CN101897399A - 一种菠萝蜜多糖粗品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有由葡萄糖单糖构成的单一多糖成分的菠萝蜜多糖粗品，及其制备方法和用途。
Description
技术领域
本发明属于食品工程领域。具体而言，涉及从菠萝蜜中提取的多糖粗品及其制备方法。
背景技术
随着人民生活水平的提高，人们越来越重视自己的生活质量，然而生活环境的日益恶化使人们日益受到各种疾病的威胁，人们更加关注营养保健，期待着从自然资源中寻找具有增强免疫作用的天然食物及保健产品。
多糖是生物体内一类重要的大分子，随着大量的研究人们发现一些多糖(如香菇多糖、灵芝多糖、茯苓多糖等)具有很好的免疫调节作用，且无毒副作用，是一类具较大开发价值的免疫调节剂。
菠萝蜜，又名木菠萝、树菠萝，属桑科桂木属常绿乔木(Artocarpus heterophyllusLam)，为海南主要农作物之一，其果肉中含有较高含量的多糖，且具有较强的增强免疫作用，与该多糖相关的食品领域开发应用未曾见诸报道。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种菠萝蜜多糖粗品及其制法，该粗多糖由均一分子量的多糖成分组成，且该多糖结构中由葡萄糖一种单糖组成。
在本发明的又一个方面，所述菠萝蜜多糖粗品中的精制后的多糖占总多糖含量的50-60％。
除非特别指明，本申请中所示含量百分比均以重量百分比表示。
具体实施方式
本发明的菠萝蜜多糖粗品的制备方法为：
(1)取菠萝蜜粉末，加入10-30倍量水，100℃水浴回流提取1小时，取出3000rpm离心，倾出上清液，再加入10-30倍量水，如此提取3次，合并个各次上清液。
(2)将上清液水浴加热浓缩至约原菠萝蜜粉末重量的10倍，加入浓缩液1/5体积的氯仿及氯仿1/5体积的正丁醇，剧烈震动，静置分层，除去下层有机溶剂及中间变性蛋白质层，保留水层，重复4-5次。
(3)向水层中加入乙醇使醇浓度达到75％，置4℃下沉淀1小时，倾出上清液，再加入乙醇使醇浓度达到75％，如此沉淀3次，将沉淀真空冷冻干燥，得到的粉末即为菠萝蜜多糖粗品。
步骤(1)中菠萝蜜粉末可通过将菠萝蜜果肉剥离后低温烘干粉碎制得。
根据本发明的制备方法，菠萝蜜多糖粗品的得率为35-45％。
还可向本发明的菠萝蜜多糖粗品中添加适当辅料或其它成分制成片剂、胶囊等各种剂型的制剂。
因此，本发明还提供一种含有本发明的菠萝蜜多糖粗品的组合物。
本发明的菠萝蜜多糖粗品也可单独地或者与其他组分混合使用。
本发明所制备的菠萝蜜多糖粗品及其制剂可用于食品、保健食品、医药、和化妆品等方面。
实验结果表明，本发明的菠萝蜜多糖粗品无毒，且具有较为显著的增强免疫作用。
菠萝蜜多糖粗品制备实例：
称取30g菠萝蜜粉末加蒸馏水300mL，沸水浴回流提取1小时，取出3000rpm离心，倾出上清液，再加入300mL蒸馏水，如此提取3次，合并个各次上清液。将上清液水浴加热浓缩至约300mL，加入60mL氯仿及12mL正丁醇，剧烈震动，静置分层，除去下层有机溶剂及中间变性蛋白质层，保留水层，重复5次。向水层中加入乙醇使醇浓度达到75％，置4℃下沉淀1小时，倾出上清液，沉淀加蒸馏水溶解，再加入乙醇使醇浓度达到75％，如此沉淀3次，将沉淀冷冻真空干燥，得到的粉末即为本发明产物菠萝蜜多糖粗品。
菠萝蜜多糖粗品组成分析实例：
(1)菠萝蜜多糖粗品中多糖种类的分析(凝胶柱色谱法)：取菠萝蜜多糖粗品0.05g溶于水，上葡聚糖凝胶G-100柱，用蒸馏水洗脱，每5ml收集洗脱液一次，苯酚硫酸法测定洗脱液中多糖含量，以洗脱体积为横坐标，多糖含量为纵坐标作图，结果为单一洗脱峰，说明菠萝蜜多糖分子量均一，即菠萝蜜多糖由分子量均一的多糖成分组成。
