CN101888776A

CN101888776A - 治疗或预防炎性病症的方法和组合物

Info

Publication number: CN101888776A
Application number: CN200880117461XA
Authority: CN
Inventors: C·颜; J·-D·李; B·伯克; K·焦; X·徐
Original assignee: University of Rochester
Current assignee: University of Rochester
Priority date: 2007-09-20
Filing date: 2008-09-16
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2028-09-16
Also published as: CA2703019A1; US9682070B2; US9241932B2; US20160256444A1; CN101888776B; US20140296273A1; US20100221340A1; EP2203057A4; WO2009039069A1; EP2203057A1

Abstract

公开了用于治疗或预防患者中的炎性病症的药物组合物和方法。药物组合物和方法包括单独使用长春胺或长春胺衍生物，或者与一个或多个另外的治疗剂(包括类固醇(优选皮质类固醇)、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和非甾体抗炎药物)联合使用长春胺或长春胺衍生物。

Description

治疗或预防炎性病症的方法和组合物

本申请要求申请日为2007年9月20目的美国临时专利申请系列号60/973,998的优先权，通过引用全文并入本文。

政府支持声明

本发明在政府基金P01HL077789和RO1DC005843(二者皆由NationalInstitutes of Health授予)的支持下完成，政府享有本发明的一些权利。

技术领域

本发明涉及长春胺衍生物用于治疗或预防炎性病症的用途，以及用于实施这些治疗性或预防性处理的药物组合物。

背景技术

炎症是多种重要的人类疾病的标志，所述疾病例如动脉粥样硬化(Libby等人，“Inflammation and Atherosclerosis，”Circulation 105：1135-43(2002)；Libby，“Inflammation in Atherosclerosis，”Nature 420：868-74(2002))，肺的炎性疾病(Tetley，“Inflammatory Cells and Chronic Obstructive PulmonaryDisease，”Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4：607-18(2005))和关节炎(Okamoto，“NF-κB and Rheumatic Diseases，”Endocr Metab Immune DisordDrug Targets 6：359-72(2006))，等等。在过去几十年中，类固醇已经被用作主要的治疗性抗炎药。然而，虽然类固醇的确显示出有力的抗炎效应，但是过度使用类固醇也在患者中引起了严重的有害效应。因此，迫切需要开发新型抗炎剂。

核因子κB(NF-κB)是重要的转录因子，其参与调控促炎性调节子(包括细胞因子、趋化因子和吸附分子)的表达(Kunsch等人，“Oxidative Stress as aRegulator of Gene Expression in the Vasculature，”Circ Res 85：753-66(1999))，从而在调节炎性反应中发挥重要作用。NF-κB是二聚体转录因子，其由Rel-相关蛋白的同二聚体或异二聚体组成(Ghosh等人，“NF-κB and Rel Proteins：Evolutionarily Conserved Mediators of Immune Responses，”Annu Rev Immunol16：225-60(1998))。在无活性的状态时，NF-κB位于细胞质中，与抑制性亚基IκBα形成多蛋白复合物。经过外部刺激剂激活之后，炎性信号聚集在一组IκB激酶(称为IKK复合物)上。IKK复合物将IκBα的两个保守性N末端丝氨酸残基磷酸化，使其发生泛素化并被蛋白酶体降解。然后，被释放的NF-κB进入细胞核，与多种炎性反应基因的启动子区域中的κB元件相互作用，并激活其转录(Liu等人，“Nuclear Factor-κB Decoy：Infitrating the Heartof the Matter in Inflammatory Heart Disease，”Circ Res 89：850-2(2001))。因此，IκBα的磷酸化似乎是各种刺激剂聚集以调节NF-κB的中心点。

已经鉴定出两个IKK：IKKα(IKK1)和IKKβ(IKK2)，并显示它们是多蛋白IKK复合物的一部分(Mercurio等人，“IKK-1and IKK-2：Cytokine-activated IκB Kinases Essential for NF-κB Activation，”Science278：860-6(1997)；Zandi等人，“The IκB Kinase Complex(IKK)Contains TWoKinase Subunits，IKKαand IKKβ，Necessary for IκB Phosphorylation andNF-κB Activation，”Cell 91：243-52(1997))。IKKα和IKKβ均为Ser/Thr激酶，每个都直接将IκB蛋白磷酸化(Zandi等人，“Direct Phosphorylation of IκB byIKKαand IKKβ：Discrimination Between Free and NF-κB-bound Substrate，”Science 281：1360-3(1998)；Lee等人，“MEKK1 Activates both IκB Kinasealpha and IκB Kinase beta，”Proc Natl Acad Sci USA 95：9319-24(1998))。也已经鉴定出了IKK复合物中的几个其它分子，例如信号调节激酶(ERK)激酶激酶1(MEKK1)，诱导NF-κB的激酶(NIK)，NF-κB的必需调节子NEMO/IKKAP1/IKKγ，和与IKK复合物结合的蛋白(Lee等人，“MEKK1Activates both IκB Kinase alpha and IκB Kinase beta，”Proc Natl Acad Sci USA95：9319-24(1998)；Yamaoka等人，“Complementation Cloning of NEMO，aComponent of the IκB Kinase Complex Essential for NF-κB Activation，”Cell93：1231-40(1998)；Rothwarf等人，“IKK-gamma is an Essential RegulatorySubunit of the IκB Kinase Complex，”Nature 395：297-300(1998)；Mercurio等人，“IκB kinase(IKK)-associated Protein 1，a Common Component of theHeterogeneous IKK Complex，”Mol Cell Biol 19：1526-38(1999))。已经表明这些分子(作为激酶、调节蛋白或骨架蛋白发挥作用)对于将上游信号传输至IKKα和IKKβ是必需的。因此，需要鉴别这些靶标中哪些可用于调节炎症，特别是鉴别可用于治疗性调节这些靶标从而治疗或预防炎性病症的药物。

本发明旨在克服本领域中的这些缺点和其它缺点。

发明概述

本发明的第一个方面涉及治疗或预防炎性病症的方法，其包括在有效治疗或预防炎性病症的条件下向患者施用长春胺或长春胺衍生物。

优选地，当长春胺衍生物是长春西汀(vinpocetine)时，单独施用长春西汀或与另一种不是COX-2抑制剂的药剂联合施用长春西汀，并且待治疗的炎性病症不包括胃肠道炎性病症。

本发明的第二个方面涉及一种药物组合物，其包括长春胺或长春胺衍生物，以及类固醇、血管紧张素II受体(I类)拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和非甾体抗炎化合物中的一种或多种。

本文呈现的数据第一次显示：长春胺衍生物长春西汀在体外和体内通过靶向IKK而抑制NF-κB依赖性的炎性反应。长春西汀在多种细胞类型中抑制TNFα诱导的NF-κB激活以及后续的促炎性调节子诱导。长春西汀还抑制单核细胞吸附和趋化。此外，长春西汀在小鼠肺中强烈抑制TNFα或LPS诱导的炎性反应。还显示了长春西汀靶向IKK的活性不依赖于其众所周知的对磷酸二酯酶1(PDE1)活性和Ca²⁺/Na⁺调节的抑制性效应。本发明鉴别了长春西汀和其它的长春胺衍生物作为新型的抗炎剂，其通过破坏IKK途径而发挥作用，这为治疗各种NF-κB依赖性的炎性疾病或病症提供了新的治疗策略。基于这些结果预计：能够诱导IKK抑制的长春胺和其它长春胺衍生物将有类似的功用。

附图说明

图1A-D显示长春西汀在多种细胞类型中抑制TNFα诱导的NF-κB依赖性的启动子活性。在存在或不存在所标明的各种剂量的长春西汀(Vinp)(图1A)或50μM长春西汀(图1B-D)时，以TNFα(10ng/ml)或不以TNFα刺激经NF-κB-Luc报道分子质粒转染的大鼠大动脉VSMC(图1A)或血管EC(HUVEC)(图1B)、肺上皮细胞A549(图1C)和巨噬细胞RAW264.7(图1D)，刺激持续6小时。然后将细胞裂解以进行荧光素酶检验。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份进行。^*P＜0.05vs.对照；^#P＜0.05vs.单独的TNFα。

图2显示长春西汀在Hela细胞中抑制TNFα诱导的NF-κB依赖性的启动子活性。以NF-κB-Luc报道分子质粒转染Hela细胞并以TNFα或不以TNFα刺激经转染的细胞(如对于图1A-D所述)，使用各种剂量的长春西汀注射溶液(Vinp)(可注射的商售长春西汀药物组合物)。然后将细胞裂解以进行荧光素酶检验。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份进行。^*P＜0.05vs.对照；^#P＜0.05vs.单独的TNFα。

图3A-D显示长春西汀在多种细胞类型中抑制TNFα诱导的促炎性调节子的表达。在存在或不存在长春西汀(50μM)时，以TNFα(10ng/ml)或不以TNFα处理大鼠大动脉VSMC(图3A)、血管EC(HUVEC)(图3B)、肺上皮A549细胞(图3C)或巨噬细胞RAW264.7(图3D)，处理持续6小时。通过实时定量RT-PCR(Q-PCR)在mRNA水平上测定TNFα、IL-1β、IL-8、MCP-1和VCAM-1、ICAM-1、MIP-1的表达。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份进行。^*p＜0.05vs.对照；^#p＜0.05vs.单独的TNFα。

图4显示长春西汀在A549细胞中以剂量依赖性方式抑制TNFα诱导的促炎性调节子的表达。在存在或不存在所标明的各种剂量的长春西汀(Vinp)注射溶液(商售长春西汀药物组合物)时，以TNFα(10ng/ml)或不以TNFα处理A549细胞，处理持续6小时。通过Q-PCR在mRNA水平上测定TNFα、IL-1β和IL-8的表达。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份进行。^*p＜0.05vs.对照；^#p＜0.05vs.单独的TNFα。

图5A-C显示长春西汀抑制EC的单核细胞吸附和VSMC的趋化活性。图5A显示了显微镜图像，其显示U937单核细胞吸附至HUVEC，如体外吸附检验所测定。以载体(vehicle)(DMSO)或50μM长春西汀预处理HUVEC30分钟，暴露于TNFα(10ng/ml)或载体6小时。分析经TNFα或载体刺激的HUVEC上吸附的U937单核细胞。图5B定量显示了吸附至HUVEC的单核细胞。图5C显示了单核细胞朝向VSMC的趋化性，如跨孔迁移所测定。在存在或不存在各种剂量的长春西汀时，以TNFα(10ng/ml)或不以TNFα处理大鼠大动脉VSMC，处理持续9小时。收集VSMC条件化的培养基并用于在博伊登室(Boyden Chamber)中进行单核细胞的趋化性检验。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份进行。^*p＜0.05vs.对照；^#p＜0.05vs.单独的TNFα。

图6A-B显示长春西汀在体内抑制肺的炎性反应。图6A显示腹膜内(i.p.)施用长春西汀(2.5、5和10mg/kg体重)显著抑制了通过气管内(i.t.)施用LPS(2μg/小鼠)而在小鼠肺中产生的TNFα、IL-1β和MIP-2mRNA的诱导。图6B显示长春西汀(10mg/kg体重)抑制来自经LPS处理的小鼠肺的支气管肺泡灌洗(BAL)液中的多形核嗜中性粒细胞(PMN)的浸润。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD。^*P＜0.05vs.未处理组；^#P＜0.05vs.单独的LPS。

图7A-C显示长春西汀(使用可注射的长春西汀溶液)在体内抑制肺的炎性反应。图7A显示腹膜内(i.p.)施用长春西汀注射溶液(10mg/kg体重)显著抑制了通过气管内(i.t.)施用LPS(2μg/小鼠)而在小鼠肺中产生的TNFα、IL-1β和MIP-2mRNA的诱导。图7B-C显示长春西汀抑制来自经LPS处理的小鼠肺的支气管肺泡灌洗(BAL)液中的多形核嗜中性粒细胞(PMN)的浸润。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD。^*P＜0.05vs.未处理组；^#P＜0.05vs.单独的LPS。

