JP4940841B2 - 変調コントラスト顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、位相標本を可視化する機能を有する顕微鏡に関する。

特許文献１は、変調コントラスト法という公知の技術を開示している。この変調コントラスト法を用いて位相標本を可視化する機能を有する顕微鏡は変調コントラスト顕微鏡と呼ばれている。この変調コントラスト顕微鏡においては、コンデンサレンズの開口絞り部材上に偏心した位置に矩形状の部分開口を持ち偏斜照明を行う（本明細書中部分開口とは光路を遮って配置される開口板に該光路を形成する光束の一部を透過するよう形成された開口を意味する）。この変調コントラスト顕微鏡においてコンデンサレンズの開口絞りと共役な位置に変調器を持つ。変調器は異なる透過率領域を複数持っている。照明光は標本面形状（例えば、右上がり斜面、平面、左上がり斜面）によって異なる屈折をするので、開口絞り部材の矩形開口の像は位相標本のどこを通ったかによって、変調器上の異なる場所に結像する。もし結像した場所が透過率の低い場所であるならば暗く、高い場所であるなら明るく照明されたのと同じことになる。以上のように、異なる透過率領域を持つ変調器と偏斜照明によって位相標本にコントラストを持たせることができる。

特許文献２に於いて、変調コントラスト顕微鏡が主に使われる顕微受精では、主に卵子や精子を観察する。卵子や精子は形状が微細かつ凹凸の変化が激しい位相物体であるので、変調器上の透過率８〜２５％の所定領域に結像すべきコンデンサ開口部の矩形開口の像が前記所定の領域からずれやすく、コントラストがつきすぎて微細構造が見難いという問題がある。これを防ぐために、特許文献２に於いては、コンデンサ開口部につけた矩形開口の像に比べて、変調器の透過率８〜２５％領域の幅を大きく取ってある。
特開昭５１−２９１４９号公報 特開２００３−１３１１３９号公報

特許文献１の変調コントラスト顕微鏡では、凹凸の変化が激しい微細構造の位相標本を観察すると、コントラストが高すぎて微細構造が見えないという課題がある。これは、すでに特許文献２が解決した課題である。

しかしながら、特許文献２には、以下のような別途の課題がある。変調コントラスト顕微鏡の主な使用分野は、顕微受精である。図１０は、顕微受精での標本を表す模式図である。卵子を培液で覆い、乾燥を防ぐためにミネラルオイルをかけてある。それぞれの屈折率は異なるので、界面ごとに照明光は屈折する。特に培液は球状をしていることからレンズのように働き、照明光が非常に屈折する。つまり、標本は光学的に一様ではない。

変調コントラスト顕微鏡で位相標本を観察するためには、０次光が変調器上の特定の透過率をもつ領域に結像するように、まず部分開口の位置を調整する必要がある。なお、部分開口を通った照明光のうち、位相標本面で回折しない光を０次光という。

調整後、ＸＹステージを動かすと、位相標本が光学的に一様でないために、０次光が結像する場所が変わってしまい、背景が明るくなったり暗くなったりする。背景が明るければ、卵子や精子のコントラストは低下し、暗ければ、コントラストがつきすぎて、微細な構造が見えなくなってしまう。

特許文献２では、コントラスト軽減については触れているが、０次光の結像位置がずれることについては触れていない。ただ結果として、特許文献２に於いても、０次光の結像位置ずれは、多少軽減されているかもしれない。しかし、部分開口が矩形であるために、結像位置のずれによる面積の変動が大きい。すると照明光量の変動も大きくなり、コントラストの急激な変動につながる。このようなことから、特許文献１と特許文献２が抱える課題の両方を解決することが待望されている。

本発明は、上述したような事情に鑑みてなされたものであって、凹凸変化の激しい微細構造を持つ位相標本を観察して、部分開口の像が光軸を中心にした所定の半径方向にずれた場合に、部分開口の形を該半径方向に対して部分開口の面積変化が緩やかになるようにして、部分開口の像の移動に伴う背景の明るさやコントラストの変動を緩やかにすることができる、変調コントラスト顕微鏡を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１の態様に係る変調コントラスト顕微鏡は、照明光学系内のコンデンサレンズの前側焦点位置または該前側焦点位置と共役な位置に配置される部分開口を有する開口板と、
観察光学系内の対物レンズの後側焦点位置または該後側焦点位置と共役な位置に配置される複数の異なる透過率領域を有する変調器とを備え、
前記部分開口と前記コンデンサレンズおよび前記対物レンズを介して共役関係にある、前記複数の異なる透過率領域のうちの所定の透過率領域は、他の透過率領域と一直線で区切られ、
前記部分開口を構成する長手方向の形状がそれぞれ、前記一直線とは一致しない異なる形状であり、前記長手方向に直交する短手方向の長さが前記長手方向に沿って変化する箇所を少なくとも含むことを特徴とする。

