CN107771219A - 与糖化同时进行的酵母繁殖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于繁殖酵母的方法，所述酵母用于从木质纤维素生物质生产发酵产物，所述方法包括由以下组成的步骤：a.提供反应器；b.在所述反应器中使以下接触：能够代谢戊糖和己糖的酵母群，比例为每公斤制备的完全培养基0.2‑2.0g酵母固体；源自木质纤维素生物质预处理的原料榨渣，固体含量(MS)为8％‑15％；营养物；和纤维素酶，比例为每克MS 5‑15mg蛋白，和c.在微好氧条件下于25‑38℃，优选28‑33℃的温度下孵育所述混合物，其中所述原料榨渣的糖化和所述酵母的生长同时进行。

Description

与糖化同时进行的酵母繁殖
技术领域
本发明涉及用于生产生物燃料和其他绿色化学化合物(通过发酵过程产生)的酵母的领域。
背景技术
化石能源储备的减少使得该行业寻找替代解决方案，尽可能利用可再生原材料和较少污染的方法。在这些解决方案中，将提及从植物生物质、从源自植物废物或甚至城市废物的生物质生产生物乙醇。为了被接受，化学化合物的绿色版本必须与现有版本一样高效，甚至更高效，并且生产它们的方法必须具有经济竞争力。
有许多应用：源自如甘蔗、甜菜、小麦、玉米或植物油等植物原料的第一代燃料生物柴油或乙醇，源自非食物植物生物质或源自作物残渣的第二代燃料生物柴油、生物煤油、纤维素基乙醇，以及其他重化学或精细化学产品。
原料必须经过预处理。根据其来源，预处理是机械的(刮削、研磨、切碎、制粉、压力)、热的或化学的。将所得的原料榨渣(raw marc)进行提取和/或酶水解。这产生其中加入发酵罐微生物的可发酵底物。最后，发酵产物可用于例如通过蒸馏或通过溶剂萃取来提取目标产物。该方法的各个步骤构成了技术屏障并且已经被广泛研究：预处理生物质以使其可被酶接近，定义用于碳水化合物聚合物的有效水解或者所得的各种糖(戊糖、己糖)的酒精发酵的酶混合物。
发明简述
作为本发明的主题的酵母的酒精繁殖步骤没有大的描述。在这方面，本发明涉及一种繁殖酵母的方法，包括在于以下的步骤：
a)提供反应器；
b)在所述反应器中使以下接触：
-能够代谢戊糖和/或己糖的酵母群，比例为每公斤制备的完全培养基0.2-2.0g酵母干物质；
-优选从植物生物质获得的由有机纤维组成的预处理的原料榨渣，固体含量(SC)为8％-15％，优选10％-12％，甚至更优选10％；
-营养物；
-氮源，例如酵母提取物、尿素、氨水；
-纤维素酶，比例为每克SC 5-15mg酶蛋白，
c)在微好氧条件下于25-38℃，优选28-33℃的温度下孵育所述混合物，
其中所述原料榨渣的糖化和所述酵母的生长同时进行。
附图说明
图1是生产生物乙醇的方法，包括预处理、酵母繁殖和酒精发酵阶段，同时给出了该方法能够产生的各种底物的细节，所述底物可用于酵母繁殖和乙醇生产步骤。
五种底物的糖组成如下：
(1)纤维素(葡萄糖聚合物)和溶解的半纤维素(己糖和戊糖的单体和寡聚物)。固体底物。
(2)水解的纤维素和水解的半纤维素(己糖和戊糖的单体和寡聚物)。含有悬浮固体的液体底物。
(3)纤维素(葡萄糖聚合物)。固体底物。
(4)溶解的半纤维素(己糖和戊糖的单体和寡聚物)。液体底物。
(5)水解的纤维素(葡萄糖)。含有悬浮固体的液体底物。
图2说明了在木质纤维素水解物上繁殖(或SHF，分离的水解和发酵)期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图3说明了在C5酒上繁殖期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图4说明了在10％SC和10mg酶蛋白/g SC，在根据本发明的SSP繁殖(同时糖化和繁殖)期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图5说明了在12％SC和10mg酶蛋白/g SC，在根据本发明的SSP繁殖期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图6说明了在10％SC和7mg酶蛋白/g SC，在根据本发明的SSP繁殖期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图7说明了在32℃下，在根据本发明的SSP繁殖期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图8说明了在30和32℃下，在根据本发明的SSP繁殖期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图9说明了在10％SC和7mg酶蛋白/g SC，在添加或不添加醋酸盐的情况下，在根据本发明的SSP繁殖期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图10说明了在10％SC和10mg酶蛋白/g SC，在添加或不添加醋酸盐的情况下，在根据本发明的SSP繁殖期间，酵母(以细胞/ml表示)、底物(C5和C6糖)和乙醇(以g/kg表示)浓度的变化。
