CN101874035A - 新的硫酸化寡糖衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有作为硫酸乙酰肝素-结合蛋白的抑制剂作用的新的化合物；包含所述化合物的组合物，和所述化合物及其组合物在用于治疗哺乳动物受试者抗血管生成、防转移、抗炎、抗微生物、抗凝和/或抗血栓形成中的用途。

Description

新的硫酸化寡糖衍生物
技术领域
本文所述的发明涉及具有作为硫酸乙酰肝素-结合蛋白包括类肝素酶的抑制剂活性的化合物。尤其，本发明涉及硫酸化寡糖衍生物，虽然本发明的范围并不一定局限于此，但特别地，本发明涉及用特定的、高亲脂性基团修饰的多硫酸化寡糖。本发明还涉及制备所述化合物、包含所述化合物的组合物的方法、以及所述化合物及其组合物在用于哺乳动物受试者抗血管生成、防转移、抗炎、抗微生物、抗凝和/或抗血栓形成治疗中的用途。当将其施用于哺乳动物受试者时，该化合物还具有预防上述病症的作用。
背景技术
被称作PI-881，2的硫酸化寡糖剂是一种有前途的肿瘤生长和转移抑制剂3，4，1并已在癌症患者中进了临床试验5，6。PI-88是大小在二糖至六糖范围的高度硫酸化、单磷酸化的甘露糖寡糖混合物7，8。PI-88通过抑制血管生长因子(主要是FGF-1、FGF-2和VEGF)及其受体与硫酸乙酰肝素的相互作用9，1来发挥抗血管生成作用。此外，PI-88是一种有效的类肝素酶抑制剂，类肝素酶是一种裂解蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素侧链的糖苷酶，该蛋白聚糖是肿瘤细胞周围细胞外基质(ECM)和基底膜的主要成分1，2。类肝素酶与血管生成密切相关：它能从ECM中释放活性的与硫酸乙酰肝素-结合的血管生长因子并且它还参与ECM的降解和随后的与新血管的生长有关的组织重塑10。通过类肝素酶进行的ECM降解在肿瘤细胞的扩散(转移)中也是至关重要的11，10，允许肿瘤细胞进入血流并停留在远处(在此处其可形成继发性肿瘤)。
除了其抗血管生成作用外，PI-88可通过(i)抑制内源性途径中的蛋白酶，(ii)刺激组织因子途径抑制物(TFPI)释放，和(iii)激活肝素辅因子II介导的凝血酶抑制来抑制凝血级联系统。但PI-88不与ATIII相互作用，并因此没有表现出抗-Xa或AT III介导的抗-IIa活性12，13。在猴子的体内研究表明低剂量的PI-88会刺激所有硫酸乙酰肝素-结合TFPI从血管细胞壁释放12。除了其对凝血的作用外，TFPI还是一种抗血管生成剂14和转移抑制剂15。PI-88还显示出阻滞血管平滑肌细胞增殖和内膜增厚16，抑制细胞的单纯疱疹病毒(HSV)感染和HSV-1及HSV-2的细胞间播散17，抑制登革热和脑炎虫媒病毒小鼠模型中的传染性和提高存活率，18抑制被动海曼肾炎中的蛋白尿19和在体外对抗恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的抗疟疾活性20。
各种其他的多硫酸化寡-和多糖及其衍生物显示出与PI-88类似的生物活性类型已为人们所熟知21-26。这些生物活性归结于各种硫酸乙酰肝素(HS)-结合蛋白的抑制。近来，公开了某些具有改善的药物代谢动力学和/或ADME(吸收、分布、代谢、排泄)特征的硫酸化寡糖衍生物27，28。所述化合物包含一个单一的碳骨架，并因此具备了优于混合物如PI-88的合成和表征优势。
本发明的目的是产生具有更强效力、改善的药物代谢动力学性质和减少了副作用的HS-类似物。
发明内容
根据本发明的第一个实施方案，本发明提供了一种以下通式的化合物：
[X]n-Y-ZR1R2            I
其中：
X和Y各为一个单糖单元，其中不参与形成糖苷键的各个羟基独立地被SO3M或H所取代，其中M是任何可药用的阳离子；
X和Y是任何D-或L-己糖或戊糖；
Y是环状或开环的形式；
当Y是还原单糖时，Z是O、N、S或C或其更高的氧化态，或是一个键，与端基碳相连；
R1是选自包括烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂芳基、酰基、芳酰基、烷基酰胺基、烷基硫酰胺基(alkylthioamido)、三唑基的组的联结子(linker)，或是一个键；
R2是选自包括胆甾醇基、胆甾烷基、胆酸盐、脱氧胆酸盐、直链烷基、支链烷基、取代烷基、直链酰基，支链酰基、取代酰基的组的亲脂部分；
n是0-6的整数；
各个化合物的硫酸化程度为总羟基的70至100％，其中
当R1是一个键时，则R2不为甘草次酸或其衍生物；
当R1是一个键，和n＝0或1，和Z是S时，则R2不为C8或C18直链烷基；
当n是3-6，和R1是一个键，及X和Y是α(1→4)-连接的葡萄糖时，则R2不为C12至C18直链烷基；
当n是3-5，和R1是一个键，及X和Y是β(1→3)-连接的葡萄糖时，则R2不为C4至C12直链烷基或胆甾醇基；和
当X和Y是核糖，和R1是一个键时，则R2不为C18基团。
根据本发明的第二个实施方案，其提供了一种用于预防或治疗哺乳动物患者的由血管生成、转移、发炎、凝血/血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染和/或心血管疾病引起的病症的药物或兽药组合物，该组合物包含至少一种如第一个实施方案所述的化合物和用于至少一种所述化合物的可药用或兽用的载体或稀释剂。
本发明的第三个实施方案包含式II化合物在用于生产预防或治疗患有由血管生成、转移、发炎、凝血/血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染和/或心血管疾病引起的病症的哺乳动物患者的药物中的用途：
[X]n-Y-ZR1R2  II
其中：
X和Y各为一个单糖单元，其中不参与形成糖苷键的各个羟基独立地被SO3M或H所取代，其中M是任何可药用的阳离子；
X和Y是任何D-或L-己糖或戊糖；
Y是环状或开环的形式；
当Y是还原单糖时，Z是O、N、S或C或其更高的氧化态，或是一个键，和与端基碳相连；
R1是选自包括烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂芳基、酰基、芳酰基、烷基酰胺基、烷基硫酰胺基、三唑基的组的联结子(linker)，或是一个键；
R2是选自包括胆甾醇基、胆甾烷基、胆酸盐、脱氧胆酸盐、直链烷基、支链烷基、取代烷基、直链酰基，支链酰基、取代酰基的组的亲脂部分；
n是0-6的整数；和
各个化合物的硫酸化程度为总羟基的70至100％。
根据本发明的第四个实施方案，本发明提供了一种预防或治疗哺乳动物患者的由血管生成、转移、发炎、凝血/血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染和/或心血管疾病引起的病症的方法，该方法包含给予受试者有效量的至少一种式II的化合物，或包含至少一种所述化合物的组合物。
为了使本发明可以被更容易地理解和实施，现将仅以实施例的方式参照附图，对其一个或多个优选的实施方案进行描述。
附图的简要说明
图1所示为在用于证明化合物的抗血管生成活性的大鼠主动脉血管生成试验中，血管生成萌芽(angiogenic sprouting)的范围的实例。
图2所示为从第0天开始每48天用培养基(用于未经处理的对照组)或试验化合物处理7天的主动脉培养物的数据。在第7天，在随后的7天中每2-3天向培养物中加入VEGF(10mg/mL)，然后对血管生成范围进行评分，从而证明该化合物是通过抗血管生成机制而不是诱导对组织的毒性作用来发挥其抑制作用的。所有这三个化合物都有效抑制了血管生成(参见表4)。
图3所示为在B16小鼠黑色素瘤模型中，未经处理的对照组小鼠和用所选的试验化合物处理的小鼠的肿瘤体积的中值。就本发明的化合物而言尽管减少了剂量水平，或限定了暴露时间，但抗肿瘤活性与PI-88或非亲脂性类似物相比仍有所增加。Bid＝一日二次(每天两次)，sid＝一日一次(每日一次)，qd＝每天(每天)。
图4所示为在B16小鼠黑色素瘤模型中，用所选试验化合物处理的荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制百分比(％TGI)数据。尽管减少了本发明化合物的剂量水平，但％TGI值与PI-88或非亲脂性类似物相比仍有提高。bid＝一日二次(每天两次)，sid＝一日一次(每日一次)。
图5所示为该试验化合物阻滞小鼠肺部B16F1黑色素瘤细胞群形成的实例。在各图像下面说明了化合物和给药剂量。
图6所示为B16肺转移模型中，以所选试验化合物与盐水对照组相比的百分数计的肺转移性瘤(lung metastatic nodules)数。与盐水对照组相比，用PI-88和所选化合物处理的小鼠表现出较少的肺转移性瘤。尽管在大多数情况下减少了本发明化合物的剂量水平，但肿瘤转移抑制仍然类似于观察到的较高剂量的PI-88的情况。bid＝一日二次(每天两次)，sid＝一日一次(每日一次)。
图7所示为结肠直肠癌HT29异种移植模型中，用所选试验化合物处理的荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制百分比(％TGI)的数据。就本发明的化合物而言，尽管减少了剂量水平，但％TGI值与PI-88或非亲脂性类似物相比仍有提高。bid＝一日二次(每天两次)，sid＝一日一次(每日一次).
图8所示为试验化合物对细胞与细胞间HSV传递的影响。用～200 PFU HSV-1或HSV-2中的一种感染细胞，然后用补充以1％甲基纤维素和10μg/ml试验化合物的EMEM将其覆盖。该结果用药物处理的细胞中相对于模拟处理对照组中产生的病毒斑块的平均面积的百分比来表示。捕捉到20个病毒斑块的图像，并使用IM500软件对其进行面积测定。
图9所示为试验化合物对HSV病毒粒子结合细胞的影响。在GMKAH1细胞吸附病毒的2小时期间，在4℃下将特定浓度的试验化合物与用甲基-[3H]胸苷标记的HSV-1或HSV-2的一起培养。该结果以在用化合物处理的病毒粒子时发现的附着病毒cpm相对于用模拟处理的对照组的附着病毒cpm的百分比来表示。在用化合物4的试验中，在4℃下附着在细胞上的模拟处理病毒的附着cpm的平均数就HSV-1而言为4263，就HSV-2而言为1742。所示值是来自两个独立实验的四次测定的平均值。
图10至40所示为本发明的反应流程图和化学结构。
优选实施方案的详细说明
WO 2005/085264中所述的硫酸化寡糖衍生物为优良的血管生成和由HS-结合蛋白介导的其他过程的抑制剂。此类化合物具有预防或治疗哺乳动物患者的由血管生成、转移、发炎、凝血、血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染和/或心血管疾病引起的病症的用途。该用途是由于所述化合物能够抑制HS-结合蛋白如生长因子FGF-2和VEGF，以及类肝素酶的活性产生的。发明人发现如果将硫酸化寡糖用高亲脂性基团例如胆甾烷醇或硬脂酸修饰，所述基团直接或通过联结子与糖类连接，则生成的新化合物显著增强了作为抗血管生成剂的能力和改善了药物代谢动力学性质。这可由其在各种体外和离体血管生成试验如生长因子-诱导内皮细胞增殖和迁移试验、Matrigel上的内皮管腔形成试验以及大鼠主动脉试验中的活性来证明。增强的效力还可在动物肿瘤生长模型中被证明。特别值得注意的是，较小的硫酸化糖(例如单-至三糖)，与较长的同系物相比通常无活性或仅有弱的抗血管生成活性(或其他拟HS-活性)，一旦将其加以修饰，其显著增强的活性相似于或优于其较长的但未经修饰的同系物。
某些该化合物还显示出增强的作为抗病毒剂的能力。例如，亲脂性修饰产生了增强抑制单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、或HIV的细胞感染和细胞与细胞间传播能力的结果。此外，该修饰可使得某些化合物具有完全灭活病毒颗粒的能力，因而使得这些化合物具有了比可以抑制病毒结合/进入步骤但不能灭活病毒的未修饰的硫酸化寡糖(如PI-88)的更强的抗病毒效力。
未修饰的硫酸化寡糖的副作用之一是抗凝血活性。本文所述的亲脂性修饰产生了一种新的化合物，与PI-88相比其具有显著降低的抗凝血活性，这可以产生更宽的治疗窗。还可消除用PI-88治疗动物时常见的注射部位青肿，因此有效地提高了患者的依从性。
如下文概括地描述和实施例中所阐明的那样，可使用各种不同方案来合成本说明书中所述的硫酸化寡糖衍生物。
就式I和式II的主题化合物而言，所述单糖单元X和Y可以是例如任何己糖或戊糖以及可以是D或L异构体。此类己糖包括葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔罗糖、半乳糖、艾杜糖以及古洛糖.此类戊糖包括核糖、阿拉伯糖、木糖以及来苏糖。所述单糖单元的糖苷键可以是仅为一种类型或是在构型和连接方面的不同类型。
所述的可药用阳离子M可以是任何这类阳离子，但优选地是钠。
就整数n而言，n为0-6的整数，优选2、3或4，以提供三-、四-或五-糖化合物。
所述的基团R2可以是任何适合的亲脂部分。但优选地是胆甾烷基或丙基硬脂酰胺。
在适用的情况下，式I化合物ZR1上的端基构型可以是α或β或α/β端基碳的混合物。
就上文定义的式I和式II化合物中给出的取代基而言，术语“烷基”，当其被单独地或在复合词如“芳基烷基”中使用时，是指直链、支链或环烃基团。
术语“芳基”，当其被单独地或在复合词如“芳基烷基”中使用时，表示芳香烃的单一的、多环的、共轭的或稠合的残基。芳基可以任选地被一种或多种任选的取代基所取代。
术语“酰基”是指基团-C(O)-R，其中R是烷基或芳基基团。由于该R基团可以如上所述任选地被取代，因此“酰基”是指任选取代的酰基。
烷基、芳基或酰基的任意取代基包括卤素(溴、氟、氯、碘)、羟基，C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基(n-和i-异构体))、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基(n-和i-异构体)、丁氧基(n-，仲-和t-异构体)、硝基、氨基、C1-6烷氨基(例如甲基氨基，乙基氨基，丙基(n-和i-异构体)氨基)、C1-6二烷基氨基(例如二甲氨基、二乙氨基，二异丙基氨基)、卤代甲基(例如三氟甲基、三溴甲基、三氯甲基)、卤代甲氧基(例如三氟甲氧基、三溴甲氧基、三氯甲氧基)和乙酰基。
