CN101918569A - 用于处理生物质的球孢梭菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种处理生物质的方法，其中在所述生物质中添加球孢梭菌微生物。

Description

用于处理生物质的球孢梭菌
技术领域
本发明涉及一种通过使用球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)微生物处理生物质的方法。
背景技术
生物燃料主要通过借助酵母菌、细菌或真菌发酵植物基质而获得。所产生的液体能量源，特别是生物乙醇，可以随后作为燃料用于合适的加热装置或作为汽车发动机或发动机中的燃料或燃料添加剂以发电或产热。因此，生物质转变成了液体的或移动性良好的具有相对较高能量密度的能量源，可以极为普遍地投入使用。
通常可以使用具有高糖含量或淀粉含量的当地植物作为形成液体生物燃料的原料。在欧洲主要是玉米粒和谷类以及甜菜，在北美洲是玉米，在拉丁美洲是甘蔗或糖蜜。还可以考虑其他的能量植物，例如高粱、黑小麦或木薯。目前，在液化生物质时，特别使用玉米粒和谷类作为原料。植物不仅是人类和畜类的食物来源，还用于产生能量、改善二氧化碳平衡以及保护资源，由于植物原料短缺日益严重，原料价格升高和竞争的产生，目前越来越多地追求不仅使用玉米粒和谷类，还使用产生能量的全部植物，或者使用不需要密集农业管理的植物，例如柳枝稷或芒草。由所述原料制备的生物燃料为所谓的“第二代”燃料。此外，也追求更多地使用合适的植物余料，例如来自木材业、园林和自然景观维护的麦秆、植物废料。
为了确保生物质的有效发酵，作为原料使用的植物材料，特别是其中包含的有机干物质(oTS)必须针对随后的应用而分解。这通过有机干物质的水解实现，其同样对应于有机干物质的液化。然后通过发酵由液体生物质-基质制备乙醇或其他生物燃料。然而，通过现有技术无法达到高能效，其原因特别在于不充分的原料液化和应用。
在制备生物乙醇时，首先通过添加酵母菌进行酒精发酵，所述酵母菌将葡萄糖转化为乙醇。根据基质的情况，已经含有相对较高糖含量的基质(例如糖蜜)可直接使用，或者必须首先酶法分解或化学分解高分子基质，例如淀粉、纤维素或半纤维素(例如谷类、麦秆、全植物使用)，由此可以进行酒精发酵。首先由微生物特别是细菌负责该水解基质的分解(其也对应于液化)。
当有机原料不仅转化为液体生物燃料还转化为气态能量源时，使用沼气装置。在沼气装置中，通过有机物质的微生物分解过程形成甲烷。在此，在多级发酵或消化过程中，通过厌氧或微氧(也就是说，排除空气)微生物的活性产生沼气。
从化学层面讲，作为发酵基质使用的有机材料具有高分子量组成，所述高分子量组成在沼气装置的每个方法步骤中通过微生物的代谢活动分解为低分子量组成。截至目前，还未充分表征对有机发酵基质的发酵过程具有活性的微生物种群。
根据现有技术，存在四种不同的先后、并行以及相互交错的生化代谢过程：水解、酸化、乙酸化和产甲烷，这些代谢过程使得有机发酵基质可以分解为终产物甲烷和二氧化碳。
在水解过程中，通常单独存在的高分子有机化合物通过发酵细菌的胞外酶(例如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶)转化为可溶的分解产物。由此分解脂肪，例如脂肪酸，碳水化合物，例如多糖、低聚糖和单糖，以及蛋白质，寡肽或氨基酸。此外，产生的气态产物主要由二氧化碳组成。
在酸化过程中，通常与水解细菌相同，兼性和专性厌氧细菌将水解产物(例如单糖、二糖、二肽、寡肽、氨基酸、甘油、长链脂肪酸)在细胞内代谢为短链脂肪酸或碳酸，例如丁酸、丙酸和乙酸，代谢为短链醇，例如乙醇，代谢为气态产物氢气和二氧化碳。
在随后的乙酸化过程中，在酸化过程中形成的短链脂肪酸和碳酸以及短链醇被产乙酸菌消化，并且在β-氧化之后作为乙酸再次排出。乙酸化的副产物为CO2和氢气(H2)分子。
在专性厌氧的产甲烷过程中，乙酸化过程的产物例如乙酸以及其他基质例如乙醇和甲酸酯通过产甲烷的有机体转化为甲烷和CO2。此处产生的CO2以及其他工艺步骤(例如水解)中形成的CO2也可以与积累的H2通过微生物再次转化为甲烷。
制备沼气、液化生物质与每个化学转化过程一样，提高定量原料形成的最终产物产量是过程控制的主要目的。应该由一定量的生物质形成尽可能多的液体有机化合物或尽可能多的甲烷。
天然再生材质专业协会于2005年公开了沼气测量程序的结果(“Ergebnisse des Biogas-Messprogramms”，2005，Hrsgb.天然再生材质专业协会e.V.，Gülzow)，其中提及了不同的沼气装置。由于沼气装置包括不同样式、不同生产商并且具有不同的原料处理装置，该测量程序描述了各种装置的典型外观。所调查的沼气装置测得的总容积负荷为0.45kg oTS/m3d(多级装置)至5.7kg oTS/m3d(一级装置)。通常的一级和多级装置的容积负荷为1至3kg oTS/m3d。
发酵罐容积负荷指的是引入发酵罐中的基质量，该量以千克有机干物质每立方米发酵罐容积每天计。产生的沼气量极大地取决于发酵罐容积负荷，更高的容积负荷产生更多的沼气。高容积负荷使得沼气形成过程更为经济可行，但是另一方面却增加生物发酵过程的不稳定性。
提升容积负荷是有效运行沼气装置的一种可能性。因此，通过缓慢升高以oTS/d计的进料量来升高沼气产量。在实践中至今还未出现大于6kg oTS/m3d的高容积负荷。装置操作的目的是经济地操作装置。在此，生物发酵过程的稳定性处于首要地位，因为装置故障导致非常高的成本。
为了实现过程稳定性，目前的装置在低容积负荷下操作，但是在有效操作时有必要处理相应较大的发酵体积。因此，额外的建筑成本升高了初期投资。在高容积负荷下，由于发酵罐中存在的生物群落与有机材料的强负荷，发酵罐内容物首先由固体形式开始连续稠化。其原因在于升高的干物质含量以及生物质不完全转化为沼气。
用于沼气制备的基质具有5％至90％的干物质含量。对于需要可泵送基质的湿发酵法，可以使用干物质含量为达35％(至多40％)的基质。由于具有较高干物质含量，特别是具有较高有机干物质含量的基质通常能提供较高的能量，因此优选使用这些基质。然而，在这种情况下，泵和搅拌器增加了能量消耗，并且在高粘度和高干物质含量情况下，泵、搅拌器等的磨损和修理增加了额外费用，从而产生了较高费用。在由于干物质含量高而需要稀释基质的情况下，产生了额外的水费用和废水费用以及用于供水、回收水或废水的技术设备。
在连续操作中，更高的干物质含量给发酵罐内容物的可搅拌性和可泵性造成更多的问题。当干物质含量进一步升高时，稠化使生物群落不稳定并因此大范围导致生物发酵过程和气体生成的完全停顿，这被称作“发酵罐崩溃(Fermenterabstruz)”。为了防止稠化，可以通过添加液体物质，例如水或厩液，以实现发酵罐内容物的液化。此处的问题是，法律体制(EEG，可再生能源法)不允许在获得干发酵津贴(Trockenfermentations-Bonus)的情况下添加干物质含量平均为30％的基质。因此，很少通过额外供应液体来液化发酵罐材料。
除了上述考虑之外，人们也考虑到淡水资源的匮乏，因此排除了通过添加水来液化发酵罐内容物。厩液作为液化剂一方面费用高昂，另一方面，并不能在各地都可使用，并且质量和性能也变化不定。此外，在某些国家使用厩液时，出于法定原因，需要在发酵过程之后将发酵残渣倒入土壤之前进行卫生处理的步骤。
因此，进一步需要一种处理生物质的方法，特别是液化生物质以制备生物燃料的有效方法，以及用于生成沼气的方法，所述方法与现有技术相比可以使沼气产量升高。
定义
术语“生物燃料”在本发明中指由生物质制备的液体或气态燃料或能量源。生物燃料可用于操作内燃机以及用于动态应用(例如汽车)和静态应用(例如在热电联产机组中形成电能和热能)。生物燃料的例子是生物柴油、生物乙醇、生物甲醇、生物煤油、生物氢或沼气。
术语“生物乙醇”在本发明中指通过酒精发酵由作为可再生碳载体或可生物分解废料成分的生物质制备的乙醇。其以不同的浓度作为矿物油燃料例如柴油或生物燃料的添加剂。
术语“沼气”在本发明中指厌氧生物分解有机基质所产生的气态产物。理论上，其包含约45-70％的甲烷，30-55％的二氧化碳，以及少量的氮气、硫化氢和其他气体。
术语“发酵”在本发明中包括厌氧和微氧代谢过程，其在工艺过程中供应的基质中的微生物的作用下形成产物，例如沼气。在此，“发酵”的定义仅限于厌氧过程。
术语“发酵罐”在本发明中指在其中发生基质的微生物分解并同时产生沼气的容器。术语“反应器”、“发酵容器”和“腐化容器”也可互换使用。
术语“发酵基质”或“基质”在本发明中指添加至发酵罐中以进行发酵的有机或生物可分解材料。基质可以是可再生原料、农业肥料、来自农产品深加工行业的基质、当地的有机余料、屠宰残渣
Figure BPA00001178518500051
或绿色废料。所述基质的例子为玉米青贮、黑麦青贮、甜菜浆、糖蜜、牧草青贮、牛厩液或猪厩液、牛粪、猪粪、鸡粪或马粪、酒糟、苹果残渣、水果残渣或葡萄残渣、谷类糊、土豆糊或水果糊。来自有机垃圾、厨余、市场废弃物的有机废料，来自隔油池、内脏、猪内脏的油脂。术语“发酵基质”和“基质”可互换使用。
术语“发酵残渣
Figure BPA00001178518500052
”指的是生产沼气所形成的残渣，其留在发酵罐中并通常被储入特定容器。
术语“容积负荷”在本发明中指的是每天向每立方米(m3)发酵罐的工作容积中加入的以Kg计的有机干物质(oTS)量.
