CN101910905B - 调节对比度显微镜 - Google Patents

Abstract

一种调节对比度显微镜，提供具有改进的对比度的针对ICSI中操作的精子(特别是尾部的端部)的良好视图。该调节对比度显微镜包括光圈构件(24)和调节器(28)，光圈构件(24)布置在会聚透镜26的前侧焦平面处或附近并具有部分光圈(24A)，调节器(28)布置在与光圈构件(24)基本上共轭的平面处并在第一物镜27或其共轭平面的后侧焦平面处或附近。对应于部分光圈(24A)的调节器(28)的区域(28A)的透过率T(％)满足条件1≤T≤8。结果可获得针对ICSI精子操作的良好查看。本发明可应用于调节对比度显微镜。

Description

调节对比度显微镜

技术领域

本发明涉及调节对比度显微镜，且更具体地涉及允许提高对比度的调节对比度显微镜。

背景技术

所谓的调节对比度显微镜观察法(霍夫曼调节对比度)是专利文献1中公开的已知显微镜观察法。制造商基于专利文献1中公开的原理制造对比度显微镜。

专利文献2公开了基于专利文献1的原理的调节对比度显微镜。该调节对比度显微镜包括光源、会聚透镜、布置在会聚透镜的前侧焦点位置的光圈(aperture)、物镜以及布置在与光圈基本上共轭且具有透过率T(％)的区域的位置处的调节器，其中显微镜被配置成满足公式(1)和公式(2)的条件：

1.05＜|(Mo′×fc)/(Mc′×fr)|＜1.4    (1)

8＜T＜25                              (2)

在公式(1)和公式(2)中，Mo′表示在垂直于设置调节器的光轴的平面内的透过率T的区域在径向方向的尺寸，Mc′表示以显微镜光轴为中心、在径向方向上的光圈的尺寸，fc是会聚透镜的焦距，且fr是从样本的表面直到调节器的光学系统的焦距。

除了公式(1)和公式(2)，专利文献2还公开了显微镜进一步满足公式(3)的条件的例子：

0.2R＜D＜0.6R    (3)

在公式(3)中，R表示布置调节器的平面的有效半径的尺寸，且D表示从透过率T的区域到显微镜光轴的距离。

专利文献1：日本专利申请公开51-128548

专利文献2：日本专利申请公开2003-131139

如专利文献2中所示，近年来所谓的ICSI(intracytoplasmic sperminjection，卵细胞质内精子注入法)已用作针对不孕治疗的体外受精技术。

为了将精子注射入卵细胞中，ICSI的正常程序通常包括首先从精子的尾部吸入精子。必须选择良好形态的精子，且必须保证从尾部的最末端用吸液管吸入精子，以不损坏精子，从而增加受精成功率。

然而，在专利文献1和专利文献2中阐述的调节对比度显微镜观察法条件下，对于精子而言对比度弱，而精子在ICSI中与卵子同样重要。在精子的尾端对比度特别地弱。上述方法的问题在于，结果是难以区分小形式的精子内的尾端部分，且因此难以选择良好形态的精子，并难以从尾部的最端部用吸液管吸入精子。

具体地，专利文献2阐述了“通过将部分光圈和透过率T的区域的长度设置为在以上公式(1)的范围内，也在诸如卵子的透明带和卵子颗粒等的精细部分中，在分辨率和对比度之间有良好的平衡，而没有过度的对比度，这样优化了视图，”。然而，专利文献2没有阐述针对公式(2)中的透过率T的任何基本原理，也没有提及任何对于精子(特别是尾部)的对比度。

发明内容

考虑到以上问题，本发明的目的是提供调节对比度显微镜，该调节对比度显微镜通过改进尾部的端部的对比度，提供了ICSI中精子的良好视图，特别是ICSI中精子操作期间的良好视图。

本发明的调节对比度显微镜是包括光圈构件和调节器的调节对比度显微镜，其中光圈构件布置在会聚透镜的前侧焦平面处或附近并具有第一部分光圈，调节器布置在与光圈构件基本上共轭的平面处并在物镜或其共轭平面的后侧焦平面处或附近，其中对应于第一部分光圈的调节器的预定区域的透过率T(％)满足1≤T≤8。