图8A-H显示长春西汀通过靶向IKK而抑制TNFα诱导的NF-κB的激活。图8A显示长春西汀对于TNFα诱导的IκBα磷酸化和降解的影响。在存在或不存在长春西汀(50μM)时，以TNFα(10ng/ml)处理大鼠大动脉VSMC，处理持续所标明的不同的时间段(0-30分钟)。进行Western印迹分析以评价IκBα、总的IκBα-和β-肌动蛋白的磷酸化水平。图8B显示TNFα(10ng/ml)在大鼠大动脉VSMC中诱导IKK激酶活性。通过免疫复合物激酶检验来分析IKK激酶的活性。图8C显示长春西汀抑制TNFα诱导的IKK激酶活性。在存在所标明的各种剂量的长春西汀时，以TNFα处理VSMC 10分钟。图8D显示了IKK的相对活性，如所标明的那样。通过光密度扫描测定放射自显影图像中GST-IκBα带的强度。结果以对照([长春西汀]＝0)(人为设定为100％)进行校正。^*p＜0.05，^**p＜0.01vs.等于0时的长春西汀。图8E-H显示了长春西汀对于通过在VSMC中表达组成型活性形式的MEKK1(CA-MEKK1)(图8E)、IKKα(CA-IKKα)(图8F)、IKKβ(CA-IKKβ)(图8G)或WT p65(图8H)而诱导的NF-κB的激活的影响。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD。^*p＜0.05vs.载体对照组；^#p＜0.05vs.单独的CA-MEKK1、CA-IKKα、CA-IKKβ或WT p65。

图9A-B显示了长春西汀对IKK活性的抑制性效应。通过免疫复合物激酶检验来分析IKK激酶的活性。将经TNFα处理10分钟的VSMC进行免疫沉淀，从而获得IKK免疫复合物。在存在从VSMC(以所标明的各种浓度的长春西汀进行预处理)制备的细胞裂解物存在的情况下，以GST-IκBα和[γ-³²P]ATP进行激酶检验。图9A是代表性的放射自显影图像，其显示了IKK激酶的活性(上端)；Western印迹分析显示了IKKβ的水平(下端)。图9B显示了IKK的相对活性，如所标明的那样。通过光密度扫描测定放射自显影图像中GST-IκBα带的强度。结果以对照([长春西汀]＝0)(人为设定为100％)进行校正。数据代表至少三次独立实验的平均值±SD。^*p＜0.05vs.等于0时的长春西汀。

图10显示了Ca2⁺和PDE抑制剂对TNFα诱导的IKK激酶活性、IκB磷酸化和IκB降解的影响。在存在50μM长春西汀、30μM硝苯地平(Ca²⁺通道阻滞剂)、15μM IC86340(PDE1抑制剂)、2mM EGTA(细胞外Ca²⁺螯合剂)或30μM BAPTA/AM(细胞内Ca²⁺螯合剂)的情况下，以TNFα(10ng/ml)处理大鼠大动脉VSMC 10分钟。代表性放射自显影图像显示了IKK激酶的活性(通过所述的IKK免疫复合物激酶检验进行分析)。进行Western印迹分析以评价磷酸化的IκBα、总的IκBα-和β-肌动蛋白的水平。数据代表至少三次独立实验。

图11显示长春西汀减少了在体内抑制肺的炎性反应的地塞米松的剂量。腹膜内(i.p.)单独施用地塞米松(500μg/kg体重)或与长春西汀(5mg/kg体重)联合施用显著抑制了通过气管内(i.t.)施用LPS(2μg/小鼠)而在小鼠肺中产生的TNFα、IL-1β和MIP-2mRNA的诱导。数据代表平均值±SD，n＝3。^*P＜0.05vs.未处理组；^#P＜0.05vs.单独的LPS。

图12是一个示意图，其显示了长春西汀如何在体外和体内抑制NF-κB依赖性的炎性反应。如所标明的，长春西汀通过靶向IKK而抑制NF-κB依赖性的炎性反应，这不依赖于其众所周知的对PDE1和Ca²⁺调节的作用。

发明详述

本发明涉及治疗或预防炎性病症的方法，其包括在有效治疗或预防炎性病症的条件下向患者施用长春胺或长春胺衍生物。本文还公开了可用于本发明方法的药物组合物。

如本文所用，患者可以是任何哺乳动物，但优选地哺乳动物是人、非人灵长类、啮齿类、牛、马、绵羊或猪。根据本发明也可以治疗其它哺乳动物。

如本文所用，长春胺衍生物可以是任何已知的或今后开发的能够诱导IKK抑制的长春胺衍生物。所诱导的IKK抑制可由长春胺衍生物直接或间接引起。直接是指所施用的衍生物作用于IKK本身，而间接是指衍生物的代谢物拮抗IKK，或者衍生物(或其代谢物)所作用的天然细胞成分拮抗IKK。因此，通过诱导的IKK抑制，长春胺或长春胺衍生物可用于治疗NF-κB所介导的炎性病症。

长春胺具有以下结构：

如何从小蔓长春花(Vinca minor L.)的叶子中回收长春胺是本领域熟知的。已经合成了一些长春胺衍生物，它们对于治疗性施用有良好耐受。在National Center for Biotechnology Information的PubChem Substance数据库中列出了一些已知的长春胺衍生物。这些包括但不限于，酯侧链的衍生物、A环的衍生物(以包括一个或多个卤素、羟基或烷基取代基)、C环的衍生物(以包括酮基或羟基取代基)、D环的衍生物(以包括一个或多个羟基或烷基取代基，含有或不含有D环的不饱和)和E环的不饱和。

优选的长春胺衍生物是那些共同具有直接或间接诱导IKK抑制(即拮抗)的能力的衍生物。可以在体外通过IKK激酶检验测定IKK的拮抗剂，如随附的实施例和其它地方所描述(参见Shishodia等人，“Ursolic AcidInhibits Nuclear Factor-κB Activation Induced by Carcinogenic Agents throughSuppression of IκBα kinase and p65 Phosphorylation：Correlation withDown-regulation of Cyclooxygenase 2，Matrix Metalloproteinase 9，and CyclinD1，”Cancer Res.63(15)：4375-83(2003)，通过引用全文并入本文)。可以通过在摄取长春胺衍生物之后回收细胞裂解物并测定细胞裂解物拮抗IKK的能力而测定长春胺衍生物间接拮抗IKK的能力；细胞裂解物包含长春胺衍生物的代谢物或长春胺衍生物或其代谢物所作用于的天然细胞成分，当长春胺衍生物或其代谢物作用于该细胞成分时，抑制IKK。

示例性的长春胺衍生物包括但不限于：

(i)

(+)-长春西汀或其盐；

(ii)

(-)-象牙酮宁(也称为长春布宁)或其盐；

(iii)

象牙胺(eburnamine)或其盐；

(iv)

象牙烯宁或其盐；

(v)

二氢象牙烯宁或其盐；

(vii)

阿扑长春胺酸(apovincaminic acid)或其盐；

(viii)

阿扑长春胺或其盐；

(ix)

溴长春胺或其盐；

(x)

长春布醇(也称为RU-24722)或其盐；

(xi)

亚甲基甲氧基阿扑长春胺酸(methylenemethoxyapovincaminate)(也称为MR-711)或其盐；

(xii)

(3S，16R)-二氢-象牙烯宁-4-甲醇(也称为RGH-0537)或其盐；

(xiii)

(1S，12S)-吲哚并喹嗪基-1-甲醇(也称为RGH-2981或长春培醇)或其盐；

(xiv)

其中R₁是卤素，R₂可以是羟基基团，而R₃可以是氢，或R₂和R₃一起在携带它们的碳原子之间形成另外的键；或其盐(如Hannart的美国专利4,285,949中所描述，通过引用全文并入本文)；

(xv)

其中该化合物通过D/E环的顺式稠合而形成，并且(i)Y是氢，在这种情况下Z₁和Z₂一起同时代表氧原子，或Z₁是甲氧基羰基基团且Z₂是羟基基团；或(ii)Y和Z₂一起形成碳-碳键且Z₁是甲氧基羰基基团；或其盐(如Sevenét等人的美国专利4,033,969所描述，通过引用全文并入本文)；

(xvi)

其中R₄是氢或羟基基团，R₅是烷基基团；或其盐(如Toyomaki等人的美国专利4,364,947所描述，通过引用全文并入本文)；

(xvii)

其中R₆是氢或甲氧基，X和Y是氢或者X和Y一起形成它们所结合的环碳原子之间的双键；或其盐(如Heymès等人的美国专利4,145,552所描述，通过引用全文并入本文)；和

(xviii)任意两个或更多个以上化合物或其盐的组合。

长春胺衍生还可以是盐的形式，优选为药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指那些保持游离碱或游离酸的生物学有效性和性质的盐，其在生物学上或其它意义上不是不合需要的。盐是与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)和有机酸(例如，乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、乙醛酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、苯乙烯酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲基苯磺酸、水杨酸、N-乙酰半胱氨酸等)形成的。其它的盐对于本领域技术人员是已知的且可以容易地调整以用于本发明。

术语“长春胺衍生物”还包括长春胺或其衍生化合物的前药。“前药”是指在体内被转化成母药的药剂。通常使用前药，因为在一些情况下，前药比母药更容易施用。例如，前药可能通过口服施用而成为生物可利用的，而母药不行。在药物组合物中，前药还可能具有相对于母药改善的溶解性，或者被证明更加美味或更容易配制。举例来说(而非限于此)，前药是这样的本发明的化合物：其以酯(“前药”)施用以促进穿越细胞膜的输送，在细胞膜那里水溶性对于移动性是有害的；而一旦进入细胞内(在细胞内水溶性是有利的)，则前药被代谢水解为活性体，例如羧酸衍生物。前药的另一个例子可以是与酸基团结合的短的肽(多聚氨基酸)，其中肽被代谢以提供活性部分。

术语“长春胺衍生物”还包括这些化合物的任何活性代谢物。例如，如随附的实施例中所证明，长春西汀本身不抑制IKK活性；而来自于经长春西汀处理的细胞的细胞裂解液确实抑制IKK活性。相信细胞裂解液中包含具有所需活性的长春西汀代谢物。

还应该认识到其它的长春胺衍生物也可以用于本发明。

取决于炎症的位点，可能需要使用外围活性的(peripherally active)长春胺衍生物，例如RGH-0537和RGH-2981(二者已在上文中列出)。在另一个具体实施方式中，可以使用那些能够穿越血液-脑屏障的长春胺衍生物，例如长春西汀。

根据一个具体实施方式，长春胺衍生物是长春西汀，但是长春西汀不与任何其它治疗剂(下文中有描述)联合使用。长春西汀是通过稍微改变长春胺(一种从长春花属(Periwinkle)植物小蔓长春花(Vinca minor)中提取的生物碱)分子而产生的。长春西汀最初在1978年被发现并以商品名Vavinton(匈牙利)上市。从那以后，由于其有益的脑血管效应和神经保护属性，长春西汀在很多国家被广泛用于预防性治疗脑血管疾病和认知损伤，包括中风、老年性痴呆和记忆障碍(

等人，“Role of Sodium Channel Inhibition inNeuroprotection：Effect of Vinpocetine，”Brain Res Bull 53：245-54(2000)，每篇通过引用全文并入本文)。例如，在世界范围内不同类型的含有长春西汀的记忆增强剂(在欧洲被称为

在日本被称为

)现在已经被用作膳食补充。长春西汀是改善脑部血流的脑血管舒张剂(

等人，“Role of Sodium Channel Inhibition in Neuroprotection：Effect ofVinpocetine，”Brain Res Bull 53：245-54(2000)，每篇通过引用全文并入本文)。还已经表明长春西汀通过增强从血液中摄取氧和葡萄糖并增加神经元的ATP生物能的产生而用作脑代谢增强剂(等人，“Role of SodiumChannel Inhibition in Neuroprotection：Effect of Vinpocetine，”Brain Res Bull53：245-54(2000)，每篇通过引用全文并入本文)。长春西汀似乎具有多个细胞靶标，例如Ca²⁺/钙调蛋白-刺激的磷酸二酯酶(PDE1)，电压门控的钠离子通道和钙离子通道(