图11比较了在10％SC和7mg酶蛋白/g SC，在添加或不添加醋酸盐的情况下，木质纤维素水解物上的繁殖(SHF)和SSP繁殖期间的酵母(以细胞/ml表示)浓度的变化。
图12比较了在10％SC和7mg酶蛋白/g SC，在添加或不添加醋酸盐的情况下，C5酒上的繁殖和SSP繁殖期间的酵母(以细胞/ml表示)浓度的变化。
图13说明了在用SSP繁殖的I-4783酵母接种的添加有醋酸盐(4g/kg)的小麦秸秆上的SSCF发酵期间，糖(C5和C6)和乙醇(以g/kg表示)的浓度。
根据图1，预处理的植物生物质可以以五种不同的形式用作酵母繁殖和/或酒精发酵中的底物：
-最普遍的解决方案是在纤维素酶存在下对完整榨渣进行水解，以获得液体木质纤维素水解物(2)，其包含己糖(C6)和戊糖(C5)的单体的混合物，以及少量的寡聚物。
-另一种常见的底物是半纤维素水解物，也称为“C5酒”(4)，其对应于预处理出口处的底物的可溶部分。
-预处理出口处的这种半纤维素水解物(4)提取物导致富含纤维素的纤维素基榨渣(3)，其可以通过与完整榨渣相同的方式借助纤维素酶水解。这种情况下，所得的纤维素基水解物主要包含葡萄糖单体(5)。
-固体形式的富含纤维素的纤维素基榨渣(3)也可以不经在先水解而使用。这种情况下，在发酵期间加入纤维素酶，纤维素水解和葡萄糖消耗同时进行。
-最后，最彻底的方法的整合是使用预处理的原料榨渣(1)作为发酵底物而没有中间水解或分离步骤。这种情况下，在发酵期间加入纤维素酶，纤维素的水解与木糖和己糖的消耗同时进行。用于酒精发酵步骤的后一种选择被称为木糖和己糖的同时糖化和共发酵(或SSCF)。
将用于发酵步骤的酵母的繁殖涉及不同问题，尤其是在氧气转移方面。
其通常在C5酒(4)上进行。因此，专利申请US2014/0065700提及在C5酒上进行的繁殖，并且申请WO 2009/155633表明纤维素水解的在先步骤是必需的。
繁殖在科学文献中没有涉及很多，且与水解同时进行的繁殖从未被描述过。所用底物是预处理出口处的可溶部分(或C5酒)，或是通过预先水解所有预处理植物而获得的木质纤维素水解物。繁殖后，酵母用于发酵(与(SSF)或不与糖化一起)，或用于生产目标蛋白(Duarte等,2008；Applied Biochem Biotechnol,148:119-29；Meyer等,1992；BiotechnolBioeng,40(3):353-8；Holder等,1989；Biological Wastes,28(4):239-46；Gonzalez-Valdes&Moo-Young,1981；Biotechnology Letters,3(3):143-8)。Bellissimi&Richards(Bellissimi E,Richards C:Yeast propagation,in The alcohol textbook,areference for the beverage,fuel and industrial alcohol industries,5thedition,edited by Ingledew WM,Kelsall DR,Austin GD,Kluhspies C.Nottingham:University Press；2009:145-159)表明用于生产工业酵母的方法是好氧繁殖，其中不生产乙醇且获得最大量的细胞。这是因为，在长时间内且在严格的厌氧条件下，酵母的生长能力是有限的。
液化或水解之前的预处理原料榨渣的一个缺点是其粘度。为此，认为液化/增溶或水解步骤是必需的。没有文献描述或启示同时的糖化和繁殖过程。
专利申请WO 2011/56991 A1描述了在将用于发酵的富含己糖的液体培养基中平行进行同时糖化和发酵过程，任选与曝气繁殖一起。专利申请WO 2010/014817 A2描述了旨在提高发酵阶段期间发酵微生物(酵母)的质量和/或数量的方法。专利申请WO 2014/72232A1描述了在木质纤维素水解物(用作碳源)中用于好氧繁殖的方法，其中水解物以“分批补料”方式添加，从而在反应器中获得并维持给定的pH。专利申请US 2014/0273167 A1描述了在来自于水解的富含己糖的底物上具有搅拌和曝气的用于繁殖酵母的好氧方法。专利申请US 2014/0273166 A1描述了在来自于植物生物质转化的底物上用于繁殖酵母的方法，所述底物优选富含戊糖。在这种情况下，经过繁殖的酵母是能够代谢戊糖的转化酵母。在C5酒上的繁殖方法需要从预处理榨渣提取液体部分的复杂步骤。在富含C6水解物(或包含C5-C6混合物的水解物)上的繁殖方法也需要特殊的水解步骤。这种步骤昂贵且耗时。因此，仍然需要改进方法，以制造更集成的版本，其在产量、生产力和繁殖率方面保持令人满意的表现水平。
本发明提供同时糖化和繁殖的方法。与现有技术中关于获得能够进行酵母繁殖的底物之前的水解或提取步骤的必要性相反，本申请提供了用预处理原料榨渣作为酵母繁殖底物，而不需要在先水解或分离步骤的方法。该方法结合了纤维素酶对原料榨渣的糖化和使用由酶水解释放的可获得的C5糖和C6糖的酵母生长。
根据本发明的同时糖化和繁殖方法随后将简称为SSP(同时糖化和繁殖)。
根据本发明的繁殖的一个优势是，由于通过消除一个步骤集成方法而减少了时间和成本。
