CN101875927A

CN101875927A - 一种腈水解酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN101875927A
Application number: CN2009100501343A
Authority: CN
Inventors: 薛建萍; 唐璐敏; 郝婷婷; 朱健; 李还宝; 张仙; 杨巍
Original assignee: SHANGHAI PESTICIDE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SHANGHAI PESTICIDE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2010-11-03

Abstract

本发明公开了一种微生物来源的腈水解酶及其制备方法和应用。本发明提供的腈水解酶，其N端的20个氨基酸序列为：NH₂-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD。本发明提供的腈水解酶可以通过对Arthrobacter nitroguajacolicus菌进行发酵而获得。本发明提供的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，反应的水解副产物少，条件温和，时空产率高，此外，3-羟基丁腈水溶性好，反应可以在纯水相中进行，有利于酶的稳定，因而具有很高的工业化生产潜力。

Description

一种腈水解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶学领域，具体地说，涉及一种微生物来源的腈水解酶及其制备方法和应用。

背景技术

腈水解酶是一种具有广泛底物适应性的生物催化剂，可以催化腈水解生成相应的羟基酸。由于天然腈化物的广泛存在，使很多微生物都或多或少具有降解腈化物的能力。目前已有多种微生物来源的腈水解酶被报道，其反应底物多种多样，具体如以下表1所示：

表1、用于制备腈水解酶的菌株及其对应的水解底物

3-羟基丁酸俗称β-羟基丁酸，英文名称为3-hydroxybutyric acid或DL-β-hydroxybutyric acid，其分子式为C₄H₈O₃，分子量104.10，CAS号为625-71-8，结构式：

3-羟基丁酸有两种构型的对映体，分别为(R)-3-羟基丁酸[CAS：625-72-9]和(S)-3-羟基丁酸[CAS：6168-83-8]。

3-羟基丁酸在医药领域中的用途广泛，例如(R)-3-羟基丁酸不仅可用于治疗癌症、糖代谢紊乱等疾病，还具有抑制酮体水平异常提高，减少自由基伤害，加强代谢效率等功效(WO2004108740)。同时，在可降解塑料合成中，3-羟基丁酸也有应用价值，例如，以其为基础可得到3-羟基脂肪酸，进而制备具有生物可降解性和生物相容性的热塑性材料聚羟基脂肪酸酯(PHB)。因此，制备3-羟基丁酸具有重要意义。

但现有工艺中，制备3-羟基丁酸主要通过化学方法，如β-丁内酯的水解、Reformatsky反应、还原法、丁烯酸水合制备、萘锂催化剂制备以及水解法或氧化法等方法制备，但采用上述化学法具有以下不足：合成工艺复杂，反应条件比较苛刻，对设备要求高，金属催化剂价格昂贵，易造成污染，对环保不利等。

而生物法催化腈水解副产物少，反应条件温和，但目前发现的腈水解酶中还没有哪一种酶能够水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。

发明内容

本申请的发明人在长期的研究中，找到了一种微生物来源的新的腈水解酶，其能够水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。

因此，本发明的首要目的就在于，提供一种微生物来源的腈水解酶。

本发明还有一个目的在于，提供所述腈水解酶的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供所述腈水解酶的应用。

本发明提供的腈水解酶的N端的20个氨基酸序列为NH₂-THPQFKAAVVQAAPVFL NLD。

根据本发明，所述腈水解酶来源于Arthrobacter nitroguajacolicus菌的发酵产物。

本发明提供的腈水解酶，通过发酵Arthrobacter nitroguajacolicus菌而获得。

本发明提供的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。

本发明提供了一种新的腈水解酶，该酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，且反应的水解副产物少，反应条件温和，时空产率高。此外，由于3-羟基丁腈的水溶性好，因此水解反应可以在纯水相中进行，有利于酶的稳定，因而具有很高的工业化生产潜力。