本发明化合物的硫酸化程度通常为至少70％。即，寡糖衍生物的不形成糖苷键中的羟基的至少70％被SO3M所取代。硫酸化程度通常为70至100％，并且优选地是至少高达90％。
可以通过从糖类结构单元逐步合成的路线或通过从适当长度的寡糖开始并对进行所需的修饰来制备式I和式II化合物。式I的单糖可以从单糖起始原料直接制备。可通过多种不同的本领域技术人员所熟知的方法向糖中引进亲脂性修饰。例如，亲脂性基团可以通过O-、N-、S-或C-糖苷键被引到末端还原糖的端基位置，且可以将所述基团直接连接于端基位置或可以通过联结子将其连接。本领域技术人员应当能够认可有许多类型的适当的联结子。
应当注意的是然后对所有如上文所述制备的衍生物进行脱保护(通常用NaOMe脱乙酰基)，并用磺化剂如三氧化硫吡啶复合物或三氧化硫三甲胺复合物磺化所得的多元醇。
如上所述，本发明化合物具有预防或治疗哺乳动物受试者的由血管生成、转移、发炎、凝血、血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染或心血管疾病引起的病症的用途。该化合物特别是具有治疗人的上述疾病的用途。该化合物通常以如下文段落所述的药物组合物的一种成分的形式被给药。
用于口服的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液态形式。片剂可以包括固体载体如明胶或辅助剂或惰性稀释剂。液体药物组合物通常包括液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液，或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此类组合物和制剂一般会含有至少0.1wt％的该化合物。
肠胃外给药包括通过以下途径给药：静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌内、眼内、经上皮给药、腹膜内和局部给药。局部给药包括皮肤、眼、直肠、鼻的给药，以及通过吸入或通过气雾剂方式给药。就静脉内、皮肤或皮下注射，或在需要治疗的位置注射而言，所述的活性成分应该是一种肠胃外可接受的水溶液形式，其应该是无热原和具有适宜的pH、等渗性和稳定性的。使用例如该主题化合物或其衍生物的溶液，本领域技术人员应该可以制备出适宜的溶液。
除了至少一种所述化合物和载体或稀释剂之外，本发明的组合物可以进一步包括可药用或兽药可用的赋形剂、缓冲剂、稳定剂、等渗化剂、防腐剂或抗氧化剂或任何其他本领域技术人员所熟知的材料。本领域技术人员应该可以理解此类材料应该是无毒的且不会干扰所述化合物(s)的效力。任何添加剂的确切性质可以取决于该组合物的给药途径：即该组合物是将被口服给药或是肠胃外给药。就缓冲剂而言，水性组合物(aqueous compositions)通常包括这样的物质以使得该组合物保持在接近生理pH或至少pH在约5.0至8.0范围内。
本发明的组合物还可以包括除至少一种所述化合物外的活性成分。此类成分将主要根据它们的效力来选择，例如抗血管生成、抗转移、抗凝血、抗微生物以及抗血栓形成剂，以及有效对抗升高的血液甘油三酯水平和心血管疾病的物质，但可以根据任何相关的情况来选择它们。
本发明的药物或兽药组合物将以所考虑的具体情况所必需的预防有效或治疗有效量给予受试者。以组合物方式被给药的至少一种化合物的实际量，以及给药频率和时程将取决于所治疗的病情或所需的预防的性质和严重度。治疗处方如剂量的确定等将在照料受试者的执业医师或兽医师的技能范围内。然而通常，用于向人类受试者给药的组合物将包括每kg体重约0.01至100mg的该化合物，更优选地是包括每kg体重约0.1至10mg。
该化合物可以以其可药用或兽药用的衍生物形式被包括在组合物中。本文所用的所述化合物的“衍生物”包括盐、与金属离子例如Mn2+和Zn2+的配位络合物、酯类如体内可水解的酯、游离酸或碱、水合物或前体药物。具有酸性基团如磷酸根或硫酸根的化合物可以与碱金属或碱土金属如Na、K、Mg以及Ca，和与有机胺如三乙胺和三(2-羟乙基)胺形成盐。还可以在带有碱性基团如胺的化合物与无机酸(如盐酸、磷酸或硫酸)或有机酸(如醋酸、柠檬酸、苯甲酸、富马酸或酒石酸)之间形成盐。既具有酸性基团又具有碱性基团的化合物可以形成内盐。
使用本领域技术人员所熟知的技术，在所述化合物上的羟基或羧酸基团与适当的羧酸或醇反应配偶子之间形成酯。
可以在体内或体外将本发明化合物的前体药物衍生物转化成所述的母体化合物。通常，母体化合物的至少一种生物活性可以在化合物的前药形式中被抑制，和可以通过将前体药物转化成母体化合物或其代谢产物而将其活化。本发明化合物的前体药物包括使用保护基，其可以在体内被除去从而释放活性化合物或用来抑制药物的清除。适合的保护基对本领域技术人员是已知的。
仍然如上所述，本发明化合物具有用于制备预防或治疗哺乳动物受试者的由血管生成、转移、发炎、凝血/血栓形成、微生物感染、升高的血液甘油三酯浓度和/或心血管疾病引起的病症的药物的用途。此类药物的制备方法对本领域技术人员而言是已知的，并且其包括用于生产上述药物组合物的方法。
现将给出本发明化合物合成路线的一般说明。
常规方法
脱乙酰基的常规方法
用甲醇钠甲醇溶液(1.35M，0.2-0.6当量)处理全醋酸酯的无水甲醇(0.1M)(或甲醇-THF)溶液。室温下搅拌该混合物1-3小时(用TLC进行监测)。加入酸性树脂AG
Figure GPA00001139318900101
-50W-X8(H+型)直至调节pH＝6-7，过滤该混合物，并用甲醇冲洗该树脂。真空浓缩合并的滤液和冲洗液，并彻底干燥从而得到多元醇产物。
磺化作用的常规方法
将DMF中的多元醇与SO3·三甲胺或SO3·吡啶复合物(2当量/醇)的混合物进行加热(60℃，o/n)。用甲醇处理冷却(r.t.)的反应混合物，然后通过添加Na2CO3(10％w/w)使其变为碱性(以使pH＞10)。将该混合物过滤，并蒸发以及共蒸发(水)该滤液。将粗制的多硫酸化的物料溶解于水中，并用分子排阻色谱法(参见下文)进行处理，从而得到所述的硫酸化产物。当需要时，在冷冻干燥之后，将该产物通过离子交换树脂柱(AG
Figure GPA00001139318900111
-50W-X8，Na+型，1×4cm，去离子水，15mL)以将该产物均一地转化为钠盐形式。蒸发收集到的溶液并冷冻干燥从而得到最终产物。
分子排阻色谱法
在5×100cm柱中的Bio-Gel P-2上用0.1M的NH4 +·HCO3 -以2.8mL/分钟的流速进行分子排阻色谱(SEC)，收集2.8分钟(7.8mL)的级分。通过在硅胶板上点样和炭化显像来分析级分的糖类含量，和/或通过二甲基亚甲蓝(DMB)试验来分析多带电粒种29。最后，通过CE8来检测组分的纯度并将那些被认为是无盐的收集起来并冷冻干燥。
实施例1：十二烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(2)
向三氯乙酸亚氨酸酯128(0.469g，0.285mmol)的DCM(15mL)溶液中加入1-十二烷醇(0.849mmol，3当量)和
Figure GPA00001139318900112
MS(50mg)。在-20℃下搅拌该混合物20分钟。加入TMSOTf(103μL，0.57mmol，2当量)并在用Et3N(38μL，0.285mmol，1当量)淬灭前将该混合物在-20℃下搅拌50分钟。升至室温后，过滤该混合物并用DCM冲洗固形物。将合并的滤液和冲洗液在硅胶上蒸发，并通过柱层析(二氧化硅2×20cm，CHCl3，CHCl3-甲醇99∶1至98∶2梯度洗脱)进行纯化从而得到无色胶质形式的糖苷2。获得每部分中都含有副产物的两部分级分BnNHAc(76mg，2∶BnNHAc＝5∶3；179mg，2∶BnNHAc＝5∶11)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：5.30-5.16(m，8H)，4.99-4.87(m，8H)，4.31-3.77(m，19H)，3.68-3.61(m，1H，OCH2)，3.44-3.36(m，1H，OCH2)，2.18，2.17，2.15，2.11，2.10，2.09，2.07，2.06，2.05，2.02，2.01，1.97，1.95(都是单峰，总计48H，16×Ac)，1.58(五重峰，2H，J＝6.7，CH2)，1.33-1.22(m，18H，9×CH2)，0.86(t，3H，J＝6.7，CH3)。
十二烷基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(3)
按照脱乙酰基的常规操作，用NaOMe(甲醇中11M，5μL，0.055μ μmol)处理甲醇(3mL)中的糖苷2(72mg，0.043mmol)。室温下搅拌该混合物20小时，加入AG50WX8树脂(H+型)对其进行中和，过滤并用水清洗。用乙酸乙酯(×2)萃取该溶液以除去BnNHAc。将水相进行蒸发以至干燥，将残留物冷冻干燥从而得到无定形固体多元醇3，将其直接用于下一步骤。1HNMR(D2O，400MHz，内标4.60ppm DOH)δ4.97-4.83(m，5H)，4.06-3.21(m，32H)，1.41(br s，2H)，1.11(br s，18H)，0.71(t，3H，J＝6.7，CH3)。
十二烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(4)
按照磺化作用的标准操作，对多元醇3(0.43mmol)进行磺化并用SEC对其进行纯化从而得到白色粉末产物4(77mg)。1HNMR(D2O，400MHz，内标4.60ppm DOH)δ5.19(s，1H)，5.15(d，1H，J＝1.9)，5.10(d，1H，J＝1.9)，5.07(d，1H，J＝1.9)，4.89(m，1H)，3.77-3.64(m，30H，糖)，3.48-3.41(m，1H，OCH2)，3.33-3.27(m，1H，OCH2)，1.30(m，2H，CH2)，1.10-0.90(m，18H，9xCH2)，0.54(t，3H，J＝6.7，CH3).
实施例2：12-叠氮基-1-十二烷醇
以如下次序用叠氮化钠(121mg，1.855mmol，2当量)、碘化四丁基铵(17mg，0.0464mmol，0.05当量)和饱和的碳酸氢钠水溶液(0.9mL)处理12-溴-1-十二烷醇(246mg，0.927mmol)在叔-丁醇(1.8mL，0.5M)中的混合物。室温下搅拌该混合物4天。用Celite的短柱过滤该混合物，并用乙酸乙酯(20mL)冲洗滤饼。将合并的滤液和冲洗液在硅胶上蒸发，并用快速柱层析(2.5×18cm，己烷-乙酸乙酯6∶1，4∶1至2∶1梯度洗脱)将其纯化从而得到无色油状12-叠氮基-1-十二烷醇(193mg，92％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：3.62(t，2H，J＝7.0，OCH2)，3.24(t，2H，J＝7.0，NCH2)，1.61-1.51(m，4H)，1.35-1.25(m，16H).
12-叠氮基十二烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(5)
向三氯乙酸亚胺酸酯1(0.325g，0.197mmol)的DCM(15mL)溶液中加入12-叠氮基十二烷醇(1.5当量)和
Figure GPA00001139318900131
MS(50mg)。在-20℃下搅拌该混合物20分钟。加入TMSOTf(54μL，0.296mmol，1.5当量)并在用Et3N(1当量)猝灭前在-20℃下搅拌该混合物30分钟。升至室温后，过滤该混合物并用DCM冲洗固形物。将合并的滤液和冲洗液在硅胶上蒸发，并用柱层析对其进行纯化(二氧化硅2×20cm，用CHCl3，CHCl3-甲醇99∶1至98∶2梯度洗脱)从而得到含有副产物BnNHAc的无色胶质糖苷5(71.1mg，5∶BnNHAc＝1∶1)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.29-5.14(m，8H)，5.01-4.86(m，8H)，4.28-3.75(m，19H)，3.64(dt，1H，J＝9.5，7.0，OCH2)，3.39(dt，1H，J＝9.5，7.0，OCH2)，3.22(t，2H，J＝7.0，NCH2)，2.16，2.15，2.11，2.10，2.09，2.09，2.09，2.09，2.07，2.06，2.04，2.04，2.01，1.95(都是单峰，总计48H，16×Ac)，1.57(m，4H，2×CH2)，1.36-1.22(m，16H，8×CH2)。
12-(4-苯基-[1，2，3]三唑-1-基)十二烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(6)
以下列顺序向1mL HPLC样品瓶中装载叠氮化物5(71mg，41.5μmol)、叔-丁醇(100μL，0.4M)、苯乙炔(83μmol，2当量)、硫酸铜溶液(水中0.3M，14μL，4.2μmol，10mol％)和抗坏血酸钠溶液(水中1M，12.4μL，12.4μmol，30mol％)。室温下搅拌该混合物2天。然后在硅胶上蒸发该混合物并通过快速柱层析(1×18cm，用己烷-乙酸乙酯6∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2至1∶3梯度洗脱)对其进行纯化，从而得到无色胶质苯基三唑6(46.3mg，62％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.82(d，2H，J＝7.2，Ph)，7.75(s，1H，三唑)，7.41(t，2H，J＝7.2，Ph)，7.31(t，1H，J＝7.2，Ph)，5.30-5.15(m，8H)，5.03-4.87(m，8H)，4.38(t，2H，J＝7.2，NCH2)，4.29-3.77(m，19H)，3.64(dt，1H，J＝9.6，6.8，OCH2)，3.40(dt，1H，J＝9.6，6.8，OCH2)，2.17，2.16，2.16，2.13，2.11，2.11，2.11，2.10，2.09，2.07，2.05，2.05，2.02，2.00，1.96(都是单峰，总共48H，16×Ac)，1.93(m，2H，CH2)，1.57(m，2H，CH2)，1.34-1.24(m，16H，8×CH2).