本发明的另一个优势是，由于同时进行的酶促水解而限制了可发酵糖，这使得可以实现高的生物质产量而不需要施加分批补料方案。
本发明的另一个优势是，持续的低葡萄糖水平促进通常在葡萄糖存在下被抑制的木糖消耗。
本发明的另一个优势是，由于仅占SSCF发酵体积3％的接种，最终的高生物质含量(约17.4g/kg)能够限制酵母繁殖单元的大小以及发酵液的稀释。
本发明的另一个优势是，预处理榨渣中存在的抑制剂对生长表现水平的影响显著降低。
最后，本发明的另一个优势是，由酶水解释放的葡萄糖的消耗限制了污染的危险。
发明详述
根据本发明的同时糖化和繁殖方法应用于预处理的生物质。所述生物质是木质纤维素材料，即包含木质纤维素的材料。木质纤维素材料可以包含其他成分，例如纤维素基材料(纤维素、半纤维素)和可发酵或非可发酵糖和果胶。通常，木质纤维素材料来源于植物材料：来自植物的茎、叶、壳、树皮，来自树的叶、树枝或木材。木质纤维素材料也可以来自草本材料、农业残渣、森林残渣、固体城市废物或造纸废水。
根据本发明的一个实施方案，用于该方法的生物质来自芒属、杨树或小麦秸秆。
必须对木质纤维素材料进行预处理，以分解木质素和纤维素的晶体结构。这促进半纤维素和纤维素的溶解，以及它们对于可用于处理生物质的酶的可用性。本领域技术人员已知的任何预处理手段，尤其是浸渍然后预处理手段可以是合适的。示意性地，预处理可以是化学的、机械的或生物的。化学预处理包括用碱性或酸性催化剂(特别是硫酸)或用有机溶剂、二氧化硫或二氧化碳处理。液体培养基中的氧化和在受控pH下的水热分解也被认为是化学处理。
机械预处理对应于任何机械或物理处理，例如研磨、辐射、高压或高温爆炸(汽爆)。根据一些实施方案，化学和机械处理可以组合、顺序进行或同时进行。
根据一个有利的实施方案，原材料的预处理包括以下步骤：
-在比例为按重量计0.1％-2.0％，优选0.5％的酸性或碱性化学催化剂，尤其是酸性催化剂，优选硫酸存在下浸渍。有利地，所述浸渍在约50℃至约80℃，尤其是约60℃-70℃，优选约65℃的温度下进行；
-在约120℃至约250℃，尤其是约170℃至约190℃，优选约180℃的温度，在约5至约15巴，尤其是约8至约10巴，优选约9巴下蒸汽喷射1-10分钟，优选5分钟。
然后，预处理的植物生物质可以用作酵母繁殖和/或酒精发酵的底物，如上述图1所示。
繁殖也称为生物质的增殖、增生或生产。目的是为获得发酵的最佳量的生物质。源自预处理生物质的繁殖培养基可以富含戊糖、富含己糖或戊糖和己糖的混合物。术语“戊糖”是指具有5个碳原子的糖，也称为C5糖或更简单的C5。主要的天然单体代表性戊糖是D-木糖和L-阿拉伯糖。类似地，己糖是具有6个碳原子的糖，也称为C6糖或更简单的C6。单体形式的己糖的主要代表是葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖。
根据本发明的SSP(同时糖化和繁殖)繁殖旨在能够转化一种或多种戊糖和一种或多种己糖两者的酵母。
表述“酵母菌株”是指酵母细胞的同源群体。从克隆分离获得酵母菌株。克隆产生从单个酵母细胞获得的细胞群体。
术语“衍生酵母菌株”是指通过一次或多次杂交和/或通过突变和/或通过遗传转化衍生的酵母菌株。
通过杂交衍生的酵母菌株可以通过或不通过种间杂交获得。通过突变衍生的酵母菌株可以是在其基因组中经历至少一个自发突变或至少一个诱变诱导的突变的酵母菌株。衍生菌株的突变可以影响或不影响表型。术语“诱变”是指突变发生的过程。通常，可能有两种方法，随机诱变和插入或定点诱变。第一种是应用物理处理(例如UV辐射)或用诱变化学试剂处理，这些化学试剂在所研究生物体的基因组中随机诱导突变。第二种将使用分子生物学方法在基因组的任何区域或精确基因座上产生精确的修饰(即启动子、基因、终止子等)。术语“基因座”旨在表示基因在染色体上的精确和不变的物理位置。通过遗传转化衍生的酵母菌株是其中引入了优选由质粒提供或直接整合入基因组中的DNA序列的酵母菌株。
示意性地，可以区分在酵母菌株繁殖期间的四个阶段：“滞后”阶段，期间检测不到生长，并且可以将其比作适应期；随后是“生长期”，期间细胞以最大生长速率繁殖，然后是在最大生长期降低然后停止时发酵生物体进入其中的“固定期”，最后是衰退期，期间活细胞的数量将减少。繁殖通常是曝气过程。好氧或繁殖培养基的曝气确保了比厌氧条件好得多的生物质产量。同样，可以将营养物引入培养基，如氮源、磷源或矿物质。由于其成本，在工业中很少添加维生素和有机化合物如氨基酸或核酸。生长阶段越快和越短，将越避免微生物污染。繁殖的过高污染将导致在随后的发酵步骤中的产量损失。为了限制污染，可以使用抗微生物剂和青霉素或维吉尼亚霉素类型的抗生素，或啤酒花的酸提取物。
根据本发明的通过SSP繁殖必须在微好氧条件下进行。这意味着培养基是曝气的，但提供的氧量是有限的。溶解氧压力为零，这与好氧条件相反。根据本领域技术人员已知的方法使用氧探针测量发酵培养基中溶解的氧。通过适度曝气和搅拌获得根据本发明的方法中的微好氧条件。优选地，曝气为0.1VVM(空气体积/培养基体积/分钟，即对于含有600ml培养基的反应器每分钟60ml)，搅拌设定在500rpm左右。具体而言，搅拌取决于实施该方法的规模；换言之，本领域技术人员根据材料、所述材料的体积以及可接受的能量消耗进行调整。工作体积越高，搅拌越弱。
