CN101912611B

CN101912611B - 具有抗肿瘤作用的药物组合物

Info

Publication number: CN101912611B
Application number: CN 201010274385
Authority: CN
Inventors: 绪广林; 吴昊; 杜逸芳; 蔡婕; 敖桂珍; 孙婷
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2010-09-06
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2030-09-06
Also published as: CN101912611A

Abstract

本发明涉及一种联合用药物，特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的联合用药物。该联合用药物它包含具有抗肿瘤作用的榄香烯类物质和非固醇类具有抗炎作用的物质以及一种或多种可药用载体。这样的协同组合，使组合后的药物具有更好的抗肿瘤活性。

Description

具有抗肿瘤作用的药物组合物

技术领域

本发明涉及榄香烯类物质和非固醇类具有抗炎作用的物质的组合物或复合产品，以及它们在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

　癌症是严重威胁人类生命的常见病和多发病,目前，全世界每年新发生的癌症患者大约1000万，死于癌症的人数近600万，在我国每年新发病患者大约180万，死亡130万，而且发病率逐年上升。我国癌症死亡占各类疾病死因的第2位，在城市已占据首位。癌症不仅给患者造成生理上的巨大伤害，同时在心理上、精神上也给患者带来严重创伤，给无数人的生活带来了磨难，无情地夺去了无数人的生命，破坏了无数人的美满幸福生活，造成了家庭和社会的沉重负担。但癌症的治疗一直是一个世界性的难题，多年来世界各国都在寻找和探索各种有效手段来预防或治疗癌症。

目前，临床上使用的抗肿瘤药物大多对肿瘤细胞抑制的选择性不强，全身用药毒性较大，且多具有免疫抑制作用。因此，研究开发高效低毒新颖的抗肿瘤药物仍是一项极为紧迫而重要的全球性课题。近年来，大量的临床和实验研究证明，中医药和联合药物疗法在肿瘤的防治和康复方面有特效，已渐成为人们关注的焦点。

榄香烯是存在于“活血化淤”中药温郁金( Curcuma Wenyujin Y. H. Chen et C. Ling,又名温莪术)的一种挥发油成分（郭永等,中药通报, 1983,8(3):31-33）。近几年, 国内外对榄香烯的抗癌作用及其特点、机制进行了一定的研究,结果发现,其对恶性胸/腹水、颅内肿瘤、肺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌有显著疗效，也可用于治疗或辅助治疗喉癌、白血病、黑色素瘤、恶性淋巴瘤、食管癌等疾病（郭智涛，中国肿瘤临床,2005 ,32 (2):109；叶元芬，宁波大学学报:理工版，2001,14 (2) :38.）。它不仅在临床上对多种肿瘤有确切疗效, 而且能改变或增强免疫原性,产生免疫保护作用。同时还可逆转肿瘤细胞的多药耐药性,特别适用于已对其他化疗药物产生耐受性的肿瘤的治疗（钱军. 中国肿瘤临床, 1996, 23 (6) : 453 – 455；陈剑群等，中国肿瘤临床,1996,23(4):299-301；王宝成等，中国肿瘤临床,1996,23(2):143-146.）。榄香烯的结构为只含有碳、氢两种元素的倍半萜,水溶性差,其到达作用部位浓度低,稳定性较差,血管刺激作用较大, 而且榄香烯抗癌作用比5-FU、顺铂等弱, 对某些实体瘤疗效不明显。所以目前榄香烯仍作为二线抗癌药物。

目前，已从温莪术挥发油中鉴定出桉叶素( Eucalyptol)、榄香烯( Elemene)、莪术烯(Curzerene)、β-榄烯酮(β- Elemenone)、吉马酮(Germacrone)、莪术二酮(Curdione)、新莪术二酮(Neocurdione)等主要成分，其中榄香烯是温莪术发挥药理作用的主要成分．而β-榄香烯是其中最重要的活性成分（万明珠等，时珍国医国药，2009，20（10）：2428-2430）。

非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是一类具有解热、镇痛、抗炎作用的药物，广泛应用于临床，其通过阻断前列腺素(prostaglandins，PGs)的合成，从而实现抗炎、止痛、解热的作用(司文秀等，中国药房，2007，18：19.)。近年研究均表明NSAIDs能够通过诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤的侵袭和转移而发挥抗肿瘤的作用。

虽然NSAIDs在预防肿瘤的发生、抑制肿瘤的生长、转移及在动物实验中取得了较好的肯定效果，但至今其临床应用仍然受限，主要是由于许多问题尚待解决，例如：用药时间较长，用药剂量偏大或难以确定，抗瘤谱较窄（主要对结直肠癌效果较好），胃肠道及心血管方面的副作用等（钟鹰等，现代医药卫生，2009， 25（23）: 3584-3586）。