术语“有机干物质”(oTS)在本发明中指除去无机成分并在105℃下干燥之后不含水的有机混合物的含量。理论上，基质的干物质含量以％计。
术语“停留时间”在本发明中指基质在发酵罐中的平均停留时间。
术语“沼气比产量”或“甲烷比产量”在本发明中指产生的沼气或甲烷的量(以标准立方米Nm3计的产生的气体)除以使用的有机干物质或基质的量(理论上以每吨t计)。
术语“时空产量”指的是的以标准升(Nl)(标称为一升发酵体积)计的产生的沼气量。该测量值用于更好地比较不同装置的气体产量。
术语“核苷酸序列”包括DNA序列和相应的RNA序列。本发明中，使用碱基A、U、C、G情况下的RNA序列对应于例如使用碱基A、T、C、G情况下的相应DNA序列，反之亦然。
借助于标准化过程确定微生物的核苷酸序列，通过该过程可以以高精确度证实微生物的DNA或RNA的每个核苷酸。尽管该排序方法在每个位点都通常具有高精确度，但是对于确定每个位点上的核苷酸来说，还未达到足够的精度。在这种情况下，在本发明中，在核苷酸序列中标明符号“N”。当下文在核苷酸序列中使用符号“N”时，其代表任意可能的核苷酸缩写，即，在核糖核酸的情况下为A、U、G或C，在脱氧核糖核酸的情况下为A、T、G或C。
此处所使用的术语“核苷酸突变”指原始核苷酸序列的改变。在此，单个核苷酸或多个直接相连的或由未改变的核苷酸隔断的核苷酸序列可以缺失(删除)、插入(加入或添加)或由其他核苷酸取代(替换)。该术语还包括上述每种改变的可能组合。
此处所使用的术语“缺失”指每个原始序列中缺失了1、2或多个核苷酸。
此处所使用的术语“加入”或“添加”指的是在每个原始序列中插入1、2或多个核苷酸。
此处所使用的术语“取代”指的是特定位点上的核苷酸被其他核苷酸取代。
术语“微生物”指的是微小生物，其理论上为单细胞，但是也可以是多细胞。微生物的例子为细菌、微藻类、真菌或原生动物。
微生物的“属”，微生物的“种”和微生物的“株”在本发明中指生物分类学特别是系统分类学的相应基本分类。按照其RNA序列鉴定并区分微生物的属、种和株。一定的属、一定的种或一定的株不仅包括具有完全确定的RNA序列的微生物，还包括其一定数量的遗传变型，其中该遗传变型增加了株、种、属的数量。
细菌“种”的定义随着科学变化且并不完全，不同的观念也是无可非议的。在本发明中，“种”的含义与染色体组和物种分析相关并且记载在Review von Staley(Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.，2006，361，1899-1909)。广泛发现，具有大于70％DNA-DNA杂交或大于94％平均核苷酸同一性(ANI，平均核苷酸同一性)的两种细菌属于同一种，具有小于97％的16S rRNA同一性的两种细菌属于不同的种。
在本文中，术语“培养物”指在操作条件下的微生物自然增长物，该操作条件保证微生物能够生长或至少存活。对于细菌来说，为例如富集培养物或纯培养物，液体培养物以及在固体介质例如琼脂上的培养物，还有长期培养物例如冷冻甘油培养物，固定化培养物，例如凝胶培养物，或高浓度培养物例如细胞球(zellpellets)。
微生物“纯培养物”这一术语指单个细胞的子代。通过多级过程从不同微生物的混合物中分离出该单个细胞。所述多级过程包括从细胞种群中分离出单个细胞，并且要求通过生长和细胞分裂而从细胞中产生的菌落与其他单个细胞或菌落保持分离。通过小心分离菌落、重新悬浮至液体中以及反复筛选(Ausstreichen)可以获得目标微生物的纯培养物。如果原料中所需有机体数量占多数，也可以在液体营养介质中进行纯培养物的分离。通过在营养液中连续稀释悬浮液，使得最终在最后的悬浮步骤中仅剩一个细胞。然后，该细胞作为纯培养物的基底。术语“纯培养物”的含义以及用于形成纯培养物的方法记载在“Allgemeine Mikrobiologie”中(Hans G Schlegel，第7版，1992，Georg Thieme出版社出版，第205页)，在此以引用的方式并入本文。
术语“混合培养物”指不同微生物的混合物。微生物的天然种群理论上为混合培养物。然而也可以人工方式混合培养物，例如多个纯培养物的组合。
发明内容
本发明的目的是提供一种处理生物质的方法，其与现有技术相比，可以提高可利用生物燃料的产量。
通过根据权利要求1所述的处理生物质的方法解决本发明的目的。从属权利要求、说明书和实施例描述了本发明进一步优选的细节、方面和具体实施方案。
本发明提供了一种处理生物质的方法。在生物质中添加球孢梭菌微生物。
所述处理生物质的方法优选为液化生物质的方法。在处理生物质或形成沼气的过程中，球孢梭菌微生物的用途或行为迄今为止仍未公知。然而，出人意料的，通过向生物质-基质添加球孢梭菌微生物可以极大地降低基质粘度。使用球孢梭菌微生物使生物质高度液化，并使得用于制备生物燃料的装置的效率和生产率明显改善。
所述处理生物质的方法还优选为由生物质形成沼气的方法。出人意料的，通过向发酵基质添加球孢梭菌微生物不仅能够升高发酵罐容积负荷，还可以显著增加形成的沼气量。正如在实验中所表明的，添加球孢梭菌微生物使得发酵罐容积负荷升高超过50％，却不会影响发酵过程的稳定性。在升高容积负荷的同时，形成的沼气量也显著增加。此外，由于与不添加球孢梭菌微生物的情况相比，更多的有机干物质被分解，因此沼气比产量也升高。在使用改良的基质时，通过升高的分解度可以获得显著升高的气体比产量。此外，在一定的气体产量下，通过添加球孢梭菌微生物可以显著缩短发酵基质在发酵罐中的停留时间，由此可以升高容积负荷。因此，使用球孢梭菌微生物使得沼气装置的效率和生产率显著改善。
球孢梭菌微生物积极属性的一种可能的解释为，该微生物的代谢活性升高了水解速率，因此该代谢活性使得一部分存在的难分解有机体质(例如纤维素、半纤维素)转化为可溶的酸和CO2。纤维素在水和水溶液中不溶，因此在发酵过程中纤维素的分解导致液化。材料的可搅拌性和可泵送性保持不变，因为干物质含量不继续升高。因此，可以不断混合所述材料并且可以更好地将气体从该过程中导出。
在水解步骤中，通过球孢梭菌微生物升高的分解效率和代谢效率实现发酵罐材料的液化，且不会观察到所形成的沼气的酸化以及甲烷含量的恶化。容积负荷显著升高且过程稳定性得以改善。
根据本发明，通过添加球孢梭菌微生物提供了一种方法，该方法能够保证发酵过程的升高的稳定性并且能导致发酵基质的液化。通过分解不溶的组成部分导致的基质液化可被用于由生物质制备生物燃料。
根据本发明一个优选的具体实施方案，以微生物培养物的形式添加球孢梭菌微生物，所述微生物培养物主要由球孢梭菌微生物组成。在沼气装置的发酵基质中，球孢梭菌微生物可以仅占存在的微生物总量的小于10-4％的痕量。对于添加微生物来说，由于通过其天然形式(natürlichen Vorkommen)分离的微生物的量理论上不够，因此通常以培养物的形式进行增殖。实践表明，以微生物培养物的形式向发酵罐的发酵基质中添加微生物最为简单直接。
可以以培养物悬浮液的形式，以干燥、冻干或潮湿细胞球的形式或者以孢子悬浮液、孢子制剂或干燥、冻干、潮湿的孢子球的形式添加球孢梭菌培养物。
由于上述发酵过程的各种积极效果与球孢梭菌微生物相关，待添加的培养物中应该存在超过天然形式的量的该种微生物。当然可以添加任意组成的混合培养物。唯一的要求是，存在与天然形式相比更多量的球孢梭菌。
优选球孢梭菌微生物和煎盘梭菌(Clostridium sartagoformum)和/或浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)微生物组成的混合培养物。特别优选球孢梭菌菌株SBG3微生物和煎盘梭菌菌株SBG1a和/或浸麻类芽孢杆菌菌株SBG2微生物组成的混合培养物。对于生物质的处理，煎盘梭菌和浸麻类芽孢杆菌微生物具有与球孢梭菌微生物相似的性能，因此它们也适用于处理生物质。因此，在本文所述的处理生物质的方法和应用中，也可以使用煎盘梭菌和浸麻类芽孢杆菌微生物。
优选以微生物培养物的形式将球孢梭菌微生物添加至发酵基质，其中微生物培养物主要由球孢梭菌微生物组成。除了确定球孢梭菌微生物的数量之外，还确定微生物总量，以便给出球孢梭菌微生物在培养物中的百分比含量。当混合培养物中存在的不同微生物中球孢梭菌微生物的百分比含量最高时，那么球孢梭菌微生物在混合培养物中是主要存在的微生物。
不同发酵基质中的微生物种群组成以及发酵过程中有机体组成的变化通常不是公知的，其极易变化并且受复杂动力学过程的控制，而该动力学过程又受各个工艺条件的影响。为了确定微生物组成和发酵基质中微生物总量以及确定发酵基质中不同微生物的含量，本领域技术人员知晓各种不同的方法，例如Amann等人的论文(Microbiol.Review.59，143-169，1995)中所描述的那些方法。
为了确定与前述微生物培养无关的微生物组成，优选的方法为例如在核酸提取和聚合酶链反应(PCR)之后创建rDNA克隆文库(例如基于16S rRNA)，随后可以进行测序。借助该克隆文库，可以例如通过用特定荧光标记的寡核苷酸探针进行原位杂交来确定发酵基质中微生物种群的组成。合适的基于rRNA的寡核苷酸探针通过上述文献被人们公知，或者可以通过probeBase(Loy等人，2003，Nucleic Acids Res.31，514-516.Loy等人，2007.Nucleic Acids Res.35：D800-D804)或ARB程序包(Ludwig等人，Nucleic Acids Research.2004，32，1363-1371)查到。可以以合适方式使用定量斑点杂交法、原位杂交法或全细胞杂交法来定量地确定单种微生物在总种群中的含量。