然后可以将所得生物质用于发酵过程。发酵优选在32℃下进行，中度搅拌，例如90rpm。搅拌是中度的，以免氧化。发酵培养基的pH优选通过例如酸/碱对的缓冲能力来控制。根据本发明的方法中优选的目标pH是5.0。当发酵的目的是生产乙醇时，通过本领域技术人员已知的任何合适的手段来测量存在于发酵培养基中的乙醇的量。可以直接测量生产的乙醇，也可以通过与乙醇生产相关的参数(如质量损失)进行间接测量。例如，可以通过色谱法，特别是通过HPLC(高效液相色谱法)，使用酶试剂盒或通过使用重铬酸钾的分析来测量乙醇生产。存在于培养基中的木糖和/或葡萄糖的量通过本领域技术人员已知的任何合适的方式，优选通过色谱法，特别是通过HPLC来测量。
本领域技术人员知晓如何确定酒精发酵的合适条件。
例如，可以参考在参考书“Yeast Technology”,2nd edition,1991,G.Reed andT.W.Nagodawithana,published by Van Nostrand Reinhold,ISBN 0-442-31892-8中所述的酒精发酵条件。
发酵培养基包含以下元素：至少一种可发酵碳源、至少一种氮源、至少一种硫源、至少一种磷源、至少一种维生素来源和/或至少一种矿物质来源。
碳源例如以能够立即被酵母同化的糖的形式提供，例如木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖或半乳糖、蔗糖型的二糖和/或这些糖的混合物。
这些糖可以以下形式提供：糖浆、糖蜜、EP2(糖的二次结晶的低品级流出物(run-off))、植物材料的全部或部分水解物和/或它们的混合物。
氮源例如以以下形式提供：酵母提取物、硫酸铵、氢氧化铵、磷酸二铵、铵水、尿素和/或其组合。
硫源例如以以下形式提供：硫酸铵、硫酸镁、硫酸和/或其组合。
磷源例如以以下形式提供：磷酸、磷酸钾、磷酸二铵、磷酸一铵，和/或其组合。
维生素来源例如以以下形式提供：玉米浆、糖蜜、酵母水解物、纯维生素或纯维生素混合物的溶液，和/或其组合。维生素来源为酵母提供的所有维生素的量与参考书中建议的量至少相等。可以组合几种维生素来源。
矿物质来源例如以以下形式提供：糖蜜、矿物盐的混合物，和/或其组合。
矿物质来源为酵母提供的所有大量元素和微量元素的量与参考书中建议的量至少相等。可以组合几种矿物质来源。
一种且相同的物质可以提供几种不同的元素。
根据本发明的繁殖的特征在于，糖化和繁殖同时进行。
使用的预处理原料榨渣以固体含量为8％至15％，优选10％至12％，有利地10％的比例使用。根据本发明的一个实施方案，所述榨渣包含约1/3可溶固体(“C5酒”类型)和2/3不溶固体(木质纤维素纤维类型)。
将预处理原料榨渣与能够代谢戊糖和己糖的酵母群接触。优选以干燥形式添加酵母，比例为0.2-2g/kg，即每千克制备的完全培养基0.2-2g酵母干物质。
向预处理原料榨渣和酵母的混合物添加能够进行糖化的纤维素酶和半纤维素酶的组合。糖化是指多糖水解为可溶的单体糖。这意味着如果酵母没有为了繁殖而消耗单糖，随着单糖通过酶的释放，单糖的浓度将会增加。因此细胞能够使纤维素水解从而获得葡萄糖。外切纤维素酶或纤维二糖水解酶在纤维素的末端起作用以形成二糖纤维二糖。内切葡聚糖酶通过切割纤维素的内部键而起作用，形成基于纤维素的寡糖。纤维二糖酶或β-葡糖苷酶通过其还原端水解基于纤维素的寡聚物和纤维二糖，释放葡萄糖。
具体而言，术语“纤维素酶”将酶蛋白混合物归在一起。优选地，酶以每克固体5至15mg蛋白质(酶)的比例使用。有利地，它们以每克固体7至10mg蛋白质(酶)的比例使用，优选每克固体7mg酶蛋白质。为了正确理解和比较具有纤维素酶类型活性的各种组合物之间的活性，可以使用FPU(滤纸单位)活性作为参考。国际组织IUPAC(国际纯化学与应用化学联合会)的生物技术委员会建议采用以下程序：FPU活性在Whatman No.1纸上测定，初始浓度为50g/l。目的是通过比色测定法(用二硝基水杨酸，DNS)测定来自Whatman No.1纸的还原糖的量。举例来说，测定在60分钟内释放2g/l当量的葡萄糖的待分析的酶溶液测试样品。用活性(以IU/ml表示)除以蛋白质浓度获得具体活性；它们以IU/mg表示。
有利地，根据本发明的方法中使用的纤维素酶和半纤维素酶的组合对应于与包含由天然真菌产生的蛋白质的组合物相比具有一种或多种改进活性的酶组合物。这种纤维素酶是本领域技术人员已知的，例如由Durand等，1988(Enzyme Microb.Technol。，10：341346)所述。根据本发明的一个优选实施方案，纤维素酶对应于申请WO2010/029259A1中所述的酶组合物，特别是由丝状真菌，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)生产的酶组合物。
然后在微好氧条件下，于25-38℃，优选28-33℃，优选30-32℃的温度下孵育混合物。
有利地，溶液pH为约5.0。
孵育维持24-50小时，尤其是28-50小时，更优选30-42小时。