本発明の第２の態様に係る変調コントラスト顕微鏡は、照明光学系内のコンデンサレンズの前側焦点位置または該前側焦点位置と共役な位置に配置される部分開口を有する開口板と、
観察光学系内の対物レンズの後側焦点位置または該後側焦点位置と共役な位置に配置される複数の異なる透過率領域を有する変調器とを備え、
前記部分開口は矩形形状であり、
前記部分開口と前記コンデンサレンズおよび前記対物レンズを介して共役関係にある、前記複数の異なる透過率領域のうちの所定の透過率領域は、前記矩形形状を構成する一直線とは一致しない異なる形状によって他の透過率領域と区切られていることを特徴とする。

本発明によれば、凹凸変化の激しい微細構造を持つ位相標本を観察して、部分開口の像が光軸を中心にした所定の半径方向にずれた場合に、部分開口の形を該半径方向に対して部分開口の面積変化が緩やかになるようにして、部分開口の像の移動に伴う背景の明るさやコントラストの変動を緩やかにすることができる。

図１は、本発明の実施の形態に係る変調コントラスト顕微鏡の全体構成の模式図である。図１に示す変調コントラスト顕微鏡において、１は光源、２はコレクタレンズ、３は照明レンズ、４はミラー、５はコンデンサレンズ、６は開口板、７は対物レンズ、８はレボルバ、９，１０，１１，１２はリレーレンズ、１３は接眼レンズ、１４は変調器、１５は標本Ｓを載置するためのステージである。光源１から出た光は、ケーラー照明法によって標本Ｓを照らしている。照明光学系のコンデンサレンズ５の開口絞りと、結像光学系の対物レンズ７の後側焦点位置とが共役関係にある。

開口板６は、コンデンサレンズ５の開口絞り位置又はその近傍に配置されている。図２に示すように、開口板６には、光軸を中心にして偏心位置に光束の一部を透過する開口である部分開口６ａが設けられている。また、変調器１４は、対物レンズ７の後側焦点位置又はその近傍に配置されている。この光学系では、部分開口６ａが光軸から偏心した位置に配置されているので、コンデンサレンズ５に入射した光は、標本Ｓを斜め方向から照明するように射出し、対物レンズ７及び変調器１４を通過して、標本像を形成する。

図２は、コンデンサレンズの開口絞り位置又はその近傍に配置される開口板の模式図である。開口板６の部分開口６ａは、その面積変動を小さくしつつ、透過光量を抑制する形状に形成してある。別言すれば、開口板６の部分開口６ａは、光軸を中心とする所定の半径方向に対して面積が緩やかに変化する構造であれば、何でも良い。図２の中で、黒は、透過率０％、白は、透過率１００％である。

具体的には、図３（ａ）〜（ｇ）は、それぞれ異なる開口板の部分開口の形状を示す模式図である。図２及び図３（ａ）に示すように、開口板６の部分開口６ａは、その矩形の４個の角部を直線状に削除して、略八角形に形成してある。

図３（ｂ）に示すように、開口板６の部分開口６ａは、その矩形の４個の角部を円弧状に削除して、丸みのついた略八角形に形成してあってもよい。

図３（ｃ）に示すように、開口板６の部分開口６ａは、その矩形の４個の角部を階段状に削除して、略八角形に形成してあってもよい。

以上、図３（ａ）〜（ｃ）の例では、部分開口６ａは、その両端部の幅が狭く、中央部ほど幅が広くなるように形成してある。

図３（ｄ）に示すように、開口板６の部分開口６ａは、その中央部の幅が狭く両端部が広くなるように、円弧状に削除してあってもよい。

図３（ｅ）に示すように、開口板６の部分開口６ａは、その中央部の幅が狭く両端部が広くなるように、直線状に削除してあってもよい。

図３（ｆ）に示すように、開口板６の部分開口６ａは、その中央部の幅が狭く両端部が広くなるように、階段状に削除してあってもよい。

以上、図３（ｄ）〜（ｆ）の例では、部分開口６ａはいずれも、その中央部の幅が狭く、両端部ほど幅が広くなるように形成してある。

図３（ｇ）に示すように、開口板６の部分開口６ａは、その側面が部分的に凸に隆起していてもよい。

図４は、対物レンズの後側焦点位置又はその近傍に配置した光軸を中心として所定の半径方向に異なる透過率領域をもつ変調器の模式図である。

変調器１４は、光軸を中心とした所定の半径方向に３種類の異なる透過率領域に分割してある。即ち、無色は、１００％の透過率であり、灰色のＡ部は、大略１０％の透過率、黒色のＢ部は、略０％の透過率である。