根据本发明优选的具体实施方案，球孢梭菌微生物占添加至发酵基质的培养物中存在的微生物总量的至少10-4％。特别优选地，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10-2％，特别优选地，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少1％。
根据本发明另一优选的具体实施方案，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10％。特别优选地，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少50％，特别优选地，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少90％。
根据非常特别优选的具体实施方案，添加球孢梭菌微生物的纯培养物。该纯培养物的生化特征在于特定的代谢过程和代谢活性，以及特定的生长条件。由于特定的代谢过程和代谢活性，添加发酵微生物的纯培养物特别有助于更好地控制整个沼气形成过程。
根据本发明另一优选的具体实施方案，添加球孢梭菌微生物作为至少一种固定化微生物培养物的组成部分。对于添加微生物来说，由于通过其天然形式(natürlichen Vorkommen)分离的微生物的量理论上不够，因此通常以培养物的形式进行增殖。实践表明，以固定化微生物培养物的形式向发酵罐的发酵基质中添加微生物最为简单直接。
由于上述发酵过程的各种积极效果与球孢梭菌微生物相关，待添加的固定化培养物中应该存在超过天然形式的量的微生物。当然可以添加任意组成的固定化混合培养物。唯一的要求是，存在与天然形式相比更多量的球孢梭菌微生物。
根据本发明优选的具体实施方案，球孢梭菌微生物占添加至发酵基质的固定化培养物中存在的微生物总量的至少10-4％。特别优选地，球孢梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物总量的至少10-2％，特别优选地，球孢梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物总量的至少1％。
根据另一优选的具体实施方案，球孢梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物总量的至少10％。特别优选地，球孢梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物总量的至少50％，特别优选地，球孢梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物总量的至少90％。
根据特别优选的具体实施方案，至少添加球孢梭菌微生物的固定化纯培养物。
作为球孢梭菌微生物固定其上的载体材料，可以使用天然或合成聚合物。优选使用形成凝胶的聚合物。其优点在于，细菌可被容纳或储存在凝胶结构中。优选使用缓慢溶于水或缓慢分解的材料，使得球孢梭菌微生物的释放在较长时间段内进行。
合适的聚合物的例子为聚苯胺(Polyanillin)、聚吡咯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯、环氧树脂、聚乙烯亚胺、多糖例如琼脂糖、藻酸盐或纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、乙酸纤维素、碱性-纤维素硫酸酯、聚苯乙烯和马来酐的共聚物、苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、聚苯乙烯磺酸酯、聚丙烯酸酯和聚丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚酯、硅氧烷、纤维素邻苯二甲酸酯、蛋白质例如明胶、阿拉伯树胶、白蛋白或纤维蛋白原、明胶和水玻璃的混合物、明胶和多聚磷酸酯的混合物、明胶和马来酐与甲基乙烯基醚的共聚物的混合物、醋酸丁酸纤维素、壳聚糖、聚二烷基二甲基氯化铵(Polydialkyldimethylammonium-chlorid)、聚丙烯酸和聚二烷基二甲基氯化铵的混合物，以及上述物质的混合物。通常也可以使用交联剂例如戊二醛、脲甲醛树脂或单宁酸化合物使所述聚合物材料交联。
藻酸盐作为固定剂(Immobilisate)特别有利，因为一方面其对球孢梭菌微生物的活性仅产生很小的负面影响，另一方面其可被微生物缓慢分解。通过藻酸盐固定剂的缓慢分解可以逐渐地释放被包覆的球孢梭菌微生物。
对于固定化来说，将微生物与聚合物凝胶混合，然后在合适的硬化剂溶液中硬化。为此，首先使其与凝胶溶液混合，然后以合适高度将其滴入硬化剂溶液中。用于固定化的确切操作步骤对于本领域技术人员来说是公知的。
根据另一优选的具体实施方案，在添加下述微生物的同时，在发酵反应器中加入额外的生物质。添加微生物之后，可以在1秒至3天的时间段内同时添加额外的生物质，或者可以在添加微生物的同时添加额外的生物质。在此，可以通过连续添加新的基质来连续升高发酵反应器容积负荷，或使容积负荷基本保持恒定，其中可以在任何容积负荷下，优选在≥0.5千克有机干物质每立方米每天[kg oTS/m3d]的容积负荷下，更优选在≥4.0kg oTS/m3d的容积负荷下，特别优选在≥8.0kgoTS/m3d的容积负荷下进行发酵，其与现有技术相比容积负荷升高至两倍以上。
所使用的发酵基质也可以特别地具有高含量的固体组成部分。通过添加具有水解活性的球孢梭菌发酵微生物至少部分地液化该固体组成部分。通过由于添加球孢梭菌微生物而达到的发酵基质液化可以防止并针对性地抵抗发酵罐材料的稠化。可以避免在发酵过程中以水或厩液的形式向发酵基质中添加其他液体。因此，另一优点是保护淡水资源。由此获得可搅拌和可泵送的基质也是有利的。因此保护了搅拌器和泵，并且搅拌过程需要的能量显著减少。
在酒精发酵过程中也可以使用球孢梭菌微生物液化生物质，以制备生物燃料。
根据另一具体实施方案，在不断搅拌发酵基质的情况下处理生物质。通过不断搅拌发酵基质可以使球孢梭菌培养物更好地分布在发酵基质中。此外，在形成沼气的情况下，可以更好地将形成的沼气从发酵过程中导出。
此外，不断搅拌发酵基质使发酵反应器中热量均匀分布。发酵反应器中的温度测量值(定期循环且连续进行)表明，发酵基质在20℃至80℃，优选约35℃至60℃，特别优选40℃至50℃的温度下有效发酵。因此，这些温度范围在本发明中是优选的。除了水解之外，发酵过程的最后步骤，即通过产甲烷微生物形成甲烷的步骤，在高温下特别高效。对于多级沼气装置，在不同的温度下操作不同的反应器是合理的，例如在中温条件下进行第一步骤，并在恒温条件下进行后续步骤，特别是产甲烷步骤。对此，合适的条件在现有技术中是公知的(例如DE 10 2005 012367A1)。
本发明所有的具体实施方案并不局限于制备沼气的一级方法。使用球孢梭菌微生物也可以以二级或多级方法进行。同样地，可以在形成液体生物燃料的方法中使用球孢梭菌微生物。
根据另一具体实施方案，连续添加发酵基质和球孢梭菌微生物。在稳定的微生物群落的情况下，连续操作发酵反应器可连续形成沼气，由于会扰乱发酵过程，因此应避免突然停止添加用于发酵的基质。
同样地，所述发酵方法和连续过程的具体实施方案也可以间歇进行，例如“分批”发酵。因此，根据另一具体实施方案，在发酵过程中，可以例如定期向发酵基质中添加球孢梭菌微生物。定期添加球孢梭菌微生物使活细胞数量增加，并且因此使发酵过程(例如水解)更好地进行，同时更好地利用了用于发酵的发酵基质。
根据本发明优选的具体实施方案，将一定量的球孢梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后，球孢梭菌微生物的含量占发酵基质中存在的微生物总量的10-8％至50％。特别的，取决于发酵罐尺寸以及发酵基质量，为了获得所需的效果，可以添加量非常不同的微生物。
确定发酵基质中微生物总量和确定发酵基质中不同微生物的含量对于本领域技术人员来说不成问题。因此，可以例如借助荧光标记的寡核苷酸探针并根据上文所述方法具体确定发酵基质中不同微生物的含量。
特别优选地，将一定量的球孢梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后，球孢梭菌微生物占发酵基质中存在的微生物总量的10-6％至25％。特别优选地，将一定量的球孢梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后，球孢梭菌微生物占发酵基质中存在的微生物总量的10-4％至10％。非常特别优选地，将一定量的球孢梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后，球孢梭菌微生物占发酵基质中存在的微生物总量的10-3％至1％。
基本上可以在发酵过程的任何时间点添加球孢梭菌微生物，特别地，在发酵罐首次运转或再次运转时，也可以使用球孢梭菌微生物接种发酵基质。可以以培养物的方式，定期或不定期地(优选每周或每年，特别优选每天或每周两次至五次)、单次或多次地以合适的浓度和量添加球孢梭菌微生物。合适的微生物浓度和添加量已被提及并且记载于具体实施方案中。
在发酵过程波动时，也可以添加球孢梭菌微生物来稳定发酵。可以通过监测发酵过程的特定表征参数早期检测到所述波动。特征参数提供了关于制备沼气的发酵过程的质量信息。这些表征参数不仅有形成的沼气量，还有形成的沼气的甲烷含量，以及例如形成的沼气的氢气含量，发酵基质的pH值，发酵基质的氧化还原电位，发酵基质的碳酸含量，发酵基质中不同碳酸的含量，发酵基质的氢气含量，发酵基质的干物质含量，发酵基质的有机干物质含量，发酵基质的粘度以及发酵反应器容积负荷。
本发明还包括球孢梭菌微生物处理生物质的用途。
本发明还包括球孢梭菌微生物液化生物质的用途。
本发明还包括球孢梭菌微生物由生物质发酵形成沼气的用途。