有利地，靶细胞浓度(繁殖结束时)为每毫升5.0×108-1.0×109个细胞。
根据本发明一个具体的实施方案，能够代谢戊糖和己糖两者的转化酵母根据专利申请WO 2010/000464 A1、WO 2011/128552 A1和WO 2012/072793 A1所述的方法获得。有利地，根据申请WO2013/178915A1所述的方法获得的所述菌株还耐醋酸。
根据本发明的一个实施方案，所用酵母菌株优选代谢木糖和葡萄糖。换言之，根据一个具体的实施方案，本发明涉及用发酵微生物来发酵源自木质纤维素生物质的糖，优选戊糖和/或己糖的方法，其特征在于，所述微生物根据同时糖化和繁殖方法直接在预处理原料榨渣上产生。
根据本发明一个优选的实施方案，根据本发明进行同时糖化和繁殖的酵母菌株是以保藏号I-4624、I 4625、I-4626和I-4627于2012年5月24日或以保藏号I-4783于2013年6月26日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心,Institut Pasteur,25 rue duDocteur Roux,75724 Paris Cedex 15)的菌株之一。
根据本发明一个优选的实施方案，通过SSP的繁殖在发酵步骤之前。
本发明的另一个主题是用于产生至少一种发酵产物的方法，包括在好氧或半好氧条件下的发酵步骤，所述发酵步骤是通过在预处理原料榨渣上根据其中同时进行糖化和繁殖的方法繁殖的酵母进行。
发酵产物尤其选自乙醇、从乙醇获得的代谢物或次级代谢物。
根据本发明的优选发酵产物是乙醇。
基于以下实施例将更好的理解本发明，所述实施例不以任何方式限制。
具体实施方式
实施例1.预处理条件和底物组成的分析
在这些试验中所用的底物是使用根据以下方法的预处理获得的小麦秸秆原料榨渣：将研磨的秸秆浸渍于按重量计含有0.1-2.0％H2SO4的酸性水中，然后通过在约50％固体上于170-190℃，优选180℃持续汽爆1-10分钟进行预处理。
通过高效液相色谱(HPLC)分析秸秆原料榨渣，表1示出了糖和抑制剂的含量。
表1：用于本研究的秸秆榨渣的组成
浓度以g/kg表示
NQ表示未定量，即未测量。
底物分析显示常规的醋酸和糠醛含量。秸秆原料榨渣的固体含量等于46.0％。在随后进行的大多数繁殖试验中，在反应器中的加工期间所述榨渣以10％固体使用，这对应于以上给出浓度的4.6倍稀释，而表中示出的其他两种底物，即水解物和C5酒使用时不经额外的稀释。
以下实验用以保藏号I-4783于2013年6月26日保藏于CNCM(法国国家微生物培养物保藏中心,Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行。所用方法如下所述。相比之下，能够代谢戊糖和己糖另一个酵母菌株会得到相似的结果。
参考方法使用液体底物，即木质纤维素水解物，其在繁殖前需要水解预处理榨渣的步骤；或C5酒(也称为半纤维素水解物)，其在预处理出口处需要从榨渣分离可溶糖的步骤。
相反，根据本发明的同时糖化和繁殖(SSP)方案使用预处理原料榨渣的固体底物。
实施例2.参照方法
2.1方案
根据调整至在这些试验中所用的以保藏号I-4783保藏于CNCM的酵母的量，向C5酒和木质纤维素水解物分别添加抗细菌剂和营养物，即：
25％NH4OH
尿素
85％H3PO4
矿物质混合物
抗细菌剂。
矿物质混合物的组成如表2所示。本领域技术人员知道如何调节比例以获得最佳效率。
表2：矿物质混合物的组成
以0.4g/kg干酵母的比例接种反应器，并将其维持在30℃的温度。
通过添加KOH和H2SO4，将pH维持在5.0。
对于微好氧条件，将空气流速设定为0.1VVM(空气体积/培养基体积/分钟)，并将搅拌设定为500rpm。
作为说明，对于含有600ml培养基的反应器，0.1VVM的空气流速为60ml/min。
2.2结果
2.2.1在木质纤维素水解物上的繁殖(SHF)
在木质纤维素水解物上，在微好氧条件(0.1VVM)下，酵母繁殖期间的酵母生长、底物消耗和乙醇生产的动力学如图2所示。
该繁殖试验持续46.1h，但图2表明，酵母生长在培养约27h后结束。估计产生的生物质的最终含量为3.9x108个细胞/ml。葡萄糖的消耗优于木糖，这在葡萄糖过量的情况下是常规的。产生的乙醇为18g/kg。
观察结果：为方便阅读，图中没有示出繁殖期间酵母的活力。一旦培养过去最初几个小时，这些例子中所有的试验都大于95％。
2.2.2在C5酒上的繁殖。
在C5酒上，在微好氧条件(0.1VVM)下，酵母繁殖期间的酵母生长、底物消耗和乙醇生产的动力学如图3所示。
在C5酒上的该繁殖试验显示较长的滞后阶段(与木质纤维素水解物上的试验相比)，然后生物质迅速增加，在培养41h后达到7.5x108个细胞/ml。产生的乙醇为10g/kg。
已经观察到生物质最终含量的差异。总而言之，C5酒上的繁殖期间的酵母产量高于木质纤维素水解物上的繁殖，且主要由C6糖(葡萄糖)组成。
实施例3：同时糖化和繁殖(SSP)
3.1根据本发明的SSP方法
还在包含以下的反应器中进行同时糖化和繁殖的方法：水、在大多数试验中分别以10％或12％的固体(SC)比例使用的纤维素基预处理原料榨渣(固体底物)，以及如以上参照方法所述的营养物。
