1.1、IgG标准曲线的建立：
含1/400鼠抗树鼩IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；2％BSA封闭，200μl/孔，37℃温育2h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，将标准品树鼩IgG稀释成浓度为10.0μg/ml、8.0μg/ml、6.0μg/ml、5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，同时设阴性对照和空白对照，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树鼩IgG多克隆抗体，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃避光温育15min；加入2M H2SO4终止反应，100μl/孔，用酶标仪测定OD450值。以不同稀释浓度的标准品树鼩IgG含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。
1.2、树鼩血浆中IgG含量检测：
含1/400鼠抗树鼩IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；2％BSA封闭，200μl/孔，37℃温育2h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/5000待检树鼩血浆，不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，将标准品树鼩IgG稀释成浓度为10.0μg/ml、8.0μg/ml、6.0μg/ml、5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，同时设阴性对照和空白对照，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树鼩IgG多克隆抗体，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃避光温育15min；加入2M H2SO4终止反应，100μl/孔，用酶标仪测定OD450值。
2、结果：
将标准品树鼩IgG稀释成浓度为10.0μg/ml、8.0μg/ml、6.0μg/ml、5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，重复检验三次，结果表明，其具有良好线性关系的检测区间为0.25μg/ml～3.0μg/ml，标准曲线方程为y＝0.3674x-0.0352(R2＝0.9912)。
选取30只健康树鼩，尾静脉采血，EDTA抗凝获得血浆，用上述建立的方法进行抗凝血浆的IgG含量检测。检测结果为树鼩抗凝血浆的IgG含量水平为8.6-17.8g/L。
Claims (4)
1.树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法，包括以鼠抗树鼩IgG单克隆抗体为捕获抗体，以兔抗树鼩IgG多克隆抗体为二抗与抗原树鼩IgG结合，以羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，建立检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法包括将捕捉抗体即鼠抗树鼩IgG单克隆抗体包被与ELISA板上，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使树鼩IgG与捕捉抗体结合，37℃温育1h；使结合到固相化捕捉抗体上的树鼩IgG与二抗即兔抗树鼩IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h；加入检测抗体即羊抗兔IgG-HRP与兔抗树鼩IgG多克隆抗体结合，37℃温育1h，来检测树鼩IgG。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于上述三抗体夹心ELISA方法中酶标板为购自Coster公司的96孔单孔可拆式酶标板，包被缓冲液为pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，样品稀释液为pH 7.4的PBS缓冲液，洗涤液为0.05％的PBST缓冲液，商品化的羊抗兔IgG-HRP购自博士德生物工程有限公司。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于更具体的步骤为：
(1)IgG标准曲线的建立：
含1/400鼠抗树鼩IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；2％BSA封闭，200μl/孔，37℃温育2h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，将标准品树鼩IgG稀释成浓度为10.0μg/ml、8.0μg/ml、6.0μg/ml、5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml；同时设阴性对照和空白对照，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树鼩IgG多克隆抗体，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃避光温育15min；加入2M H2SO4终止反应，100μl/孔，用酶标仪测定OD450值；以不同稀释浓度的标准品树鼩IgG含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程；
(2)树鼩血浆中IgG含量检测：
含1/400鼠抗树鼩IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100μl/孔，37℃温育2h，4℃过夜；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；2％BSA封闭，200μl/孔，37℃温育2h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/5000待检树鼩血浆，不同稀释浓度的标准品树鼩IgG，将标准品树鼩IgG稀释成浓度为10.0μg/ml、8.0μg/ml、6.0μg/ml、5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，同时设阴性对照和空白对照，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树鼩IgG多克隆抗体，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100μl/孔，37℃温育1h；PBST洗涤3次，300μl/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃避光温育15min；加入2M H2SO4终止反应，100μl/孔，用酶标仪测定OD450值。
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