12-(4-苯基-[1，2，3]三唑-1-基)十二烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(8)
(a)按照脱乙酰基作用的常规操作，用NaOMe(甲醇中11M，50μL，0.55μmol)处理甲醇(4.5mL)中的全醋酸酯6(46mg，0.0254mmol)。室温下搅拌该混合物18小时，通过加入AG50WX8树脂(H+型)将其中和，过滤，并用甲醇冲洗。蒸发该滤液并在下面为P2O5的真空干燥器中干燥残余物，并使用而不用进行进一步的纯化和鉴别。(b)按照磺化作用的标准操作，对上述多元醇7进行磺化并通过SEC进行纯化，从而得到白色粉末产物8(45mg)。1H NMR(D2O，400MHz，内有4.60ppm DOH)δ7.88(s，1H，三唑-CH)，7.47-7.44(m，2H)，7.21-7.10(m，3H)，5.23(br s，1H)，5.19(d，1H，J＝1.5)，5.12(d，1H，J＝1.8)，5.10(d，1H，J＝1.5)，4.91(m，1H)，4.76-3.72(m，32H，糖和NCH2)，3.37-3.30(m，1H，OCH2)，3.23-3.17(m，1H，OCH2)，1.51(m，2H，CH2)，1.12(m，2H，CH2)，0.90-0.63(m，16H，8×CH2)。
实施例3：12-(4-萘基-1-基-[1，2，3]三唑-1-基)十二烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(9)
以下列顺序向1mL HPLC样品瓶中装载叠氮化物5(86mg，50.3μmol)、叔-丁醇(100μL，0.4M)、1-乙炔基萘(83μmol，2当量)、硫酸铜溶液(水中0.3M，14μL，4.2μmol，10mol％)以及抗坏血酸钠溶液(1M，在水中，12.4μL，12.4μmol，30mol％)。室温下搅拌该混合物11天。然后在硅胶上蒸发该混合物并用快速柱层析(1×18cm，用己烷-乙酸乙酯6∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2至1∶3梯度洗脱)将其纯化，从而得到无色胶质萘基三唑9(24.2mg，26％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.38-8.33(m，1H)，7.92-7.86(m，2H)，7.80(s，1H，三唑-CH)，7.72(dd，1H，J＝7.3，1.5)，7.54-7.48(m，3H)，5.31-5.15(m，8H)，5.03-4.87(m，8H)，4.47(t，2H，J＝7.3，N-CH2)，4.30-3.77(m，19H)，3.64(dt，1H，J＝9.7，6.8，OCH2)，3.40(dt，1H，J＝9.7，6.8，OCH2)，2.17，2.16，2.16，2.13，2.12，2.11，2.11，2.10，2.09，2.07，2.06，2.05，2.02，2.00，1.97，1.57(15s，都是3H，2.100为6H，16×Ac)，2.07-1.95(m，与Ac的单峰重叠，2H，CH2)，1.57(m，1H，CH2)，1.42-1.23(m，16H，8×CH2)。
12-(4-萘-1-基-[1，2，3]三唑-1-基)十二烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(11)
(a)按照脱乙酰基作用的常规方法，用NaOMe(甲醇中11M，40μL，0.44μmol)处理甲醇(3mL)中的糖苷9(39.6mg，0.0213mmol)。室温下搅拌该混合物24小时，通过加入AG50WX8树脂(H+型)将其中和，过滤并用甲醇进行冲洗。蒸发滤液并在下面为P2O5的真空干燥器中干燥残余物。(b)按照磺化作用的标准操作，磺化上述多元醇10并用SEC进行纯化，从而得到白色粉末产物11(40mg，68％)。1H NMR(D2O，400MHz，内有4.60ppm DOH)δ8.05(s，1H，三唑-CH)，7.97(d，1H，J＝8.3)，7.90(d，2H，J＝7.8)，7.55-7.40(m，4H)，5.44-5.22(m，4H)，5.09-3.82(m，33H，糖和NCH2)，3.41-3.33(m，1H，OCH2)，3.25-3.16(m，1H，OCH2)，1.78(五重峰，2H，CH2)，1.14-0.79(m，18H，9×CH2)。
实施例4：2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-甘露吡喃糖(13)
将四糖1230全乙酰化(Ac2O、吡啶、DMAP，室温，4天)并用快速色谱法(硅胶，己烷-乙酸乙酯梯度洗脱)进行纯化，从而得到油状全醋酸酯13。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.20(d，1H，J1，2＝1.8，H-1)，5.35-5.15(m，7H)，5.05-4.92(m，5H)，4.30-3.85(m，15H)，2.18(s，6H，OAc)，2.14(s，6H，OAc)，2.12(s，6H，OAc)，2.10(s，3H，OAc)，2.08(s，6H，OAc)，2.06(s，3H，OAc)，2.03(s，3H，OAc)，2.02(s，6H，OAc)，1.97(s，3H，OAc)。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基 三氯乙酸亚胺酸酯(14)
在0℃下用苄胺(0.137g，1.3mmol，139μL)处理乙醚(3.0mL)和THF(750μL)中的全醋酸酯13(500mg，398μmol)。将该混合物缓慢地升至室温并反应一整夜。蒸发掉溶剂并将残留物溶于DCM中，用0.5M冷HCl(×3)冲洗，然后用盐水冲洗，并将该有机溶液进行干燥(Na2SO4)，过滤，蒸干。将残留物溶于无水DCM中，并加入分子筛(
Figure GPA00001139318900171
30mg)、无水碳酸铯(12.9mg，39.8μmol)和碳酸钾(110mg，796μmol)。在加入三氯乙腈(115mg，80μL，796μmol)前，将该混合在0℃下进行搅拌。在室温下搅拌该混合物5小时直至通过TLC显示完全转化。过滤该混合物并蒸发溶剂，从而得到粗制品，将该粗制品进行柱层析(SiO2，6∶1 Hex∶EtOAc至1∶3 Hex∶EtOAc，用1∶2 Hex∶EtOAc洗脱产物)，从而得到澄清油状的在置于冰箱中固化的三氯乙酸亚胺酸酯14(307.5mg，57％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.40(d，0.7H，J1，2＝1.5，H-1Iα)，6.22(d，0.3H，J1，2＝1.5，H-1Iβ)，5.40-5.14(m，7H)，5.05-4.89(m，5H)，4.31-3.84(m，15H)，2.19-1.98(m，39H，OAc)。
3β-胆甾醇基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(15)
在-20℃下将DCE(在
Figure GPA00001139318900172
MS上干燥，0.7mL，0.094M)中的14(90mg，0.0663mmol)和胆固醇(39.8mg，0.0995mmol，1.5当量)溶液与
Figure GPA00001139318900173
MS(～50mg)一起进行搅拌同时用注射器加入TMSOTf(18mL，0.0995mmol，1.5当量)。在40分钟的时间内将温度(外部)升至-5℃。黄色慢慢转变成橙色(略带红色)。加入Et3N(50μL)。该颜色立即消失。将该混合物用DCM(20mL)进行稀释并用饱和的Na2CO3-盐水冲洗，干燥(Na2SO4)并过滤。在硅胶上蒸发滤液并用柱层析进行纯化(二氧化硅1×18cm，用己烷-乙酸乙酯4∶1，2∶1，1∶1，1∶2至1∶3梯度洗脱)，从而得到无色胶质的糖苷15(58mg，55％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：5.34-5.14(m，8H，糖和胆固醇-H6)，5.05-4.90(m，6H，糖)，4.30-3.84(m，15H，糖)，2.34-0.80(m，30H，胆固醇)，2.17，2.16，2.13，2.06，2.05，2.02，2.01，2.01，1.96(都是单峰，每个3H，9×Ac)，2.11，2.10(都是单峰，每个6H，4×Ac)，0.98(s，3H，Me)，0.90(d，3H，J＝6.4，Me)，0.85(d，3H，J＝6.4，Me)，0.84(d，3H，J＝6.4，Me)，0.66(s，3H，Me)；ESMS：m/z 1604([M+Na]+)。
3β-胆甾醇基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(16)
将甲醇(在
Figure GPA00001139318900181
MS上干燥，3mL)中的15(56mg，0.0354mmol)的溶液与甲醇(50μL)中的11M NaOMe一起搅拌40分钟。形成一种白色沉淀。加入THF(1mL)而没有成功的提高溶解度。加入DMF(4mL)。一些沉淀溶解。将该混合物总共搅拌6小时。加入水(0.8mL)以使得成为澄清溶液。加入AG50W-X8树脂(H+型)将pH调节到6～7。过滤该混合物并用甲醇(1mL)冲洗树脂。由于产生严重的泡沫所以停止了在旋转蒸发器上进行的蒸发。通过用气流蒸发和冻干该混合物，从而得到白色固体多元醇16，该白色固体在下面为P2O5的真空干燥器中干燥一整夜并直接用于下一步骤。
3β-胆甾醇基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(17)
按照磺化作用的标准操作，磺化多元醇16(0.0354mmol)。通过加入5M NaOH(561μL，2.81mmol，以SO3吡啶复合物计2.05当量)将该冷却的粗制混合物进行碱化。蒸干后，将残留物溶解于水中(3mL)并通过SEC进行纯化。将纯化组分合并在加有1M Na2CO3的纯水中用Slide-A-Lyser
Figure GPA00001139318900182
Cassette 2K(0.5-3mL)透析一整夜。另外加1MNa2CO3并更换新鲜的纯水。进行一整夜透析。除去黄色溶液并冷冻干燥，从而得到灰白色粉末产物17(34.8mg，42％)。1H NMR(D2O，400MHz)δ6.41-6.26(m，4H，糖和胆甾醇基-H6)，5.09(s，1H)，5.03(d，1H，J＝2.2)，4.86(s，1H)，4.73-3.94(m，22H)，3.51(m，1H，胆甾醇基-H3)，2.35(dm，1H，J＝11.7，胆甾醇基-H4)，2.24(dm，1H，J＝11.7，胆甾醇基-H4)，1.90-0.51(m，包括0.869[s，3H]，0.766[d，3H，J＝6.6]，0.689[d，3H，J＝6.6]，0.686[d，3H，J＝6.6]，和0.533[s，3H]，43H，胆甾醇基)。
实施例5：胆甾烷醇
将胆固醇(500mg)加入到乙酸乙酯中。加入10％钯碳(cat.)，并在氢气球下搅拌该混合物一整夜。过滤该混合物，蒸发溶剂，从而得到定量产率的白色固体产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.58(m，1H，CHOH)，2.44(宽峰，1H，OH)，1.97-0.83(m，31H)，0.88(d，3H，J＝6.6，CH3)，0.85(dd，6H，J＝1.5，J＝6.6，CH3)，0.79(s，3H，CH3)，0.64(s，3H，CH3)。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(18)
在氩气条件下向14(600mg，4.42×10-4摩尔)的DCM(32mL)溶液加入胆甾烷醇(300mg)。在-20℃下搅拌该混合物20分钟。加入TMSOTf(40μL)。在-20℃下搅拌该混合物40分钟，然后加热到-10℃20分钟。向该混合物加入三乙胺(70μL)并将其升至室温。蒸发溶剂。用柱层析(SiO2：3∶1 Hex∶EtOAc至1∶2Hex∶EtOAc)纯化该粗制品，从而得到澄清的油状糖苷18(220mg，31％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.35-5.15(m，7H)，5.03-4.91(m，6H)，4.31-3.85(m，15H)，3.51(m，1H，C-3)，2.18(s，3H，OAc)，2.17(s，3H，OAc)，2.14(s，3H，OAc)，2.12(s，6H，OAc)，2.11(s，3H，OAc)，2.10(s，3H，OAc)，2.07(s，3H，OAc)，2.06(s，3H，OAc)，2.05(s，3H，OAc)，2.03(s，3H，OAc)，2.00(s，3H，OAc)，1.97-0.78(m，31H，胆甾烷醇)，1.97(s，3H，OAc)，0.88(d，3H，J＝6.6，CH3)，0.85(dd，6H，J＝1.5，J＝6.6，CH3)，0.79(s，3H，CH3)，0.63(s，3H，CH3)。
3β-胆甾烷基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(19)
按照常规操作将糖苷18(43.1mg)进行脱乙酰化，从而得到白色固体多元醇19(21mg，74％)，将该多元醇进行反应而不进行纯化或鉴定。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(20)
将多元醇19(19mg，18.3μmol)溶解于DMF(1.3mL，0.015M)中。加入SO3.吡啶(6当量/OH，1.43mmol，227mg)并在60℃下搅拌该混合物一整夜。在一次性加入5M NaOH(613μL)从而中和该溶液之前将该混合物在冰水中冷却。蒸发溶剂。残留物用C18 SPE柱脱色，并通过用2000MWCO透析盒，在48小时的时间换三次水的透析方法除去盐分，然后冷冻干燥，从而得到白色固体产物20(19.2mg，44％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ5.52-5.46(m，3H)，5.26-5.20(m，2H)，5.04(m，1H)，4.88(m，1H)，4.84-4.15(m，21H)，3.76(m，1H，C-3)，2.00-0.81(m，31H，胆甾烷醇)，0.91(d，3H，CH3)，0.86(d，6H，J＝6.2，CH3)，0.81(s，3H，CH3)，0.66(s，3H，CH3)。
实施例6.3-叠氮基丙基-1-基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(21)
将BF3·Et2O(78mg，550μmol)加入到全醋酸酯13(276mg，220μmol)和3-叠氮基丙烷-1-醇31(67mg，660μmol)的无水DCE(8mL)溶液中。在一个密封的容器中，在加入另外一部分BF3·Et2O(115mg，810μmol)和将该溶液在加热3小时之前，在60℃下搅拌该溶液2小时。将该溶液冷却至室温并将其倒入到碎冰、NaHCO3(饱和水溶液)和盐水的混合物中。用乙酸乙酯萃取该混合物，并用1∶1盐水∶NaHCO3(饱和水溶液)进一步冲洗该有机层，然后干燥(Na2SO4)，蒸发和用无水甲苯共蒸馏。加入无水DCM(5mL)、醋酸酐(66mg，648μmol)、Et3N(89mg，875μmol)和DMAP(晶体)，在-20℃下储存该溶液一整夜。直接将溶液加到准备好的快速色谱柱(17×2cm硅胶，60∶40至75∶25 EtOAc∶Hx梯度洗脱)上，从而得到油状的糖苷21(176mg，61％)。ESMS：m/z 1319.69([M+Na]+).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.31-5.12(m，7H)，5.00-4.87(m，6H)，4.26-3.94(m，11H)，3.90-3.81(m，2H)，3.77(dt，1H，J＝9.9，6.0)，3.47(dt，1H，J＝9.9，6.0)，3.42-3.32(m，2H)，2.14(1)，2.13(5)，2.10，2.08×2，2.06×2，2.05，2.03(2)，2.02(5)，1.99，1.98，1.93(13×s，13×3H，OAc×13)，1.84(五重峰，1H，J＝6.2).13C NMR(100MHz，CDCl3)δ：170.6，170.5，170.4，170.3，170.1(4)，170.0(9)，169.9(2)，169.8(8)，169.7，169.6，169.5(4)，169.4(5)，169.3，99.4，98.9，98.8，98.1，76.8，75.1(5)，75.1(1)，70.9，70.8，70.1，69.6，69.5，69.4，69.2，68.5，68.3，67.3，66.6，66.1，65.5，64.7，62.5，61.9，61.7，48.0，28.5，20.8(4)，20.7(6)，20.7，20.6，20.5(4)，20.5(2)，20.4(9)，20.4(7)。
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(22)
(a)将糖苷21(500mg，386μmol)溶解于THF(10mL)中。加入三苯膦，聚合物键合(725mg)，并在室温下搅拌该混合物1小时。加入水(210μL)，在50℃下搅拌该混合物4小时。冷却该混合物，过滤，并蒸发溶剂，从而得到一种白色固体，不进行进一步的纯化或鉴定将该固体用于下一步骤中。