(2)组成多糖单糖成分的鉴别：取菠萝蜜多糖粗品0.05g加1mol/L硫酸置具塞试管中，100℃水浴下封管水解6小时，取出，用固体碳酸钡中和至中性，离心，取上清液；取硅胶G铺板(CMC为黏合剂)，将上述上清液和单糖标准品样品点样，展开剂为正丁醇∶丙酮∶水＝4∶5∶1。薄层板展开后晾干，喷洒苯胺-邻苯二甲酸显色剂，置烘箱中110℃加热10min显色，在紫外灯365nm下观察，其斑点位置和比移值与葡萄糖一致，且只显示一个葡萄糖斑点，说明该菠萝蜜多糖结构中由葡萄糖一种单糖组成。
菠萝蜜多糖安全性及功能评价
1.实验仪器、试剂及药品
分析天平，灌胃器，丙酮，甲醇，4％Giemsa-磷酸缓冲液，菠萝蜜多糖粗品，本实验室自制。
2.实验动物
健康小鼠，体重18～22g(同次试验体重相差不超过4g)，雌雄各半。由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，许可证号：SCXK(湘)2006-0001。动物室温度为20～24℃，相对湿度为60～70％。鸡。
3.实验内容
3.1菠萝蜜多糖粗品的急性毒性实验
3.1.1菠萝蜜多糖粗品LD50的测定
在前期预试验基础上，取菠萝蜜多糖，加适量CMC配制成药液。取健康小鼠10只，体重18～22g，雌雄各半。以药液所能配制成的最大浓度(0.167g/ml)，最大剂量(0.8ml/20g)一次灌胃给药，连续观察7天，记录小鼠有无异常反应和死亡情况。
小白鼠灌胃后，活动自如，毛色光滑，饮食、二便均正常，连续观察7天无明显异常反应，亦无死亡。限于药物的浓度与给药体积不能再增大，不能测出其LD50，故进行最大给药量测定试验。
3.1.2菠萝蜜多糖粗品最大给药量的测定
取健康小鼠30只，根据性别、体重分层随机分成两组，受试物组20只，空白对照组10只，雌雄各半。受试物组以菠萝蜜多糖最大浓度(0.167g/ml)、最大容量(0.8ml/20g)一日内连续灌胃2次，间隔4小时；空白对照组给予相应的蒸馏水。连续观察7天，记录动物的情况。
在第一次给药后2h，个别小鼠出现大便湿软，而有个别出现多尿现象，其他指标均无异常，也无1只小鼠死亡；在灌胃2次/日后，连续7天内，给药组小鼠一切观察指标正常，未见明显中毒症状，亦无小鼠死亡，实验前后小鼠平均体重略有增加(见表1)，与对照组小鼠比较无明显差异。
表1小鼠经口灌胃菠萝蜜多糖粗品急性毒性试验的体重变化(n＝20，x±s)
| 组别 | 给药剂量 | 实验前体重 | 实验后体重 | 死亡数 |
| 样品A组 | 6.68g/kg | 19.7±0.86 | 23.1±1.12 | 0 |
| 空白对照组 | 19.8±1.02 | 22.9±2.13 | 0 |
本实验结果表明，菠萝蜜多糖粗品的LD50值难以测出，故测其最大给药量。以药物最大浓度及最大给药体积，一日内2次给小鼠灌胃给予菠萝蜜多糖，七天内小鼠未见明显的中毒症状，亦无一死亡。故测得其一日最大给药量为13.36g/kg。
3.2对小鼠免疫器官胸腺和脾脏的影响
取正常小白鼠30只，随机分成3组，每组10只，雌雄各半，各组按剂量每天一次，连续灌胃30天，称重，颈椎脱臼处死动物，剖取脾脏和胸腺，并称重，计算其脏器指数。脾指数＝脾重(mg)/体重(g)；胸腺指数＝胸腺重(mg)/体重(g)。结果见表2。
表2菠萝蜜多糖粗品对小鼠免疫器官胸腺和脾脏的影响(n＝10，x±s)
| 组别 | 剂量(g/kg) | 胸腺指数(mg/g) | 脾脏指数(mg/g) |
| 生理盐水对照组 | - | 1.52±0.336 | 3.47±0.950 |
| 菠萝蜜多糖粗品组 | 4.50 | 2.07±0.545* | 3.48±0.884 |
| 灵芝粉组 | 1.80 | 2.12±0.554* | 3.61±0.551 |
注：与空白对照组比较，*P＜0.05。