本发明还包括通过所述方法获得的液化生物质用于制备生物燃料的用途。优选的，使用通过所述方法获得的液化生物质制备生物乙醇。
本发明还包括球孢梭菌微生物菌株SBG3，其保藏号为No.DSM22577。根据布达佩斯条约，所述球孢梭菌微生物SBG3以纯培养物的形式保藏在不伦瑞克市的德国微生物菌种保藏中心。其名称为：球孢梭菌SBG3，保藏号DSM 22577。
本发明还包括煎盘梭菌微生物菌株SBG1a，其保藏号为No.DSM22578。根据布达佩斯条约，所述煎盘梭菌微生物SBGla以纯培养物的形式保藏在不伦瑞克市的德国微生物菌种保藏中心。其名称为：煎盘梭菌SBG1a，保藏号DSM 22578。
可以借助本领域技术人员公知的方法从发酵罐的发酵基质或发酵残渣中分离出球孢梭菌细菌。为此，将来自发酵罐的合适基质引入筛选培养基中，经过长时间的培养并最终从筛选培养基中分离出微生物的单个菌落。在借助PCR扩增所获得的微生物的DNA之后，可以基于DNA筛选出球孢梭菌微生物。
从第二发酵罐的发酵基质中分离出球孢梭菌细菌SBG3。为此，使氮气和二氧化碳通过液体筛选培养基，然后向筛选培养基中添加Na2S并高压灭菌(20分钟，121℃)。然后将从第二发酵罐获得的生物质引入筛选培养基中，并在至少30℃的温度下培养至少一周。将从液体筛选培养基获得的样本涂覆于固体筛选培养基上，然后筛选在固体筛选培养基上生长的微生物群落。在借助PCR扩增所获得的微生物DNA之后，可以与已知的DNA序列进行比较。
从第二发酵罐的发酵基质中成功分离出球孢梭菌细菌SBG3之后，对该微生物进行序列分析。确定了16S rRNA的部分序列，其随后转变为相应的DNA序列。该DNA序列SEQ ID No.1包括1409个核苷酸。作为下一子代鉴定出梭菌属(Clostridium sp.)微生物克隆1099982248072，其来自婴儿的粪便样本并且与生物燃料的工艺形成有关(GenBank登录号EF434352，序列长度为1340个核苷酸)。所述序列的对比表明，梭菌属克隆1099982248072的序列与SEQ ID No.1相比总共有46个核苷酸的取代或空位。使用梭菌属克隆1099982248072的1340个核苷酸的序列长度计算出96.57％的同一性。
本发明还包括含有核酸的微生物，所述核酸具有核苷酸序列，该核苷酸序列包括一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于96.57％。特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于96.58％，或大于96.59％，或大于96.60％，或大于96.65％，或大于96.70％，或大于96.75％，或大于96.80％，或大于96.90％，或大于97.0％，或大于97.1％，或大于97.2％，或大于97.3％，或大于97.4％，或大于97.5％，或大于97.6％，或大于97.7％，或大于97.8％，或大于97.9％。
特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于98.0％。特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与SEQ ID No.1的序列同一性大于98.1％，或大于98.2％，或大于98.3％，或大于98.4％，或大于98.5％，或大于98.6％，或大于98.7％，或大于98.8％，或大于98.9％，且特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQID No.1的序列同一性大于99％。
根据另一优选的具体实施方案，该微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列具有一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.5％，且特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.8％。
根据非常特别优选的具体实施方案，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1完全相同。
在本发明优选的具体实施方案中，针对原始核苷酸序列SEQ ID No.1，可以在一个位点，或两个位点，或三个位点，或四个位点，或五个位点，或六个位点，或七个位点，或八个位点，或九个位点，或十个位点，或十一个位点，或十二个位点，或十三个位点，或十四个位点，或十五个位点，或十六个位点，或十七个位点，或十八个位点，或十九个位点，或二十个位点，或二十一个位点，或二十二个位点，或二十三个位点，或二十四个位点，或二十五个位点，或二十六个位点，或二十七个位点，或二十八个位点，或二十九个位点，或三十个位点，或三十一个位点，或三十二个位点，或三十三个位点，或三十四个位点，或三十五个位点，或三十六个位点，或三十七个位点，或三十八个位点，或三十九个位点，或四十个位点，或四十一个位点，或四十二个位点，或四十三个位点，或四十四个位点，或四十五个位点，或四十六个位点上发生核苷酸突变。术语“核苷酸突变”的含义记载于本文的“定义”章节。
本发明还包括适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的微生物培养物，其中在微生物培养物中存在微生物，该微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性至少为96.57％，其中该微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10-4％。
优选地，在适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的微生物培养物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于96.57％。特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于96.58％，或大于96.59％，或大于96.60％，或大于96.65％，或大于96.70％，或大于96.75％，或大于96.80％，或大于96.90％，或大于97.0％，或大于97.1％，或大于97.2％，或大于97.3％，或大于97.4％，或大于97.5％，或大于97.6％，或大于97.7％，或大于97.8％，或大于97.9％。
特别优选地，在适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的微生物培养物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于98％。特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于98.1％，或大于98.2％，或大于98.3％，或大于98.4％，或大于98.5％，或大于98.6％，或大于98.7％，或大于98.8％，或大于98.9％，特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.0％。
根据另一优选的具体实施方案，在适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的微生物培养物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.5％。非常特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.8％。
根据特别优选的具体实施方案，在适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的微生物培养物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1完全相同。
根据另一优选的具体实施方案，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10-2％，优选至少1％。特别优选地，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10％，特别优选至少25％。
特别优选地，球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少50％，特别是至少90％。特别优选地，培养物是适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的微生物纯培养物，其中培养物是上文中用其核苷酸序列表征的球孢梭菌微生物SBG3的纯培养物。
特别优选地，在上述情况下，培养物是固定化的微生物培养物。
本发明还包括适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的固定化微生物培养物，其中在该固定化微生物培养物中存在微生物，该微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性至少为96.57％。