(b)将上述胺(250mg，197μmol)溶解于DCM(6mL)中。加入硬酯酰氯(2当量，394μmol，119mg，133μL)，接着加入三乙胺，室温下搅拌该混合物5小时。蒸发溶剂，将残留物加到DCM中，用NaHCO3(饱和的)冲洗，干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂。将该粗制的产物用柱层析(SiO2：DCM→4％甲醇/DCM)进行纯化，从而得到澄清的油状酰胺22(102mg，33％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.86(宽峰m，1H，NH)，5.32-5.12(m，7H)，5.02-4.88(m，6H)，4.28-3.96(m，15H)，3.73(m，1H，CH2O)，3.45(m，1H，CH2O)，3.32(m，2H，CH2N)，2.15(s，3H，OAc)，2.15(s，3H，OAc)，2.12(m，2H，CH2CO)，2.11(s，3H，OAc)，2.10(s，6H，OAc)，2.08(s，6H，OAc)，2.06(s，3H，OAc)，2.04(s，6H，OAc)，2.00(s，3H，OAc)，1.99(s，3H，OAc)，1.95(s，3H，OAc)，1.79(m，2H，CH2)，1.58(m，2H，CH2)，1.28-1.20(m，28H，CH2)，0.84(t，3H，CH3)。
3-硬酯酰胺丙基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(23)
按照常规操作将酰胺22(101.6mg)脱去乙酰基，从而得到白色固体多元醇23(61mg，93％)，不进行进一步纯化或鉴定而用于反应。
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(24)
将多元醇23(60.9mg，62μmol)溶解于DMF(0.02M，3.1mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，2.42mmol，385mg)，并在60℃下搅拌该溶液一整夜。在冰水中冷却该混合物，并在蒸发掉溶剂前一次性加入5M NaOH(2.1当量/SO3.吡啶，5.08mmol，1.02mL)。将该化合物加入到1％甲醇水中，并在C18 SPE柱上将其纯化。然后在冷冻干燥之前，用2000MWCO透析盒将该化合物透析两个晚上以上，从而得到白色固体产物24(113mg，79％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ5.56(m，1H)，5.48(m，2H)，5.28(m，1H)，5.11(m，1H)，5.06(m，1H)，4.91-4.13(m，22H)，3.87(m，1H，CH2O)，3.70(m，1H，CH2O)，3.32(m，2H，CH2N)，2.29(t，2H，CH2CO)，1.88(m，2H，CH2)，1.62(m，2H，CH2)，1.33-1.28(m，28H，CH2)，0.90(t，3H，CH3)。
实施例7.3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(25)
在无水DCM中将三氯乙酸亚胺酸酯1(165mg，0.1mmol)、胆甾烷醇(78mg，2当量，0.2mmol)和
Figure GPA00001139318900231
分子筛(100mg)搅拌2小时。在0℃下逐滴地加入TMS-三氟甲磺酸酯的无水DCM(0.4M，0.075mL，0.03mmol，0.3当量)溶液，并在相同的温度下不断地搅拌40分钟。通过加入Et3N(5μL)来淬灭该反应，用乙酸乙酯(100mL)将其稀释，超声处理(3分钟)，缓慢地倾析。用饱和的NaHCO3溶液(3×20mL)冲洗有机溶液，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取有机相，用盐水(1×20mL)冲洗，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，从而得到无色泡沫状糖苷。在硅胶柱(20×2cm，甲苯∶乙酸乙酯，1∶2)上纯化该产物。纯化得到了2个组分(A，B)，其中组分A(90mg，48％得率)含有纯的产物但组分B为纯产物与脱去乙酰基产物的混合物(1∶1，74mg)。为了提高想要得到的糖苷的得率，将干燥的组分B和DMAP(cat)溶解于无水吡啶(2mL)中和通过在0℃下逐滴滴加Ac2O(0.1mL)将其乙酰化并在室温下不断地搅拌2小时。通过在0℃下加入无水甲醇(5mL)和连续搅拌30分钟来淬灭该混合物。真空浓缩和与甲苯(3×20mL)共蒸发该溶液，从而生产得到纯的糖苷25(71mg，38％得率)，得到86％的总得率。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.14-5.32(m，9H，5H-4，2H-3，H-2IV)，4.90-5.05(m，8H，5H-1，3H-3)，3.90-4.31(m，19H，H-2，H-3I，H-3II，H-3III，5H-5，5H-6，5H-6b)，3.80(ddd，1H，H-5)，3.52(m，1H，H-3Cho1.)，2.18，2.17，2.14，2.12，2.11，2.10，2.08，2.07，2.06，2.03，2.01，1.98，(s，48H，16×Ac)，0.55-1.82(m，33H，12CH2，9CH)，0.89(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.857(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.853(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.79(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.64(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
3β-胆甾烷基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(26)
按照常规操作将糖苷25(181mg，0.097mmol)脱去乙酰基从而得到白色晶状的多元醇26(116mg，100％)，将其用于下一步骤而不进行进一步的纯化或鉴定。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(27)
将干燥的多元醇26(40mg，0.033mmol)溶解于无水DMF(0.83mL)中，并加入将刚刚洗过和干燥的SO3.吡啶(250mg，3当量每OH-基团，1.85mmol)，在60℃下搅拌16小时。通过在0℃下(pH 12)逐滴地滴加NaOH水溶液(5M，2.1当量SO3，0.66mmol)来淬灭该反应，并在40℃下真空浓缩从而得到一种黄色粉末。将该粉末溶解于水中(HPLC级，12mL)，在2K柱中用纯水交换透析36小时。16小时后向该柱中加入NH4HCO3(0.1M，0.5mL)的水溶液以确保pH大于7。通过用反相HPLC，10％MeCN-水→35％MeCN-水梯度洗脱，5mL/min的流速，用ELS检测来纯化该产物。合并含有纯的产物的组合并将其冻干，从而得到蓬松的白色粉末27(23.8mg，得率25％)。1H NMR(400MHz，D2O)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.48-5.57(m，4H，4H-2)，5.29，5.23(bs，4H，H-1′，H-1″，H-1″′，H-1″″)，4.35-4.90(m，23H，H-1，5H-3，5H-4，2H-5，5H-6，5H-6b，4.28(t，1H，H-2)，4.15-4.24(m，3H，3H-5)，3.81(m，1H，H-3Cho1.)，0.66-2.05(m，33H，12CH2，9CH)，0.96，0.94，0.90，0.88，0.85，0.70(s，15H，CH3).0.85(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.88(d，6H，J＝6.8，2×胆甾烷基-CH3)，0.85(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.70(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
实施例8.苄基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(28)
将2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基 三氯乙酸亚胺酸酯32(0.609g，0.822mmol，1.1当量)和苄基3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷33(0.435g，0.747mmol)溶解于无水DCM(6mL)中。加入粉末状MS(80mg，刚活化的)。在0℃下搅拌该混合40分钟。逐滴地加入TMSOTf(0.027mL，0.149mmol，0.2当量)的DCM(1.5mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物同时用TLC(己烷-乙酸乙酯＝65∶35)对反应进行检测。40分钟后，反应完全并加入Et3N(0.3mL，2.15mmol)。将该粗制的混合物与另一批粗制品(TCA：1.42g，2.098mmol；2-醇：1.22g，2.098mmol，TMSOTf：0.114mL，0.629mmol，0.3当量，0℃，40分钟)合并。通过用Celite短柱过滤该混合物，用DCM(3×1mL)冲洗。向合并的滤液和冲洗液中加入吡啶(0.121mL，1.494mmol，2当量)和苯甲酰氯(0.130mL，1.212mmol，1.5当量)。室温下搅拌该混合物o/n，在硅胶上蒸发并用柱层析进行纯化(硅胶3×20cm，己烷-乙酸乙酯200∶20，400∶80，200∶50，240∶80，200∶90，200∶100梯度洗脱)从而得到无色胶质状的二糖28(594mg，68％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.15-7.88(m，14H，Ph)，7.59-7.25(m，26H，Ph)，6.16-5.94(m，5H)，5.30-5.27(m，2H)，4.82(d，1H，J＝11.7)，4.68-4.39(m，8H)。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-D-甘露吡喃糖(29)
将二糖28(670mg，0.577mmol)溶解于甲醇(3mL)和乙酸乙酯(30mL)中。加入钯炭(5％，80mg)。在室温o/n，50psi的氢气条件下搅拌该混合物。TLC指示有～60％的转化。加入更多的钯炭(5％，80mg)。在50psi下连续搅拌3天。TLC指示转化完全。用Celite短柱过滤该混合物并用乙酸乙酯进行冲洗(5×1mL)。蒸发合并的滤液和冲洗液以至干燥，从而得到无色泡沫状的标题化合物29(609mg，99％)。不进行纯化将该产物直接用于下一步骤。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-D-甘露吡喃糖基三氯乙酸亚胺酸酯(30)
向预冷(0℃)的29(609mg，0.569mmol)的无水DCM(2.8mL，0.2M)溶液中加入三氯乙腈(114μL，1.138mmol，2当量)。加入DBU(4.3μL，0.05当量，0.0285mmol)的无水DCM(0.3mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物4小时，TLC(己烷-乙酸乙酯＝65∶35)指示反应完全。在硅胶上蒸发该粗制的混合物，通过硅胶柱层析(2.5×14cm，己烷-乙酸乙酯-Et3N 210∶20∶0.5，200∶50∶0.5，180∶60∶0.5，150∶70∶0.5梯度洗脱)进行纯化。合并产物的组分，蒸发，并在下面为P2O5的真空干燥器中干燥o/n，从而得到白色泡沫状三氯乙酸亚胺酸酯30(530mg，77％)，不进行进一步纯化而将其用于下一步骤。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(31)
向三氯乙酸亚胺酸酯30(260mg，0.214mmol)和3β-胆甾烷醇(166mg，0.428mmol，2当量)的无水DCM(3.8mL)溶液中加入刚活化的、粉末状的分子筛
Figure GPA00001139318900261
(50mg)。在0℃下搅拌该混合物0.5小时，在0℃下逐滴地加入TMSOTf(7.7μL，0.0428mmol，0.2当量)的无水DCM(0.3mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物1.5小时，TLC指示反应完全。加入Et3N(150μL)，并在硅胶上蒸发该混合物，通过硅胶柱层析(2×15cm，己烷-乙酸乙酯210∶20，200∶50，180∶60，180∶90梯度洗脱)进行纯化，从而得到白色泡沫状苷31(301mg，98％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.11-7.28(m，35H，Bz)，6.09(ddor t，1H，JH3(II)-H4(II)＝10.3，JH4(II)-H5(II)＝9.6，H4II)，5.97-5.87(m，3H，H2II，H3I and H4I)，5.28(d，1H，JHI-H2＝2.2，H1)，5.28(d，1H，JHI-H2＝1.5，H1)，4.69-4.44(m，6H，H5I，H5II，H6I and H6II)，4.33(br s，1H，H2I)，3.59(m，1H，OCH-cho1)，3.02(dd，1H，JH2(II)-H3(II)＝2.9，H3II)，1.99-0.47(m，31H，胆甾烷基)，0.91(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.872(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.867(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.75(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.65(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
3β-胆甾烷基α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(32)
用11M NaOMe的甲醇(0.1mL，1.1mmol，5.4当量)溶液处理31(293mg，0.203mmol)在无水THF(4mL)和甲醇(6mL)中的溶液。室温下搅拌该混合物o/n。用AcOH(50μL)处理该混悬液从而产生立即澄清的溶液。加入AG50WX8树脂(H+型)以调节pH到6。过滤该混合物并用甲醇冲洗树脂(2×2mL)。蒸发合并的滤液和冲洗液至干，并在真空干燥器中干燥o/n，从而得到浅黄色粉末多元醇32(171mg，118％)，不进行进一步纯化而将其用于下一步骤。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(33)
将多元醇32(96mg，0.135mmol)溶解于无水DMF(3.4mL，0.04M)中。加入三氧化硫-吡啶复合物(451mg，2.835mmol，3当量每羟基，刚刚用水、甲苯、乙醇、DCM清洗的，并在P2O5真空干燥器中干燥1小时)。在60℃下搅拌该混合物o/n，并将其冷却至0℃。加入5M NaOH(794μL，3.969mmol，以SO3计1.4当量)和饱和的Na2CO3(2.5M，690mL，1.701mmol，基于SO3为0.6当量)。颜色稍微变深(黄橙色)。将该混合物蒸发至干。将残留物溶解于4mL水(pH＞9)中，用Bio-Gel P-2柱层析进行纯化(用0.1M NH4HCO3 196mL/h洗脱，每次收集6分钟)。用MBT和CE鉴定产物组分。冷冻干燥产生得到浅黄色粉末产物33(33mg，两步的收率为20％).1H NMR(D2O，300MHz)δ5.27(s，1H)，4.98(s，1H)，4.81(s，1H)，4.64-4.48(m，4H)，4.38-4.18(m，4H)，4.08-3.85(m，4H)，3.50(m，1H，OCH)，1.75-0.49(m，46H，胆甾烷基)。
实施例9.2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基三氯乙酸亚胺酸酯(36)
将三糖3430全乙酰化(Ac2O、吡啶、DMAP，室温，4天)并用快速色谱法(硅胶，己烷-乙酸乙酯梯度)进行纯化从而得到油状的全醋酸酯35。在0℃下向乙二胺(1.2mmol，0.08mL)在无水THF(15mL)中的溶液中逐滴地加入冰醋酸(0.65mmol，0.038mL)，结果立即产生沉淀，该沉淀在水后处理之前一直存在。在0℃下加入全醋酸酯35(500mg，0.52mmol)，并在室温下搅拌该混合物2.5小时，在-20℃下储存一整夜。然后TLC(甲苯/乙酸乙酯，1∶2)表明没有了起始物料和产物慢慢的产生出现，该产物主要以端基混合物的形式出现。通过加入醋酸(0.12mL)中和该溶液以使pH达到6。在空气流条件下蒸发掉溶剂，将残留物溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用饱和的NaHCO3-溶液(3×50mL)、水(3×10mL)、盐水(30mL)对其进行冲洗，干燥(Na2SO4)，并真空浓缩从而得到黄色泡沫状不经进一步纯化而使用的半缩醛(500mg)。将该半缩醛(500mg，～0.54mmol)溶解于无水DCM(4mL)中，在0℃下加入K2CO3(0.95g，6.81mmol)和三氯乙腈(0.67mL，6.63mmol)，并在室温下连续地搅拌120分钟。将该混合物直接在硅胶柱(30×2.5cm，甲苯-乙酸乙酯，1∶1→1∶2→乙酸乙酯)上进行纯化，得到蓬松的白色粉末三氯乙酸亚胺酸酯36(300mg，65％)。在-20℃下用P2O5干燥该化合物存放一整夜。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(37)
在干DCM中搅拌亚氨酯(imidate)36(295mg，0.28mmol)、胆甾烷醇(210mg，2当量，0.56mmol)和
