CN101889549A - 一种人工接种离体鉴定菊花白锈病抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人工接种离体鉴定菊花对菊花白锈病抗性的方法，方法步骤是：A.采用500ml宽口玻璃瓶作为离体培养容器。B.液体培养基和固体培养基分别配制，培养基组合时，固体培养基在下，液体培养基在上。C.剪取健康且无菊花白锈病病原菌感染的菊花茎段。D.摘取带有冬孢子堆的菊花叶片。E.用手指摩擦感病叶片冬孢子堆上的冬孢子，将其接种于待测菊花叶片。F.将接种好病原菌的菊花茎段扦插于装有固、液组合培养基的培养瓶内，17-21℃下，24h黑暗后，进行培养室内每天1000Lx光强下16h，黑暗8h的培养。G.培养15天后，肉眼观察待测菊花叶片上有无冬孢子堆。本发明建立了人工接种离体鉴定菊花白锈病抗性的方法，克服了菊花白锈病抗性鉴定的安全隐患，实现了在可控条件下安全有效地鉴定不同菊花品种对菊花白锈病的抗性。

Description

一种人工接种离体鉴定菊花白锈病抗性的方法
技术领域
本发明属于花卉抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种人工接种离体鉴定不同菊花品种对于菊花白锈病抗性的方法。
背景技术
菊花(Dendranthema morifolium)是我国传统十大名花和世界四大鲜切花之一，具有重要的人文、经济和社会价值。菊花白锈病(CWR，chrysanthemum white rust)是世界性检疫病害，也是危害菊花的首要病害之一。
菊花白锈病由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起，病原菌主要危害菊花叶片，发病快，毁灭性强。日本最早于1895年发现该病。我国1963始在上海发现，随后在山东、杭州、吉林、沈阳、大连、丹东、兰州等地均报道了该病的严重发生。荷兰、英国、比利时、加拿大等欧美国家均有严重发生该病的相关报道。目前，该病的排查与综合防治已经引起了世界各国健康及检疫组织的高度关注。
不同菊花品种对于菊花白锈病的抗、感程度不同，采用科学有效的方法评价和鉴定不同菊花品种的抗病性，对于筛选抗病菊花资源和培育抗病菊花新品种具有重要意义。然而，菊花白锈病的病原菌只能在菊花组织上存活，不能在培养基中离体培养；而且，由于菊花白锈病为检疫性病害，开放式活体接种容易造成该病的大规模发生和扩散，造成毁灭性灾害。这使得该病的抗性鉴定极其困难。因此，寻求一种在可控条件下接种和鉴定该病的有效方法是科学评价和筛选抗病菊花材料的关键。
综上可见，如果能找到离体可控条件下接种鉴定菊花对菊花白锈病抗性的方法，则可以科学有效地评价不同菊花品种对于菊花白锈病的抗、感程度，为筛选抗病菊花资源提供科学方法，为选育出抗病菊花新品种提供科学指导。目前尚未见到利用田间栽培的菊花茎段通过人工离体接种鉴定菊花白锈病抗性的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工接种离体鉴定菊花白锈病抗性的方法，使在可控条件下快速有效地鉴定不同菊花品种对于菊花白锈病的抗性。
本发明提供的技术方案如下：
A.培养容器准备：采用500ml宽口玻璃瓶作为离体培养容器。
B.培养基配制与组合：液体培养基和固体培养基分别配制，然后进行培养基组合，培养基组合时，固体培养基在下，液体培养基在上。用封口膜封口后，用高压灭菌器于121℃下灭菌20分钟。
C.待测菊花的采集：剪取健康且无菊花白锈病病原菌感染的菊花茎段，其上需有3-5个刚刚完全展开的叶片。
D.病原菌采集：摘取带有冬孢子堆的菊花叶片。
E.接种：用手指摩擦感病叶片冬孢子堆上的冬孢子，将其接种于待测菊花叶片。
F.培养：将接种好病原菌的菊花茎段扦插于装有固、液组合培养基的培养瓶内，17-21℃下，24h黑暗后，进行培养室内每天1000Lx光强下16h，黑暗8h的培养。
G.观察鉴定：培养15天后，肉眼观察待测菊花叶片上有无冬孢子堆。
上述培养基组合时，将固体培养基趁热分装，待其凝固后，再分装液体培养基，并使固、液体培养基的厚度分别为0.8-1.2cm和0.4-0.6cm。
本发明的积极效果是：建立了人工接种离体鉴定菊花白锈病抗性的方法，克服了菊花白锈病抗性鉴定的安全隐患，实现了在可控条件下安全有效地鉴定不同菊花品种对菊花白锈病的抗性，对于菊花资源的抗病性筛选及抗病新品种的培育具有重要的科学指导意义。
具体实施方式
实施例1：
成功离体接种鉴定了菊花品种‘芬华笑日’对菊花白锈病的抗性，认定了菊花品种‘芬华笑日’对菊花白锈病表现为感病。
实施具体方法如下：
A.培养容器准备。
用500ml宽口玻璃瓶作为离体培养容器。先用自来水水将玻璃瓶洗刷干净，再用蒸馏水冲洗3遍。
B.培养基配制与组合。
1.培养基的基本组分：1/2MS培养基的大量元素部分。
具体含量为：硝酸铵(NH4NO3)825mg/L，硝酸钾(KNO3)950mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)220mg/L，硫酸锰(MgSO4·7H2O)185mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)850mg/L。
2.培养基的配制方法
液体培养基配制：分别称取硝酸铵825mg、硝酸钾950mg、氯化钙220mg、硫酸锰185mg、磷酸二氢钾850mg，然后将上述物质分别溶解于150ml蒸馏水；再将上述5种溶液混合；最后用蒸馏水定容于1000ml容量瓶，即成液体培养基。
固体培养基配制：首先配制1000ml液体培养基，再称取6g琼脂粉于液体培养基中，微加热使之充分溶解，即成固体培养基。
3.培养基组合方法
首先趁热将固体培养基分装于培养容器中，厚度0.8-1.2cm。待培养容器中的固体培养基凝固后，再分装液体培养基，液体培养基的液面厚度为0.4-0.6cm。此时固体培养基在下，液体培养基在上。用封口膜封口后，用高压灭菌器于121℃下灭菌20分钟，待用。
C.待测菊花茎段的采集。
选取健康且无菊花白锈病病原菌感染的菊花品种‘芬华笑日’的脚芽萌蘖苗，用剪刀剪取10cm茎段，其上需带有3-5个刚刚完全展开的叶片。
D.病原菌采集。
病原菌取自带有菊花白锈病病原菌冬孢子堆的菊花品种‘神马’的叶片。
菊花叶片受菊花白锈病病原菌侵染后，在叶背处形成直径为1-5mm肉眼可见的冬孢子堆。采集感病叶片时，自叶柄基部摘取。
E.病原菌接种。
用手指摩擦感病叶片的冬孢子堆，刮取冬孢子，然后将冬孢子涂抹于待测‘芬华笑日’叶片的上、下表皮。
F.培养。
将接种好病原菌的菊花茎段，用长把镊子垂直扦插于装有组合培养基的培养瓶内，随即用无菌蒸馏水喷雾，并用塑料薄膜封口保湿，置于17-21℃的环境下，保持24h黑暗后，置于光照强度为1000Lx的培养室内培养，每天光照时数为16h/d，黑暗8小时。
G.症状观察与鉴定。
培养15天后，透过玻璃瓶，肉眼可清晰见到‘芬华笑日’叶片上的白色冬孢子堆。
鉴定结果表明，菊花品种‘芬华笑日’为感病品种。
实施例2：
成功离体接种鉴定了菊花品种‘C029’对菊花白锈病的抗性，认定了菊花品种‘C029’对菊花白锈病表现为抗病。
实施具体方法如下：
A.在实施中，培养容器准备、培养基配制与组合、待测菊花茎段采集、病原菌采集、病原菌接种与培养的具体方法同实例1。所不同的是，培养15天后，待测菊花品种‘C029’叶片上未见冬孢子堆出现。
鉴定结果表明，菊花品种‘C029’为抗病品种。
B.抗病性鉴定的田间检验。
1.试验小区设计
在日光温室的隔离区内，将健康未感染菊花白锈病的‘芬华笑日’和‘C029’分别排列成1行；在‘芬华笑日’和‘C029’的行间用1行发病的‘神马’分隔；再用2行‘神马’排列在两个边行，以便充分接种。这样，整个试验小区共5行，每行均3盆。
2.接种与管理
叶面用自来水喷雾后，将整个试验小区覆盖透明塑料薄膜保湿，此时完成了模拟自然接种。隔离区温度17-21℃。接种后遮荫24h后，正常接收自然光照。
3.观察与鉴定
接种20天后观察，原来未发病的‘芬华笑日’盆栽苗叶片上开始出现冬孢子堆，而‘C029’上无任何可见症状；直至接种后30天，‘C029’叶片上仍无冬孢子堆，此时‘芬华笑日’叶片上的无冬孢子堆已出现明显蔓延，出现严重的发病症状。
由此可以认定，A中菊花品种‘C029’的人工离体接种鉴定方法是准确可靠的。
以上在两个代表性菊花品种上的实施应用结果表明，本发明方法是一种有效鉴定菊花白锈病抗性的人工接种离体鉴定方法，能很好地评价不同菊花品种对菊花白锈病的抗性，对于抗病菊花资源筛选和培育抗病新品种具有重要的科学指导意义。