由表2可见，与空白对照组比较，菠萝蜜多糖粗品可明显提高小鼠胸腺指数，(P＜0.05)；对脾脏指数无明显影响作用。
3.3对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
无菌操作下，自鸡翼下静脉采血，搅拌去除血纤维，加生理盐水适量，用生理盐水洗涤3次，前2次离心速度为1500rpm，离心5min，弃上清液和界面的白细胞层。最后再连续2次离心(2000rpm，5min)直至红细胞区值恒定，用生理盐水配成体积分数为20％的红细胞悬液。
取小鼠30只，并随机分为3组，雌雄各半，各组小鼠分别根据体重灌胃给药，连续30天，实验前一天，用剪毛剪将每只小鼠腹部同一部位毛去掉，于末次给药后30min，腹腔注射20％鸡红细胞悬液1mL。间隔30min，颈椎脱臼促死动物，将其仰位固定鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃生化培养箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未粘片的细胞。晾干，以1∶1(v/v)丙酮甲醇溶液固定，用4％Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。用t检验进行组间方差分析。结果见表2。
表2菠萝蜜多糖粗品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(n＝10，x±s)
注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
由表2表明，与空白对照组比较，菠萝蜜多糖粗品可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数(P＜0.05，P＜0.01)。
菠萝蜜多糖粗品(4.5g/kg)可显著增加小鼠胸腺的重量，提高小鼠胸腺指数，明显增强小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬功能。(P＜0.05)。实验结果提示菠萝蜜多糖粗品对小鼠的免疫力具有一定的增强作用。
Claims (7)
1.一种菠萝蜜多糖粗品，其特征在于，该粗多糖由单一多糖成分组成，且该多糖结构中由葡萄糖一种单糖组成。
2.如权利要求1所述的菠萝蜜多糖粗品，其特征在于，所述菠萝蜜多糖粗品中精制后的多糖占总多糖含量的50-60％。
3.一种含权利要求1-3任一项所述的菠萝蜜多糖粗品的组合物。
4.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物为片剂、胶囊等各种剂型的制剂。
5.如权利要求1-3任一项所述的菠萝蜜多糖粗品的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)取菠萝蜜粉末，加入10-30倍量水，100℃水浴回流提取1小时，取出3000rpm离心，倾出上清液，再加入10-30倍量水，如此提取3次，合并个各次上清液。
(2)将上清液水浴加热浓缩至约原菠萝蜜粉末重量的10倍，加入浓缩液1/5体积的氯仿及氯仿1/5体积的正丁醇，剧烈震动，静置分层，除去下层有机溶剂及中间变性蛋白质层，保留水层，重复4-5次。
(3)向水层中加入乙醇使醇浓度达到75％，置4℃下沉淀1小时，倾出上清液，再加入乙醇使醇浓度达到75％，如此沉淀3次，将沉淀真空冷冻干燥，得到的粉末即为菠萝蜜多糖粗品。
6.如权利要求5，步骤(1)中菠萝蜜粉末可通过将菠萝蜜果肉剥离后低温烘干粉碎制得。
7.如权利要求1-3任一项所述的菠萝蜜多糖粗品用于制备增强免疫作用制剂的用途。
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