附图说明

图1是上层粗酶液和放置8h后的上层粗酶液进行电泳检测的检测结果，其中，泳道1为直接检测的结果，泳道2为放置8h后的检测结果。

图2是经苯基疏水柱纯化后P3-P7号接收段溶液及粗酶液的蛋白质电泳检测结果，其中，泳道1-5分别为P7-P3号接收段的检测结果，泳道6为粗酶液的检测结果。

图3是经丁基疏水柱纯化后B2号接收段溶液的蛋白质电泳检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

以下实施例中，所使用的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus，已于2008年3月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCCNo.2405。

以下实施例中，用于发酵培养Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405菌株的培养基配方如下：

斜面培养基(wt％)：葡萄糖1.0％、酵母膏0.3％、NaCl 0.1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.02％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、琼脂粉2％。

发酵培养基(wt％)：葡萄糖1.5％、蛋白胨1.0％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、KH₂PO₄ 0.05％、K₂HPO₄·3H₂O 0.05％、谷氨酸纳0.075％、半胱氨酸盐酸盐0.015％、苯甲腈0.025％(体积)，pH7.0。

以下实施例中，酶活的检测方法如下：

1体积的酶液加1/20体积的丙烯腈(99.0％)，反应1小时后加入盐酸终止反应，气相色谱分析产物丙烯酸含量。

酶活单位定义：1毫升酶液反应1小时产生1个ppm的酸为1个单位。

以下实施例中，测定水解产物3-羟基丁酸的含量的方法采用高效液相色谱法，具体如下：

检测条件：色谱柱为150mm×4.6mm，不锈钢柱，内装Kromasil ODS C₁₈、5u的填充物；流动相为磷酸二氢钠缓冲液∶乙腈＝95∶5(V/V)；流速为0.5ml/min；检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为20μL。

检测方法：称取3-羟基丁酸标准品0.1g，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇匀。称取约含3-羟基丁酸0.1g的样品，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇匀。

在上述色谱条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准品溶液，待相邻两针标准品溶液峰面积的响应值变化小于1.0％时，按照标样、样品、样品、标样的顺序进行测定。将测得的两针样品以及前后两针标样的峰面积进行平均。试样的质量分数X％按以下公式计算：

X = \frac{m_{1} \times A_{2}}{m_{2} \times A_{1}} \times P

其中，

A₁为标准品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；

A₂为样品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；

m₁为称取3-羟基丁酸标准品的质量，g；

m₂为称取试样的质量，g；

P为标准品中3-羟基丁酸标准品的质量分数，％。

实施例1、发酵菌株培养及发酵液检测

1.1、发酵菌株培养

挑取Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405，接种至斜面培养基，于28℃培养4天；然后，从斜面挑取培养好的菌株，转移到发酵培养基中，于220rpm、28℃培养4天，获得发酵液。

1.2、酶液稳定性检测

取步骤1.1获得的发酵液25ml，浓缩5倍，使用10mM Tris-HCl缓冲液进行细胞悬浮，并进行细胞破碎，细胞破碎条件如下：

超声2秒、间歇5秒、功率700～800W、时间0.5小时。

破碎后的细胞溶液于15000rpm离心30～40分钟，收集上层粗酶液。

将收集到的离心上清放置8h后，进行蛋白质电泳检测，同时以未经放置的离心上清作为对照，检测结果如图1所示。

图1的检测结果显示，随着放置时间的延长，酶液中分子量约30kDa的蛋白质增加，而分子量大于30kDa的蛋白质减少，上述结果说明破碎细胞后获得粗酶液中的目标蛋白不稳定、易降解，降解后的单体的分子量约为30kDa。

然后，采用上述方法，分别检测了该酶在HEPES、磷酸钾缓冲液等多种缓冲体系中的稳定性，结果显示在高浓度磷酸钾缓冲体系中，此酶稳定性较好。

因此，在下述发酵液进行预处理时，使用0.5M pH7.2的磷酸钾缓冲液(含1mM DTT)进行细胞悬浮。

1.3、发酵液预处理

将步骤1.1获得的发酵液浓缩5倍，然后使用0.5M pH7.2的磷酸钾缓冲液(含1mMDTT)进行细胞悬浮，并进行细胞破碎，细胞破碎条件如下：

超声2秒、间歇5秒、功率700～800W、时间1～1.5小时。

实施例2、蛋白纯化

将实施例1中获得的上层粗酶液进行饱和硫酸铵分级沉淀，并收集0～35％饱和度下的沉淀。

然后，用0.5M pH7.2磷酸钾缓冲液溶解粗酶沉淀，将获得的粗酶液经苯基疏水柱纯化，并收集洗脱液，同时检测洗脱液的酶活和蛋白含量，再将收集到的比酶活较高部分使用丁基疏水柱纯化，具体纯化条件如下：