等人，“Role of Sodium Channel Inhibition inNeuroprotection：Effect of vinpocetine，”Brain Res Bull 53：245-54(2000)，每篇通过引用全文并入本文)。到目前为止，没有关于在治疗性剂量上的显著性的副作用、毒性或禁忌症的报道(Balestreri等人，“A Double-blind PlaceboControlled Evaluation of the Safety and Efficacy of vinpocetine in theTreatment of Patients with Chronic Vascular Senile Cerebral Dysfunction，”JAm Geriatr Soc 35：425-30(1987)，通过引用全文并入本文)。

根据另一个具体实施方式，长春胺衍生物是长春西汀，其与有效量的另一种能够用于治疗炎症的药剂联合使用，其中这样的药剂不是COX-2抑制剂。示例性的药剂在下文中列出。

根据另一个具体实施方式，长春胺衍生物是除了长春西汀以外的长春胺衍生物。很多以上列出的其它的长春胺衍生物也被鉴定为血管舒张剂(Vas等人，“Eburnamine Derivatives and the Brain，”Med Res Rev.25(6)：737-57(2005)，通过引用全文并入本文)。本发明也考虑到除了长春西汀以外的长春胺衍生物与有效量的另一种能够用于治疗炎症的药剂联合使用。示例性的药剂在下文中列出。

本发明包括在炎症发生之前作为预防剂(例如发生外科损伤之前)或者在炎症发生之后作为治疗剂施用长春胺或长春胺衍生物。为了控制炎症的目的，优选为在发生炎性病症之后即刻施用长春胺衍生物。慢性炎性病症可以反复治疗。因此考虑到长春胺或长春胺衍生物的施用可用于在解剖学位点上减少炎症，从而控制与炎症相关的症状例如疼痛。治疗或预防炎症是指减轻炎症的程度(即严重性)(与不治疗相比)，或者缩短炎性反应的持续时间。

示例性的施药方式包括但不限于，口服、吸入、鼻内或气道滴注、经眼、鼻内、中耳注射、耳滴液、局部、透皮、非肠道、皮下、静脉内注射、动脉内注射、注射至炎症位点、皮内注射、肌内注射、胸腔内滴注、腹膜内注射、心室内、病灶内、应用至粘膜或移植缓释载体。

炎性病症可以是任何由NF-κB介导的炎性病症。示例性的炎性病症包括但不限于，动脉粥样硬化、急性和慢性肺部炎症(例如慢性支气管炎、哮喘、肺感染(包括细菌和病毒感染，例如SARS和流感病毒)、囊肿性纤维化等)、感染病毒的组织的炎症(例如病毒性肺部感染、病毒性心肌炎、病毒性脑膜炎等)、溃疡性结肠炎、内毒素休克、关节炎(例如风湿性关节炎、青少年关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、病毒性或后病毒性关节炎、僵直性脊椎关节炎等)、牛皮癣、克罗恩病、炎症性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、损伤非依赖性II型糖尿病、贫血诱导的炎症、中耳炎(中耳感染)、痛风、多发性硬化、恶病质和毛细血管扩张性共济失调症(AtaxiaTelangiestasia)。施用长春胺或长春胺衍生物以治疗其它的NF-κB介导的炎性病症也考虑在内。

当长春胺衍生物为长春西汀时，优选地，待治疗的炎性病症不是胃肠道炎性病症，例如溃疡性结肠炎、克罗恩病、炎症性肠病。

如上所述，长春胺或长春胺衍生物还可以与一种或多种治疗性制剂(包括类固醇(优选为皮质类固醇)、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和非甾体类抗炎药物(NSAID))联合施用。如上所述，明确排除已知作为COX-2抑制剂的NSAID与长春西汀的联合使用。

ACE抑制剂的作用机理是通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)(其阻止血管紧张素I转化为血管紧张素II，血管紧张素II是强烈的血管收缩剂)，从而产生较低水平的血管紧张素II，这引起血浆中肾素活性随之升高并且醛甾酮的分泌减少。如其名字所含的意义，血管紧张素受体阻滞剂(ARB)通过直接抑制血管紧张素II受体从而阻止血管紧张素II的作用而发挥作用。

术语ACE抑制剂包括任何这样的药剂或化合物，或两个或更多个这样的药剂或化合物的组合：具有抑制(部分抑制或全部抑制)生理非活性的十肽形式的血管紧张素(“血管紧张素I”)通过酶式反应迅速转化为引起血管收缩的八肽形式的血管紧张素(“血管紧张素II”)的能力。

合适的ACE抑制剂的例子包括但不限于以下的化合物：AB-103，血管紧张肽转化酶抑制肽(ancovenin)，贝那普利拉，BRL-36378，BW-A575C，CGS-13928C，CL242817，CV-5975，Equaten，EU4865，EU-4867，EU-5476，甲羟米辛，FPL 66564，FR-900456，Hoe-065，15B2，吲哚普利，酮基甲基尿素，KR1-1177，KR1-1230，L681176，赖苯普利，MCD，MDL-27088，MDL-27467A，莫维普利，MS41，烟草胺，喷托普利，非那西汀(phenacein)，匹伏普利，伦唑普利，RG-5975，RG-6134，RG-6207，RGH0399，ROO-911，RS-10085-197，RS-2039，RS 5139，RS 86127，RU-44403，S-8308，SA-291，螺普利拉，SQ26900，SQ-28084，SQ-28370，SQ-28940，SQ-31440，Synecor，乌替普利，WF-10129，Wy-44221，Wy-44655，Y-23785，Yissum，P-0154，扎普利，AsahiBrewery AB-47，alatriopril，BMS 182657，Asahi Chemical C-111，AsahiChemical C-112，Dainippon DU-1777，mixanpril，Prentyl，佐芬普利拉，I(-(1-羧基-6-(4-哌嗪基)己基)氨基)-1-氧-丙基八氢-1H-吲哚-2-羧酸(I(-(1-carboxy-6-(4-piperidinyl)hexyl)amino)-1-oxo-propyloctahydro-1H-indole-2-carboxylic acid)，Bioproject BP1.137，Chiesi CHF 1514，Fisons FPL-66564，伊屈普利，培哚普利拉和Servier S-5590，阿拉普利，苯那普利，卡托普利，西拉普利，地拉普利，依那普利，依那普利拉，福辛普利，福辛普利拉，米卡普利，赖诺普利，培哚普利，喹那普利，雷米普利，雷米普利拉，肌丙抗增压素乙酸盐，替莫普利，群多普利，群多普利拉，施瑞普利，莫昔普利，喹普利拉，螺普利，及其组合。

术语“AC抑制剂”还包括所谓的NEP/ACE抑制剂(也称为选择性或双作用的中性内肽酶抑制剂)其具有中性内肽酶(NEP)的抑制性活性和血管紧张素转化酶(ACE)的抑制性活性。特别优选的和适合用于本文的NEP/ACE抑制剂的例子为美国专利号5,508,272，5,362,727，5,366,973，5,430,145，5,225,401，4,722,810，5,223,516，5,508,272，5,552,397，4,749,688，5,504,080，5,612,359，5,525,723，5,430,145和5,679,671以及欧洲专利申请0481522，0534263，0534396，0534492和0671172中公开的那些，每篇通过引用全文并入本文

术语“血管紧张素II受体(1型)拮抗剂”包括任何这样的药剂或化合物，或两个或更多个这样的药剂或化合物的组合：其具有抑制(部分抑制或全部抑制)血管紧张素II与血管紧张素受体结合(特别是与AT₁受体结合)的能力。这些药剂也称为血管紧张素受体阻滞剂(ARB)。

合适的血管紧张素II受体拮抗剂的例子包括但不限于以下化合物：肌丙抗增压素乙酸盐，坎地沙坦西来替昔酯(candesartan cilexetil)，CGP-63170，EMD-66397，KT3-671，LR-B/081，缬沙坦，A-81282，BIBR-363，BIBS-222，BMS-184698，坎地沙坦，CV-11194，EXP-3174，KW-3433，L-161177，L-162154，LR-B/057，LY-235656，PD-150304，U-96849，U-97018，UP-275-22，WAY-126227，WK-1492.2K，YM-31472，络沙坦钾，E-4177，EMD-73495，依普罗沙坦，HN-65021，厄贝沙坦，L-159282，ME-3221，SL-91.0102，他索沙坦，替米沙坦，UP-269-6，YM-358，CGP-49870，GA-0056，L-159689，L-162234，L-162441，L-163007，PD-123177，A-81988，BMS-180560，CGP-38560A，CGP48369，DA-2079，DE-3489，DuP-167，EXP-063，EXP-6155，EXP-6803，EXP-7711，EXP-9270，FK-739，HR-720，ICI-D6888，ICI-D7155，ICI-D8731，isoteoline，KR1-1177，L-158809，L-158978，L-159874，LR B087，LY-285434，LY-302289，LY-315995，RG-13647，RWJ-38970，RWJ-46458，S-8307，S-8308，沙普立沙坦，肌丙抗增压素，sarmesin，WK-1360，X-6803，ZD-6888，ZD-7155，ZD-8731，BIBS39，C1-996，DMP-811，DuP-532，EXP-929，L-163017，LY-301875，XH-148，XR-510，佐拉沙坦，PD-123319，及其组合。

示例性的皮质类固醇包括但不限于，去炎松、氟轻松、可的松、氢化可的松、环索奈德、氟替卡松、氟尼缩松、莫米松、倍他米松、甲基泼尼松龙、地塞米松、布地奈德、倍氯米松、强的松、甲基氢化波尼松、氢化波尼松，及其组合。

示例性的NSAID包括但不限于，布洛芬(2-(异丁基苯基)-丙酸)；氨甲蝶呤(N-[4-(2，4二氨基6-喋啶基-甲基]甲基氨基]苯甲酰基)-L-谷氨酸)；阿司匹林(乙酰水杨酸)；水杨酸；苯海拉明(2-(二苯基甲氧基)-NN-二甲基乙胺盐酸盐)；萘普生(2-萘乙酸，6-甲氧基-9-甲基-，钠盐，(-))；酮咯酸(1H-吡咯里嗪(Pyrrolizine)-1-羧酸，2，3-二氢-5-苯甲酰基-，(+-))；保泰松(4-丁基-1，2-二苯基-3，5-吡唑烷二酮)；舒林酸-(2)-5-氟(fuoro)-2-甲基-1-[[对-(甲基亚磺酰基)苯基]亚甲基]-1H-茚-3-乙酸；二氟尼柳(2′，4′，-二氟-4-羟基-3-联苯羧酸；吡罗昔康(4-羟基-2-甲基-N-2-吡啶基-2H-1，2-苯并噻嗪-2-甲酰胺1，1-二氧化物，一种昔康类药物；吲哚美辛(1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-H-吲哚-3-乙酸)；甲氯灭酸钠(N-(2，6-二氯-间-甲苯基)邻氨基苯甲酸，钠盐，一水合物)；酮洛芬(2-(3-苯甲酰基苯基)-丙酸；托美丁钠(钠1-甲基-5-(4-甲基苯甲酰基-1H-吡咯-2-乙酸盐二水合物)；双氯芬酸钠(2-[(2，6-二氯苯基)氨基]苯乙酸(benzeneatic acid)，单钠盐)；羟基氯喹硫酸盐(2-{[4-[(7-氯-4-喹啉基)氨基]戊基]乙基氨基}乙醇硫酸盐(1∶1)；青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)；氟比洛芬([1，1-联苯]-4-乙酸，2-氟-α甲基-，(+-))；依托度酸(cetodolac)(1-8-二乙基-13，4，9，四氢吡喃-[3-4-13]吲哚-1-乙酸；甲灭酸(N-(2，3-二甲苯基)邻氨基苯甲酸；和苯海拉明盐酸盐(2-二苯基甲氧基-N，N-二-甲基乙胺盐酸盐)。

这些另外的治疗剂可以以单一制剂或分开的多个剂量共同施用。优选地，直接施用到炎症位点或邻近炎症位点的位点，虽然全身性施用途径也考虑在内。合适的施用方式包括以上列出的那些。