更优选地，对应于第一部分光圈的调节器的预定区域的透过率T(％)满足5≤T≤8。

显微镜满足1.0≤Mo/Mc≤1.3，其中Mc表示调节器上的第一部分光圈的图像的宽度，且Mo表示具有透过率T(％)的调节器的预定区域的宽度。

更优选地，显微镜满足1.0≤Mo/Mc≤1.2。

光圈构件还具有用于调节对比度的第二部分光圈。

本发明通过改进尾部的端部的对比度提供了ICSI中精子的良好视图，特别是ICSI中精子操作期间的良好视图。

附图说明

图1是示出调节对比度显微镜的配置的示意图；

图2是光学系统的示意图；

图3是示出光圈构件的细节的图；

图4是示出调节器的细节的图；

图5是示出具有第二部分光圈的光圈构件的细节的图；

图6是表示样本(A)的一维仿真图像的图；

图7是表示样本(B)的一维仿真图像的图；

图8是表示样本(C)的一维仿真图像的图；

图9是表示对比度值和透过率T的各个值之间的关系的图；以及

图10是示出在物镜的后侧焦平面上的光圈构件和调节器的投影的示意图。

附图标记的说明

21光源，22聚光透镜(collector lens)，23镜，24光圈构件，24A和24B部分光圈，25转台(turret)，26会聚透镜(condenser lens)，27第一物镜，28调节器，28A区域，29第二物镜，30棱镜，31目镜透镜

具体实施方式

以下参考附图说明本发明的实施例。

图1是示出调节对比度显微镜的配置的示意图。

在图1中，调节对比度显微镜1是根据调节对比度显微镜观察法的原理、用于放大观察样本S的正立显微镜。

调节对比度显微镜1包括基台11、直立基座12、臂13、照明透镜单元14、样本台15、台驱动单元16、旋转器17、物镜18、观察筒19和目镜透镜筒20。直立基座12被直立地设置在基台11上。臂13在直立基座12的顶部水平地延伸。图中的虚线表示光轴AX。

在基台11的后面(图中的左侧)设置光源部11a。照明透镜单元14和台驱动单元16被固定到直立基座12的前面。台驱动单元16在光轴AX的方向上上下地移动在其上设有样本S的样本台15，并以样本台15可以围绕光轴AX旋转的方式保持样本台15。将物镜18插入光路径以及将物镜18从光路径移除的旋转器17设置在臂13的引导端(leading end)的底部处。在臂13的引导端的顶部处设置观察筒19。目镜透镜筒20设置在观察筒19的引导端部处。

接着说明光学系统沿光路径的布局。

光源21容纳在光源部11a中。聚光透镜22和向上反射照明光的镜23容纳在基台11内。光圈构件24、转台25和会聚透镜26保持在照明透镜单元14中。因而，转台25的旋转允许从具有不同的部分光圈尺寸的多个光圈构件24中选择期望的光圈构件24。

物镜18具有第一物镜27和调节器28。第二物镜(图像形成透镜)29和棱镜30布置在观察筒19中。以如下方式布置棱镜30：使得到达棱镜30的光被划分成两个，其中被划分的光束中的一个被引导到目镜透镜31，而另一个被引导到成像装置(未示出)。

如上所述配置光学系统。接着参考图2-4说明该光学系统的操作。

如图2所示，光源21发射的照明光被聚光透镜22校准，被镜23反射，并入射到光圈构件24。光圈构件24布置在会聚透镜26的前侧焦平面(焦距fc)处或附近。如图3所示，光圈构件24具有以预定距离从光圈构件24的中心偏移地布置的矩形部分光圈24A。

现在回到图2，照明光在穿过部分光圈24A光圈构件24之后，通过会聚透镜26朝向样本S，并照明样本S。在被照明光照明时样本S发射的光通过第一物镜27(焦距fo，数值孔径NAo)在图像平面上形成图像。在光圈构件24的基本上共轭的平面处(在图2中，第一物镜27的后侧焦平面处或附近)，调节器28比第一物镜27更朝向图像平面布置。

如图4所示，调节器28具有透过率是T(％)的预定的区域28A。区域28A与图3所示的矩形部分光圈24A相似地在以预定距离从中心偏移的位置处形成。现在返回图2，穿过调节器28的光通过第二物镜29形成图像，并经由棱镜30入射到目镜透镜31。

结果，当通过目镜透镜31察看样本图像时，可以观察例如样本S的不规则形状的对比度图像。尽管图中未示出，显然也可以通过成像装置如数字照相机等捕获观察图像，并且被捕获图像可以显示在显示装置上。