1、苯基疏水柱(Phenyl-650C)

柱床：高12cm×直径1cm，体积9.4ml；

流速：0.1ml/min吸附、1ml/min洗柱(0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.2)、0.1ml/min洗脱(去离子水)；

上柱量：2ml(6.42mg/ml)。

以1.5～2ml为一个接收段，并以A280来监测蛋白质洗脱的过程，在测完每段接收液的A280值后等体积加入1M、pH7.2磷酸钾缓冲液。

在接收了约6ml液体后，A280较空白对照明显上升，将A280明显上升的几段接收液浓缩后检测蛋白质含量和酶活，检测结果如表1所示，其中，P0为上柱前的粗酶液，P2-P7为A280明显的几段接收液。

表1、苯基疏水柱纯化后接收段及粗酶液蛋白含量及酶活检测结果

根据表1的结果，将P0以及P3～P7号接收段溶液进行蛋白质电泳检测，电泳结果如图2所示，根据检测结果，将比酶活较高的两段接收液P4和P5合并。

重复苯基疏水柱纯化步骤，以获得足够用于丁基疏水柱纯化的接收液，然后使用丁基疏水柱纯化，具体纯化条件如下：

2、丁基疏水柱(Butyl-650C)

柱床：高12cm×直径1cm，体积9.4ml；

上样量：1ml(3.12mg/ml)。

以约1.5ml为一个接收段，以A280来监测蛋白质洗脱的过程，在测完每段接收液的A280值后等体积加入1M、pH7.2磷酸钾缓冲液。

在接收了约6ml液体后，A280较空白对照开始有所上升，将A280明显的几段接收液浓缩后检测蛋白质含量和酶活，检测结果如表2所示，其中，B0为上柱前的酶液，B1～B6为A280明显的几段接收液。

表2、丁基疏水柱纯化后接收段及粗酶液蛋白含量及酶活检测结果

根据表2的结果，取B2段接收液进行蛋白质电泳检测，电泳检测结果如图3所示。

上述结果显示：上完第一根苯基疏水柱后的比酶活较高的酶液仍能在30～40kDa范围里看到明显的大于30kDa分子量条带；而上完第二根丁基疏水柱后，收集到的酶液中仅见到分子量近30kDa的小分子量条带。

实施例3、蛋白检测

将实施例2中经丁基疏水柱纯化获得的酶进行N端测序，检测结果显示，该酶的N端二十个氨基酸的序列为NH₂-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD(由于该酶是经降解获得的，因此其N端第一个氨基酸不是氨基酸M)。

然后，将测定序列进行Blastp比对，比对结果如表3所示，其中，标注有*的蛋白质序列归类为EC3.5.5.1，未标注*的蛋白质序列归类为EC3.5.5.7。

表3、Blastp比对结果

NCBI蛋白质序列号	序列
NCBI蛋白质序列号	序列	N端测序结果	THPQFKAAVVQAAP
AAA82085*	MKNYPTVKVAAVQAAP	N端测序结果	THPQFKAAVVQAAP
AAA82085*	MKNYPTVKVAAVQAAP	P82605*	MSNYPKYRVAAVQASP
P20960*	MQTRKIVRAAAVQAASP	P82605*	MSNYPKYRVAAVQASP
P20960*	MQTRKIVRAAAVQAASP	YP_001261492*	MSDGPFKVAAVQAAP
YP_001758608*	MTNIYKVAVVQASP	YP_001261492*	MSDGPFKVAAVQAAP
YP_001758608*	MTNIYKVAVVQASP	P10045*	MDTTFKAAAVQAEP
AAY35081	MKEPLKVACVQAAP	P10045*	MDTTFKAAAVQAEP
AAY35081	MKEPLKVACVQAAP	YP_233119	MKEPLKVACVQAAP
NP_773042	MQDTKFKVAVVQAAP	YP_233119	MKEPLKVACVQAAP