通过同时添加纤维素酶(比例分别为每克SC 7和10mg蛋白质)和干酵母(比例为0.4g/kg)开始繁殖。
本实施例中所用的酶可以用等量的商品酶替代。为了比较，实施例中所用的纤维素酶特异性的FPase活性(参见以上，参考滤纸单位)为0.8-1.5IU/mg。它们可以用相同含量(以IU/mg表示)的商品酶替代。
分别将温度维持在30℃或32℃。
通过添加KOH和H2SO4将pH维持在5.0。
对于微好氧条件，将空气流速设定为0.1VVM(空气体积/培养基体积/分钟)，并将搅拌设定为500rpm。
在各种繁殖试验期间取样，以计数酵母并通过高效液相色谱(HPLC)定量糖和发酵产物。
对最终样品进行总的酶水解以测定繁殖结束时未水解的纤维素的含量。
3.2固体含量(SC)-酶剂量对
在SSP中测试各种SC-酶剂量对。前提是：(i)可发酵糖浓度必须能够在繁殖结束时获得约15g/kg的生物质含量；(ii)纤维素水解动力学必须限制葡萄糖的量，使得(1)将碳流导向生物质生产而不是导向乙醇生产，这甚至在氧气存在下也可能发生(如果糖浓度太高)，和(2)偏向使用木糖而不损失生产力；和(iii)混合物粘度必须允许培养基的中度搅拌和微好氧条件。
测试的固体含量(SC)和酶剂量如表3所示。
表3：SSP中测试的固体含量(SC)和酶剂量
提醒：对于参照方法(以上)，这些繁殖试验用0.4g/kg干酵母接种，并在pH5.0、30℃、500rpm的中度搅拌和0.1VVM的微好氧条件下进行。
3.2.1以10％SC和10mg酶蛋白/g SC在SSP中的繁殖
在纤维素酶(10mg蛋白/g SC)存在下，在秸秆原料榨渣(10％SC)上，在微好氧条件下(0.1VVM)繁殖I-4783酵母，这能够同时进行纤维素水解。酵母繁殖期间的酵母生长和乙醇生产的动力学，以及葡萄糖和木糖浓度的变化如图4所示。
结果：该繁殖试验持续41h，结束时获得5.6x108个细胞/ml。产生11g/kg的乙醇，然后在秸秆原料榨渣上的这种SSP繁殖期间部分被消耗。此外，所用的固体含量(SC)能够将所有底物加入初始容器，同时维持培养基允许中度搅拌和微好氧条件的低粘度。
重复实验，生长超过41小时。结果(未显示)如下：培养48h后获得6.5×108个细胞/ml，生长动力学与先前在相同操作条件下获得的那些重叠。
3.2.2以12％SC和10mg酶蛋白/g SC在SSP中的繁殖
在纤维素酶(10mg蛋白/g SC)存在下，在秸秆原料榨渣(12％SC)上，在微好氧条件下(0.1VVM)繁殖I-4783酵母，这能够同时进行纤维素水解。酵母繁殖期间的酵母生长和乙醇生产的动力学，以及葡萄糖和木糖浓度的变化如图5所示。
结果：该繁殖试验持续46.3h，结束时获得5.8x108个细胞/ml。产生15g/kg的乙醇，然后在秸秆原料榨渣上的这种SSP繁殖期间部分被消耗。
固体含量(SC)从10％增加至12％没有引起粘度的任何显著增加，使其能够干扰培养基的中度搅拌和微好氧条件。
3.2.3以10％SC和7mg酶蛋白/g SC在SSP中的繁殖
在纤维素酶(7mg蛋白/g SC)存在下，在秸秆原料榨渣(10％SC)上，在微好氧条件下(0.1VVM)繁殖I-4783酵母，这能够同时进行纤维素水解。酵母繁殖期间的酵母生长和乙醇生产的动力学，以及葡萄糖和木糖浓度的变化如图6所示。
结果：该繁殖试验持续43.9h，结束时获得8.3x108个细胞/ml。产生9.3g/kg的乙醇，然后在秸秆原料榨渣上的这种SSP繁殖期间完全被消耗。
讨论：
比较在各种SC和酶剂量下进行的SSP试验所得的表现水平，表明：
-对于用10mg蛋白/kg SC进行的试验，SC从10％增加至12％导致乙醇生产增加，但对于酵母生长没有积极影响。
-对于在10％SC进行的试验，酶剂量从10mg酶蛋白/g SC降低至7mg酶蛋白/g SC导致更大的葡萄糖限制，这导致更快的木糖消耗，碳流更加被导向生物质生产。由酶剂量降低引起的水解产量的差异在繁殖结束时低于2％。
3.3温度的影响
为了观察温度对SSP繁殖效率的影响，在纤维素酶(比例为10mg蛋白/g SC)存在下，在秸秆原料榨渣(比例为10％SC)上，在微好氧条件下(0.1VVM)于32℃繁殖I-4783酵母。该繁殖试验期间的酵母生长和乙醇生产的动力学，以及葡萄糖和木糖浓度的变化如图7所示。
结果：该繁殖试验持续42.6h。培养结束时观察到生长变慢。产生12g/kg的乙醇，然后部分被消耗。估计最终的生物质为5.7x108个细胞/ml。
图8比较了在10％SC和10mg蛋白/g SC上分别于30℃和32℃进行的SSP试验中酵母群的变化以及木糖和乙醇浓度的变化。
没有观察到对酵母生长的积极影响。
似乎温度升高可以促进木糖摄取，这导致更快的乙醇生产动力学。
温度升高提高酶水解，并增加可发酵糖的量(这种情况下增加12％)。如果完全转移繁殖液以接种酒精发酵，无论其什么形式，还原糖占小比例，且将在酒精发酵中被使用。
3.4方法稳健性试验：在高浓度醋酸盐存在下的SSP试验