Claims (2)

1.一种人工接种离体鉴定菊花白锈病抗性的方法，其特征在于：
A.培养容器准备：采用500ml宽口玻璃瓶作为离体培养容器；
B.培养基配制与组合：液体培养基和固体培养基分别配制，然后进行培养基组合；培养基组合时，固体培养基在下，液体培养基在上，封口后，用高压灭菌器于121℃下灭菌20分钟；
C.待测菊花的采集：剪取健康且无菊花白锈病病原菌感染的菊花茎段，其上需有3-5个刚刚完全展开的叶片；
D.病原菌采集：摘取带有冬孢子堆的菊花叶片；
E.接种：用手指摩擦感病叶片冬孢子堆上的冬孢子，将其接种于待测菊花叶片；
F.培养：将接种好病原菌的菊花茎段扦插于装有固、液组合培养基的培养瓶内，17-21℃下，24h黑暗后，进行培养室内每天1000Lx光强下光照16h、黑暗8h的培养；
G.观察鉴定：培养15天后，肉眼观察待测菊花叶片上有无冬孢子堆。
2.根据权利要求1所述的人工接种离体鉴定菊花白锈病抗性的方法，其特征在于：培养基组合时，将固体培养基趁热分装，待其凝固后，再分装液体培养基，并使固、液体培养基的厚度分别为0.8-1.2cm和0.4-0.6cm。
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