这些活性药剂优选以药物组合物的形式施用，所述药物组合物中包含一个或多个长春胺衍生物(或长春胺本身)，其可以是单独的或与一个或多个另外的活性药剂联合，还包括药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指任何合适的佐剂、载体、赋形剂或稳定剂，其可以是固体或液体的形式，例如，药片、胶囊、粉末、溶液、悬浮液或乳液。

通常，组合物将含有约0.01-99％，优选约20-75％的(一种或多种)活性化合物，以及佐剂、载体和/或赋形剂。

例如，向粘膜施用可以通过气雾喷雾器(其中含有气雾或干粉形式的活性药剂的小颗粒)实现。

固体单位剂型可以是常规类型的。固体形式可以是胶囊等，例如普通的明胶形式的胶囊，其中含有本发明的化合物和载体(例如，润滑剂和惰性填充剂，例如，乳糖、蔗糖或玉米淀粉)。在另一个具体实施方式中，这些化合物以常规的药片基底(乳糖、蔗糖或玉米淀粉)和粘合剂(如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸)和润滑剂(例如硬脂酸或硬脂酸镁)一起制成药片。

药片、胶囊等还可以包含粘合剂例如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸氢钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂型单位形式是胶囊时，除了以上类型的材料之外，其可以含有液体载体例如脂肪油。

可以存在各种其它材料作为包被或修饰剂型单位的物理形式。例如，药片可以以虫胶、糖或二者进行包被。糖浆中除了活性成分之外，可以含有蔗糖(作为甜味剂)、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯(作为防腐剂)、染料和调味料例如樱桃或橘子香料。

可以通过这些材料溶液或悬浮液(处于生理上可接受的稀释剂中)联合药学佐剂、载体或赋形剂以可注射剂量施用活性药剂。这样的佐剂、载体和/或赋形剂包括但不限于，无菌液体，例如水和油，其中加入或不加入表面活性剂和其它药学上和生理上可接受的成分。示例性的油为石油、动物、植物或合成来源的油，例如，花生油、豆油或矿物油。一般来讲，水、盐水、水性右旋糖和相关的糖溶液以及二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是可注射溶液优选的液体载体。

这些活性化合物还可以非肠道施用。可以在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)合适地混合的水中制备这些活性化合物的溶液或悬浮液。也可以在处于油中的甘油、液态聚乙二醇及其混合物中制备分散液。示例性的油为石油、动物、植物或合成来源的油，例如，花生油、豆油或矿物油。一般来讲，水、盐水、水性右旋糖和相关的糖溶液以及二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是可注射溶液优选的液体载体。在通常的储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以阻止微生物的生长。

为了用作气雾剂，可以将处于溶液或悬浮液中的本发明化合物与合适的抛射剂(例如，烃抛射剂，如丙烷、丁烷或异丁烷)和常规佐剂一起装配在加压的气雾剂容器中。本发明的材料还可以以非加压形式(例如喷雾器或雾化器)施用。

优选的药物组合物包括但不限于，(1)处于药学上可接受的载体中的长春胺衍生物和皮质类固醇；(2)处于药学上可接受的载体中的长春胺衍生物和血管紧张素II受体拮抗剂；(3)处于药学上可接受的载体中的长春胺衍生物和ACE抑制剂；(4)处于药学上可接受的载体中的除了长春西汀之外的长春胺衍生物和NSAID；(5)处于药学上可接受的载体中的长春胺衍生物和皮质类固醇与NSAID；和(6)处于药学上可接受的载体中的长春胺衍生物和皮质类固醇，以及血管紧张素II受体拮抗剂与ACE抑制剂中的一种或两种。

根据一个具体实施方式，用于治疗或预防肺部炎症的药物组合物为肺表面活性剂制剂的形式或可吸入制剂(粉末或雾化流体)的形式。

可以被修饰以包括长春胺或长春胺衍生物的合适的表面活性剂制剂的例子包括但不限于，外源性肺表面活性剂制剂(例如，(ForestLaboratories)，

(Ross Products)和

(DEY，California，USA))以及合成的肺表面活性剂制剂(例如，

(GlaxoWellcome Inc.)和ALEC)。这些表面活性剂制剂通常通过气道滴注(即插管之后)或气管内施用。

根据另一个具体实施方式，用于治疗或预防由关节炎病症引起的炎症或关节炎症的药物组合物为可注射制剂、透皮制剂或局部施用的制剂的形式。

透皮制剂包括但不限于，透皮输送系统，通常是贴剂的形式，其中含有活性药物库(depot)(处于药学上可接受的透皮载体或简单的液相载体中)，其被沉积到皮肤上，在那里被吸收。一些透皮输送系统在本领域是已知的，例如Chiang等人的美国专利6,149,935；Mitragotri等人的PCT申请公开WO2006091297；Reed等人的欧洲专利申请EP1674068；Kanios等人的PCT申请公开WO2006044206；Santini等人的PCT申请公开WO2006015299，每篇通过引用并入本文。

局部施用的制剂包括但不限于，凝胶、糊剂、霜剂、洗液、药膏、喷雾剂、粉末、油和溶液。可选地，组合物可以通过脂质体、纳米体(nanosome)或菌丝(mycel)输送。局部输送载体还可以包括一个或多个本领域已知的其它的局部可接受的添加剂。

霜剂是含有水和油并以乳化剂稳定的制剂。亲脂性霜剂被称为油包水乳剂，亲水性霜剂被称为水包油乳剂。用于油包水乳剂的霜底通常是吸附性基底，例如凡士林、地蜡或羊毛脂。用于水包油乳剂的基底一般是脂肪酸甘油单酯、二酯和三酯，或脂肪醇与肥皂、烷基硫酸盐或烷基聚乙二醇醚(作为乳化剂)。

洗液是不透明的、稀薄的、非油脂的乳液液体剂型，其用于外部施用至皮肤，通常含有基于水的载体和50％以上的挥发物，具有足够低的粘性从而可以通过倾倒而输送。洗液通常是亲水性的，含有50％以上的挥发物(按照LOD(干燥减重)法测定)。当擦到皮肤上时，洗液会迅速蒸发，产生清凉感觉。

糊剂是不透明或半透明的、粘性的、油脂乳液或悬浮液半固体剂型，用于外部施用到皮肤，其通常含有50％以上的基于烃的或基于聚乙二醇的载体和20％以下的挥发物。糊剂通常含有大比例(20-50％)的分散在脂肪或水性载体中的固体。当擦到皮肤上时，药膏倾向于不蒸发或者被吸收。

药膏是不透明或半透明的、粘性的、油脂乳液或悬浮液半固体剂型，用于外部施用到皮肤，其通常含有50％以上的基于烃的或基于聚乙二醇的载体和20％以下的挥发物。药膏通常是亲脂性的，其含有＞50％的烃或聚乙二醇作为载体，以及＜20％的挥发物(按照LOD法测定)。当擦到皮肤上时，药膏倾向于不蒸发或者被吸收。

凝胶通常是半透明的、非油脂乳液或悬浮液半固体剂型，用于外部施用到皮肤，其含有足以形成三维交联基质的量的胶凝剂。凝胶通常是亲水性的，并且含有足够量的胶凝剂，例如淀粉、纤维素衍生物、卡波姆(carbomer)、镁铝硅酸盐、黄原胶、硅胶和铝或锌肥皂。

在用于局部施用的组合物的情况下，组合物还可以包括一种或多种干燥剂、除泡沫剂；缓冲剂、中和剂、pH调节剂；着色剂；软化剂；乳化剂、乳液稳定剂和增粘剂；润湿剂；添味剂；防腐剂、抗氧化剂和化学稳定剂；溶剂；和增厚剂、增硬剂和悬浮剂，以及水或溶剂的平衡。

根据另一个适合移植的具体实施方式，药物组合物可以是聚合物基质的形式，基质中含有待施用的药剂(长春胺或长春胺衍生物)。可以通过材料的选择和载体上装载的药物的量来控制长春胺或长春胺衍生物的释放。可移植的药物输送系统包括但不限于，微球体、水凝胶、聚合物库(reservoirs)、胆固醇基质、聚合物系统和非聚合物系统。一些合适的可移植输送系统在本领域是已知的，例如Ishikawa等人的美国专利6,464,687，Guillen的美国专利6,074,673，每篇通过引用全文并入本文。

长春胺或长春胺衍生物的优选剂量为约0.01至约2mg/kg，优选为约0.05至约1mg/kg，最优选为约0.05至约0.5mg/kg。例如，10mg剂量的长春西汀可以从商业渠道获得。皮质类固醇、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂和NSAID的剂量是本领域熟知的。但是预期在一些情况下，当与长春胺或长春胺衍生物共同施用时，可以降低这些其它活性药剂的剂量。

实施例

提供以下实施例以解释本发明的具体实施方式，但是不是为了以任何方式限制本发明的范围。

用于实施例的材料和方法

反应试剂：化合物长春西汀购自BIOMOL(PA，USA)；Cavinton^TM(可注射的长春西汀组合物，50μM)购自Gedeon Richter Co.(Hungary)。重组小鼠TNFα购自Roche(Mannheim，Germany)。IC86340(PDE1抑制剂)为ICOS Inc.惠赠。抗IκBα(sc-371)和肌动蛋白(sc-1616)的多克隆抗体购自Santa Cruz(CA，USA)。抗phospho-Ser32IκBα(#9241)的多克隆抗体购自Cell Signaling(MA，USA)。IKKα和IKKβ抗体分别购自Santa Cruz(CA，USA)和Cell Signaling(MA，USA)。

细胞培养：按照以前的描述(Aizawa等人，“Role of Phosphodiesterase 3inNO/cGMP-mediated Anti-inflammatory Effects in Vascular Smooth MuscleCells，”Circ Res 93：406-13(2003)，通过引用全文并入本文)，使用酶式分离方法从250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠中分离大鼠大动脉血管平滑肌细胞(VSMC)并将细胞保持在含有10％胎牛血清(FBS)(Life Technologies，Rockville，MD)的DMEM培养基中。将处于5-10个传代的细胞用于实验。按照以前的描述(Che等人，“Insulin-like Growth Factor-1EnhancesInflammatory Responses in Endothelial Cells：Role of Gab1 and MEKK3 inTNF-α-induced c-Jun and NF-κB Activation and Adhesion MoleculeExpression，”Circ Res90：1222-30(2002)，通过引用全文并入本文)，从人类脐带静脉中分离人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC)，细胞生长于含有低血清生长补充物(Cascade Biologics，Inc.，Portland，OR)的Medium 200中。将处于4个传代的细胞用于实验。按照以前的描述(19)，将人类肺上皮细胞系A549保持在补充了的10％FBS的F-12K培养基中。巨噬细胞样细胞系(U937)和单核细胞系(THP1)生长于补充了10％FBS的RPMI 1640培养基中。小鼠巨噬细胞细胞系RAW 264.7(American Type Culture Collection，Manassas，VA)培养于补充了10％FBS的DMEM中。所有的细胞在标准条件(37℃，潮湿环境中含5％CO₂的空气中)下培养。按照以前的描述(Shuto等人，“Activationof NF-κB by Nontypeable Hemophilus influenzae is Mediated by Toll-likeReceptor 2-TAK1-dependent NIK-IKKα/β-IκBα and MKK3/6-p38MAP KinaseSignaling Pathways in Epithelial cells，”Proc Natl Acad Sci USA 98：8774-8779(2001)，通过引用全文并入本文)，将Hela细胞保持在补充了10％FBS的最低必需培养基中。

Western印迹分析：在含有20mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，0.25％Triton X-100，1mM EDTA，1mM EGTA，10mM-甘油磷酸盐，10mM NaF，100μM Na₃VO₄，1mM苄脒，2μM PMSF，1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，MO.USA)的缓冲液中通过刮擦、超声和离心(12,000g，15分钟)制备细胞裂解物。收集上清液，然后进行SDS-PAGE并以所示的抗体进行Western印迹分析。