为评估SSP方法的稳健性，向培养基加入醋酸盐(QS(足够的量)为3g/kg)进行试验，以模拟预处理榨渣的较高毒性。这些试验在以下条件下进行：pH5.0、30℃、10％SC，和酶/底物比例等于7mg蛋白/g SC和10mg蛋白/g SC。培养基中醋酸盐含量从0.7g/kg增加至3g/kg对应于预处理榨渣中醋酸含量从3.6g/kg增加至13.8g/kg。
当转为工业规模时，后者的浓度为预处理底物的挥发性化合物含量的增加留下了相当大的余量。
在10％SC和7mg蛋白/g SC下，添加和不添加醋酸盐进行的繁殖试验期间，酵母生长动力学，以及木糖和乙醇浓度的变化如图9所示。
比较分别在0.7g/kg或3.0g/kg醋酸存在下进行的SSP动力学发现，醋酸盐浓度增加减缓木糖的利用，并造成长达25h的培养物生长的明显延迟。碳流略微转向乙醇生产。然而，生物质浓度的差异在培养结束时消失：在3.0g/kg醋酸盐的试验中，在42.5h获得8.0x108个细胞/ml，而在0.7g/kg醋酸盐的试验中，在43.9h获得8.3x108个细胞/ml。
在10％SC和10mg蛋白/g SC下，添加和不添加醋酸盐进行的繁殖试验期间，酵母生长动力学，以及木糖和乙醇浓度的变化如图10所示。
比较分别在0.7g/kg或3.0g/kg醋酸存在下进行的SSP动力学发现，醋酸盐浓度增加造成长达30h的培养物生长的明显延迟，且碳流略微转向乙醇生产。在繁殖结束时，在3g/kg醋酸盐存在下产生的生物质含量超过参考：与不添加醋酸盐的试验在48.1h获得6.5x108个细胞/ml相比，在46.7h获得6.9x108个细胞/ml。
这些结果表明，预处理秸秆榨渣中醋酸量的大幅增加没有显著降低SSP繁殖方法的表现水平。这种稳健性对于在C5酒上的酵母繁殖方法而言不可预期，因为培养基毒性对木糖发酵的影响比对葡萄糖发酵的影响大得多。
本文再次测试了两个酶/底物比例。结果与之前所得结果(以上)一致，即，酶剂量减少改进SSP方法的表现水平。
实施例4：比较根据本发明的SSP和参考方法获得的生长表现水平
在相同的温度、pH、微好氧条件、中度搅拌和接种水平条件下，将酵母群的变化与参考方法所获得的进行比较。可发酵糖的量在同一数量级。
4.1与木质纤维素水解物(SHF)上的繁殖比较
在10％SC和7mg蛋白/g SC下，在添加和不添加醋酸盐的情况下，在木质纤维素水解物上的繁殖和SSP试验期间的酵母群变化如图11所示。
结果和讨论
不添加醋酸盐的木质纤维素水解物上的繁殖试验和SSP繁殖试验的各自底物相同，除了一个区别：一个提前水解。从繁殖开始，在水解物上的生长就较慢，这可以由培养开始时底物水解更广泛引起的稍高的醋酸盐含量来解释(1.0g/kg，与SSP的0.7g/kg相比)；由糖引起的渗透压也较高。除了动力学更好，SSP繁殖能够获得的生物质的量多得多(8.3x108个细胞/ml，与3.9x108个细胞/ml相比)。
此外，令人惊讶地注意到，在3g/kg醋酸盐存在下进行的SSP繁殖试验也比参考试验好。
4.2与C5酒上的繁殖比较
在10％SC和7mg蛋白/g SC下，在添加和不添加醋酸盐的情况下，在C5酒上的繁殖和SSP试验期间的酵母群变化如图12所示。
结果和讨论
在C5酒上进行的繁殖的生长动力学显著慢于在原料榨渣上的SSP繁殖试验；然而，繁殖结束时生长速率的增加使其获得与SSP繁殖相等的最终生物质含量。然而，如果与所示试验相比减少繁殖时间，SSP繁殖相对于C5酒上的繁殖的优势将增加。
在该繁殖试验中所用的C5酒来源于与SSP繁殖试验所用的相同的纤维素小麦秸秆榨渣。其通过以下方法获得：将纤维素基榨渣悬浮于水中，然后进行固体/液体分离。这种获得C5酒的方法实际上是从预处理榨渣中提取所有的可溶性成分，因此可以考虑并且证实抑制剂含量与木糖浓度成正比，这使得在抑制剂方面C5酒成为最浓缩的底物。
此外，以下事实意味着SSP方法的优势将随着预处理榨渣的毒性而增加：培养基毒性对木糖摄取的影响大于对葡萄糖消耗的影响；以及预处理榨渣的毒性增加导致C5酒中抑制剂含量的较快增加(因为它与木糖含量成正比)。因此，SSP容器中的醋酸盐含量从0.7g/kg增加至3g/kg(其略微降低SSP的生长动力学)对应于C5酒中醋酸盐含量从1.6g/kg增加至约7g/kg(其极大地损害酵母的生长)。
4.3合成并比较繁殖表现水平
对于进行的每个繁殖试验，表4提供：
-培养基中所用的糖浓度(对于SSP进行的试验，总量和可发酵量)，
-所得生物质的最终浓度(以细胞/ml)表示，
-生物质产量(与可发酵糖的含量关联，并与SC含量关联)，
-估计的酵母产量，以g酵母/g可发酵糖表示。
表4：各个繁殖试验中所用糖的量、所得生物质浓度和生物质产量。
观察：
-基于纤维素水解产量等于100％这一假设计算糖的潜力。
-通过估计在培养结束时采集的样品上总酶水解残留纤维素的量来计算可发酵糖的量。
-为估计生物质产量(以g酵母/g可发酵糖表示)，考虑1g酵母包含1.8x1010个细胞进行转化(在C5酒上的繁殖结束时测量)。
-对于在10％SC和10mg蛋白下于30℃进行的繁殖试验，测量的最终量异常低，这在计算产量时受到损害。
结果和讨论
表4表明，在10％SC和7mg蛋白/g SC进行的SSP方法获得最高的生物质终浓度。在最佳条件下，C5酒上获得的最终生物质含量与SSP方法获得的接近，而木质纤维素水解物上的繁殖获得的最终生物质含量显著低于所有其他试验。