优选地，在适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的固定化微生物培养物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于96.57％。特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ IDNo.1的序列同一性大于96.58％，或大于96.59％，或大于96.60％，或大于96.65％，或大于96.70％，或大于96.75％，或大于96.80％，或大于96.90％，或大于97.0％，或大于97.1％，或大于97.2％，或大于97.3％，或大于97.4％，或大于97.5％，或大于97.6％，或大于97.7％，或大于97.8％，或大于97.9％，或大于98.0％，或大于98.1％，或大于98.2％，或大于98.3％，或大于98.4％，或大于98.5％，或大于98.6％，或大于98.7％，或大于98.8％，或大于98.9％。特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.0％。
根据另一优选的具体实施方案，在适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的固定化微生物培养物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.5％。特别优选地，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.8％。
根据非常特别优选的具体实施方案，在适用于处理生物质的方法，特别是液化生物质的方法和/或由生物质发酵形成沼气的方法的固定化微生物培养物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1完全相同。
此外，本发明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物在处理生物质的方法中的用途。优选的，在上文详述的处理生物质的方法中使用该微生物。
此外，本发明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物在液化生物质的方法中的用途。优选的，在上文详述的液化生物质的方法中使用该微生物。
此外，本发明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物在由生物质发酵形成沼气的方法中的用途。优选的，在上文详述的由生物质发酵形成沼气的方法中使用该微生物。
此外，本发明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物培养物在处理生物质的方法中的用途。优选的，在上文详述的处理生物质的方法中使用该微生物培养物。
此外，本发明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物培养物在液化生物质的方法中的用途。优选的，在上文详述的液化生物质的方法中使用该微生物培养物。
此外，本发明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物培养物在由生物质发酵形成沼气的方法中的用途。优选的，在上文详述的由生物质发酵形成沼气的方法中使用该微生物培养物。
附图说明
为了解释本发明以及说明其益处，下文中提供具体实施方案。通过图1至4详细解释该具体实施方案。应理解，本发明不应局限于具体实施方案所提供的信息。附图表示：
图1：用于研究发酵基质液化程度的基质流动试验；
图2：发酵过程的测量结果：以时空产量(Nl/l)作为气体产量和发酵罐容积负荷相对于时间绘图；
图3：另一发酵过程的测量结果：以时空产量(Nl/l)作为气体产量和发酵罐容积负荷相对于时间绘图；
图4：另一发酵过程的测量结果：以时空产量(Nl/l)作为气体产量和发酵罐容积负荷相对于时间绘图。
具体实施方式
从第二发酵罐的发酵基质中成功分离出球孢梭菌细菌SBG3。根据布达佩斯条约，在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)以纯培养物的形式保藏该有机体(球孢梭菌SBG3，保藏号DSM 22577)。
同样地，从第二发酵罐的发酵基质中成功分离出煎盘梭菌细菌SBG1a。根据布达佩斯条约，在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)以纯培养物的形式保藏该有机体(煎盘梭菌SBG1a，保藏号DSM 22578)。
正如下文的具体实施方案所示，煎盘梭菌菌株细菌SBG1a不仅在混合培养物中而且在纯培养物中均具有与球孢梭菌菌株细菌SBG3相似的如本发明所述的性能，例如，升高容积负荷，提高气体产量，稳定沼气工艺，以及液化生物质。
在下文中，如果没有特殊说明，则使用标准分子生物学方法，例如Sambrook等人所描述的方法(1989年，Molecular cloning：ALaboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。
微生物分离和增殖
从第二发酵罐的发酵基质中成功分离出球孢梭菌菌株细菌SBG3。借助筛选培养基进行微生物分离，该筛选培养基以羧甲基纤维素(CMC)作为唯一的碳源。羧甲基纤维素与在沼气装置的发酵基质中获得的纤维素非常相似，并且通过羟基和羧甲基(-CH2-COOH-)的连接在水介质中具有改善的溶解性。为筛选球孢梭菌SBG3而使用的介质(德国微生物菌种保藏中心，介质250加1％CMC和0.2％酵母抽提物)用N2充气，以此在厌氧条件下进行筛选。借助0.5克/升的Na2S还原所包含的剩余氧气。
然后，用来自第二发酵罐的材料的上清液(以1∶2000稀释)接种筛选培养基。在40℃下培养一周之后，通过显微镜分析显示出单个的杆菌。通过在厌氧羧甲基纤维素板上涂片从而进一步筛选液体培养物并分离至纯培养物。
对于大量的球孢梭菌菌株细菌SBG3(例如，对于向3型发酵罐中的添加物)，在接种了100毫升预培养物的1m3发酵罐中所提供的条件下进行培养。由于所述生长以约2小时的倍增时间相当快速地进行，球孢梭菌SBG3非常适用于生物技术应用。少量的细菌(例如，对于向1、2和4型发酵罐中的添加物)在500毫升至1升的规模下培养。在1至2天的时间段内培养发酵过程中的添加物。达到108至1010细胞每毫升培养基的细胞浓度。通过离心分离获得细菌细胞，并且在将其应用于发酵过程之前，将其引入尽可能小的体积的新鲜培养基中。冷冻所述细胞以便进行中间储存。
可以在相同的条件下培养煎盘梭菌和浸麻类芽孢杆菌微生物，例如，用于具有大约相同含量的所述三种微生物的混合培养物。
DNA分离和核苷酸序列确定
利用菌落PCR方法，根据标准程序，使用培养的分离菌落的细胞材料来扩增微生物DNA。
为了确定16S rRNA序列，利用PCR从细胞DNA扩增16S rRNA基因。为此，使用具有序列GRGTTTGATCCTGGCTCAG和ACGGHTACCTTGTTACGACTT的引物(5’→3’方向，H的含义为C、T或A)。然后，作为PCR产物获得的DNA片段被克隆至克隆载体中(通过使用p-Drive载体和德国希尔登/QIAGEN公司的QIAGEN PCR克隆试剂盒进行连接)，转化大肠杆菌(根据QIAGEN PCR克隆手册)并使用菌落PCR进行研究。对获得的菌落PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)，以筛选合适的克隆。从每个克隆中分离出相应的质粒DNA并按照链终止法(Sanger等人，1977)测序。
序列分析
在菌落的序列分析之后，可以使用程序包ARB(Ludwig等人，Nucleic Acids Research，2004，32，1363-1371)系统分析16S rDNA或其相应的16S rRNA转录产物，并将其分类为球孢梭菌微生物。使用数据库www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)分析16S rDNA或相应的16S rRNA序列鉴定出作为下一子代的梭菌属克隆1099982248072。
包含纤维素的培养基的液化
使用具有水解活性的发酵微生物球孢梭菌SBG3的纯培养物的研究表明，将其添加至包含羧甲基纤维素的极粘稠的粘性筛选培养基导致介质的逐步液化，直至达到细菌生长过程中的水样一致性，这可以通过摇晃培养瓶和肉眼观察清楚地看到。
发酵基质的液化-基质流动试验
在湿法发酵方法中，液化具有高干物质含量的发酵基质或保持液-浆一致性是必要的，以保证工艺过程平稳和经济地运行。有时候，在连续操作中这也导致发酵罐内容物的“黏液”增多，其同样对沼气形成过程产生负面作用。通过一个试验确定添加微生物对发酵基质一致性所造成的影响，其中在斜面上测量基质样本的流动性能(基质流动试验)。
用于流动试验的原料为来自沼气装置的含约8％至12％干物质的材料。将来自发酵罐的500毫升材料装入1升肖特瓶中并在40℃下培养1天。然后将来自球孢梭菌SBG3、煎盘梭菌SBG1a、浸麻类芽孢杆菌SBG2的500毫升预培养物或来自由所述三种细菌以相同比例构成的混合物的500毫升预培养物(对应于大约4x 1011个细胞)的细菌细胞团再悬浮并添加至1毫升的培养基中，并在40℃下摇动培养5天。对于对照样本，仅添加1毫升培养基。将1.3克样本放置在金属斜面的起点，并通过厘米刻度尺读取每个样本的流速(每10分钟运行的距离)，该流速是发酵基质的液化或粘度的度量标准。流动试验的结果描述于图1中。
图1中显示了如下曲线：曲线1：未添加微生物的对照样本(对比例)；曲线2：煎盘梭菌SBG1a(对比例)；曲线3：球孢梭菌SBG3；曲线4：浸麻类芽孢杆菌SBG2(对比例)；曲线5：由煎盘梭菌SBG1a、球孢梭菌SBG3和浸麻类芽孢杆菌SBG2以相同比例构成的混合物。图1A显示了涂覆样品之后直接测量的曲线，图1B显示了涂覆样品2分钟之后的曲线，图1C显示了涂覆样品18分钟之后的曲线。