図５は、開口板６の部分開口６ａの像が変調器に結像した状態を示す模式図である。コンデンサレンズ５の前側焦点と対物レンズ７の後側焦点とは、共役関係にあるので、部分開口６ａの像は、対物レンズ７の後側焦点位置に結像する。位相標本が光軸に対して完全に垂直な平面であるとき、コンデンサレンズ５を介して形成される部分開口６ａの像は、図５に示したように、変調器１４のＡ部内に結像するように調整されている。既に説明したように、位相標本の形状によって、照明光は、異なる射出角に屈折し、対物レンズ７の後側焦点の透過率の異なる領域を通る。これは、既知の変調コントラスト法である。

図６は、半径方向内側に屈折した光により対物レンズ７の後側焦点位置に結像した部分開口の像の模式図である。変調器１４上で透過部と部分開口の像とが重なっている。本実施の形態では、部分開口６ａは、その矩形の４個の角部を直線状に削除して略八角形に形成してあるため、変調器１４上で透過部と部分開口の像とが重なっている面積は、従来の矩形形状の場合に比べて小さい。

このように、重なっている面積が小さいということは、そこを通る照明光の量が減るということである。照明光が減れば、部分開口の像の移動に伴う背景の明るさやコントラストの変動が緩やかになる。

図７は、半径方向外側に屈折した光により対物レンズ７の後側焦点位置に結像した部分開口の像の模式図である。変調器１４上で不透過部と部分開口の像とが重なっている。本実施の形態では、部分開口６ａは、その矩形の４個の角部を直線状に削除して略八角形に形成してあるため、重なっている面積は、従来の矩形形状の場合に比べて小さい。

このように、重なっている面積が小さいということは、そこを通る照明光の量が減るということである。照明光が減れば、部分開口の像の移動に伴うコントラストの変動が緩やかになる。

以上、図６及び図７に示したように、本実施の形態では、凹凸変化の激しい微細構造を持つ位相標本を観察して、開口板６の部分開口６ａの像が所定の半径方向にずれた場合でも、変調器１４の異なる透過率領域を通る照明光量が急激に変化しないようにしている。即ち、部分開口６ａの形を所定の半径方向に対して、部分開口６ａの面積変化が緩やかになるようにしている。従って、部分開口の像の移動に伴う背景の明るさやコントラストの変動を緩やかにすることができる。

上述した実施の形態では、コンデンサレンズ５の開口絞り側の開口板６の部分開口６ａの形状を変えることで、０次光の結像位置のずれによる影響を軽減している。しかし、変調器を以下のように変更することによって同じ効果を出すことができる。

具体的には、図８（ａ）〜（ｆ）に示すような対物レンズ７の後側焦点位置上又はその近傍に配置した異なる透過率領域を持つ変調器１４に変更する。

図８（ａ）に示す変調器１４においては、Ａ部の透過率領域は隣接する透過率領域に、光軸を中心とする円中心から離れるにしたがって直線状にせり出し、そして隣接する透過率領域の角を削除するよう形成してある。

図８（ｂ）に示す変調器１４においては、Ａ部の透過率領域は隣接する透過率領域に、光軸を中心とする円中心から離れるにしたがって階段状にせり出し、そして隣接する透過率領域の角を削除するよう形成してある。

図８（ｃ）に示す変調器１４においては、Ａ部の透過率領域は隣接する透過率領域に、光軸を中心とする円中心から離れるにしたがって曲線状にせり出し、そして隣接する透過率領域の角を削除するよう形成してある。

図８（ｄ）に示す変調器１４においては、Ａ部の透過率領域は隣接する透過率領域に、光軸を中心とする円中心に近づくにしたがって直線状にせり出し、そして隣接する透過率領域の角を削除するよう形成してある。

図８（ｅ）に示す変調器１４においては、Ａ部の透過率領域は隣接する透過率領域に、光軸を中心とする円中心に近づくにしたがって階段状にせり出し、そして隣接する透過率領域の角を削除するよう形成してある。