Figure GPA00001139318900281
分子筛(100mg)0.5小时。在0℃下逐滴地加入TMS-三氟甲磺酸酯的无水DCM(0.4M，0.21mL，0.084mmol，0.3当量)溶液，并在室温下将其持续地搅拌30分钟。通过在0℃(pH 5)下加入Et3N(0.02mL)来淬灭该反应，用DCM(25mL)进行稀释，超声处理(3分钟)，轻轻倒出。用饱和的NaHCO3-溶液(3×20mL)冲洗该有机溶液，用乙酸乙酯(50mL)再次萃取水相，用盐水冲洗(20mL)，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，从而得到粗制的白色固体糖苷(564mg)。在硅胶柱(20×2cm，甲苯∶乙酸乙酯3∶2→1∶1→1∶2)上纯化该产物。纯化得到混合组分A(56mg，～80％糖苷)和白色固体状含有纯的糖苷37的组分B(170mg，得率58％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.26-5.34(m，3H，2×H4，H3)，5.17-5.24(m，3H，H2I，H3II，H4)，5.28(dd，1H，JHI-H2＝2.0，H2II)，5.05(d，1H，JHI-H2＝2.0，H1)，5.02(d，1H，H1II)，4.93(d，1H，JHI-H2＝2.0，H1I)，4.30(dd，1H，JH6a-H6b＝-12.7，JH6-H5＝3.9，H6a)，3.97-4.22(m，9H，2×H6a，3×H6b，H3I，3×H5，3.95(dd，1H，H2)，3.53(m，1H，胆甾烷基-H3)，2.19，2.15，2.14，2.11，2.10，2.08，2.07，2.03，2.03，2.02，1.99(s，30H，10×Ac)，0.55-1.85(m，33H，12CH2，9CH)，0.89(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.860(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.854(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.80(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.64(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
3β-胆甾烷基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(38)
按照常规操作将全醋酸酯37(165mg，0.127mmol)脱去乙酰基从而得到白色晶状多元醇38(107mg，得率96％)，将其用于下一步骤而不进行进一步的纯化或鉴定。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(39)
将无水多元醇38(50mg，0.058mmol)溶解于无水DMF(2.9mL，0.02M)中，并加入刚刚清洗过和干燥了的SO3.吡啶(1∶1，277mg，3当量每OH基团，1.74mmol)。在60℃下搅拌该混合物16小时，然后冷却至0℃15分钟，并在0℃下通过一次性加入冰冷的NaOH水溶液(5M，2.1当量/SO3，0.731mL，3.65mmol)来对其进行中和(达到pH 12)。在0℃下搅拌该混悬液15分钟，用水(10mL)将其稀释转移到500mL-圆底烧瓶中，并在40℃下真空浓缩。得到一种浅黄色粉末，将该粉末溶解于水中(10mL)得到pH 10的溶液。通过加入NaOH水溶液(5M，5滴)将该溶液调整到pH 12，室温下使用Slide-A-Lyzer
Figure GPA00001139318900291
盒(2000MWCO，4-12mL)用水(4L)交换透析16小时。在0℃下用水(4L)交换继续不断地透析3天，其中在即后的每24小时，向水中加入NH4HCO3的水溶(3M，0.6mL)液以调节pH至～6.5。然后将除去盐分的溶液冷冻干燥从而得到蓬松的白色粉末状全硫酸酯39(91mg，83％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ5.50(m，2H，H1 or H2)，5.23，5(m，2H，H1 or H2)，4.12-4.92(m，17H，H1，1×H2，3×H-3，3×H-4，3×H-5，3H-6，3H-6b)3.80(m，1H，H-3Cho1.)，0.66-2.04(m，33H，12CH2，9CH)，0.95(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.887(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.882(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.85(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.70(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
实施例10.3-叠氮丙基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(41)
将BF3·Et2O(115mg，810μmol)加入到五糖全醋酸酯4028(500mg，324μmol)和3-叠氮基丙烷-1-醇(98mg，972μmol)的无水DCE(8mL)的溶液中。在加入另一部分BF3·Et2O(115mg，810μmol)之前，在60℃下在一个密封的容器中搅拌该溶液2小时，并将该溶液再加热3小时。将溶液冷却至室温，倾倒在碎冰、NaHCO3(饱和水溶液)和盐水的混合物中。用乙酸乙酯萃取该混合物，用1∶1盐水∶NaHCO3(饱和水溶液)进一步冲洗有机层，然后干燥(Na2SO4)，蒸发和与无水甲苯一起共蒸馏。加入无水DCM(5mL)、醋酸酐(66mg，648μmol)、Et3N(89mg，875μmol)和DMAP(结晶)，在-20℃下存放该溶液一整夜。将该溶液直接用于准备好的快速色谱柱(17×2cm硅胶，梯度洗脱60∶40至75∶25乙酸乙酯∶Hx)上，从而得到油状的糖苷41(387mg，75％)。ESMS：1601.81，[M+NH4]+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.30-5.13(m，8H)，5.02-4.88(m，8H)，4.28-3.75(m，20H)，3.49(dt，1H，J＝9.8，6.1，OCH2CH2B)，3.42-3.35(m，2H，CH2N3)，2.16，2.14(9)，2.14(7)，2.11，2.10，2.09(2)，2.08(8)，2.08(7)，2.08，2.07，2.06，2.05，2.04，2.00，1.99，1.95(16s，16×3H，AcO×16)，1.89-1.84(m，2H，CCH2C)。13C NMR(100MHz，CDCl3)δ：170.4，170.3，170.2，170.1，169.9，169.8(2)，169.7(7)，169.6，169.5，169.4，169.3，169.2，99.1(2)，99.1(0)，98.8(4)，98.7(7)，98.1，76.7，75.0，74.9，74.7，71.0，70.8，70.7，70.0，69.5，69.3，69.2，68.5，68.2，67.2，66.7，66.6，66.0，65.4，64.6，62.4，62.3，61.9，61.5，47.9，28.5，20.7(4)，20.7(2)，20.6(9)，20.6，20.4(9)，20.4(6)，20.4.
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(42)
将叠氮化物41(460.5mg，291μmol)溶解于THF(10mL)中。加入聚合物结合的三苯膦(725mg)，并在室温下搅拌该混合物1小时。加入水(200μL)，并在50℃下搅拌该混合物4小时。冷却该混合物，过滤，蒸发溶剂，从而得到一种白色固体(APCIMS：1558.25[M+H]+)。将产物溶解于DCM(10mL)中。加入硬酯酰氯(2当量，580μmol，176mg，196μL)，接着加入三乙胺(2当量，580μmol，80μL)，并在室温下搅拌该混合物6小时。蒸发溶剂，将残留物加到DCM中，然后用NaHCO3(饱和的)进行冲洗，干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂。将该粗制的产物用柱层析进行纯化(SiO2：DCM→2％甲醇/DCM)从而得到澄清的油状酰胺42(232mg，44％，两个步骤)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.10(宽峰m，1H，NH)，5.24-5.09(m，8H)，4.96-4.83(m，8H)，4.22-3.71(m，19H)，3.68(m，1H，CH2O)，3.40(m，1H，CH2O)，3.26(m，2H，CH2NH)，2.12-2.09(m，2H，CH2CO)，2.11(s，3H，OAc)，2.10(s，6H，OAc)，2.06(s，3H，OAc)，2.04(s，3H，OAc)，2.03(s，12H，OAc)，2.02(s，3H，OAc)，2.01(s，3H，OAc)，1.99(s，6H，OAc)，1.95(s，3H，OAc)，1.94(s，3H，OAc)，1.90(s，3H，OAc)，1.74(m，2H，CH2CH2N)，1.53(m，2H，CH2CH2CO)，1.23-1.16(m，28H，CH2)，0.79(t，3H，CH3)。
3-硬酯酰胺丙基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(43)
按照常规操作将酰胺42(231.5mg)脱去乙酰基，从而得到白色固体多元醇43(140mg，96％)，将其直接反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(44)
将多元醇43(140mg，122μmol)溶解于DMF(0.02M，6.1mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，5.83mmol，928mg)，在60℃下搅拌该溶液一整夜。在冰水中冷却该混合物，并在蒸发掉溶剂前同时加入5M NaOH(2.1当量/SO3.吡啶，2.45mL)。将该化合物加入到1％甲醇水中，并在C18SPE柱上将其纯化。然后在冻干之前，用2000MWCO透析盒透析该化合物两整夜，从而得到白色固体产物44(220mg，65％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ5.55(d，1H，H-1)，5.53(d，1H，H-1)，5.50(d，1H，J1，2＝1.8，H-1)，5.49(d，1H，H-1)，5.28(m，1H)，5.12(m，1H)，5.08(m，1H)，4.90-4.12(m，28H)，3.85(ddd，1H，J＝6.2，J＝7.0，J＝10.5，CH2O)，3.68(ddd，1H，J＝6.2，J＝6.2，J＝9.7，CH2O)，3.31(m，2H，CH2N)，2.29(t，2H，J＝7.0，CH2CO)，1.88(t，2H，J＝6.2，CH2CH2N)，1.62(m，2H，CH2CH2CO)，1.31(m，28H，CH2)，0.90(t，3H，J＝7.0，CH3)。
实施例11.3β-(丙炔-2-基氧基)胆甾烷醇
在室温下将3β-胆甾烷醇(1.23g，3.16mmol)完全地溶解于无水甲苯(7mL，0.45M)中。一次性加入粉末状叔丁醇钾(1.06g，9.49mmol，3当量)。室温下搅拌该混合物3小时。加入炔丙基溴溶液(甲苯中的80wt％，0.94g，6.32mmol，2当量)。室温下搅拌该混合物3天。用己烷(30mL)和乙酸乙酯(10mL)稀释该混合物，用水(2×60mL)和盐水(60mL)对其进行冲洗。用乙酸乙酯(20mL)萃取水相一次。干燥(Na2SO4)合并的有机相，过滤，并在硅胶上蒸发滤液，用柱层析进行纯化(硅胶2.5×24cm，己烷250mL，己烷-乙酸乙酯125∶5梯度洗脱)，从而得到黄色固体产物。从乙酸乙酯(3mL)中重结晶，得到灰白色结晶(736mg，55％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ4.18(d，2H，J＝2.2)，3.45(m，1H)，2.38(t，1H，J＝2.2)，1.99-0.57(m，31H)，0.89(d，3H，J＝6.6)，0.86(d，3H，J＝6.6)，0.86(d，3H，J＝6.6)，0.79(s，3H)，0.64(s，3H)。
3-叠氮基丙基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(45)
将全醋酸酯35(1000mg，1.03mmol)和3-叠氮基丙醇(1.2当量，124mg，1.24mmol)溶解于无水DCM(5mL)中，然后在0℃下逐滴地加入BF3-乙醚配合物(5当量，0.546mL，5.17mmol)，在60℃下搅拌该混合物3小时。在0℃下通过加入Et3N(2.2mL，15.5mmol)终止该反应。然后在0℃下通过加入吡啶(1mL)、DMAP(cat.)和Ac2O(0.585mL)将该粗制的反应混合物乙酰化，并在室温下不断地搅拌o/n。在0℃下通过加入干甲醇(5mL)来淬灭该暗红色的溶液，并在室温下搅拌2小时。与甲苯(50mL)共蒸发后，将残留物溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用饱和的NaHCO3-溶液(3×20mL)、水(50mL)对其进行清洗，用乙酸乙酯(3×20mL)再次萃取水相，与其他有机提取物合并，用盐水冲洗(20mL)，干燥(Na2SO4)，真空浓缩，从而得到粗制的胶质状糖苷(～1g)。在硅胶柱上(20×2cm，甲苯-乙酸乙酯，2∶1→1∶1→1∶2)纯化该粗制的产物，得到了想要得到的灰白色白色泡沫状糖苷45(374mg，36％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.19-5.38(m，6H，3×H4，H2II，H3I，H3III)，5.08(dd 1H，JH2-H3＝3.3，H2III)，5.04(d，1H，JHI-H2＝1.7，H1III)，4.94(m，2H，H1I，H-1II)，4.31(dd，1H，JH6a-H6b＝12.5，JH6-H5＝4.2，H6a)，3.93-4.26(m，9H，2×H6a，3×H6b，H2I，H3II，H5I，H5II或H5III)，3.93(ddd，1H，H5II或H5III)，3.82(dt，1H，Jgem＝10.0，J＝6.6，OCH2)，3.53(dt，1H，J＝6.6，OCH2)，3.43(t，2H，J＝6.6，CH2N3)，2.20，2.161，2.157，2.12，2.11，2.10，2.19，2.05，2.04，2.00(s，30H，10×Ac)，1.90(五重峰，2H，J＝6.6，CH2)。
3-{4-(胆甾-3β-基-氧甲基)-[1，2，3]三唑-1-基}丙基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(46)
将3β-(丙炔-2-基氧基)胆甾烷醇(156mg，2当量，0.367mmol)和叠氮化物45(185mg，0.183mmol)溶解于DCM/叔-丁醇(3∶2，w/w，0.4M，0.562mL)的混合物中。向该混合物中加入CuSO4水溶液(0.3M，0.1当量.，0.061mL)和抗坏血酸钠水溶液(1M，0.3当量，0.055mL)，在无光条件下剧烈地搅拌该混合物48小时。TLC分析(甲苯∶乙酸乙酯，1∶1)显示反应终点出现了比起始叠氮化物极性更大的产物。用DCM(50mL)稀释该混合物，用饱和的NaHCO3-溶液(3×30mL)冲洗。用乙酸乙酯(3×20mL)再次萃取水相，合并有机提取物，用盐水(20mL)冲洗，干燥(Na2SO4)，真空浓缩从而得到黄色泡沫状粗制品(475mg)。在硅胶柱(25×2.5cm，甲苯-乙酸乙酯，1∶2→1∶3→1∶4)上纯化该粗制品从而得到白色泡沫状三唑46(214mg，81％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.76(s，1H，＝CH)，5.18-5.36(m，6H，3xH4，H2II，H3I，H3III)，5.06(dd 1H，JH2-H3＝3.2，H2III)，5.02(d，1H，JHI-H2＝1.7，H1III)，4.94(d，2H，JHI-H2＝1.6，H-1II)，4.92(d，1H，JHI-H2＝1.6，H1I)，4.71(s，2H，OCH2)，4.49(t，2H，J＝6.6，CH2N)，4.30(dd，1H，JH6a-H6b＝-11.9，JH6-H5＝4.0，H6a)，3.96-4.26(m，9H，2×H6a，3×H6b，H2I，H3II，H5I，H5II或H5 III )，3.92(ddd，1H，H5 II或H5III)，3.43(m，2H，OCH2，H-3Cho1)，2.31(m，2H，CH2)，2.19，2.145，2.142，2.11，2.09，2.08，2.06，2.04，1.99(s，30H，10×Ac)，1.90(五重峰，2H，J＝6.6，CH2)，0.56-2.04(m，33H，12CH2，9CH)，0.89(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.858(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.855(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.79(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.64(s，3H，胆甾烷基-CH3).