人们发现，通过添加活球孢梭菌菌株细菌SBG3使得发酵罐内容物的粘度急剧下降，然而添加有机体煎盘梭菌SBG1a和浸麻类芽孢杆菌SBG2也表现出显著但并不那么明显的效果。通过添加所述3种微生物的混合物也可以实现基质的明显液化。另一试验表明，添加死亡细胞(高压灭菌杀死)实际上不产生效果。肉眼观察该样本，发现在添加活球孢梭菌菌株SBG3的细胞时，黏液物质的含量降低。出人意料的，对于已经经历了发酵罐和由微生物引起的发酵过程的基质来说，添加细菌也能导致进一步的液化。这意味着，在没有添加外部微生物的发酵过程中，基质不能完全分解并含有额外的能量，该能量可以通过添加本发明的微生物得以利用。
细胞浓度的确定
为了确定活细菌的细胞浓度，将10微升细菌样本(例如，预培养物，细菌培养物(Bakterienzuchtansatz)，发酵罐样本的上清液)与2微升BacLightTM染料(Invitrogen)混合并使用显微镜放大1000倍进行观察(AXIO ImagerA1，Zeiss，Jena)。在使用紫外线下以及两种不同滤镜的情况下，可以通过BacLightTM系统确定样本中活细胞的含量。在阿-蔡二氏计数池
Figure BPA00001178518500231
中计算总细胞数量。来自预培养物的活细胞含量理论上大于90％。
样本中球孢梭菌SBG3或浸麻类芽孢杆菌SBG2或煎盘梭菌 SBG1a细胞含量的确定-“钓鱼(Fishing)法”
根据Amann等人描述的方法(1995，Microbiol.Rev.59，143-169)，通过“全细胞杂交”确定球孢梭菌SBG3或浸麻类芽孢杆菌SBG2或煎盘梭菌SBG1a的细菌含量。对于球孢梭菌SBG3，使用具有序列Cy3-CCACAGCTCTCACGCCCG(5’→3’方向)的标记的寡核苷酸作为“钓鱼”的探针，对于浸麻类芽孢杆菌SBG2，使用具有序列Cy3-GCAACCCGAACTGAGACC(5’→3’方向)的标记的寡核苷酸作为“钓鱼”的探针，对于煎盘梭菌SBG1a，使用具有序列Cy3-CTTCATGCGAAAATGTAA(5’→3’方向)的标记的寡核苷酸作为“钓鱼”的探针。标记的寡核苷酸均在5’-端携带吲哚菁染料(Cy3)。
发酵罐类型
在不同类型的发酵罐中进行中试规模的试验。在约40℃的操作温度下操作发酵罐。主要使用有机干物质(oTS)含量为30％至35％的玉米青贮作为基质。为了保证对参与发酵过程的具有代谢活性的微生物供应微量元素，通常添加商业可获得的微量元素混合物(例如
Figure BPA00001178518500241
)。
1型发酵罐：水平式长方体活塞流发酵罐，容积150升，在结构上通过附加的具有用于基质流的小孔的壁分割发酵罐空间，将发酵罐空间分割为基质进料管后有1/4空间和孔板后有3/4空间，二级装置。
2型发酵罐：容积为150升的水平式长方体活塞流发酵罐作为第一级，容积为200升的总球形搅拌发酵罐作为第二级；总容积为350升。具有球形发酵罐和活塞流发酵罐之间的再循环系统的二级装置。
3型发酵罐：水平式圆柱体活塞流发酵罐，容积30立方米，一级装置。
4型发酵罐：水平式长方体活塞流发酵罐，容积150升，发酵罐空间中没有结构分割，一级装置。任选再循环。
微生物在发酵罐内的分布-“示踪试验”
由于黏性基质的搅拌以及向发酵罐中添加其他物质持续一段时间，并且该时间还取决于所使用的搅拌工艺，因此建立一种试验，通过该试验可以确定发酵罐中添加的微生物达到均匀分布所需要的时间段。在该“示踪试验”中，在添加基质的位置以10毫克锂/千克起始基质的浓度(当使用2型发酵罐时该量加倍)添加粉末状LiCl以代替微生物。然后，不同的时间段之后(在第一天进行添加)，在发酵罐的不同位置(从基质入口之后的发酵罐起点至基质出口之前的终点)取得基质样本，并根据方法DIN EN ISO 13346(S7a)和DIN EN ISO 11885(E22)借助诱导结合等离子体原子发射光谱法分析其锂含量。完全搅拌发酵罐内容物之后，在发酵罐前端和发酵罐后端测得的锂含量相同并且为约10毫克/千克起始基质(对于2型发酵罐来说为约20毫克/千克起始基质)。对于三种不同类型发酵罐的“示踪试验”的结果列于表1中。
表1：
人们发现，对于2型和3型发酵罐，添加“示踪物”5天之后达到发酵罐内容物的完全搅拌以及“示踪物”的均匀分布，对于1型发酵罐，添加“示踪物”8天之后才达到发酵罐内容物的完全搅拌以及“示踪物”的均匀分布。由此可以预计，添加的微生物达到均匀分布的时间段也为更多的天数。
添加或不添加本发明的微生物的长期发酵以制备沼气
在中试工艺规模中可以稳定达到实践中已知的平均容积负荷至少两倍的容积负荷。在8kg oTS/m3d的容积负荷下，通过每立方米每周添加2x1013个细胞达到稳定的操作。在此，不改变实践中通常使用的工艺参数，例如温度(40℃)和pH值(6-9)或缓冲能力。
在容积为150升至30000升的不同试验发酵罐和实际装置条件下(T～40℃，pH 6-8，连续供料，不断搅拌)的发酵过程中，在数月的时间段中确定发酵罐的以千克有机干物质每立方米每天(kgoTS/m3d)计的容积负荷的时间曲线和产生的沼气的时间曲线。为了更好地比较不同试验装置，对于气体产量来说，需要标明时空产量(每升发酵体积产生的沼气的标准升[Nl/l])而不是沼气比产量，其中产生的沼气量通过发酵体积得以标准化。此外，计算预期的理论气体产量的时间曲线。
农业技术与建筑委员会(KTBL)和联邦农业研究中心以及天然再生材质专业协会公布了参考数据，该标准数据代表在稳定的发酵过程中，根据所使用的基质而预计的沼气量。因此，该理论参考数据可以反映理论产生的沼气量。或者，也可以使用其他国家的其他研究所公布的参考数据。对于玉米青贮来说，其oTS含量为22％至40％，预计有533Nl/kg oTS至650Nl/kg oTS的气体产量(“Handreichung Biogasgewinnung und-nutzung”，2006，Hrsgb.天然再生材质专业协会e.V.，Gülzow，和KTBL主页，www.ktbl.de)。通过所述参考数据计算以[Nl/d]计的理论气体产量的时间曲线，其中在所有试验中，非常高的理论气体产量值为663Nl/kg oTS。对于使用的玉米青贮的oTS含量，实际测得的值取决于在30％至40％oTS范围内变化的负载。
除了气体产量和容积负荷之外，测量发酵过程的一系列其他表征参数，例如发酵罐内容物的干物质含量、pH值、酸浓度(例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乙酸当量)、温度、气体比产量、沼气组成、粘度、传导率、氧化还原电位和营养物质及微量元素的浓度。
在4型发酵罐中添加球孢梭菌微生物SBG3的长期发酵
工艺装置为容积为150升的水平式长方体活塞流发酵罐。该发酵罐作为一级发酵罐操作。
图2显示了在添加和不添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的情况下，在试验发酵罐中的发酵过程中不同表征参数的测量结果。使用附图标记10标明的曲线表示以千克有机干物质每立方米每天(kg oTS/m3d)计的发酵罐容积负荷的时间曲线，使用附图标记20标明的曲线为测得的每五天取平均值的时空产量(Nl/l)的时间曲线。附图标记30标明了以[Nl/l]计的理论气体产量的时间曲线。
在不添加微生物的情况下操作装置直至第246天。在稳定的发酵过程中，该装置可以达到6至7kg oTS/m3d的相当高的容积负荷，其中实际气体产量略低于理论值。
从第232天(星号)开始尝试将容积负荷升高至10kg oTS/m3d，这导致立即形成沼气。使容积负荷再次返回至约6kg oTS/m3d的值之后，从第246天开始每周添加两次球孢梭菌菌株微生物SBG3的培养物(每次以30毫升至20毫升的体积添加5x 1010至2x 1011个细胞)。通过X轴上的散列符号40标明添加球孢梭菌SBG3的时间点。
然后，实际气体产量在理论计算值之上持续升高。容积负荷可以在稳定发酵过程中持续升高，到第360天增至9kg oTS/m3d的值。因此，时空产量也从初始的4Nl/l升高至6Nl/l。第360天之后(箭头)，由于操作暂停，停止基质供应并不再进一步添加微生物。气体生产完全停顿。
从第384天开始，在不添加新微生物的情况下，装置的容积负荷在一天之内增至5kg oTS/m3d。大约到第415天时，容积负荷升高至7kg oTS/m3d的值，然后持续保持在7至8kg oTS/m3d的高值。因此，气体生产再次以高效率进行，并且在整个观察时间段内保持在理论预计的气体产量范围内或者高于理论预计的气体产量。
本领域技术人员公知，在停顿数周之后无困难地启动装置是非常特别的。重新启动装置之后，使用针对球孢梭菌SBG3的寡核苷酸探针的“钓鱼”实验表明，发酵罐中产生有机体，并且该有机体以发酵罐内容物中检测到的细菌总量的约0.5％的浓度存在。这也解释了在定期添加球孢梭菌微生物SBG3的情况下早已观察到升高的容积负荷、气体产量以及发酵过程稳定性的积极效果的原因。
在1型发酵罐中添加球孢梭菌微生物SBG3和添加球孢梭菌 SBG3、煎盘梭菌SBG1a和浸麻类芽孢杆菌SBG2菌株微生物的混合物 的情况下的长期发酵
工艺装置为容积为150升的水平式长方体活塞流发酵罐。该发酵罐作为二级发酵罐操作，因为通过附加的具有用于基质流的小孔的壁在结构上分割了发酵罐空间。因此发酵罐空间在一定程度上被分割成两个反应室，两个反应室的容积比为1∶3，其中基质进料管后方的空间较小而孔板后方的空间较大。发酵过程的表征参数测量值表明，在两个反应室中形成部分不同的数值，由此可以推断，优选在一个或另一个反应室中进行不同的基质转换。
图3显示了在1型试验发酵罐中添加微生物的混合物或球孢梭菌菌株微生物SBG3的情况下，发酵过程中不同表征参数的测量结果。用附图标记10标明的曲线表示以千克有机干物质每立方米每天(kgoTS/m3d)计的发酵罐容积负荷的时间曲线，用附图标记20标明的曲线表示测得的每五天取平均值的时空产量(Nl/l)的时间曲线。附图标记30标明了以[Nl/l]计的理论气体产量的时间曲线。