近年来，具有抗炎作用的天然物质引起了人们的广泛关注，该类物质共同的结构特征主要是含有多羟基苯或多个苯酚的结构，这些物质如白藜芦醇、水飞蓟素(Silymarin)、茶多酚、丹皮酚、金雀异黄素(Genistein)、槲皮素（Quercetin）、guggulsterone、乳香酸、睡茄交酯(withanolides)等，近年的研究表明，这些物质都具有一定的抗肿瘤作用(Khanna D等，Curr Opin Pharmacol，2007，7(3): 344- 51. )。例如：白藜芦醇对肿瘤的起始、促进和发展3个阶段均有抑制作用；丹皮酚能抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡；水飞蓟素可作用于癌变过程中的不同阶段，如抑制癌细胞增殖，调节细胞周期，诱导细胞凋亡，抑制新生血管形成，抑制癌细胞侵入和转移以及抗炎作用等，以发挥抗肿瘤作用。但其也存在如非甾体抗炎药类似的问题，以致很难在临床一线上作为抗肿瘤药品使用。

由于以上存在的问题使这些物质无法获得令人满意的治疗效果，因此，需要提高上述物质的对肿瘤细胞生长抑制活性的效果，扩大其抗肿瘤的范围（抗瘤谱），以及/或提供一种方法以降低化学治疗剂的剂量从而减少用药时间及/或减少对患者潜在或有害的副作用。尽管有这种需要，但在治疗癌症的过程中增效并不常被发现。本发明的药物组合物、治疗复合产品以及用途和方法满足了这一需要。

发明内容

本发明就是为了解决上述存在的问题，而提供一种具有抗肿瘤活性的药物组合物，一方面是增强榄香烯类物质和非固醇类具有抗炎作用的物质的抗肿瘤作用，另一方面是扩大其抗肿瘤的范围（抗瘤谱），以及/或降低化学治疗剂的剂量从而减少用药时间及/或减少对患者潜在或有害的副作用。

为了达到上述目的本发明是这样实现的：

一种联合用药物，它包含具有抗肿瘤作用的榄香烯类物质和非固醇类具有抗炎作用的物质以及一种或多种可药用载体。

所说的联合用药物，它是包含具有抗肿瘤作用的榄香烯类物质和非固醇类具有抗炎作用的物质以及一种或多种可药用载体的药物组合物或药物复合物。

本发明一方面提供了一种具有抗肿瘤活性的药物组合物的组合方法，所述方法包括给需要这种治疗的哺乳动物，包括人同时或顺序（可先用榄香烯类物质，再用非固醇类具有抗炎作用的物质；也可先用非固醇类具有抗炎作用的物质，再用榄香烯类物质）的施用有效量的榄香烯类物质和有效量的非固醇类具有抗炎作用的物质。

另一方面，本发明提供了一种榄香烯类物质用于制备与非固醇类具有抗炎作用的物质同时或顺序给药以治疗癌症的药物的应用。

另一方面，本发明提供了一种非固醇类具有抗炎作用的物质用于制备与榄香烯类物质同时或顺序给药以治疗癌症的药物的应用。

另一方面，本发明提供了一种榄香烯类物质用于制备与非固醇类具有抗炎作用的物质的组合。

本发明所说的组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体是指药学领域中常用的除活性成分以外添加物，例如稀释剂（淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐类）、赋形剂等，填充剂如淀粉蔗糖、粘合剂如水、乙醇、纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮，崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠，增溶剂如聚山梨酯类和聚氧乙烯脂肪酸酯类等，吸收促进剂、表面活性剂如吐温、司盘，吸附载体、润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等。另外，还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包合物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、熔胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等，用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、脂质体、微囊、微球、毫微粒等，也可将其制成各种缓释、控释制剂。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射剂，特别优先特定部位靶向释放的制剂。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的肿瘤种类和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01-1000 mg/kg 体重，优选0.1-100mg/kg体重。可以一次或多次施用。

榄香烯类物质选自β-榄香烯、γ-榄香烯、δ-榄香烯、β-榄香醛、β-榄香醇、β-氟化榄香烯及其类似物，优选的榄香烯类为β-榄香烯。

优选的非固醇类具有抗炎作用的药物选自含多酚结构（含二至多个酚羟基）类物质如白藜芦醇、水飞蓟素(Silymarin)、茶多酚、丹皮酚、金雀异黄素(Genistein)、槲皮素（Quercetin）、没药甾酮（guggulsterone）、乳香酸、睡茄交酯(withanolides)或昔布类非甾体抗炎药如塞来昔布、帕瑞昔布、罗非昔布、依托考昔、伐地昔布、鲁米昔布等。