3-{4-(胆甾(cholestan)-3β-基-氧甲基)-[1，2，3]三唑-1-基}丙基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷(47)
按照常规方法将干燥的全醋酸酯46(202mg，0.141mmol)脱去乙酰基，从而得到白色结晶体多元醇47(138mg，97％)，将其用于下一步骤而不进行进一步的纯化或鉴定。
3-{4-(胆甾(cholestan)-3β-基-氧甲基)-[1，2，3]三唑-1-基}丙基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→2)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(48)
将干燥的多元醇47(50mg，0.049mmol)溶解于无水DMF(2.45mL，0.02M)中，并加入刚刚洗过和干燥的SO3.吡啶复合物(234mg，每个OH基团3当量，1.47mmol)，在60℃搅拌该混合物16小时。将该反应混合物冷却至0℃15分钟，然后在0℃在一部分中(达到pH 12)通过加入冰冷的NaOH水溶液(5M，2.1当量/SO3，0.617mL，3.09mmol)将其中和。0℃下搅拌该混悬液15分钟，用水(10mL)将其稀释，并在40℃真空条件下与(3×20mL)水共蒸发。将黄色固体溶解于水中(9mL，→pH10.5)，然后通过加入NaOH水溶液(5M，5滴)将该溶液调到pH 12，并在室温下使用Slide-A-Lyzer
Figure GPA00001139318900351
透析盒(2000MWCO，4-12mL)用水(4L)交换透析16小时。0℃下继续用水(4L)交换透析2天，其中每隔24小时后加入NH4HCO3水溶液(3M，0.6mL)以交换水(4L)从而调节pH到6-6.5。然后冷冻干燥已脱盐的溶液从而得到蓬松的白色粉末产物48(94mg，94％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ8.08(s，1H，＝CH)，5.50(m，2H，H2II，H2III)，5.22，5(m，1H，H1II or H1III)，5.07(m，1H，H1I)，4.33-4.93(m，19H，H1IIor H1III，3×H3，3×H4，3×H4，CH2N，4H6，H2，OCH2)，4.15(m，4H，2×H6，2×H-5)，4.02(m，1H，H-5)，3.83(m，1H，OCH2)，3.71(m，1H，OCH2)，3.51(m，1H，H-3Cho1)，2.28(m，2H，CH2)，0.62-2.06(m，33H，12CH2，9CH)，0.94(d，3H，J＝5.8，胆甾烷基-CH3)，0.86(d，9H，J＝6.7，胆甾烷基-CH3)，0.70(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
实施例12.苄基3-O-烯丙基-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(49)
将3-O-烯丙基-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基三氯乙酸亚胺酸酯34(0.504g，0.744mmol，1.05当量)和苄基2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(0.413g，0.709mmol)溶解于无水DCM(6.4mL，0.11M)中。加入粉末状MS
Figure GPA00001139318900361
(70mg刚活化的)。在0℃下搅拌该混合物30分钟。逐滴地加入TMSOTf(26μL，0.142mmol，0.2当量)的DCM(0.6mL)溶液(最终浓度：1M)。在0℃下搅拌该混合物同时用TLC(己烷-乙酸乙酯＝65∶35)监测该反应。60分钟后，转化完全，并加入Et3N(0.15mL)。用吡啶(0.115mL，1.418mmol，2当量)和苯甲酰氯(0.124mL，1.064mmol，1.5当量)处理该粗制混合物。室温下搅拌该混合物o/n并将其过滤。用DCM(6×1mL)清洗该固体。将合并的滤液和冲洗液在硅胶上蒸发，并用柱层析进行纯化(硅胶2.5×24cm，己烷-乙酸乙酯200∶20，210∶40，200∶50，180∶60，170∶85梯度洗脱)从而得到纯的淡黄色胶质状产物49(0.738g，95％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.20-8.06(m，8H，Ph)，7.90-7.80(m，4H，Ph)，7.67-7.23(m，23H，Ph)，5.98(dd or t，1H，JH3(I)-H4(I)＝9.8，JH4(I)-H5(I)＝9.8，H4I)，5.75(dd or t，1H，JH3(II)-H4(II)＝9.8，JH4(II)-H5(II)＝9.8，H4II)，5.41(m，1H，烯丙基-2′)，5.23(d，1H，J＝2.0)，5.18-5.15(m，2H)，4.87-4.71(m，3H)，4.64-4.56(m，4H)，4.48(dd或t，1H，J＝12.7，J＝4.9)，4.34-4.27(M，2H)，4.22(dd，1H，J＝12.7，J＝3.9)，3.87(dd，1H，J＝9.8，J＝2.9)，3.74(dd，1H，J＝12.7，J＝5.9)，3.59(dd，1H，J＝12.7，J＝5.9)。
苄基2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(50)
用固体二氯化钯(25mg)处理烯丙基醚49(688mg，0.627mmol)的甲醇溶液(6mL)和1，2-二氯乙烷(6mL)(0.05M)。70℃下(外部油浴)搅拌该混合物2小时。TLC指示转化完全。在二氧化硅上蒸发该混合物并用柱层析(二氧化硅2.7×17cm，己烷-乙酸乙酯200∶20，200∶40，200∶50，210∶70，200∶100梯度洗脱)对其进行纯化，从而得到无色胶质状醇50(0.539mg，81％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.18-8.03(m，8H，Ph)，7.85-7.81(m，4H，Ph)，7.68-7.25(m，23H，Ph)，5.97(dd or t，1H，JH3(I)-H4(I)＝9.8，JH4(I)-H5(I)＝9.8，H4I)，5.68(dd，1H，JH1(I)-H2(I)＝2.0，JH2(I)-H3(I)＝2.9，H2I)，5.60(dd ort，1H，JH3(II)-H4(II)＝9.8，JH4(II)-H5(II)＝9.8，H4II)，5.28(br s，1H，H1II)，5.15(d，1H，JH1(II)-H2(II)＝2.0，H1I)，5.05(dd，1H，JH1(II)-H2(II)＝2.0，JH2(II)-H3(II)＝2.9，H2II)，4.77(d，1H，Jgem＝11.7，CH2)，4.65-4.56(m，4H，CH2，H6Ieq，H3I and H6II)，4.44(dd，1H，Jgem＝12.7，JH5(I)-H6(I)ax＝4.9，H6Iax)，4.34(m，1H，H5II)，4.32(dd，1H，Jgem＝10.7，JH5(II)-H6(II)＝2.9，H6II)，4.28(ddd，1H，JH5(I)-H6(I)ax＝4.9，JH5(I)-H6(I)eq＝2.9，H5I)，4.17(dd，1H，H3II)。
苄基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(51)
0℃下将醇50(424mg，0.401mmol)和2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基三氯乙酸亚胺酸酯(357mg，0.481mmol，1.2当量)的无水DCM(7.5mL)溶液与粉末状分子筛
Figure GPA00001139318900371
(50mg)一起搅拌1小时。用注射器逐滴地加入TMSOTf(15μL，0.0802mmol，0.2当量)的DCM(0.5mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物2小时，TLC指示转化完全。加入Et3N(100μL)。加入吡啶(65μL，0.802mmol)和苯甲酰氯(47μL，0.401mmol)。室温下搅拌该混合物o/n并在硅胶上蒸发。通过柱层析(二氧化硅2.5×17cm，己烷-乙酸乙酯210∶30，200∶50，180∶60，160∶80以及150∶100梯度洗脱)进行纯化，得到无色胶质状三糖51(392mg，60％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.19-7.89(m，16H，Ph)，7.68-7.63(m，4H，Ph)，7.61-7.15(m，35H，Ph)，6.00(dd or t，1H，JH3-H4＝10.7，JH4-H5＝9.8，H4)，5.98(dd or t，1H，JH3-H4＝9.8，J＝9.8，H4)，5.92(dd or t，1H，J＝10.7，J＝9.8，H4)，5.72(dd，1H，JH1-H2＝2.0，JH2-H3＝3.9，H2)，5.56(dd，1H，JH2-H3＝2.9，H3)，5.33(d，1H，J＝2.0，H1)，5.26(dd，1H，J＝2.0，H2)，5.19(d，1H，J＝2.0，J＝3.9，H2)，5.16(d，1H，J＝2.0，H1)，4.90(d，1H，H1)，4.78 and 4.62(AB quartet，2H，Jgem＝11.7，CH2)，4.65-4.56(m，3H)，4.45(dd，1H，Jgem＝12.7，JH5-H6＝3.9，H6)，4.35(dd，1H，H 3)，4.34-4.28(m，2H)，4.24(dd，1H，J＝12.7，JH5-H6＝2.9，H6)，4.10(dt or dm，1H，H5)，4.01(dd，1H，J＝12.7，H6)，3.95(dd，1H，JH5-H6＝2.0，H6)。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-D-甘露吡喃糖(52)
将苄基糖苷51(385mg，0.235mmol)溶解于甲醇(5mL)和氯仿(5mL)中。加入钯炭(5％，538mg)。在氢气气氛下以100psi搅拌该混合物3天。TLC指示转化完全。用Celite短柱过滤该混合物并用乙酸乙酯对其进行冲洗(5×1mL)。蒸发合并的滤液和冲洗液至干，与DCM(3mL)一起共蒸发，从而得到淡黄色泡沫状半缩醛52(338mg，93％)，将其用于下一步骤而不进行进一步的纯化或鉴定。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-D-甘露吡喃糖基三氯乙酸亚胺酸酯(53)
将半缩醛52(330mg，0.214mmol)溶解于无水DCM(1.1mL，0.2M)中。向该溶液中加入三氯乙腈(43μL，0.427mmol，2当量)。在0℃下搅拌该混合物同时加入DBU(1.6μL，0.05当量，0.0107mmol)的无水DCM(0.15mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物4小时，TLC(己烷-乙酸乙酯＝65∶35)指示转化完全。在硅胶上蒸发该粗制品，并通过硅胶柱层析(2×14cm，己烷-乙酸乙酯200∶20，150∶30，120∶30，150∶50和己烷-乙酸乙酯-Et3N 140∶70∶0.3梯度洗脱)对其进行纯化，从而得到白色泡沫状三氯乙酸亚胺酸酯53(261mg，72％)，将其直接用于下一步骤而不进行进一步鉴定。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(54)
向三氯乙酸亚胺酸酯53(128mg，0.0757mmol)和3β-胆甾烷醇(59mg，0.151mmol，2当量)的无水DCM(2mL)溶液中加入刚活化的、粉末状分子筛
Figure GPA00001139318900391
(50mg)。在0℃下搅拌该混合物0.5小时，并在0℃下逐滴地加入TMSOTf(2.7μL，0.0151mmol，0.2当量)的无水DCM(0.15mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物2小时，TLC指示反应完全。加入Et3N(150μL)。在硅胶上蒸发该混合物，并通过硅胶柱层析(2×14cm，己烷-乙酸乙酯180∶20，150∶30，120∶30，120∶40和120∶60梯度洗脱)进行纯化，从而得到无色胶质状糖苷54(74mg，51％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.21-7.15(m，50H，Bz)，6.00(dd或t，1H，JH3(II)-H4(II)＝10.0，JH4(II)-H5(II)＝10.0，H4II)，5.93(dd或t，1H，JH3-H4＝10.0，JH4-H5＝10.0，H4I和H4III)，5.61(dd，1H，JH2(I)-H3(I)＝3.0，JH1(II)-H2(II)＝1.5，H2I)，5.57(dd，1H，JH3(III)-H4(III)＝10.0，JH2(III)-H3(III)＝3.0，H3III)，5.36(d，1H，JH1(II)-H2(II)＝1.5，H1II)，5.26(dd，1H，JH2(II)-H3(II)＝3.0，H2II)，5.21(m，2H，H1I和H2III)，4.91(s，1H，H1III)，4.68-3.90(m，11H)，3.62(m，1H，OCH-cho1)，1.99-0.50(m，31H，胆甾烷基)，0.90(d，3H，J＝6.9，胆甾烷基-CH3)，0.87(d，3H，J＝6.9，胆甾烷基-CH3)，0.86(d，3H，J＝6.9，胆甾烷基-CH3)，0.80(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.65(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
3β-胆甾烷基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖苷(55)
按照常规方法将糖苷54(70mg，0.0365mmol)脱去乙酰基，从而得到浅黄色粉末状的多元醇55，将其直接用于下一步中。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(56)
将上述粉末(55)溶解于无水DMF(1.8mL，0.02M)中。加入SO3.吡啶复合物(174mg，1.096mmol，3当量每羟基，刚用水、甲苯、乙醇、DCM洗过的，在P2O5真空干燥器中干燥1小时)。在60℃搅拌该混合物o/n(18小时)，将其冷却至0℃。加入5M NaOH直到pH＞10为止。加入乙醇(6mL)，在0℃下搅拌该混合物20分钟。通过离心分离沉淀物，在旋转蒸发器上将其蒸干。将残留物再溶解于水(1.5mL)中。把该溶液装入Slide-A-Lyzer透析盒(2000MWCO，0.5-3.0mL容量)中。用水(2×0.5mL)清洗该烧瓶并将清洗液也加入到透析盒中。透析在10L纯水中，在室温下进行4小时。更换水(10L)并在0℃o/n继续进行透析。更换水(4L)并继续再进行一天透析。移出浅黄色溶液并冻干，从而得到浅橙色的粉末全硫酸酯56(46.8mg)。1HNMR(D2O，300MHz)δ5.28(s，1H)，5.21(s，1H)，5.16(s，1H)，5.05(br s，1H)，4.76(br s，1H)，4.67-3.88(m，16H)，3.53(m，1H，OCH)，1.82-0.44(m，31H，胆甾烷基)，0.74(d，3H，胆甾烷基-CH3)，0.67(d，6H，胆甾烷基-CH3)，0.65(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.49(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