已经说明了本实施例的例子，其中如图3所示，光圈构件24具有一个部分光圈24A。然而，除了第一部分光圈24A之外，光圈构件24还可以具有第二部分光圈24B，如图5所示。具体地，部分光圈24B具有例如与部分光圈24A相同的形状(矩形)，并且布置在以预定距离从部分光圈24A间隔开的位置处，如图5所示。可以通过进一步提供部分光圈24B并且控制部分光圈24B的透过率来调整对比度。

因而调节对比度显微镜1具有如上所述的配置。

在本实施例中，当在上述ICSI中使用具有上述配置的调节对比度显微镜1时，调节器28的区域28A的透过率T(％)满足公式(4)的条件。

1≤T≤8            (4)

满足公式(4)的条件与传统情况相比允许提高精子的尾部的对比度，并允许抑制由于过度的卵子对比度导致的被毁坏的观察的现象，这在上述专利文献2的传统技术中是一个问题。结果可以实现针对ICSI的最佳对比度的视图。

在公式(4)的条件下，精子、特别是其尾部的端部的对比度提高的原因得自于本发明的发明人基于详细的图像形成仿真得出的发现。接着参考图6-9说明该仿真的细节。

以上仿真在使用调节对比度显微镜1对三个下述样本进行假设观察时提供一维仿真图像。在透过率T(％)、即T＝10(％)，8(％)，5(％)，1(％)的四个不同条件下比较每个样本。

观察的假设样本是以下三种类型(A)至(C)。

(A)具有φ＝10μm，n＝1.34的球形样本：对应于相对大的样本，如卵子。

(B)具有φ＝1.5μm，n＝1.35的球形样本：对应于精子尾部的根部。

(C)具有φ＝0.5μm，n＝1.35的球形样本：对应于精子的尾部，相对朝向其端部。

卵子的实际尺寸是大约80μm，但是为了仿真，计算了具有设置为精子的约10倍尺寸的样本。

在以下仿真条件(D)至(G)下进行仿真。

(D)媒介：水(n＝1.33)

(E)物镜NA(数值孔径，Numerical Aperture)：0.55(理想系统)

(F)NA规格化的缝隙宽度，物镜瞳孔直径＝1

(a)Mc＝0.275(在调节器28上投影的、以显微镜光轴为中心的径向方向上部分光圈24A的宽度)；Mo＝0.31(在垂直于布置调节器28的光轴的平面内的具有透过率T的区域的在径向方向上的尺寸)

(b)公式(7)或公式(8)的值(进一步详细说明)：Mo/Mc＝0.31/0.275＝1.13

(c)公式(9)的值(进一步详细说明)：D＝0.49R

(G)波长λ＝588nm

图6-8示出了通过在以上阐述的条件下、对以上样本进行的仿真获得的一维仿真图像。

图6是表示样本(A)的一维仿真图像的图。

在图6中，垂直轴中的强度(A.U.)表示相对明度(brightness)，且水平轴表示x(μm)。在图6中，细实线是透过率T＝8(％)的图，且细虚线是透过率T＝10(％)的图。粗实线是透过率T＝1(％)的图，且粗虚线是T＝5(％)的图。在下述其他图中这些关系是相同的。

为了比较每个样本在每个透过率T的图，比较针对每个透过率T以及针对每个样本(在此处例子中，透过率T＝8(％)以及透过率T＝10(％))确定的对比度值。用于确定对比度值的方法可以是例如迈克耳逊对比度(Michelson contrast)，其中基于最大和最小明度值计算对比度值。用于确定对比度值的方法不特别限于以上方法，且可以采用任何其他方法。

在图6中，基于细实线和虚线表示的两个图、针对每个透过率T确定的对比度值如下所示。在透过率T＝8(％)，样本(A)的对比度值是0.78，且在透过率T＝10(％)，样本(A)的对比度值是0.72。

相似地，基于图7的样本(B)的一维仿真图像中的图确定的对比度值在透过率T＝8(％)是0.61，且在透过率T＝10(％)是0.55。

此外，基于图8的样本(C)的一维仿真图像中的图确定的对比度值在透过率T＝8(％)是0.20，且在透过率T＝10(％)是0.18。

以上结果清楚地表明与在透过率T＝8(％)相比在透过率T＝10(％)对比度被增加到更大的程度。

图9a和9b中的图总结了以上样本(A)至样本(C)中的仿真结果。具体地，图9a是示出基于图6-8的图、针对透过率T的各种值的对比度值的图，且图9b描绘了图6-8的图中透过率T(％)的各种值的图和针对透过率T＝10(％)的图之间的比较。也就是说，图9b示出了关于透过率T＝10(％)、针对每个透过率T计算的值作为对比度值的百分比(下文中称为对比度增加率)。