对于在10％SC和7mg蛋白/g SC下于30℃进行的最有效的SSP试验，酵母产量计算等于含1.6x1010个细胞/g可发酵糖(对于用增加的醋酸浓度进行的试验，为1.5x1010个细胞/g可发酵糖)。C5酒上的繁殖产量略低：获得1.4x1010个细胞/g可发酵糖。测试的其他SSP条件显示酵母产量接近于1.0x1010个细胞/g可发酵糖，而在木质纤维素水解物上进行的参考试验显示产量为5.9x109个细胞/g可发酵糖，即比最有效的SSP试验少约3倍。
为了与已知的参考比较，考虑以下转化来估计生物质产量(以g酵母/g可发酵糖表示)：细胞数量/g C5酒上的酒精繁殖结束时获得的SC。根据本领域技术人员已知的数据，木质纤维素水解物上的参考繁殖的产量为约0.12g/g。
最佳SSP条件能够获得0.33g酵母/g可发酵糖。因此，繁殖中酵母的增殖率大于40(估计的最终浓度为17.4g/kg酵母)。
在生产力方面，SSP繁殖方法也是最有效的，实际上：
-与C5酒和木质纤维素水解物上的繁殖分别为0.37g/kg/h和0.17g/kg/h相比，SSP方法的平均体积生产力估计为0.38g酵母/kg发酵液/h。
-与C5酒和木质纤维素水解物上的繁殖为0.26g/kg/h相比，SSP方法在培养的最初30个小时内的平均体积生产力估计为0.33g酵母/kg发酵液/h。
实施例5：验证SSP繁殖方法：SSCF发酵中繁殖的酵母的表现水平
本发明是酒精发酵整个工业过程中必不可少的中间环节。本实施例的目的是验证在根据本发明的繁殖结束时获得的酵母在木质纤维素底物上的酒精发酵中有效。
将SSP繁殖的I-4783酵母用于接种SSCF(同时糖化和共发酵)发酵；在秸秆原料榨渣上进行两种培养。在24％SC和10mg蛋白/g SC下进行SSCF，向培养基添加醋酸盐(QS 4g/kg)。用2.4x107个细胞/ml(即约0.5g/kg酵母)接种反应器，将培养基维持在pH 5.5、33℃下142.5小时。该发酵期间葡萄糖、木糖和乙醇浓度的变化如图13所示。
该SSCF发酵显示与通常获得的一致的动力学。酵母非常快速地消耗由酶释放的葡萄糖，使得葡萄糖浓度在发酵的最初几个小时内为零。在72小时内主要消耗释放的木糖；乙醇生产动力学则受到酶水解的限制。最终的乙醇含量等于67.4g/kg，这与不添加醋酸盐进行的SSCF(其中I-4783酵母在C5酒上繁殖)结束时获得的浓度的差异小于5％。这一结果能够得出结论：与通常使用的C5酒上的繁殖方法相比，根据本发明的繁殖方法不会降低所产生的酵母的表现水平。

Claims (11)

1.一种用于繁殖酵母的方法，所述酵母用于从木质纤维素生物质生产发酵产物，所述方法包括在于以下的步骤：
a.提供反应器；
b.在所述反应器中使以下接触：
-能够代谢戊糖和己糖的酵母群，比例为每公斤制备的完全培养基0.2-2.0g酵母干物质；
-源自木质纤维素生物质预处理的原料榨渣，固体含量(SC)为8％-15％；
-营养物；和
-纤维素酶，比例为每克SC 5-15mg蛋白，
c.在微好氧条件下于25-38℃，优选28-33℃的温度下孵育所述混合物，
其中所述原料榨渣的糖化和所述酵母的生长同时进行。
2.权利要求1所述的繁殖方法，其中所述戊糖是木糖和/或阿拉伯糖。
3.权利要求1或2所述的繁殖方法，其中所述己糖是葡萄糖。
4.权利要求1-3任一项所述的繁殖方法，其中所述酵母菌株是能够消耗戊糖且耐发酵抑制剂，尤其是醋酸的转化或非转化菌株。
5.权利要求1-4任一项所述的繁殖方法，其中维持所述步骤c中的孵育直到获得的细胞浓度为5.0x108-1.0x109个细胞/ml。
6.权利要求1-5任一项所述的繁殖方法，其中所述酵母菌株选自以以下保藏号保藏于CNCM的菌株：I-4624、I-4625、I-4626、I-4627和I-4783。
7.权利要求1所述的繁殖方法，其中以0.3-0.6g/kg的比例，以干酵母的形式接种所述酵母，所用的原料榨渣的比例为10％SC，所述纤维素酶的比例为7mg蛋白/g SC，曝气率设置为01VVM，温度设置为30℃，且培养基的pH设置为pH5.0。
8.一种用于从木质纤维素生物质生产发酵产物的方法，依次包括以下步骤：
a.预处理所述木质纤维素生物质从而获得原料榨渣，
b.使一部分固体(SC)比例为10％-12％的预处理的原料榨渣与以下接触：(i)能够代谢戊糖和己糖的酵母群，(ii)比例为每克SC5-15mg蛋白的纤维素酶，(iii)任选的营养物，
c.在微好氧条件下，于25-38℃，优选28-33℃的温度下孵育所述混合物，以获得同时糖化和繁殖，直到获得的细胞浓度为5.0x108-1.0x109个细胞/ml，
d.转移全部或部分繁殖的酵母以便与包含戊糖源和己糖源的发酵液接触，
e.在厌氧或半好氧条件下进行发酵，
f.获得所述发酵产品。
9.权利要求8所述的方法，其中所述木质纤维素生物质是植物来源的生物质。
10.权利要求8或9所述的方法，其中获得的所述发酵产物是乙醇。
11.权利要求8-10任一项所述的方法，其中所用的酵母群源自以保藏号I-4783保藏于CNCM的菌株。
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