实施例13.3-叠氮基丙基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(57)
向三氯乙酸亚胺酸酯53(128mg，0.0757mmol)和3-叠氮基丙醇(15mg，0.151mmol，2当量)的无水DCM(2mL)溶液中加入刚活化的，粉末状分子筛
Figure GPA00001139318900402
(50mg)。在0℃下搅拌该混合物0.5小时，在0℃下逐滴地加入TMSOTf(2.7μL，0.0151mmol，0.2当量)的无水DCM(0.15mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物2小时，TLC指示反应完全。加入Et3N(150μL)。在硅胶上蒸发该混合物，并通过硅胶柱层析(2×14cm，己烷-乙酸乙酯150∶20，150∶30，120∶30，120∶40，120∶60和120∶80梯度洗脱)对其进行纯化，从而得到无色胶质状糖苷57(86mg，70％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.22-7.16(m，50H，Bz)，6.02(dd或t，1H，JH3(II)-H4(II)＝10.0，JH4(II)-H5(II)＝9.5，H4II)，6.00(dd或t，1H，JH3(I)-H4(I)＝10.0，JH4(I)-H5(I)＝9.5，H4I)，5.96(dd或t，1H，JH3(III)-H4(III)＝10.0，JH4(III)-H5(III)＝9.5，H4III)，5.69(dd，1H，JH2(I)-H3(I)＝3.2，JH1(II)-H2(II)＝1.6，H2I)，5.59(dd，1H，JH3(III)-H4(III)＝10.3，JH2(III)-H3(III)＝3.2，H3III)，5.37(d，1H，JH1(II)-H2(II)＝2.4，H1II)，5.29(dd，1H，JH1(II)-H2(II)＝1.6，JH2(II)-H3(II)＝2.4，H2II)，5.23(dd，1H，JH1(III)-H2(III)＝1.6，H2III)，5.09(d，1H，JH1(I)-H2(I)＝1.6，H1I)，4.94(d，1H，JH1(III)-H2(III)＝1.6，H1III)，4.71(dd，1H，Jgem＝11.9，J＝2.4，H6)，4.60(dd，1H，J＝11.9，J＝2.4，H6)，4.58(dd，1H，H3I)，4.50(dd，1H，J＝4.8，H6)，4.38(dd，1H，JH2(II)-H3(II)＝3.2，H3II)，4.34-4.22(m，3H)，4.14-3.94(m，3H)，3.91(dt，1H，Jgem＝9.5，J＝6.4，J＝6.4，OCH2)，3.59(dt，1H，J＝6.4，J＝6.4，OCH2)，3.44(t，2H，J＝6.4，NCH2)，1.91(五重峰，2H，J＝6.4，CH2)。
3-{4-(胆甾-3β-基-氧甲基)-[1，2，3]三唑-1-基}丙基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(58)
向DCM(64μL)和叔-丁醇(60μL)(0.4M)中的57(81mg，0.0497mol)、3β-(丙炔-2-基氧基)胆甾烷醇(43mg，0.0994mmol，2当量)的混合物中，加入CuSO4溶液(在水中0.3M，33μL，0.00994mmol，0.2当量)和抗坏血酸钠溶液(水中1M，20μL，0.0199mmol，0.4当量)。室温下剧烈地搅拌该混合物3天。在硅胶上蒸发该混合物，并通过硅胶柱层析(2×14cm，己烷-乙酸乙酯170∶20，150∶30，120∶30，120∶40，120∶60，120∶80和100∶100梯度洗脱)对其进行纯化，从而得到无色胶质状三唑58(74mg，72％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.19-7.88(m，16H，Bz)，7.69-7.15(m，35H，Bz and三唑-CH)，5.99(dd或t，1H，JH3-H4＝9.9，JH4-H5＝9.9，H4)，5.98(dd或t，1H，J＝9.9，J＝9.9，H4)，5.94(dd或t，1H，H4)，5.66(dd，1H，JH2(I)-H3(I)＝3.1，JH1(I)-H2(I)＝1.6，H2I)，5.57(dd，1H，JH3(III)-H4(III)＝10.0，JH2(III)-H3(III)＝3.1，H3III)，5.36(d，1H，JH1(II)-H2(II)＝1.6，H1II)，5.28(dd，1H，JH2(II)-H3(II)＝3.1，H2II)，5.21(dd，1H，JH1(III)-H2(III)＝1.6，H2III)，5.04(d，1H，H1I)，4.94(d，1H，H1III)，4.70(s，2H，OCH2)，4.70-3.92(m，11H)，3.84(dt或ddd，1H，Jgem＝9.9，J＝6.3，J＝6.3，OCH2)，3.50(dt或ddd，1H，J＝5.5，J＝5.5，OCH2)，3.37(m，1H，OCH-cho1)，2.26(m，2H，CH2)，1.99-0.53(m，31H，胆甾烷基)，0.90(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.87(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.86(d，3H，J＝6.8，胆甾烷基-CH3)，0.76(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.64(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
3-{4-(胆甾-3β-基-氧甲基)-[1，2，3]三唑-1-基}丙基α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-α-D-甘露吡喃糖苷(59)
将全苯甲酸酯(perbenzoate)58(70mg，0.0341mmol)溶解于无水THF(2mL)和甲醇(2mL)中。用11M NaOMe的甲醇(0.2mL，2.2mmol)溶液对该混合物进行处理。室温下搅拌2天后，通过加入AG50WX8树脂(H+型)来中和该白色悬浮液。通过过滤将澄清的溶液从树脂中分离出来。用甲醇(3×2mL)清洗该树脂。蒸发合并的滤液和冲洗液至干，并在P2O5真空干燥器中进行干燥o/n，从而得到多元醇59，将其直接用于下一步骤。
3-{4-(胆甾-3β-基-氧甲基)-[1，2，3]三唑-1-基}丙基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-2，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖基-(1→3)-3，4，6-三-O-磺酸钠-α-D-甘露吡喃糖苷(60)
将多元醇59溶解于无水DMF(1.7mL，0.02M)中。加入SO3.吡啶复合物(163mg，1.023mmol，3当量每羟基，刚刚用水、甲苯、乙醇、DCM清洗过的，并在P2O5的真空干燥器中干燥了1小时)。60℃o/n下搅拌该混合物(19h)，将其冷却到0℃。加入5M NaOH直到pH＞10为止。加入乙醇(6mL)，在0℃下搅拌该混合物20分钟。用离心法分离该沉淀物，并用乙醇(1mL)对其进行清洗，将其再次溶解在水中(1.5mL)。将该橙黄色的溶液装载到Waters
Figure GPA00001139318900431
C18 SPE(200mg，分别用甲醇、甲醇-水50∶50，10∶90，5∶95和1∶99，3mL重力洗脱对其进行预处理)上，并用甲醇-水(1∶99)洗脱。将产物部分装入到Slide-A-Lyzer
Figure GPA00001139318900432
透析盒(2000MWCO，0.5-3.0mL容量)中。透析在室温下，在10L纯水中进行1天。更换水(10L)并在0℃下另外继续透析一天。分离浅黄色溶液并冻干，从而得到微黄色粉末全硫酸酯60(43mg，62％)。1H NMR(D2O，300MHz)δ7.92(s，1H，三唑)，5.27(d，1H，J＝1.8)，5.20(d，1H，J＝1.4)，5.04(m，1H)，4.89(br s，1H)，4.72(m，1H)，4.65-3.28(m，23H)，2.07(m，2H，CH2)，1.83-0.45(m，31H，胆甾烷基)，0.73(d，3H，J＝6.4，CH3)，0.66(d，6H，J＝6.4，2xCH3)，0.63(s，3H，CH3)，0.49(s，3H，CH3)。
实施例14.2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖(61)
将干燥的麦芽四糖(502mg，0.753mmol)和DMAP(cat.)溶解于无水吡啶(10mL)中，然后在0℃下逐滴地加入Ac2O(2.8g)的吡啶(5mL)溶液，在0℃下搅拌4小时，在-20℃下放置48小时。该反应不完全，因此在0℃下加入Ac2O(1g，mmol)，在室温下16小时后，在0℃下通过加入无水甲醇(10mL)淬灭该反应，并在室温下对其进行持续的搅拌2小时。与甲苯(3×30mL)一起共蒸发该溶液，从而得到白色固体全醋酸酯6135(920mg，97％)。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酸亚胺酸酯(62)
在0℃下向乙二胺(1.66mmol，0.11mL)的无水THF(15mL)溶液中，逐滴地加入冰醋酸(0.90mmol，0.053mL)立即产生沉淀物，该沉淀物在含水后处理之前一直存在。在0℃下加入全醋酸酯61(900mg，0.717mmol)，并在室温下搅拌该混合物2小时。然后TLC(甲苯/乙酸乙酯，1∶2)显示起始物料消失，和位移较小的产物出现，位移较小的产物似乎大多数为端基混合物。逐滴地滴加醋酸(0.15mL)来中和该溶液使其达到pH 6。用空气流吹走溶剂，将残留物溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用饱和的NaHCO3-溶液(3×50mL)、水(3×10mL)、盐水(30mL)对其进行冲洗，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，从而得到黄色泡沫状半缩醛(830mg)。将干燥的半缩醛(830mg，0.684mmol)溶解于无水DCM(5mL)中，在0℃下加入K2CO3(1.20g，8.60mmol)和三氯乙腈(0.849mL，8.40mmol)并在室温下连续搅拌2小时。在硅胶柱(20×1.5cm，甲苯-乙酸乙酯，1∶2→乙酸乙酯，含有0.2％(v/v)Et3N)上纯化该混合物，得到想得到的蓬松白色粉末状的三氯乙酸亚胺酸酯6235(795mg，86％)。用P2O5干燥该混合物一整夜并将其储存在-20C条件下。
胆甾烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(63)
在无水DCM(1.5mL)中搅拌三氯乙酸亚胺酸酯62(300mg，0.221mmol)、胆甾烷醇(2当量，172mg，0.442mmol)和分子筛(100mg)0.5小时。在0℃下逐滴地滴加TMS-三氟乙酸酯的无水DCM(0.5当量.，0.4M，0.275mL，0.11mmol)溶液。室温下30分钟后，加入另外一部分无水DCM中的TMS-三氟乙酸酯(0.36当量.，0.4M，0.2mL，0.08mmol)，在室温下连续搅拌30分钟。在0℃下加入Et3N(0.025mL)用10分钟来淬灭该反应，使其通过Celite短柱(0.5cm)来进行过滤，用DCM(5×25mL)和乙酸乙酯(3×25mL)清洗。两个有机相都分别用饱和的NaHCO3-溶液(3×25mL)和盐水(25mL)冲洗。合并水提取物并用乙酸乙酯(3×30mL)再次萃取，用盐水冲洗(30mL)，将其与其他有机提取物合并，干燥(Na2SO4)，真空浓缩从而得到黄色泡沫状粗制品(480mg)。在硅胶柱(30×5cm，甲苯∶乙酸乙酯3∶2→1∶1→1∶2→乙酸乙酯，含有0.2％Et3N(v/v))上对该产物进行纯化。该纯化结果在部分A中得到了所想要得到的白色泡沫状β-连接的糖苷63(81mg，23％)，在部分B含有77％部分脱去乙酰基的α-连接的糖苷和23％部分脱去乙酰基的β-连接的糖苷(118mg)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.24-5.45(m，7H，3×H1，4×H3)，5.08(t，3H，JH3-H4＝JH4-H5 9.80，H4IIII，)4.86(dd，1H，JHI-H2＝4.1，JH2-H3＝10.4，H2IIII)，4.70-4.80(m，3H，3×H2)，4.63(d，1H，JHI-H2＝7.7，H1I)，4.33-4.54(m，4H，4×H6)，3.86-4.31(m，10H，3×H4，3×H5，4×H6)，3.70(ddd，1H，H5I)，3.56(m，1H，胆甾醇基-H3)，2.20，2.19，2.16，2.11，2.07，2.04，2.03，2.02，2.015，2.010，2.00，1.99(s，39H，13×Ac)，0.55-2.00(m，33H，12CH2，9CH)，0.90(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.871(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.867(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.78(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.65(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
3β-胆甾烷基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(64)
按照常规操作将全醋酸酯63(75mg，0.047mmol)脱去乙酰基，从而得到白色固体状多元醇64(48mg，98％)，将其用于下一步骤而不进行进一步的纯化或鉴定。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(65)