RNA分离和实时RT-PCR：根据生产商的说明书，使用TRIzol反应剂(Invitrogen)分离总RNA。为了进行逆转录反应，使用TaqMan逆转录反应剂(Applied Biosystems)。简单来说，使用寡聚体(dT)和随机六聚体进行逆转录反应，在37℃进行60分钟，然后在42℃进行60分钟。使用SYBR GreenUniversal Master Mix进行PCR扩增。简单来说，反应按照一式两份进行，其中含有2X Universal Master Mix，1μl的模板cDNA和100nM的引物(总体积为12.5μl)，在96孔光学反应板(Applied Biosystems)中进行分析。通过比较型Ct方法获得mRNA的相对量，并以预先制备的用作内源性对照的Taqman检验反应剂(大鼠或小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶或人亲环素)(AppliedBiosystems)进行校正。下面的表1显示了引物序列。

表1：用于实时PCR序列的引物

上面所列的每个Genbank条目均通过引用全文并入本文。

双荧光素酶报道分子检验：为了测定针对TNFα的NF-κB启动子活性，将细胞植入6孔板中(1.5x10⁵细胞/孔)过夜，按照以前的描述(Aizawa等人，“Role of Phosphodiesterase 3in NO/cGMP-mediated Anti-inflammatory Effectsin Vascular Smooth Muscle Cells，”Circ Res 93：406-13(2003)，通过引用全文并入本文)，使用FuGENE6转染反应剂(Roche，Mannheim，Germany)或TransIT-LT1转染反应剂(Mirus Bio)，以NF-κB启动子-荧光素酶构建体或对照荧光素酶构建体pRL-TK(Promega，CA，USA)瞬间转染细胞。pFC-MEKK1来自于Stratagene。将转染的细胞进行血清饥饿处理48小时，然后暴露于TNFα6小时。使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，CA，USA)测定细胞提取物中的萤火虫和海肾荧光素酶活性。然后将NF-κB启动子驱动的萤火虫荧光素酶活性根据对照海肾荧光素酶活性进行校正，以此来计算相对荧光素酶活性。来自所有实验的数据均为至少三个独立实验组的相对荧光素酶活性(平均数±S.D.)，每组重复测定三次。

免疫沉淀和体外IKK激酶检验：按照上文所述制备细胞裂解物。以1-2μg的抗-IKKα(Santa Cruz，CA，USA)将1mg细胞裂解物孵育1-2小时，然后以50μl 50％的浆蛋白A/G加琼脂再孵育1个小时，或者在4℃孵育过夜。然后以裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物两次，以不含ATP的激酶缓冲液洗涤一次。在30℃，在存在底物GST-IκBα(AA 1-54)(由Dae-Myung Jue，CatholicUniversity of Korea惠赠)的情况下，在含有20mM HEPES(pH 7.7)，2mMMgCl₂，2mM MnCl₂，10μM ATP，5μCi的[γ-³²P]ATP(Amersham Biosciences，NJ，USA)，10mM甘油磷酸盐，10mM NaF，100μM Na₃VO₄，1mM苄脒，2μM PMSF，1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，MO，USA)的激酶缓冲液中进行体外激酶检验，持续30-60分钟。通过12％SDS-PAGE将蛋白分离并进行放射自显影。在NIH Image 1.60中对GST-IκBα的磷酸化程度进行定量。

单核细胞吸附和趋化性检验：为了进行单核细胞吸附检验，将HUVEC植于以2％明胶包被的6孔板中并培养至汇合。在50μM的长春西汀中将细胞孵育30分钟，然后以10ng/ml的TNFa处理6个小时。以无血清的RPMI1640培养基将人U937细胞洗涤3次。向孔中加入大约1ml的细胞(20,000细胞/ml)并孵育20分钟。使用无血清的RPMI 1640培养基将孔中未吸附的细胞洗3次，将其洗掉。按照以前的描述(Che等人，“Insulin-like Growth Factor-1Enhances Inflammatory Responses in Endothelial Cells：Role of Gab 1andMEKK3in TNF-α-induced c-Jun and NF-κB Activation and Adhesion MoleculeExpression，”Circ Res 90：1222-30(2002)，通过引用全文并入本文)，数出在每个孔中随机选择的5个光学视野内的吸附的细胞数。在显微镜(Olympus)下获取板中的细胞的相差显微镜图片。

为了进行单核细胞趋化性检验，使大鼠大动脉VSMC在12孔培养皿中的正常培养基中生长直至达到70-80％汇合度，然后在无血清培养基中生长至少16个小时。然后以各种剂量的长春西汀或载体预处理VSMC 30分钟，以TNFα(10ng/ml)刺激9个小时。收集每个孔中的条件化培养基以用于进一步的趋化性检验。在24孔博伊登室(Corning Life Science，NY，USA)(其中含有孔尺寸为5μm的聚碳酸酯过滤膜)中通过跨孔迁移进行单核细胞趋化性检验。向下端的室的每个孔中(一式两份)加入600μl的每种VSMC-条件化培养基。向上端的室的每个孔中加入100μl的单核细胞(THP-1)等份(10⁶细胞/100μl/孔)。孵育90分钟后，通过离心收集每个孔的下表面上的迁移的THP-1细胞，并在显微镜下直接进行细胞计数。实验一式三份进行。

肺部炎症的小鼠模型：C57BL/6小鼠购自NCI，按照以前的描述(Ishinaga等人，“TGF-βInduces p65 Acetylation to Enhance Bacteria-inducedNF-κB Activation，”EMBO J 26：1150-62(2007)，通过引用全文并入本文)，在本研究中使用7-8周龄的小鼠。麻醉之后，通过气管内方式将处于50μl PBS载体中的脂多糖(LPS，大肠杆菌血清型055:B5，每只小鼠2μg，Sigma)或TNFα(每只小鼠500ng)或同体积的盐水(作为对照)接种至小鼠，持续6个小时。在气管内接种LPS或TNFα之前2个小时，通过腹膜内途径施用长春西汀(10mg/kg体重)或等体积的载体对照。收集肺组织，然后储存于-80℃以进行mRNA表达分析。为了进行多形核嗜中性粒细胞(PMN)募集分析，使用无菌PBS通过插管进行支气管肺泡灌洗(BAL)，细胞离心(ShandonCytospin4，Thermo Electronic Co.)后，使用Hemacolor(EM Science)将来自BAL的细胞染色。每组接种使用三只小鼠。所有的动物实验均经过罗切斯特大学动物护理和使用学院委员会(institutional Animal Care and UseCommittee)的批准。

统计学分析：数据以平均值±S.D.表示。以StatView 4.0软件包(ABACUS Concepts，Berkeley，CA)进行统计学评价。p＜0.05视为显著性差异。

实施例1：长春西汀在多种细胞类型中抑制NF-κB的激活

因为NF-κB在调节炎性反应中具有重要作用，所以研究了长春西汀是否通过抑制NF-κB而作为抗炎剂。首先在多种细胞类型中使用荧光素酶报道分子质粒评价长春西汀对于NF-κB依赖性启动子活性的影响。如图1A所示，在血管平滑肌细胞(VSMC)中，长春西汀以剂量依赖性方式强烈抑制TNF-α诱导的NF-κB依赖性启动子的活性。在人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC，图1B)、人肺上皮A549细胞(图1C)和巨噬细胞细胞系(RAW264.7)(图1D)中也观察到了相似的结果。与TNF-α相似，IL-1和LPS诱导的NF-κB依赖性启动子的活性同样被长春西汀抑制。应该注意：在所测的剂量没有观察到对于细胞形态和存活性的显著性细胞毒性效应。

使用基本上相同的程序在HeLa细胞中重复这个实验，不同的是使用各种剂量的商售(可注射)长春西汀药物组合物。观察到的结果显示出对于TNF-α诱导的NF-κB依赖性启动子活性的剂量依赖性抑制(图2)，这与图1A-D中显示的结果是一致的。

实施例2：长春西汀在多种细胞类型中抑制TNF-α诱导的促炎性调节子

接下来测定了长春西汀是否也在mRNA水平上抑制TNF-α诱导的NF-κB依赖性促炎性调节子(包括细胞因子、趋化因子和吸附分子)的上调。如图3A所示，在VSMC中，长春西汀强烈抑制TNF-α诱导的TNF-α、IL-1β、IL-8、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和血管细胞吸附分子1(VCAM-1)的表达，如实时RT-PCR分析所检测。类似地，还发现长春西汀在HUVEC中抑制TNF-α诱导的TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、VCAM-1和细胞间吸附分子1(ICAM-1)的表达(图3B)，A549细胞中TNF-α、IL-1β和IL-8的表达(图3C)以及RAW264.7中TNF-α、IL-1β和巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)的表达(图3D)。

使用基本上相同的程序在A549细胞中重复这个实验，不同的是使用了各种剂量的商售(可注射)长春西汀药物组合物。观察到的结果显示出对于TNF-α诱导的TNF-α、IL-1β和IL-8的剂量依赖性抑制(图4)，这与图3A-D中显示的结果是一致的。

实施例3：长春西汀抑制EC的单核细胞吸附和VSMC的趋化活性

为了进一步研究长春西汀对于促炎性调节子的诱导的抑制性效应的生理结果，分别测定了EC和VSMC中的单核细胞吸附和趋化活性。已经知道这些细胞类型依赖于吸附分子(例如ICAM-1和VCAM-1)和趋化因子(例如MCP-1)(Kunsch等人，“Oxidative Stress as a Regulator of Gene Expressionin the Vasculature，”Circ Res 85：753-66(1999)，通过引用全文并入本文)。如图5A-B所示，长春西汀强烈抑制单核细胞向HUVEC的吸附，如吸附检验所测定。此外，长春西汀还以剂量依赖性方式抑制TNF-a诱导的单核细胞向VSMC的趋化性(图5C)，如通过博伊登室跨孔迁移所测。

实施例4：长春西汀在体内抑制肺部炎性反应

为了进一步确认长春西汀是否在体内抑制炎性反应，使用完善的小鼠模型(Ishinaga等人，“TGF-βInduces p65 Acetylation to Enhance Bacteria-inducedNF-κB Activation，”EMBO J26：1150-62(2007)，通过引用全文并入本文)测定了长春西汀对于LPS(一种众所周知的肺部炎症的强烈诱导剂)诱导的肺部炎症的影响。如图6A所示，腹膜内(i.p)施用的长春西汀以剂量依赖性方式抑制小鼠肺中通过气管内(i.t)施用LPS产生的TNF-α、IL-1β和MIP-2mRNA表达的诱导。与这些结果一致，长春西汀也显著抑制来自LPS处理小鼠的肺的支气管肺泡灌洗(BAL)液中多形核嗜中性粒细胞(PMN)的浸润(图6B)。类似地，长春西汀也抑制小鼠肺中通过气管内(i.t)施用TNF-α产生的这些炎性调节子和PMN浸润的诱导。总之，很明显长春西汀在体外和体内是NF-κB激活以及产生的炎性反应的强烈抑制剂。

使用这个相同的小鼠模型，还证明了注射商售长春西汀药物组合物强烈抑制LPS诱导的促炎性调节子(包括TNF-α、IL-1β和MIP-2)的上调(图7A)以及肺中的多形核白细胞(PMN)的间质浸润(图7B-C)(使用小鼠肺部炎症模型)。这些结果与图6A-B中显示的结果是一致的。

实施例5：长春西汀通过靶向IKK而抑制TNF-α诱导的NF-κB激活

已经鉴定出长春西汀是NF-κB依赖性炎症的一种新型抑制剂，然后鉴定了长春西汀的分子靶标。由于IKK依赖性的IκBα的磷酸化和降解在调节TNFα诱导的NF-κB的激活以及后续的NF-κB依赖性促炎性调节子的上调中发挥重要作用，所以分别使用IκBα的抗-磷酸基(phospho)-Ser32抗体和总IκB抗体通过Western印迹分析检测了长春西汀对于VSMC中TNFα诱导的IκB磷酸化和IκB降解的影响。如图8A所示，TNFα以时间依赖性方式诱导IκBα的磷酸化和降解，以长春西汀预处理则强烈抑制TNFα诱导的IκBα的磷酸化和降解。在其它细胞类型(包括EC和巨噬细胞)中也观察到了相似的结果。因此，这些结果提示长春西汀通过抑制IκBα的磷酸化和降解而抑制TNFα诱导的NF-κB激活。