重新装载该装置。一周之后，每周添加2至5次由大约相同含量的球孢梭菌菌株微生物SBG3、煎盘梭菌菌株微生物SBG1a和浸麻类芽孢杆菌菌株微生物SBG2组成的混合培养物。用附图标记50标明添加的时间点。每次添加约3克含有约1012个细胞的细胞球。在稳定的发酵过程中，容积负荷可以逐渐升高至约6kg oTS/m3d的值。获得的气体产量通常对应于理论预计的气体产量或稍高于理论预计的气体产量。
从第106天开始，每周添加5次球孢梭菌菌株SBG3的纯培养物(同样为约3克含有约1012个细胞的细胞球)以代替混合培养物。用附图标记60标明添加的时间点。直到观测时期结束，容积负荷一直保持在6至7kg oTS/m3d的高水平，并且测得的酸浓度没有达到临界范围。测得的有机干物质在发酵罐内容物中的含量从未超过12％oTS的值，因此在较高的容积负荷也可以良好搅拌，并且在发酵罐中未出现粘性物质。在未添加微生物的对比实施例中，该类型的发酵罐无法在大于5kg oTS/m3d的容积负荷下运转。
当添加球孢梭菌菌株SBG3的纯培养物时，实际测得的气体产量与添加混合培养物的时间段相比显著升高。对于每周添加5次混合培养物的时间段，测得4.1Nl/l的平均气体产量，而在添加球孢梭菌SBG3的纯培养物之后，测得4.6Nl/l的平均气体产量，其升高了12％，并且在经济上具有重大意义。该实施例还表明，在添加球孢梭菌菌株SBG3的纯培养物时，沼气比产量(Nm3/t)升高，由于在相同的容积负荷下气体产量升高，因此添加的基质也被更有效地利用。
在3型发酵罐中添加球孢梭菌微生物SBG3的长期发酵
试验装置为容积为30立方米的中试规模的大型试验装置，其结构为水平式圆柱体形状的活塞流发酵罐。该发酵罐作为一级发酵罐操作，
图4显示了在3型试验发酵罐中添加煎盘梭菌菌株微生物SBG1a或球孢梭菌菌株微生物SBG3的情况下，发酵过程中不同表征参数的测量结果。用附图标记10标明的曲线表示以千克有机干物质每立方米每天(kg oTS/m3d)计的发酵罐容积负荷的时间曲线，用附图标记20标明的曲线表示测得的时空产量的时间曲线。该时空产量以每5天取平均值(Nl/l)并用附图标记70标明。附图标记30标明了以[Nl/l]计的理论气体产量的时间曲线。
用附图标记90标明添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的时间点。用附图标记80标明添加煎盘梭菌菌株微生物SBG1a的时间点。箭头标明了发酵罐“崩溃”的起点。
从第184天开始，以4至5kg oTS/m3d的容积负荷操作该沼气装置。正如图4中所示，该试验中获得的沼气时空产量显著高于理论预计的值。为了将该过程保持在所述的高水平，从第207天开始添加煎盘梭菌菌株微生物SBG1a的纯培养物(每周添加4至5次，每次为来自100至200升培养基的约100克湿润细胞球，对应于约4至8x 1013个细胞)。因此，该过程可以以所述高水平(时空产量为3.5至4Nl/l，比理论预计的气体产量高约15％至30％)保持超过2周。然而，从第227天开始，气体产量突然下降，同时容积负荷迅速降低至仅略大于1kg oTS/m3d的值，这就是“发酵罐崩溃”。人们也可以通过其他测量参数，例如pH值(在第229天时pH值从约7.7至7.8下降至6.0)，以及自发积累的游离脂肪酸的测量值(针对乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和乙酸当量的显著升高的值)观察到发酵过程失去平衡。为了再次稳定发酵过程，从第228天开始每次添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的纯培养物(每周添加4至5次，来自100至200升培养基的约100克湿润细胞球)。在崩溃期间，获得的气体产量仅仅达到理论预计的值(参见附图标记20和30标明的测量数据)，但是从第230天开始，即添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的第一个培养物2天后，测得的气体产量再次超过理论预计的值。从第238天开始，容积负荷的升高伴随着连续升高的气体产量成为可能。球孢梭菌菌株微生物SBG3的添加持续至第257天。在该时间点，容积负荷达到约4kg oTS/m3d，并且获得的气体产量始终显著高于理论计算的值，但是效率水平还总是低于崩溃之前的效率水平。接着停止添加球孢梭菌菌株微生物SBG3，并且从第260天开始重新添加煎盘梭菌菌株微生物SBG1a(每周添加4至5次，每次为来自100至200升培养基的约100克湿润细胞球)。发现，由此可以容易地使空间产量(Raumausbeute)再次升高到4.5至5kg oTS/m3d的值，并且可以再次观察到气体盈余，其达到了发酵罐崩溃之前的水平。根据本发明，添加球孢梭菌菌株微生物SBG3被证明适用于在崩溃期间稳定发酵罐，使得沼气生产再次有效地继续进行。
通过添加球孢梭菌SBG3的纯培养物，发酵过程中的容积负荷可以升高至约9kg oTS/m3d的最大值。
在容积负荷升高的同时，可以观察到沼气产量的升高。此时观察到与以标准升/天[Nl/d]计的理论气体产量一致的以标准升/天[Nl/d]计的产生的沼气量，或者高于理论气体产量的气体产量。
添加球孢梭菌SBG3可以导致装置的容积负荷升高。此时干物质或有机干物质的百分比含量几乎保持恒定。该观察结果表明，在发酵基质的发酵过程中，未发酵的有机干物质没有产生积累。添加球孢梭菌SBG3的纯培养物有助于促进发酵基质中包含的干物质的连续转化，这再次导致连续的发酵，从而避免了干物质的积累。
在沼气装置以恒定容积负荷运转的阶段中，甚至观察到干物质的减少，这意味着球孢梭菌微生物SBG3通过其水解代谢活性不仅避免了发酵罐中干物质的积累，而且提高了干物质的水解转换。
在所述的具体实施例中，也可以使用含有球孢梭菌的混合培养物代替球孢梭菌的纯培养物。特别的，可以添加由选自浸麻类芽孢杆菌、煎盘梭菌或球孢梭菌的两种或三种微生物组成的混合培养物。
添加具有水解活性的发酵球孢梭菌微生物SBG3显示出对于有机干物质水解的积极效果。在相同条件下，通过添加球孢梭菌微生物可以使发酵罐的容积负荷从约4至5kg oTS/m3d升高至约6至9kgoTS/m3d，并且不会导致发酵过程的不稳定性。在升高的容积负荷的同时，形成的沼气量显著增加。此外，沼气比产量升高，因为与不添加球孢梭菌微生物的情况相比，更多的有机干物质被分解。使用球孢梭菌微生物使得沼气装置的效率和生产率明显改善。
序列表
<110>史马克沼气股份公司
<120>用于制备沼气的球孢梭菌
<130>SCM068WO
<150>PCT/DE2008/075017
<151>2008-12-23
<150>DE 10 2009 003 587.7
<151>2009-03-07
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1409
<212>DNA
<213>球孢梭菌SBG3
<400>1
cagatcacct tagacacgtc ccccttgcgg ttagactatt ggcttcgggt attaccggct   60
cccatggtgt gacgggcggt gtgtaccagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgatga   120
tccgcgatta ctagcaattc caacttcatg taggcgggtt gcagcctaca atccgaactg   180
agatcgcttt tgggggtttg ctccacctcg cggcttggct tccctctgtt agcgaccatt   240
gtagtacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcgt ccccaccttc   300
ctccgttttg tcaacggcag tctgattaga gtgctcttgc gtacgactaa tcacaagggt   360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac   420
cacctgtctc aactttcccc gaagccacct aatgcatctc tgcctcgtta gttggatgtc   480
aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatactcca ctgcttgtgc   540
gggcccccgt caattccttt gagtttcaac ctggcggccg tactccccag gtggatcact   600
tattgtgtta actccggcac ggaaggggtc agacccccca cacctagtaa tcatcgttta   660
cggcatggac taccagcgta tctaatcctg tttgctaccc aggcttccgt gcctcagcgt   720
cagttaaagc ccagtaggcc gccttcgcca ctggtgttcc tcccgatctc tacgcatttc   780
aacgctacac cgggaattcc gcctacatct acgtcaatca agcctcccag tttcgaacgc   840
aatttgtggg ttaagcccac agctctcacg cccgacttaa aaagccgcta cgcacccttt   900
acacccagta aatccggaca acgcttgctc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta   960