例如，如图9a所示，针对φ＝10μm(样本(A))，当透过率＝10(％)时对比度值是0.72，且当透过率T＝8(％)时对比度值是0.78。因此，针对φ＝10μm的对比度增加率为107(％)，如图9b所示。

类似地，针对φ＝1.5μm(样本(B))，当透过率＝10(％)时对比度值是0.55，且当透过率T＝8(％)时对比度值是0.61。因此，针对φ＝1.5μm的对比度增加率是111(％)。

类似地，针对φ＝0.5μm(样本(C))，在透过率＝10(％)时对比度值是0.18，且在透过率T＝8(％)时对比度值是0.20。因此，针对φ＝0.5μm的对比度增加率为117(％)。

以上结果示出了结构越精细，对比度的增加变得越明显。具体地，对于对应于精子尾部的端部的φ＝0.5μm，对比度增加17(％)。通常在对比度增加率超过10(％)时，以上效果变得可从视觉上感知。

以上结果示出了结构越精细，对比度增加变得越明显。具体地，对于对应于精子的尾端尺寸的φ＝0.5μm，对比度增加10％或更多。通常在对比度增加率超过10(％)时，对比度增加变得可从视觉上感知。从而显著地提高了从视觉上感知精子尾部的便利。

以上结果示出了保持透过率不大于T＝8(％)并允许优先增加如精子尾部等的结构的对比度，然而没有显著地改变固有地呈现高对比度的如卵子等的大结构的对比度。结果，这通过改进尾部的端部的对比度，在ICSI中提供了精子的良好视图，特别是ICSI中精子操作期间的良好视图。

根据图9a和图9b，随着透过率T变低，比卵细胞更精细的如精子等的结构的图像中的对比度增加。当透过率T低到T＝0％时，即完全没有透射光的状态下，则穿过样本的所有零级光(直接光)被调节器阻断，且不能到达图像平面。结果，在图像平面处获得的图像不是本发明期望的浮雕状(relief-like)对比度图像，而是其视图与所谓的暗视野照明(dark fieldillumination)的视图相似的图像。因此，在本发明中透过率T被设置得越低，达到T＝8％和更低，在具有精细结构的相位物体如精子的尾部中可获得的对比度越高。然而，禁止透过率T有效地为0％的状态。因此透过率T的理论下限值为T＞0％。依据组件成本且为了便利制造，在实际中使用依赖于吸收和反射的ND(Neutral Density，中性密度)膜以实现透过率T。需要在该ND膜中的一般制造误差在大约T＝±1％内。在这种情况下，在考虑到制造限制的情况下，透过率T的下限可被视为T＝1％。

在图9a中，一维仿真图像的垂直轴、即图像强度以如下方式被规格化，使得背景光的强度、即无相变化的部分处的光的强度是1。因此，显然透过率T越低，背景光的强度越好。然而，实际上，背景光的绝对值强度与透过率T成比例。因此，在例如透过率T＝1％的情况下的背景光强度是透过率T＝10％的情况下的1/10，从而仅可获得非常暗的图像。本发明的目的是提供一种适于ICSI的显微镜装置。然而，使用当前背景光的1/10、即当前图像明度的1/10将妨碍在实际的显微镜装置中获得充分的灰度差，且会导致不可接受的暗视觉观察。出于以上原因，且考虑到提高视觉观察操作的效率，透过率范围优选地在T＝5％-8％的范围内。

在该例子中，通过将透过率T(％)设置为比上述专利文献2中更低的值来选择性地提高精细结构样本如精子尾部的对比度。然而，在调节对比度显微镜观察法中，还通过除了透过率T之外的其他参数来确定对比度。因此，在本实施例中，为了实现更有效的对比度提高，优选地也考虑进这些其他因素。接着说明除了上述公式(4)之外用于提高对比度的因素。

图10示出了针对图3的光圈构件24的部分光圈24A和图4的调节器28的区域28A的位置，第一物镜27和会聚透镜26的图像之间的关系。也就是说，图10描绘了调节器28和光圈构件24的部分光圈24A在第一物镜27的后侧焦平面(或其共轭平面)上的投影。

根据以下公式(5)、通过第一物镜27的焦距fo和第一物镜27的数值孔径NAo给出第一物镜27的后侧焦平面的有效半径Ro。

Ro＝fo×NAo    (5)