NCBI蛋白质序列号	序列
NCBI蛋白质序列号	序列	Q02068	MSSNPELKYTGKVKVATVQAEP
Q03217	MVEYTNTFKVAAVQAQP	Q02068	MSSNPELKYTGKVKVATVQAEP
Q03217	MVEYTNTFKVAAVQAQP	YP_001022666	MSPPRTVRAAAVQIAP
YP_766270	MEKKPSVRVAAAQIAP	YP_001022666	MSPPRTVRAAAVQIAP
YP_766270	MEKKPSVRVAAAQIAP	YP_001354766	MKEYPKFKAAACHAAP
YP_559838	MTTSEIAKYKVAAVQAAP	YP_001354766	MKEYPKFKAAACHAAP
YP_559838	MTTSEIAKYKVAAVQAAP	ABQ36792	MGLAHPKYKVAVVQAAP
YP_001206496	MGLAHPKYKVAVVQAAP	ABQ36792	MGLAHPKYKVAVVQAAP
YP_001206496	MGLAHPKYKVAVVQAAP	YP_001020190	MPVSHPKFRAAAVQAAP
AAR97492	MSITHPKFKAAVVQAAPVFLDLD	YP_001020190	MPVSHPKFRAAAVQAAP

表3的比对结果显示，实施例2中获得的酶与腈水解酶的氨基酸序列具有很高的同源性，其中，与该酶同源性最高的腈水解酶(即NCBI蛋白质序列号为AAR97492的腈水解酶)的序列和该酶相比，自氨基酸T开始只有两个氨基酸不同。

用Vector软件(购自Invitrogen公司)将此序列与已有报道的序列(从NCBI GeneBank中获得)比对，其序列与多个腈水解酶序列(表3中的下划线部分)有较高的同源性。

根据上述结果，上述实施例中获得的酶与现有的腈水解酶具有较高的同源性，是一种新的腈水解酶。

实施例4、水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸

按照实施例2的方法制备腈水解酶，测得其酶活95180，将此酶用于水解3-羟基丁腈，具体过程如下：

取300μl酶液，加入3-羟基丁腈至终浓度为1％，30℃反应20小时，然后，检测获得的3-羟基丁酸含量，根据检测结果，生成的3-羟基丁酸的含量为0.96％。

根据上述结果，本发明获得的腈水解酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，且反应条件温和，此外，由于3-羟基丁腈水溶性好，反应可以在纯水相中进行，因而可用于工业化生产。

综上所述，本发明提供了一种新的腈水解酶，该酶可用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸，且具有很高的工业化生产潜力。

Claims

1.一种微生物来源的腈水解酶，其特征在于：所述腈水解酶的N端的20个氨基酸序列为：NH₂-THPQFKAAVVQAAPVFLNLD。

2.如权利要求1所述的腈水解酶，其特征在于：所述腈水解酶来源于Arthrobacter nitroguajacolicus菌的发酵产物。

3.如权利要求2所述的腈水解酶，其特征在于：所述Arthrobacter nitroguajacolicus菌的保减号为CGMCC No.2405。

4.如权利要求1～3中任一项所述的腈水解酶的制备方法，其特征在于：所述方法包括对Arthrobacter nitroguajacolicus菌进行发酵以获得腈水解酶。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述Arthrobacter nitroguajacolicus菌的保藏号为CGMCC No.2405。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：用于发酵的培养基的配方如下：

葡萄糖1.5wt％，蛋白胨1.0wt％，MgSO₄·7H₂O 0.05wt％，KH₂PO₄ 0.05wt％，K₂HPO₄·3H₂O 0.05wt％，谷氨酸纳0.075wt％，半胱氨酸盐酸盐0.015wt％，苯甲腈0.025％(体积)，pH7.0。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对发酵液进行固液分离以及对固液分离获得的细胞进行破壁的步骤。

8.如权利要求1～3中任一项所述的腈水解酶的应用，其特征在于：用于水解3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。