本发明的优点和效果如下：

通过大量实验，我们发现，顺序或同时地组合榄香烯类物质与非固醇类具有抗炎作用的物质，实现了榄香烯类物质抗肿瘤活性的增强，反之亦然。下面通过实施例及实验数据进一步对本发明进行详细说明。

[0025]榄香烯类物质与非固醇类具有抗炎作用的物质可以同时或顺序给药。

优选的榄香烯类物质与非固醇类具有抗炎作用的物质以增效比率存在。

其中，增效比率用于表示榄香烯类物质与非固醇类具有抗炎作用的物质进行组合时，组合物的抗肿瘤活性大于单独的榄香烯类物质或单独的非固醇类具有抗炎作用的物质的抗肿瘤活性。因此，如果各组分以增效比率存在，则它们的组合发生协同作用。

可以成功地抑制肿瘤的榄香烯类物质和非固醇类具有抗炎作用的物质的增效比率范围为100:1-1:1000(摩尔比)的榄香烯类物质：非固醇类具有抗炎作用的物质，适宜的增效比率范围为50:1-1:20 (摩尔比)，优选的比例范围为10:1-1:20 (摩尔比)。

作为抗肿瘤药所需的榄香烯类物质和非固醇类具有抗炎作用的物质的药物的组合数量，最终由临床医生根据病情实际情况决定其变化。榄香烯类物质可以从市场上得到或根据公开文献或资料通过常规方法进行制备。非固醇类具有抗炎作用的物质是已知的天然或合成的化合物或药物，也可从市场上得到或根据公开文献或资料通过常规方法进行制备。

本发明包含了上述的适宜和优选的所有组合。

下面将通过以下实施例说明本发明，而不是用于对其进行限定。

由于榄香烯类物质的脂溶性较强,通常是非肠道给予榄香烯类物质,例如静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、腔内或胸膜内。优选的模式是注射水溶液或悬浮液，优选静脉内给药，可将榄香烯类物质与非固醇类具有抗炎作用的物质分开非肠道（如上）或口服给药。如榄香烯类物质经过结构改造后的衍生物其水溶性得到改善后，可将其制成口服制剂。

当口服给药非固醇类具有抗炎作用的物质时，可将其制备成药物制剂领域中任何常规形式，口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。它们可含有赋形剂如柠檬酸钠或载体，其它选择性添加剂包括药物制剂领域中熟知的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收加速剂、湿润剂、吸收剂、润滑剂或缓冲剂。

也可有不同的联合给药方案，例如 1：一次给予本发明组合物； 2：先给予榄香烯类物质，然后在24小时内给予非固醇类具有抗炎作用的物质，或者3：先给予榄香烯类物质，然后1小时后给予非固醇类具有抗炎作用的物质，接着同时给予上述两种物质，给予后者后1小时，给予前者。

实验表明，本发明的化合物及药物组合物有明显抗肿瘤和抑制肿瘤生长的作用。例如对人结肠癌HT-29细胞、人肝癌Hep G₂细胞和人乳腺癌MCF-7细胞有明显的抑制作用，并能诱导上述细胞的凋亡。

附图说明

图1 联合用药对肿瘤细胞形态学的影响（A：联合用药 B：对照 C：榄香烯D: 塞来昔布）。

具体实施方式

实施例1：榄香烯和塞来昔布的组合对人Hep G₂细胞的抑制作用

材料：

细胞株人肝癌细胞株 Hep G₂（购自上海细胞库）

药物溶液配制：榄香烯临用前用DMSO溶解，然后加入培养细胞中，配成所需的药物终浓度。塞莱昔布用DMSO溶解配制成各种浓度的母液，置于冰箱冷藏保存。实验时，加入到培养细胞中，配成所需的药物终浓度。

细胞培养：人肝癌细胞株Hep G₂接种于无菌培养瓶中，加入适量DMEM培养液，于37℃ 5% CO₂ 及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，每2-3天传代一次。传代时用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培养细胞2-4min，用吸管吸取培养液吹打使细胞制成细胞悬液，然后按需要的浓度接种。