如图10所示，Mc表示在上述投影平面上部分光圈24A的宽度，且Mo表示具有透过率T(％)的调节器28的区域28A的宽度。此外，Do表示从第一物镜27的后侧焦平面的中心直到具有透过率T(％)的区域28A的内侧端的距离。假定部分光圈24A要布置在会聚透镜26的前侧焦点处，且调节器28要布置在第一物镜27的后侧焦点处，如针对图2所述，且假定所有透镜是等光程的(理想光学系统)，则根据以下公式(6)、通过Mc给出会聚透镜26中部分光圈24A的实际尺寸Mc’。

Mc′＝fc/fo×Mc    (6)

在调节对比度显微镜观察法中，如上所述，除了透过率T之外还通过其他参数确定对比度。因此，为了实现更有效的对比度提高，也必须考虑进这些其他参数。影响对比度的参数包括例如光圈构件24的部分光圈24A的宽度Mc和调节器28的区域28A的宽度Mo之间的比率以及调节器28的离心率。

关于部分光圈24A和区域28A的宽度，调节对比度显微镜观察法的原理规定Mc不大于Mo。因此，根据像差和制造误差，一般将Mc规定为小于Mo。然而，随着部分光圈24A的图像的宽度Mc变得小于区域28A的宽度Mo，对比度下降，这是个问题。此外，随着部分光圈24A的图像的Mc变得更小，观察期间的背景光的量减小，且图像变得更暗，这同样是个问题。因此，在特别地考虑保持对比度且确保光量的情况下，优选地在本实施例中将Mc设置在Mo的范围内并且具有与Mo尽可能接近的值。

因此在本实施例中，部分光圈24A的图像的宽度Mc和区域28A的宽度Mo优选地满足以下公式(7)的关系。

1.0≤Mo/Mc≤1.3    (7)

更优选地，满足以下公式(8)的关系，使得从视觉上几乎不可感知对比度的下降。

1.0≤Mo/Mc≤1.2    (8)

此外，为了确保根据调节对比度显微镜观察法原理的良好对比度，Do和Ro优选地满足以下公式(9)的关系，该公式(9)在本实施例中也适用。

0.2R＜Do/Ro＜0.6R    (9)

在公式(9)中，R表示布置调节器28的平面的有效半径的尺寸。

因而，在本实施例中，通过除了满足公式(4)的条件之外还满足公式(7)或公式(8)的条件来确保更好的对比度，同时通过满足公式(9)的关系来提高分辨能力。结果可获得在ICSI中精子操作时的良好查看。

在本实施例的说明中调节对比度显微镜1是正立显微镜，然而也可以是倒置的显微镜。

此外，布置调节器28的位置不限于第一物镜27的后侧焦平面。在图2的目镜透镜31和第二物镜29之间布置中继光学系统的情况下，调节器28可布置在例如中继光学系统形成的第二物镜29的后侧焦平面的共轭平面处或附近。

本发明的实施例不限于以上所述，且在不脱离本发明的范围的情况下可对实施例作出各种修改。

Claims (5)

1.一种调节对比度显微镜，包括光圈构件和调节器，所述光圈构件布置在会聚透镜的前侧焦平面处或附近并具有第一部分光圈，所述第一部分光圈是以预定距离从所述光圈构件的中心偏移地布置的矩形部分光圈，所述调节器布置在与所述光圈构件基本上共轭的平面处并在物镜或其共轭平面的后侧焦平面处或附近，

其中对应于所述第一部分光圈的所述调节器的预定区域的透过率T(％)满足1≤T≤8，与所述第一部分光圈对应的所述调节器的所述预定区域在以预定距离从所述调节器的中心偏移的位置处形成。

2.根据权利要求1所述的调节对比度显微镜，

其中对应于所述第一部分光圈的所述预定区域的透过率T(％)满足5≤T≤8。

3.根据权利要求1或2所述的调节对比度显微镜，其中所述显微镜满足1.0≤Mo/Mc≤1.3，

其中Mc表示所述调节器上的所述第一部分光圈的图像的宽度，且Mo表示具有透过率T(％)的所述调节器的预定区域的宽度。

4.根据权利要求1或2所述的调节对比度显微镜，其中所述显微镜满足1.0≤Mo/Mc≤1.2，

其中Mc表示所述调节器上的所述第一部分光圈的图像的宽度，且Mo表示具有透过率T(％)的所述调节器的预定区域的宽度。

5.根据权利要求1或2所述的调节对比度显微镜，

其中所述光圈构件还具有用于调整对比度的第二部分光圈。

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