gttagccgga gcttcctcct tggctaccgt cattatcttc accaaggaca gaggtttaca   1020
atccgaagac cgtcttccct cacgcggcat tgctgcatca gagtttcctc cattgtgcaa   1080
tatcccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca atgtggccgt   1140
tcagtctctc aacccggcta ccgatcgtcg ctttggtggg cctttacccc gccaactggc   1200
taatcggacg cgagtccatc tttcagcgga ttgctccttt gataccaagg ccatgcgacc   1260
ccaatatatc atgcggtatt agcgttcttt tcagaacgtt atccccctct gaaaggcagg   1320
ttactcacgc gttactcacc cgtccgccac taagtaagag ctaagcaagc ttctctcttc   1380
tccgtcgact tgcattttga acgtcgcga                                     1409

Claims (53)

1.一种处理生物质的方法，其特征在于，在所述生物质中添加球孢梭菌微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其是液化生物质的方法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其是由生物质形成沼气的方法。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，以微生物培养物的形式添加所述球孢梭菌微生物，其中所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10-4％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少50％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少90％。
8.根据权利要求4至7任一项所述的方法，其特征在于，添加球孢梭菌微生物的纯培养物。
9.根据权利要求4至8任一项所述的方法，其特征在于，在生物质中添加球孢梭菌微生物作为至少一种固定化微生物培养物的组成部分。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，在添加球孢梭菌微生物的同时向发酵反应器中添加额外的生物质。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于，通过连续添加生物质连续升高发酵反应器容积负荷。
12.根据权利要求3至11任一项所述的方法，其特征在于，在≥0.5kg oTS/m3d，优选≥4.0kg oTS/m3d，特别优选≥8.0kg oTS/m3d的容积负荷下由生物质形成沼气。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其特征在于，添加基质和添加球孢梭菌微生物连续进行。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于，将一定量的球孢梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后球孢梭菌微生物含量占发酵基质中存在的微生物总量的10-8％至50％。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，将一定量的球孢梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后球孢梭菌微生物含量占发酵基质中存在的微生物总量的10-3％至1％。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于，添加额外的煎盘梭菌微生物。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，其涉及煎盘梭菌菌株SBG1a微生物。
18.根据权利要求1至17任一项所述的方法，其特征在于，添加额外的浸麻类芽孢杆菌微生物。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，其涉及浸麻类芽孢杆菌菌株SBG2微生物。
20.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其特征在于，球孢梭菌微生物是梭菌属克隆1099982248072菌株的微生物。
21.球孢梭菌微生物用于处理生物质的用途。
22.球孢梭菌微生物用于液化生物质的用途。
23.球孢梭菌微生物用于由生物质发酵形成沼气的用途。
24.根据权利要求21至23任一项所述的用途，其特征在于，球孢梭菌微生物是梭菌属克隆1099982248072菌株的微生物。
25.根据权利要求1至20任一项所述的方法获得的液化生物质用于制备生物燃料的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其特征在于，使用所述液化生物质制备生物乙醇。
27.球孢梭菌微生物菌株SBG3，其在德国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为No.22577。
28.煎盘梭菌微生物菌株SBG1a，其在德国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为No.22578。
29.一种含有核酸的微生物，所述核酸具有核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ IDNo.1的序列同一性大于96.57％。
30.根据权利要求29所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于97.0％。
31.根据权利要求30所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于98.0％。
32.根据权利要求31所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.0％。
33.根据权利要求32所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1的序列同一性大于99.5％。
34.根据权利要求33所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No.1完全相同。
35.一种适用于处理生物质的方法的微生物培养物，其特征在于，在所述微生物培养物中存在根据权利要求29至34所述的球孢梭菌微生物，其中所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10-4％。
36.根据权利要求35所述的微生物培养物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少1％。
37.根据权利要求36所述的微生物培养物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少25％。
38.根据权利要求37所述的微生物培养物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少50％。
39.根据权利要求38所述的微生物培养物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少90％。
40.根据权利要求39所述的微生物培养物，其特征在于，其是球孢梭菌微生物的纯培养物。
41.根据权利要求35至40任一项所述的微生物培养物，其特征在于，其是固定化的微生物培养物。
42.根据权利要求27至34任一项所述的微生物用于处理生物质的用途。
43.根据权利要求42所述的用途，其特征在于，其涉及根据权利要求1至20任一项所述的处理生物质的方法。
44.根据权利要求27至34任一项所述的微生物用于液化生物质的用途。
45.根据权利要求44所述的用途，其特征在于，其涉及根据权利要求2至20任一项所述的液化生物质的方法。
46.根据权利要求27至34任一项所述的微生物用于由生物质发酵形成沼气的用途。
47.根据权利要求46所述的用途，其特征在于，其涉及根据权利要求3至20任一项所述的由生物质发酵形成沼气的方法。
48.根据权利要求35至41任一项所述的微生物培养物用于处理生物质的用途。
49.根据权利要求48所述的用途，其特征在于，其涉及根据权利要求1至20任一项所述的处理生物质的方法。
50.根据权利要求35至41任一项所述的微生物培养物用于液化生物质的用途。
51.根据权利要求50所述的用途，其特征在于，其涉及根据权利要求2至20任一项所述的液化生物质的方法。
52.根据权利要求35至41任一项所述的微生物培养物用于由生物质发酵形成沼气的用途。
53.根据权利要求52所述的用途，其特征在于，其涉及根据权利要求3至20任一项所述的由生物质发酵形成沼气的方法。
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