因为已经知道IKK是IκBα的磷酸化和降解的主要的上游激酶，所以测定了长春西汀是否通过抑制IKK而抑制IκB的磷酸化和降解。通过在TNFα刺激的VSMC中进行IKK激酶检验而确认TNFα诱导的IKK的激活。首先以抗IKKα抗体将来自经处理的VSMC的粗细胞裂解液进行免疫沉淀，然后使用GST-IKK免疫复合物在体外测定IKK激酶活性(以底物GST-IκBα孵育，存在[γ-³²P]-ATP)。如图8B所示，在未刺激的细胞中检测不到IKK活性，在TNFα处理5分钟后出现IKK活性，在10分钟时达到顶峰，然后下降。有趣的是，长春西汀以剂量依赖性方式抑制TNFα诱导的IKK活性(图8C和8D)，因此提示长春西汀在IKK的水平或者其上游而不是在IκBα的水平抑制TNFα诱导的NF-κB激活。

接下来测定了长春西汀是否通过抑制IKK或其主要上游激酶MEKK1(Nemoto等人，“Coordinate Regulation of IκB kinases by mitogen-activatedprotein kinase kinase kinase 1and NF-κB-inducing kinase，”Mol Cell Biol.18：7336-43(1998)，通过引用全文并入本文)而抑制TNFα诱导的NF-κB的激活。如图8E所示，组成型活性的MEKK1(CA-MEKK1)的过表达独自诱导强烈的NF-κB依赖性荧光素酶活性。以长春西汀预处理显著抑制CA-MEKK1诱导的NF-κB的激活，这表明长春西汀在MEKK1的水平或者其下游发生作用。此外，长春西汀抑制由组成型活性IKKαCA-IKKα和IKKβCA-IKKβ的表达所诱导的NF-κB的激活(图8F和8G)但不抑制由野生型(WT)NF-κB p65亚基的表达所诱导的NF-κB的激活(图8H)。综合起来，这些数据表明长春西汀通过靶向IKK而抑制TNFα诱导的NF-κB的激活。

实施例6：长春西汀通过间接机制抑制IKK激酶活性

为了确认长春西汀是否直接靶向IKK，通过将长春西汀直接应用至试管中的IKK免疫复合物来检测长春西汀对于抑制IKK激酶活性的影响。当把长春西汀直接加入到IKK中时，没有观察到长春西汀对IKK活性的显著抑制性效应。长春西汀不能直接抑制IKK活性可能是由于长春西汀需要在细胞中被生物转化成另一种能够抑制IKK活性的中间体产物。为了探索这个可能性，检测了来自经长春西汀处理的VSMC的细胞裂解液对于抑制IKK激酶活性的影响。如图9A-B所示，来自经长春西汀处理的细胞的细胞裂解液抑制IKK的活性，这提示可能是从长春西汀(或长春西汀代谢物)生物转化而来的产物引起IKK活性的抑制。在体外达到抑制IKK的显著性效应需要来自经100μM长春西汀处理的细胞裂解液(图9B)。但是，在完整细胞中阻断IKK激活需要的长春西汀的浓度要低得多(图8C-D)。这个差异最大可能是由于，相对于在细胞内部，在细胞裂解液中细胞成分被稀释(大约5-10倍)。

实施例7：长春西汀对IKK激酶活性的抑制性效应不依赖于其已知的对于PDE1活性和Ca²⁺调节的作用

基于以前的报道——增加的细胞内cAMP或cGMP通过PKA依赖性机理在VSMC中抑制NF-κB依赖性转录活性和炎性调节子的表达(Aizawa等人，“Role of Phosphodiesterase 3in NO/cGMP-mediated Anti-inflammatoryEffects in Vascular Smooth Muscle Cells，”Circ Res 93：406-13(2003)，通过引用全文并入本文)以及基于长春西汀是众所周知的PDE1抑制剂(

等人，“Role of Sodium Channel Inhibition in Neuroprotection：Effect ofvinpocetine，”Brain Res Bull 53：245-54(2000)；Hagiwara等人，“Effects ofvinpocetine on Cyclic Nucleotide Metabolism in Vascular Smooth Muscle，”Biochem Pharmacol 33：453-7(1984)，每篇通过引用全文并入本文)，测定了长春西汀对于NF-κB信号传导的抑制性效应是否是由PDE1的抑制所介导。测定了特异性PDE1抑制剂对于NF-κB转录活性的影响。发现IC86340(一种PDE1的选择性抑制剂，其抑制VSMC的生长)(Nagel等人，“Role of NuclearCa²⁺/Calmodulin-stimulated Phosphodiesterase 1A in Vascular Smooth MuscleCell Growth and Survival，”Circ Res 98：777-84(2006)，通过引用全文并入本文)对于TNFα诱导的IκB的磷酸化没有显示出任何抑制性效应。因为除了抑制PDE1之外，还已知长春西汀在神经元中抑制Ca²⁺-通道(Kaneko等人，“The Use of Xenopus Oocytes to Evaluate Drugs Affecting Brain Ca²⁺Channels：Effects of Bifemelane and Several Nootropic Agents，”Eur J Pharmacol189：51-8(1990)；Tretter等人，“The Neuroprotective Drug vinpocetine PreventsVeratridine-induced[Na⁺]_i and[Ca²⁺]_i Rise in Synaptosomes，”Neuroreport9：1849-53(1998)，每篇通过引用全文并入本文)，测定了长春西汀对于TNFα诱导的IKK活性的抑制性效应是否包括Ca²⁺流动或细胞内Ca²⁺的内稳态。在VSMC中测定了硝苯地平(一种Ca²⁺通道阻滞剂)、EGTA(一种细胞外Ca²⁺螯合剂)或BAPTA/AM(一种细胞内Ca²⁺螯合剂)对于TNFα诱导的IKK激酶活性、IκB的磷酸化和IκB的降解的影响。如图10所示，这些药剂中没有任何一个显示出对于TNFα诱导的IKK激酶活性、IκB的磷酸化和IκB的降解的任何显著抑制效应。综上，可以从这些数据中正确得出结论：长春西汀对于TNFα诱导的IKK依赖性的NF-κB激活的抑制不依赖于其已知的对于PDE1和Ca²⁺调节的作用，从而揭示出长春西汀对于IKK-NF-κB信号传导的新作用。

实施例8：长春西汀和地塞米松在体内联合用于治疗LPS诱导的炎症

图11显示长春西汀降低了体内抑制肺部炎性反应所需的地塞米松的剂量。通过气管内(i.t)向小鼠施用LPS(2μg/小鼠)诱导炎性反应，如TNF-α、IL-1β和MIP-2mRNA的诱导所指示(见每个图形中的LPS+/Dex-/Vinp-条形图)。腹膜内(i.p.)施用单独的地塞米松(500μg/kg体重)和单独的商售长春西汀药物组合物(5mg/kg体重)均抑制小鼠肺中TNF-α、IL-1β和MIP-2mRNA的诱导。当联合使用地塞米松和长春西汀时，相对于每个药物单独使用来说，联合用药以更高的水平显著抑制小鼠肺中TNF-α、IL-1β和MIP-2mRNA的诱导。这两个化合物可能具有不同的抑制炎症的机理，因此联合治疗可能对于治疗炎症特别有效。因此相信这种联合产生协同效应而非仅仅加成效应。

实施例1-8的讨论

本研究的重要意义在于在体外和体内首次鉴定了长春西汀作为新型抗炎剂。炎症是多种重要的人类疾病的标志，其中包括动脉粥样硬化(Libby等人，“Inflammation and Atherosclerosis，”Circulation 105：1135-43(2002)；Libby，“Inflammation in Atherosclerosis，”Nature 420：868-74(2002)，每篇通过引用全文并入本文)，肺部炎性疾病(Tetley，“Inflammatory Cells and ChronicObstructive Pulmonary Disease，”Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4：607-18(2005)，通过引用全文并入本文)和关节炎(Okamoto，“NF-κB and RheumaticDiseases，”Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 6：359-72(2006)，通过引用全文并入本文)。类固醇已经长期在临床上用作主要的治疗性抗炎剂。虽然类固醇确实显示出强烈的抗炎效应，但是不正确的使用类固醇会在患者中引起严重的副作用。因此，目前迫切需要开发新型抗炎剂。在过去数十年在药物开发中所作的各种努力之中，天然产品仍然是大有前景的新药候选来源，因为天然产品比那些可比较的药学产品具有较少的副作用。长春西汀——一种生物碱长春胺的衍生物，在临床上已经长期用于治疗脑血管疾病和认知损伤。众所周知长春西汀能够增强脑循环和认知功能，其目前在很多国家被用作膳食补充剂以预防性治疗脑血管疾病和与衰老相关的症状。以长春西汀进行的大量临床试验表明长春西汀扩张血管、增强脑部循环、增强从血液中的氧的利用和葡萄糖的摄入，因此激活脑代谢和神经元ATP生物能的产生。另外，长春西汀还引发神经元的保护性效应，这增加了大脑对于低氧和贫血损伤的抵抗性。显示长春西汀能容易地跨越血液-脑屏障，这使得长春西汀是少之又少的对于脑循环显示出强烈的有益效应的药物之一。在上文描述的实施例中长春西汀被鉴定为一种体外和体内的强烈的抗炎剂。这个新发现以及长春西汀是从天然产物纯化而来并已用于临床数十年的事实使得长春西汀成为治疗炎性疾病(例如动脉粥样硬化、肺部炎性疾病和关节炎(以及其他的炎性疾病))的大有前景的候选抗炎剂。

另一项有趣的发现是长春西汀对于NF-κB依赖性炎症的抑制性效应不依赖于其已知的对于PDE1和Ca²⁺调节的作用。鉴定出的长春西汀的第一个分子靶标是Ca²⁺/钙调蛋白刺激的磷酸二酯酶(PDE)(

等人，“Role ofSodium Channel Inhibition in Neuroprotection：Effect of Vinpocetine，”BrainRes Bull 53：245-54(2000)，通过引用全文并入本文)。PDE通过催化cAMP和cGMP的水解而在控制细胞内循环核苷酸水平和区室化中发挥重要作用。PDE构成一个大的酶超家族，基于它们的不同动力学特性、调节机理和对于选择性抑制剂的敏感性而被分为11个大的家族(Yan等人，“FunctionalInterplay Between Angiotensin II and Nitric Oxide：Cyclic GMP as a KeyMediator，”Arterioscler Thromb Vasc Biol 23：26-36(2003)，通过引用全文并入本文)。在VSMC中已经鉴定出4个主要的PDE家族，包括Ca²⁺/钙调蛋白刺激的PDE1、cGMP抑制的PDE3、cAMP特异性PDE4和cGMP特异性PDE5。长春西汀对于脑血管舒张的有益的血管效应至少部分与其对于PDE1抑制的效应有关。但是，与PDE1参与长春西汀引发的脑血管舒张不同，长春西汀对于NF-κB依赖性的炎症的抑制被证明不依赖于PDE1，因为IC86340(一种PDE1的特异性抑制剂)(Nagel等人，“Role of NuclearCa²⁺/Calmodulin-stimulated Phosphodiesterase 1A in Vascular Smooth MuscleCell Growth and Survival，”Circ Res 98：777-84(2006)，通过引用全文并入本文)对于IKK激活、IκB的磷酸化和降解(图10)以及NF-κB的激活没有显示出显著抑制效应。

除了作为PDE1抑制剂发挥作用以外，长春西汀还能够与谷氨酸盐受体相互作用并在神经元中以相对高的浓度抑制电压门控的Ca²⁺通道，从而调节Ca²⁺信号传导(

等人，“Role of Sodium Channel Inhibition inNeuroprotection：Effect of Vinpocetine，”Brain Res Bull 53：245-54(2000)，通过引用全文并入本文)。此外，长春西汀抑制神经元电压门控的Na⁺通道并保护神经元抵抗Na⁺流入(