図８（ｆ）に示す変調器１４においては、Ａ部の透過率領域は隣接する透過率領域に、光軸を中心とする円中心に近づくにしたがって曲線状にせり出し、そして隣接する透過率領域の角を削除するよう形成してある。

変調器１４を変更することにより、開口板６の部分開口６ａの形が矩形のままであっても、部分開口６ａの形を変えた時とまったく同じ効果を得ることができる。なお、図８において、無色は、１００％の透過率であり、Ａ部は、大略１０％の透過率、Ｂ部は、略０％の透過率である。

図９（ａ）は、ＮＤフィルタの模式図であり、（ｂ）は、ＮＤフィルタの透過率と位置との関係を示すグラフである。

図９（ａ）に於いて、透過率は、ハッチングの濃淡で表しており、白が１００％であり、ハッチングの濃い方が０％である。ＮＤフィルタでは、図９（ｂ）にも示すように、透過率が所定の半径方向に１００％から０％に連続的に変化している。従って、部分開口６ａの形が矩形のままであっても、部分開口６ａの形を変えた時とまったく同じ効果を得ることができる。

以上の説明では、透過照明型の顕微鏡について説明したが、対物レンズを結像光学系と照明光学系で兼用する落射照明型の顕微鏡でも、対物レンズの後側焦点位置又は後側焦点位置と共役な位置に変調器を配置し、対物レンズの後側焦点位置又は後側焦点位置と共役な位置に部分開口を持つ開口板を配置して、部分開口を通った光が試料面で反射し、変調器上の所定の位置に結像するようにすれば、本発明は全く同様に成立する。

なお、本発明は、上述した実施の形態に限定されず、種々変形可能である。

本発明の実施の形態に係る変調コントラスト顕微鏡の全体構成の模式図である。 コンデンサレンズの開口絞り又はその近傍に配置される開口板の模式図である。 （ａ）〜（ｇ）は、それぞれ、異なる開口板の部分開口の形状を示す模式図である。 対物レンズの後側焦点位置又はその近傍に配置した異なる透過率領域をもつ変調器の模式図である。 開口板の部分開口の像が変調器に結像した状態を示す模式図である。 光軸を中心にした所定の半径方向内側により屈折した光による部分開口の像の模式図である。 光軸を中心にした所定の半径方向外側により屈折した光による部分開口像の模式図である。 （ａ）〜（ｆ）はそれぞれ対物レンズの後側焦点位置又はその近傍に配置される異なる透過率領域をもつ変調器の例を示す模式図である。 （ａ）は、ＮＤフィルタの模式図であり、（ｂ）は、ＮＤフィルタの透過率と位置との関係を示すグラフである。 顕微受精での標本を表す模式図である。

符号の説明

５…コンデンサレンズ、６…開口板、６ａ…部分開口、７…対物レンズ、１４…変調器。

Claims (3)

1. 照明光学系内のコンデンサレンズの前側焦点位置または該前側焦点位置と共役な位置に配置される部分開口を有する開口板と、
   観察光学系内の対物レンズの後側焦点位置または該後側焦点位置と共役な位置に配置される複数の異なる透過率領域を有する変調器とを備え、
   前記部分開口と前記コンデンサレンズおよび前記対物レンズを介して共役関係にある、前記複数の異なる透過率領域のうちの所定の透過率領域は、他の透過率領域と一直線で区切られ、
   前記部分開口を構成する長手方向の形状がそれぞれ、前記一直線とは一致しない異なる形状であり、前記長手方向に直交する短手方向の長さが前記長手方向に沿って変化する箇所を少なくとも含むことを特徴とする変調コントラスト顕微鏡。
2. 前記部分開口は、矩形の四個の角を削除して、ほぼ八角形に形成してなることを特徴とする請求項１に記載の変調コントラスト顕微鏡。
3. 照明光学系内のコンデンサレンズの前側焦点位置または該前側焦点位置と共役な位置に配置される部分開口を有する開口板と、
   観察光学系内の対物レンズの後側焦点位置または該後側焦点位置と共役な位置に配置される複数の異なる透過率領域を有する変調器とを備え、
   前記部分開口は矩形形状であり、
   前記部分開口と前記コンデンサレンズおよび前記対物レンズを介して共役関係にある、前記複数の異なる透過率領域のうちの所定の透過率領域は、前記矩形形状を構成する一直線とは一致しない異なる形状によって他の透過率領域と区切られていることを特徴とする変調コントラスト顕微鏡。