方法：将榄香烯和塞来昔布以单药和联合用药的形式分为：20 mg/ml榄香烯组，30 mmol/l塞来昔布组，20mg/ml榄香烯+30mmol/l塞来昔布组。取对数生长期的HepG₂细胞，按传代方法制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml。将上述细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100ml，取不含细胞培养液的孔作为空白调零。将培养板置于37℃，5%CO₂培养箱中贴壁培养12小时后，各孔分别加入不同浓度的药物，每组设复孔。分别培养48小时后每孔加MTT(终浓度5mg/ml)5ml，继续培养4小时后，每孔加SDS-HCL150ml，孵育过夜，使结晶物充分溶解，置全自动酶标仪上测定每孔吸光度(OD)值，选取波长570nm。实验重复三次。

按以下公式计算肿瘤细胞生长抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD]??100%。

结果显示：单独20 mg/ml的榄香烯对Hep G₂的抑制率为19.3%，单独30mmol/l塞来昔布对Hep G₂的抑制率为21.4%左右，而两者联合用药以后，其对Hep G₂抑制率与两者单独用药相比均有大幅上升，达到49.2%，统计检验表明，两者联合用药后抗肿瘤作用有所增强，具有药理学上的协同作用。

实施例2：细胞凋亡的检测

取对数生长期的Hep G₂细胞，制成单细胞悬液，以1×10⁵/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的药物，继续培养24h后，分别收集细胞。移入离心管中，1000 r/min离心3min，弃上清，用孵育缓冲溶液清洗，加入100 ml标记溶液并用400目尼龙网分散细胞，室温避光孵育15min，800 rpm离心5min，并用孵育缓冲液清洗，加入Annexin V/PI染液4℃孵育20min，然后上机检测。流式细胞仪激发光波长488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

结果显示：药物处理细胞24小时后，空白、溶剂对照组的凋亡率均不高，其中空白组为9.61%，DMSO组为8.27%，两个单独给药组凋亡率分别为13.81%和17.35%，而联合用药组凋亡率达到36.89%，明显高于两者的单独用药组，统计检验表明两药物联合应用，可增强对肿瘤细胞凋亡的诱导作用，具有药理学上的协同作用。

实施例3 ：AO/EB荧光染色

取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，计数，以1 ×10⁵/ml密度接种于六孔板中。将培养板置于37℃，5%CO₂培养箱中贴壁培养24小时后，各孔分别加入不同浓度的药物，继续培养24h；收集所有细胞，移入离心管中，1000 rpm离心3 min，以PBS洗涤2次，加入2ml PBS重悬细胞，取100 ml细胞悬液到EP管中，加入8 ml AO/EB染液，孵育15min。镜下观察，绿光激发EB可观察晚期凋亡，蓝光激发AO可观察早期凋亡。

结果显示：联合用药组细胞在镜下显著表现为细胞皱缩变圆，外形模糊，染色质凝聚，核固缩并断裂成数个大小不等的内含胞质、细胞器及核碎片的凋亡小体，且比率较单独用药组明显提高。而单独用药组和对照组细胞的形态较为接近，表现为上述形态特征的细胞明显少于联合用药组（见图1）。

实施例4： caspase-3 蛋白印迹

样品准备：取对数生长期细胞，常规消化制成单细胞悬液，以1 ×10⁵/ml密度接种于六孔板中，用含0.5%血清的培液培养24h以同步细胞周期，加入各浓度药物溶液并对照组，培养24h，每孔加200 ml sample buffer，吹打，用刮刀刮下细胞收集于EP管中，超声破碎细胞，共3次，每次15秒，100℃煮样5min；制胶：配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为1mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层水，室温下静置至凝固。待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次，上样。然后，90V电泳150min。转膜：从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。取与胶同样大小的PVDF膜，在转移缓冲液中浸湿。按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。接通电源，调整电流至780mA，转膜70min，5%脱脂奶粉室温震摇2h，加TBST震摇，每次15min，共3次。一抗孵育:取5 ml抗体1：1000稀释到50 ml离心管中，将膜置于离心管中，卷起贴在离心管内壁。转动过夜。加TBST震摇，每次15min，共3次。二抗孵育：取1ml抗体1：5000用5%脱脂牛奶稀释到50 ml离心管中，将膜置于离心管中，卷起贴在离心管内壁。转动2-3h，加TBST震摇，每次15min，共3次。

结果显示，对照组细胞的caspase-3的蛋白印迹非常浅，两个单独用药组的caspase-3的蛋白印迹较为接近，比对照组略浓，而联合用药组的caspase-3的蛋白印迹不仅比对照组要浓，而且与两个单独用药组比也显得更加浓厚，表明联合用药可增强各药对caspase-3蛋白的激活作用。

Claims

1.一种治疗肝癌的联合用药物，它包含活性物质以及一种或多种可药用载体，其中活性物质由20mg/ml榄香烯和30mmol/l塞来昔布组成。