等人，“Role of Sodium Channel Inhibition inNeuroprotection：Effect of Vinpocetine，”Brain Res Bull 53：245-54(2000)，通过引用全文并入本文)。这些效应至少部分促成长春西汀的神经保护性效应。但是在以上实施例中发现，通过BAPTA/AM降低细胞内Ca²⁺浓度、通过EGTA消除细胞外Ca²⁺或通过硝苯地平抑制电压门控的Ca²⁺通道没有显著性影响长春西汀对于IKK激酶活性、IκB的磷酸化和IκB的降解(图10)或NF-κB依赖性转录活性的能力。此外，电压门控的钠通道阻滞剂河豚毒素不改变长春西汀对于NF-κB依赖性转录的效应。这些数据综合起来表明长春西汀的抗炎效应与其已知的对于Ca²⁺和Na⁺通道的作用无关，这揭示了长春西汀的一种新作用。

有趣的是，结果提示长春西汀对于NF-κB信号传导的靶位点可能是IKK(图12)。当把长春西汀应用至试管中的IKK激酶反应缓冲液中的时候，长春西汀不抑制IKK活性。但是，来自长春西汀处理的细胞的细胞裂解液抑制50％的IKK活性(图9A-B)。这些现象可以被如下可能性解释：长春西汀被摄入细胞之后被生物转化为一种能够抑制IKK活性的中间体活性产物(代谢产物)。但是，应该注意这些数据不排除一种尚未鉴别的信号传导中间体的参与。施用长春西汀后抑制IKK活性的完整分子机理仍待确定。

显示的数据还表明商售可注射长春西汀制剂(已在患者中广泛使用)也具有强烈的抗炎效应。这种商售制剂适合于在体外以剂量依赖性方式显著抑制TNF-α诱导的NF-κB激活(图2)和后续的促炎性调节子(TNF-α、IL-1β和MIP-2)诱导(图4)。长春西汀注射剂还强烈抑制LPS诱导的促炎性调节子(包括TNF-α、IL-1β和MIP-2)的上调(图7A)以及小鼠肺部炎症模型中肺中的多形核白细胞(PMN)的间质浸润(图7A-B)。最后，当与地塞米松联合治疗使用时，长春西汀注射剂足以在抑制LPS诱导的促炎性调节子(TNF-α、IL-1β和MIP-2)上调的同时降低地塞米松的有效剂量(图11)(使用相同的小鼠肺部炎症模型)。

总之，很明显长春西汀是体外和体内的新型抗炎剂。长春西汀通过靶向IKK而抑制NF-κB依赖性炎性反应，这与其众所周知的对于PDE1和Ca²⁺调节的作用无关，且与其众所周知的对于Ca²⁺和Na⁺通道的作用无关。鉴于长春西汀已经在临床上被批准为安全的，本研究应该能够带来治疗各种哺乳动物炎性疾病的新的治疗性策略的发展。

基于长春西汀的成功使用，相信其它的具有相似结构和功能的长春胺衍生物对于治疗或预防哺乳动物患者中的炎性疾病是有前景的。长春西汀的使用(单独使用或是与除了选择性COX-2抑制剂之外的治疗剂(例如皮质类固醇、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂)联合)是特别优选的。同样，除了长春西汀之外的长春胺衍生物的使用(单独使用或是与其它治疗剂(例如皮质类固醇、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂、ACE抑制剂和NASID)联合)也是优选的。

虽然已经描述了优选的具体实施方式并在本文中详细进行了描述，但是对相关领域技术人员来说明显的是可以不脱离本发明的精神而作出各种修饰、添加、替换等，因此这些被认为落在由以下权利要求书所确定的本发明的范围内。

本文描述的所有特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)和/或所公开的任何方法或过程的全部步骤，可以与任何上述方面以任何组合方式进行组合，除了其中至少一些这样的特征和/或步骤相互排除的组合。

序列表

<110>罗切斯特大学(University of Rochester)

C.颜(YAN，Chen)

J.-D.李(LI，Jian-Dong)

B.伯克(BERK，Bradford)

K.焦(JEON，Kye-Im)

X.徐(XU，Xiangbin)

<120>治疗或预防炎性症状的方法和组合物

<130>176/62361

<150>60/973,998

<151>2007-09-20

<160>30

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠TNF-α的5’引物

<400>1

agaacagcaa ctccagaaca ccct 24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠TNF-α的3’引物

<400>2

tgccagttcc acatctcgga tcat 24

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IL-1β的5’引物

<400>3

acctgctagt gtgtgatgtt ccca 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>IL-1β的3’引物

<400>4

aggtggagag ctttcagctc acat 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠CINC-1的5’引物

<400>5

agacagtggc agggattcac ttca 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠CINC-1的3’引物

<400>6

tgtggctatg acttcggttt gggt 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠MCP-1的5’引物

<400>7

tgctgtctca gccagatgca gtta 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠MCP-1的3’引物

<400>8

tacagcttct ttgggacacc tgct 24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠VACM-1的5’引物

<400>9

actgtcaact gcacggtccc taat 24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠VACM-1的3’引物

<400>10

acaagagctt tcccggtgtc ttca 24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠GAPDH的5’引物

<400>11

acaagatggt gaaggtcggt gtga 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>大鼠GAPDH的3’引物

<400>12

agcttcccat tctcagcctt gact 24

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人TNF-α的5’引物

<400>13

cagagggaag agttccccag 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人TNF-α的3’引物

<400>14

ccttggtctg gtaggagacg 20

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人IL-1β的5’引物

<400>15

aaacagatga agtgctcctt ccagg 25

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人IL-1β的3’引物

<400>16

tggagaacac cacttgttgc tcca 24

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人IL-8的5’引物

<400>17

aacatgactt ccaagctggc c 21

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人IL-8的3’引物

<400>18

ttatgaattc tcagccctct tc 22

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人MCP-1的5’引物

<400>19

cccagtcacc tgctgtta 18

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人MCP-1的3’引物

<400>20

tgctgctggt gattcttc 18

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人VACM-1的5’引物

<400>21

ttgctcagat tggtgactcc gtct 24

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人VACM-1的3’引物

<400>22

ttcgtcacct tcccattcag tgga 24

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人ICAM-1的5’引物

<400>23

ataaccgcca gcggaagatc aaga 24

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人ICAM-1的3’引物

<400>24

cgtggcttgt gtgttcggtt tcat 24

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>小鼠TNF-α的5’引物

<400>25

actgaacttc ggggtgatcg gtcc 24

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>小鼠TNF-α的3’引物

<400>26

gtgggtgagg agcacgtagt cg 22

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>小鼠IL-1β的5’引物

<400>27

aacctgctgg tgtgtgacgt tc 22

<210>28

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>小鼠IL-1β的3’引物

<400>28

cagcacgagg cttttttgtt gt 22

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>小鼠MIP-2的5’引物

<400>29

cctgccaagg gttgacttca 20

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>小鼠MIP-2的3’引物

<400>30

ttctgtctgg gcgcagtg 18

Claims

1.一种治疗或预防炎性病症的方法，包括在有效治疗或预防炎性病症的条件下向患者施用长春胺或长春胺衍生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中长春胺衍生物选自

(+)-长春西汀或其盐；

(-)-象牙酮宁或其盐；

象牙胺或其盐；

象牙烯宁或其盐；

二氢象牙烯宁或其盐；

阿扑长春胺酸或其盐；

阿扑长春胺或其盐；

溴长春胺或其盐；

长春布醇(RU-24722)或其盐；

亚甲基甲氧基阿扑长春胺酸(MR-711)或其盐；

(3S，16R)-二氢-象牙烯宁-4-甲醇(RGH-0537)或其盐；

(1S，12S)-吲哚并喹嗪基-1-甲醇(RGH-2981)或其盐；

其中R₁是卤素，R₂可以是羟基基团，而R₃可以是氢，或R₂和R₃一起在携带它们的碳原子之间形成另外的键；或其盐；

其中该化合物通过D/E环的顺式稠合而形成，并且(i)Y是氢，在这种情况下Z₁和Z₂一起同时代表氧原子，或Z₁是甲氧基羰基基团且Z₂是羟基基团；或(ii)Y和Z₂一起形成碳-碳键且Z₁是甲氧基羰基基团；或其盐；

其中R₄是氢或羟基基团，R₅是烷基基团；或其盐；

其中R₆是氢或甲氧基，X和Y是氢或者X和Y一起形成它们所结合的环碳原子之间的双键；或其盐；和

任意两个或更多个以上化合物或其盐的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用有效治疗预先存在的炎性病症的症状。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用是在炎性病症发生之前进行。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括在炎性病症发生之后反复施用。

6.根据权利要求1所述的方法，其中炎性病症选自动脉粥样硬化、急性和慢性肺部炎症、感染病毒的组织的炎症、溃疡性结肠炎、内毒素休克、关节炎、牛皮癣、克罗恩病、炎症性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、损伤非依赖性II型糖尿病、贫血诱导的炎症、中耳炎、痛风、多发性硬化、恶病质和毛细血管扩张性共济失调症。

7.根据权利要求1所述的方法，还包括反复施用长春胺或长春胺衍生物。

8.根据权利要求1所述的方法，还包括向患者联合施用治疗有效量的下列一种或多种：皮质类固醇、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂和非甾体类抗炎药物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中患者是哺乳动物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中哺乳动物是人、非人灵长类、啮齿类、牛、马、绵羊或猪。

11.根据权利要求1所述的方法，其中长春胺衍生物的施用拮抗NF-κB激酶抑制剂(IKK)的活性并且炎性病症是NF-κB介导的炎性病症。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所施用的长春胺衍生物是前药的形式，其被代谢为对NF-κB激酶抑制剂(IKK)有拮抗活性的形式，并且其中炎性病症是NF-κB介导的炎性病症。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用通过口服、吸入、鼻内或气道滴注、经眼、鼻内、中耳注射、耳滴液、局部、透皮、非肠道、皮下、静脉内注射、动脉内注射、注射至炎症位点、皮内注射、肌内注射、胸腔内滴注、腹膜内注射、心室内、病灶内、应用至粘膜或移植缓释载体进行。

14.根据权利要求1所述的方法，其中炎性病症涉及肺组织且施用通过气道滴注或吸入进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中长春胺衍生物存在于药物组合物中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

16.根据权利要求15所述的方法，其中药物组合物是肺表面活性剂组合物或适合于雾化的粉末混合物。

17.根据权利要求1所述的方法，其中炎性病症是关节炎且施用通过直接注射进行、通过透皮贴剂透皮进行或局部进行。

18.根据权利要求1所述的方法，其中以约0.01至约2mg/kg，优选0.05至约1mg/kg，最优选约0.05至约0.5mg/kg的量施用长春胺衍生物。

19.根据权利要求1所述的方法，其中长春胺衍生物是长春西汀，长春西汀单独施用或与不是COX-2抑制剂的另一种药剂联合施用；并且其中待治疗的炎性病症不包括胃肠道炎性病症。

20.一种包含长春胺或长春胺衍生物的药物组合物，其中药物组合物是肺表面活性剂制剂或可吸入制剂的形式。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中长春胺衍生物对NF-κB激酶抑制剂(IKK)有拮抗活性。

22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所施用的长春胺衍生物是前药的形式，其被代谢为对NF-κB激酶抑制剂(IKK)有拮抗活性的形式。

23.根据权利要求20所述的药物组合物，其中长春胺衍生物选自

(+)-长春西汀或其盐；

(-)-象牙酮宁或其盐；

象牙胺或其盐；

象牙烯宁或其盐；

二氢象牙烯宁或其盐；

阿扑长春胺酸或其盐；

阿扑长春胺或其盐；

溴长春胺或其盐；

长春布醇(RU-24722)或其盐；

亚甲基甲氧基阿扑长春胺酸(MR-711)或其盐；

(3S，16R)-二氢-象牙烯宁-4-甲醇(RGH-0537)或其盐；

(1S，12S)-吲哚并喹嗪基-1-甲醇(RGH-2981)或其盐；

其中R₄是氢或羟基基团，R₅是烷基基团；或其盐；

任意两个或更多个以上化合物或其盐的组合。

24.根据权利要求20所述的药物组合物，还包含类固醇。

25.根据权利要求20所述的药物组合物，其中类固醇是皮质类固醇。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中皮质类固醇选自去炎松、氟轻松、可的松、氢化可的松、环索奈德、氟替卡松、氟尼缩松、莫米松、倍他米松、甲基泼尼松龙、地塞米松、布地奈德、倍氯米松、强的松、甲基氢化波尼松、氢化波尼松，及其组合。

27.根据权利要求20所述的药物组合物，还包含有效量的皮质类固醇、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂和非甾体类抗炎药物中的一种或多种。

28.一种药物组合物，其包含长春胺或长春胺衍生物，以及皮质类固醇、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂和血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂中的一种或多种。

29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中皮质类固醇选自去炎松、氟轻松、可的松、氢化可的松、环索奈德、氟替卡松、氟尼缩松、莫米松、倍他米松、甲基泼尼松龙、地塞米松、布地奈德、倍氯米松、强的松、甲基氢化波尼松、氢化波尼松，及其组合。

30.根据权利要求28所述的药物组合物，其中血管紧张素II受体(1型)拮抗剂选自肌丙抗增压素乙酸盐、坎地沙坦西来替昔酯、CGP-63170、EMD-66397、KT3-671、LR-B/081、缬沙坦、A-81282、BIBR-363、BIBS-222、BMS-184698、坎地沙坦、CV-11194、EXP-3174、KW-3433、L-161177、L-162154、LR-B/057、LY-235656、PD-150304、U-96849、U-97018、UP-275-22、WAY-126227、WK-1492.2K、YM-31472、络沙坦钾、E-4177、EMD-73495、依普罗沙坦、HN-65021、厄贝沙坦、L-159282、ME-3221、SL-91.0102、他索沙坦、替米沙坦、UP-269-6、YM-358、CGP-49870、GA-0056、L-159689、L-162234、L-162441、L-163007、PD-123177、A-81988、BMS-180560、CGP-38560A、CGP48369、DA-2079、DE-3489、DuP-167、EXP-063、EXP-6155、EXP-6803、EXP-7711、EXP-9270、FK-739、HR-720、ICI-D6888、ICI-D7155、ICI-D8731、isoteoline、KR1-1177、L-158809、L-158978、L-159874、LR B087、LY-285434、LY-302289、LY-315995、RG-13647、RWJ-38970、RWJ-46458、S-8307、S-8308、沙普立沙坦、肌丙抗增压素、Sarmesin、WK-1360、X-6803、ZD-6888、ZD-7155、ZD-8731、BIBS39、C1-996、DMP-811、DuP-532、EXP-929、L-163017、LY-301875、XH-148、XR-510、佐拉沙坦、PD-123319，及其组合。

31.根据权利要求28所述的药物组合物，其中ACE抑制剂选自AB-103，血管紧张肽转化酶抑制肽、贝那普利拉、BRL-36378、BW-A575C、CGS-13928C、CL242817、CV-5975、Equaten、EU4865、EU-4867、EU-5476、甲羟米辛、FPL 66564、FR-900456、Hoe-065、15B2、吲哚普利、酮基甲基尿素、KR1-1177、KR1-1230、L681176、赖苯普利、MCD、MDL-27088、MDL-27467A、莫维普利、MS41、烟草胺、喷托普利、非那西汀、匹伏普利、伦唑普利、RG-5975、RG-6134、RG-6207、RGH0399、ROO-911、RS-10085-197、RS-2039、RS 5139、RS 86127、RU-44403、S-8308、SA-291、螺普利拉、SQ26900、SQ-28084、SQ-28370、SQ-28940、SQ-31440、Synecor、乌替普利、WF-10129、Wy-44221、Wy-44655、Y-23785、Yissum、P-0154、扎普利、Asahi Brewery AB-47、alatriopril、BMS 182657、Asahi Chemical C-111、Asahi Chemical C-112、Dainippon DU-1777、mixanpril、Prentyl、佐芬普利拉、I(-(1-羧基-6-(4-哌嗪基)己基)氨基)-1-氧-丙基八氢-1H-吲哚-2-羧酸、Bioproject BP1.137、Chiesi CHF 1514、Fisons FPL-66564、伊屈普利、培哚普利拉和Servier S-5590、阿拉普利、苯那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、福辛普利拉、米卡普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、雷米普利拉、肌丙抗增压素乙酸盐、替莫普利、群多普利、群多普利拉、施瑞普利、莫昔普利、喹普利拉，螺普利，及其组合。

32.根据权利要求28所述的药物组合物，其中长春胺衍生物选自

(+)-长春西汀或其盐；

(-)-象牙酮宁或其盐；

象牙胺或其盐；

象牙烯宁或其盐；

二氢象牙烯宁或其盐；

阿扑长春胺酸或其盐；

阿扑长春胺或其盐；

溴长春胺或其盐；

长春布醇(RU-24722)或其盐；

亚甲基甲氧基阿扑长春胺酸(MR-711)或其盐；

(3S，16R)-二氢-象牙烯宁-4-甲醇(RGH-0537)或其盐；

(1S，12S)-吲哚并喹嗪基-1-甲醇(RGH-2981)或其盐；

其中R₄是氢或羟基基团，R₅是烷基基团；或其盐；

任意两个或更多个以上化合物或其盐的组合。

33.根据权利要求28所述的药物组合物，其中长春胺衍生物拮抗NF-κB激酶抑制剂(IKK)的活性。

34.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所施用的长春胺衍生物是前药的形式，其被代谢为对NF-κB激酶抑制剂(IKK)有拮抗活性的形式。

35.根据权利要求28所述的药物组合物，其中组合物包含作为长春胺衍生物的长春西汀以及作为皮质类固醇的地塞米松。

36.根据权利要求28所述的药物组合物，其中药物组合物的形式为或存在于肺表面活性剂制剂、可吸入制剂、可注射制剂、透皮制剂、局部制剂或聚合物基质中。

37.一种药物组合物，其包含长春胺或除了长春西汀以外的长春胺衍生物，以及有效量的皮质类固醇、血管紧张素II受体(1型)拮抗剂和血管紧张素转化酶抑制剂和非甾体类抗炎药物中的一种或多种。

38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中皮质类固醇选自去炎松、氟轻松、可的松、氢化可的松、环索奈德、氟替卡松、氟尼缩松、莫米松、倍他米松、甲基泼尼松龙、地塞米松、布地奈德、倍氯米松、强的松、甲基氢化波尼松、氢化波尼松，及其组合。

39.根据权利要求37所述的药物组合物，其中血管紧张素II受体(1型)拮抗剂选自肌丙抗增压素乙酸盐、坎地沙坦西来替昔酯、CGP-63170、EMD-66397、KT3-671、LR-B/081、缬沙坦、A-81282、BIBR-363、BIBS-222、BMS-184698、坎地沙坦、CV-11194、EXP-3174、KW-3433、L-161177、L-162154、LR-B/057、LY-235656、PD-150304、U-96849、U-97018、UP-275-22、WAY-126227、WK-1492.2K、YM-31472、络沙坦钾、E-4177、EMD-73495、依普罗沙坦、HN-65021、厄贝沙坦、L-159282、ME-3221、SL-91.0102、他索沙坦、替米沙坦、UP-269-6、YM-358、CGP-49870、GA-0056、L-159689、L-162234、L-162441、L-163007、PD-123177、A-81988、BMS-180560、CGP-38560A、CGP48369、DA-2079、DE-3489、DuP-167、EXP-063、EXP-6155、EXP-6803、EXP-7711、EXP-9270、FK-739、HR-720、ICI-D6888、ICI-D7155、ICI-D8731、isoteoline、KR1-1177、L-158809、L-158978、L-159874、LR B087、LY-285434、LY-302289、LY-315995、RG-13647、RWJ-38970、RWJ-46458、S-8307、S-8308、沙普立沙坦、肌丙抗增压素、sarmesin、WK-1360、X-6803、ZD-6888、ZD-7155、ZD-8731、BIBS39、C1-996、DMP-811、DuP-532、EXP-929、L-163017、LY-301875、XH-148、XR-510、佐拉沙坦、PD-123319，及其组合。

40.根据权利要求37所述的药物组合物，其中ACE抑制剂选自AB-103、血管紧张肽转化酶抑制肽、贝那普利拉、BRL-36378、BW-A575C、CGS-13928C、CL242817、CV-5975、Equaten、EU4865、EU-4867、EU-5476、甲羟米辛、FPL 66564、FR-900456、Hoe-065、15B2、吲哚普利、酮基甲基尿素、KR1-1177、KR1-1230、L681176、赖苯普利、MCD、MDL-27088、MDL-27467A、莫维普利、MS41、烟草胺、喷托普利、非那西汀、匹伏普利、伦唑普利、RG-5975、RG-6134、RG-6207、RGH0399、ROO-911、RS-10085-197、RS-2039、RS 5139、RS 86127、RU-44403、S-8308、SA-291、螺普利拉、SQ26900、SQ-28084、SQ-28370、SQ-28940、SQ-31440、Synecor、乌替普利、WF-10129、Wy-44221、Wy-44655、Y-23785、Yissum、P-0154、扎普利、Asahi Brewery AB-47、alatriopril、BMS 182657、Asahi Chemical C-111、Asahi Chemical C-112、Dainippon DU-1777、mixanpril、Prentyl、佐芬普利拉、I(-(1-羧基-6-(4-哌嗪基)己基)氨基)-1-氧-丙基八氢-1H-吲哚-2-羧酸、Bioproject BP1.137、Chiesi CHF 1514、Fisons FPL-66564、伊屈普利、培哚普利拉和Servier S-5590、阿拉普利、苯那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、福辛普利拉、米卡普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、雷米普利拉、肌丙抗增压素乙酸盐、替莫普利、群多普利、群多普利拉、施瑞普利、莫昔普利、喹普利拉、螺普利，及其组合。

41.根据权利要求37所述的药物组合物，其中NSAID选自布洛芬(2-(异丁基苯基)-丙酸)；氨甲蝶呤(N-[4-(2，4二氨基6-喋啶基-甲基]甲基氨基]苯甲酰基)-L-谷氨酸)；阿司匹林(乙酰水杨酸)；水杨酸；苯海拉明(2-(二苯基甲氧基)-NN-二甲基乙胺盐酸盐)；萘普生(2-萘乙酸，6-甲氧基-9-甲基-，钠盐，(-))；酮咯酸(1H-吡咯里嗪-1-羧酸，2，3-二氢-5-苯甲酰基-，(+-))；保泰松(4-丁基-1，2-二苯基-3，5-吡唑烷二酮)；舒林酸-(2)-5-氟-2-甲基-1-[[对-(甲基亚磺酰基)苯基]亚甲基]-1H-茚-3-乙酸；二氟尼柳(2′，4′，-二氟-4-羟基-3-联苯羧酸；吡罗昔康(4-羟基-2-甲基-N-2-吡啶基-2H-1，2-苯并噻嗪-2-甲酰胺1，1-二氧化物，一种昔康类药物；吲哚美辛(1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-H-吲哚-3-乙酸)；甲氯灭酸钠(N-(2，6-二氯-间-甲苯基)邻氨基苯甲酸，钠盐，一水合物)；酮洛芬(2-(3-苯甲酰基苯基)-丙酸；托美丁钠(1-甲基-5-(4-甲基苯甲酰基-1H-吡咯-2-乙酸钠二水合物)；双氯芬酸钠(2-[(2，6-二氯苯基)氨基]苯乙酸，单钠盐)；羟基氯喹硫酸盐(2-{[4-[(7-氯-4-喹啉基)氨基]戊基]乙基氨基}乙醇硫酸盐(1∶1)；青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)；氟比洛芬([1，1-联苯]-4-乙酸，2-氟-α甲基-，(+-))；依托度酸(1-8-二乙基-13，4，9，四氢吡喃-[3-4-13]吲哚-1-乙酸；甲灭酸(N-(2，3-二甲苯基)邻氨基苯甲酸；和苯海拉明盐酸盐(2-二苯基甲氧基-N，N-二-甲基乙胺盐酸盐)。

42.根据权利要求37所述的药物组合物，其中长春胺衍生物选自

(+)-长春西汀或其盐；