将多元醇64(48mg，0.046mmol)溶解于无水DMF(2.3mL，0.02M)中，加入刚刚清洗和干燥的SO3.吡啶复合物(285mg，3当量每OH-基团，1.79mmol)，在60℃搅拌该混合物16小时。将反应混合物冷却至0℃10分钟，然后在0℃下向一部分中(达到pH 12)加入冰冷的NaOH水溶液(5M，2.1当量/SO3，0.752mL，3.76mmol)将其中和。在0℃搅拌该混悬液15分钟，用水(10mL)稀释，在40℃下真空浓缩。得到一种浅黄色粉末，将该粉末溶解于水(10mL)中得到pH 11.5的溶液。通过加入NaOH水溶液(5M，5滴)将该溶液调整到pH 12.5，使用Slide-A-Lyzer盒(2000MWCO，4-12mL)在室温下用水(4L)交换透析16小时。在0℃下继续用水(4L)交换透析3天，其中每隔24小时更换水，并向水中加入NH4HCO3水溶液(3M，0.6mL)以调整pH到～6.0-6.5。然后冷冻干燥脱去盐的溶液，从而得到蓬松的白色粉末状全硫酸酯65(97mg，89％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ5.72(d，1H，JHI-H2＝3.3，1H1)，5.69(d，1H，JHI-H2＝3.6，H1)，5.59(d，1H，JHI-H2＝3.6，H1)，5.10(d，1H，JHI-H2＝4.8，H1I)，4.19-5.02(m，23H，4×H2，4×H 3，4×H-4，3×H5，8×H6)，4.14(m，1H，H5I)，3.85(m，1H，H-3Cho1.)，0.63-2.06(m，33H，12CH2，9CH)，0.95(d，3H，J＝6.5，胆甾烷基-CH3)，0.885(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.882(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.85(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.70(s，3H，胆甾烷基-CH3)。
实施例15.2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(66)
将G4糖浆(1.8g，冻无水，含有～72％麦芽四糖(w/w)，～1.94mmol)，和DMAP(75mg)溶解于无水吡啶(36mL)中，在0℃下逐滴地滴加苯甲酰氯(94.7mmol，11mL)的吡啶(8mL)溶液，并在室温下连续搅拌16小时。在0℃下加入甲醇(50mL)和连续搅拌2小时来淬灭该混合物。该混合物与甲苯(3×50mL)一起共蒸发从而得到一种黄色糖浆。将该糖浆悬浮于乙酸乙酯(150mL)中，用饱和的碳酸氢钠溶液(5×50mL)、盐酸水(5％，5×50mL)、和水(5×50mL)对其进行冲洗。用乙酸乙酯(2×50mL)再次萃取水相，将其与主要的有机提取物合并，用盐水冲洗(50mL)，干燥(Na2SO4)，过滤和真空浓缩。为了除去大部分芳香族杂质，用沸腾的正己烷(5×50mL)冲洗该糖浆，超声处理，并在高真空条件下干燥o/n，从而得到淡米黄色泡沫状的全苯甲酰化的麦芽低聚糖混合物(6.0g)。在50℃下将残留物溶解于最小容量的甲苯/乙酸乙酯(15∶1，25mL)的混合物中，将其加到硅胶柱(21×5.5cm，用甲苯预先处理)上，用甲苯/乙酸乙酯15∶1，～1柱体积)至10∶1(1.5柱体积)至5∶1(1.5柱体积)梯度洗脱。在TLC上通过紫外来检查级分，合并化学着色和纯的麦芽四糖全苯甲酸酯的级分，真空浓缩，在高真空下干燥，从而得到白色泡沫状的纯的产物66(3.04g，76％，以干糖浆中72％的麦芽四糖为基础)。1H-NMR显示存在端基混合物(α∶β＝1∶1)和所有OH-基团全苯甲酰化(纯度＞95％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：β-端基：8.26-7.09(m，65H，13×Bz)，6.33(d，1H，J1(I)-2(I)＝7.5，H1I)，6.19(dd or t，1H，J2(IV)-3(IV)＝10.2，J3(IV)-4(IV)＝10.2，H3IV)，6.07(dd，1H，J2(II)-3(II)＝10.2，J3(II)-4(II)＝8.9，H3II)，5.96(dd，1H，J2(III)-3(III)＝10.2，J3(III)-4(III)＝8.2，H3III)，5.83(d，1H，J1(IV)-2(IV)＝4.1，H1IV)，5.82(dd or t，1H，J2(I)-3(I)＝6.8，J3(I)-4(I)＝8.2，H3I)，5.76(dd or t，1H，J4(IV)-5(IV)＝9.6，H4IV)，5.71(d，1H，J1(II)-2(II)＝4.1，H1II)，5.69(d，1H，J1(III)-2(III)＝4.1，H1III)，5.65(dd，1H，H2I)，5.34(dd，1H，H2IV)，5.20(dd，1H，H2II)，5.14(dd，1H，H2III)，5.03-4.22(m，15H，3×H4(分别在4.70，4.52和4.40ppm)，和4×H5和8×H6).注：糖环II和III的归属是不明确的。α-端基异构体：6.84(d，1H，J1(I)-2(I)＝3.6，H1I)，5.46(dd，1H，J1(I)-2(I)＝10.2，J2(I)-3(I)＝3.6，H2I)
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖叠氮化物(67)
将全苯甲酸酯66(500mg，0.235mmol)溶解于无水DCM(2mL)中，然后在0℃下加入30％HBr的醋酸溶液(0.5mL)，并在室温下搅拌2小时。将所述溶液倒入冰水-DCM(100mL)中来淬灭该反应，用冰水(3×50mL)、饱和的NaHCO3-溶液(3×30mL)、盐水(25mL)冲洗有机相，干燥(Na2SO4)，并在室温下真空浓缩，从而得到粗制的溴化物。将该粗制的溴化物溶解于氯仿(2mL)中，然后加入NaN3(130mg，2mmol)、溴化四丁基铵(129mg，0.4mmol)、和最后加入饱和的NaHCO3-溶液(3.5mL)，并在室温下剧烈地搅拌24小时。用空气流吹去溶剂。然后将残留物溶解于乙酸乙酯(10mL)中，用水(3×50mL)、饱和的NaHCO3-溶液(4×25mL)对其进行冲洗。用乙酸乙酯(2×50mL)再次萃取水相，合并有机提取物，用盐水冲洗(2×25mL)，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。得到黄色泡沫状的糖基叠氮化物67(466mg，97％)，不进行进一步纯化而将其用于下一步骤。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.03-8.24(m，65H，13×Bz)，6.10(dd，1H，JH2-H3＝10.4，JH3-H4 9.9，H3IIII，)5.99(dd，1H，JH2-H3＝10.1，JH3-H4 8.7，H3III)，5.84(dd，1H，JH2-H3＝9.9，JH2-H3＝8.2，H3II)，5.75(d，1H，JHI-H2＝3.9，H1IIII)，5.67(m，2H，H3，H4IIII)，5.63(d，1H，JHI-H2＝4.1，H1III)，5.58(d，1H，JHI-H2＝3.9，H1II)，5.26(dd，1H，JHI-H2＝4.1，JH2-H3＝10.4，H2IIII)，5.20(dd，1H，JHI-H2＝8.4，JH2-H3＝9.2，H2)，5.10(dd，1H，，JH2-H3＝10.1，H2IIII)，5.04(dd，1H，H2II)，4.98(dd，1H，JH6b-H5＝2.1，JH6bH6a＝-12.0，H6b)，4.88(d，1H，JHI-H2＝8.4，H1)，4.82(dd，1H，JH6b-H5＝1.7，JH6bH6a＝-12.0，H6b)，4.67-4.76(m，2H，H-6a，H-6b)，4.53-4.63(m，2H，H-6a，H-6b)，4.30-4.47(m，7H，3×H4，2×H6，2×H5)，4.10-4.21(m，2H，2×H5).
4-(胆甾-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(68)
将3β-(丙炔-2-基氧基)胆甾烷醇(84mg，2当量，0.196mmol)和叠氮化物67(200mg，0.098mmol)溶解于DCM/t-BuOH(3∶2，w/w，0.21M，0.200mL)的混合物中。加入CuSO4水溶液(0.3M，0.1当量.，0.033mL)和抗坏血酸钠水溶液(1M，0.3当量.，0.029mL)，避光下剧烈地搅拌该混合物48小时。TLC分析(甲苯∶乙酸乙酯，1∶1)指示反应终点，产生极性大于起始的叠氮化物的产物。用DCM(100mL)稀释所述混合物，用饱和的NaHCO3-溶液(3×50mL)对其进行清洗。用DCM(3×20mL)再次萃取水相，合并有机提取物，用盐水冲洗(50mL)，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，从而得到黄色泡沫状粗制品(279mg)。在硅胶柱(30×5cm，甲苯-乙酸乙酯，7∶1→5∶1→3∶1)上纯化该粗制品，从而得到微黄色泡沫状三唑68(153mg，63％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.05-8.24(m，65H，13×Bz)，6.14(d，1H，JH1-H2＝8.9，H1I)，6.11(dd，1H，JH2-H3＝10.6，JH3-H4 9.8，H3IIII)，6.00(dd，1H，JH2-H3＝10.1，JH3-H4＝8.6，H3III)，5.86(m，2H，H3I，H1III)，5.76(d，1H，JHI-H2＝3.8，H1IIII)，5.64-5.71(m，3H，H1III，H2I，H4IIII)，5.63(d，1H，JHI-H2＝3.8，H1II)，5.26(dd，1H，H2IIII)，5.12(dd，1H，JHI-H2＝3.8，H2III)，5.08(dd，1H，，JH2-H3＝9.8，H2II)，4.98(dd，1H，JH6b-H5＝1.7，JH6bH6a＝-12.5，H6b)，4.87(dd，1H，H6b)，4.69-4.77(m，2H，H6a，H6b)，4.53-4.66(m，4H，2×H6，OCH2，H4I)，4.29-4.50(m，7H，2×H4，2H6，3×H-5)，4.18(m，1H，H5)，4.10-4.21(m，2H，2×H5)，3.26(m，1H，H-3Cho1)，0.52-2.00(m，33H，12CH2，9CH)，0.90(d，3H，J＝6.5，胆甾烷基-CH3)，0.869(d，3H，J＝6.7，胆甾烷基-CH3)，0.864(d，3H，J＝6.6，胆甾烷基-CH3)，0.77(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.65(s，3H，胆甾烷基-CH3).
4-(胆甾-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(69)
将全苯甲酸酯68(95mg，0.038mmol)溶解于甲醇/THF(4∶1(w/w)，7.5mL)混合物中，然后在0℃下加入NaOMe的甲醇(11M，0.040mL)溶液并同时连续地在室温下进行搅拌。16小时后仍然存在部分苯甲酰化的化合物(TLC：甲醇∶乙酸乙酯，3∶1)，所以再加入NaOMe的甲醇溶液(11M，0.040mL)并同时在连续地搅拌3小时。加入强酸性阳离子交换树脂(BioRad AG-X8，H+)来中和该溶液以调整pH到7，然后过滤溶液，用甲醇(5×20mL)清洗，真空浓缩。在硅胶柱(15×1cm，乙酸乙酯，→甲醇-乙酸乙酯，3∶1→甲醇，含0.2％Et3N)上纯化残留物，从而得到白色固体状多元醇69(47mg，100％)。
4-(胆甾-3-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(70)
将多元醇69(45mg，0.040mmol)溶解于无水DMF(2mL，0.02M)中，加入刚刚清洗和干燥的SO3.吡啶复合物(248mg，每OH-基团3当量，1.56mmol)，并在60℃下搅拌该混合物16小时。将该反应混合物冷却至0℃10分钟，然后在0℃下在一部分中通过加入冰冷的NaOH水溶液(5M，2.1当量/SO3，0.656mL，3.28mmol)将其中和(达到pH12)。在0℃下搅拌该混悬液15分钟，用水(20mL)稀释，在40℃真空浓缩。将该溶解于水(11mL)中得到pH 10.5的溶液。通过加入NaOH水溶液(5M，5滴)将该溶液调整到pH 12，使用Slide-A-Lyzer
Figure GPA00001139318900501
盒(2000MWCO，4-12mL)在室温下用水(4L)交换透析16小时。在0℃下用水(4L)继续交换透析3天，其中每24小时后更换水(4L)和向水中加入NH4HCO3水溶液(3M，0.6mL)以调整pH到～6.0-6.5。然后冷冻干燥已脱盐的溶液，从而得到蓬松的白色粉末状全硫酸酯70(80mg，82％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ8.31(s，1H，＝CH)，6.25(d，1H，JHI-H2＝6.9，1H，H1I)，5.70(m，2H，2×H1)，5.65(d，1H，JHI-H2＝3.6，H1)，4.72-5.03(m，11H，4×H2，4xH3，H4IIII，OCH2)，4.13-4.69(m，15H，3×H4，4×H5，8×H6)，3.58(m，1H，H-3Cho1.)，0.63-2.05(m，33H，12CH2，9CH)，0.95(d，3H，J＝6.3，胆甾烷基-CH3)，0.87(d，6H，2×胆甾烷基-CH3)，0.84(s，3H，胆甾烷基-CH3)，0.70(s，3H，胆甾烷基-CH3).
实施例16.2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴化物(72)
在0℃下将麦芽三糖全醋酸酯(71)36(200mg，207μmol)加入到DCM(1mL)和33％HBr/HOAc(0.7mL)中。在0℃下搅拌该混合4小时。在干燥(Na2SO4)和蒸发溶剂前，用DCM稀释该溶液，用冰水(×2)、NaHCO3(饱和的)(×2)和盐水(×1)对其进行冲洗，从而得到白色固体状溴化物72，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖叠氮化物(73)
将溴化物72(～200mg)加入到乙酸乙酯(5mL)和NaHCO3(饱和的)(5mL)的混合物中。加入NaN3(500mg)，然后加入Bu4NBr(cat.)。室温下剧烈地搅拌该混合物一夜。用乙酸乙酯稀释该溶液，用NaHCO3(饱和的)(×2)和盐水(×1)对其进行冲洗，然后干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂，从而得到白色固体状叠氮化物73(198.9mg，100％，两个步骤)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
4-(胆甾-3β-基氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-1-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(74)
室温下剧烈地搅拌叠氮化物73(200mg，211μmol)、3-(丙炔-2-基氧基)胆甾烷醇(3当量，267mg)、CHCl3(2mL)、叔-BuOH(2mL)、CuSO4(50μL的0.3M水溶液)和抗坏血酸钠(62.5μL的1M水溶液)一夜。蒸发溶剂，在柱层析(SiO2∶己烷至2∶3己烷∶乙酸乙酯)上纯化残留物，从而得到三唑74(197mg，68％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.66(s，1H，三唑-H)，5.85(d，1H，J1，2＝9.3，H-1I)，5.46-5.27(m，6H，H-1II，H-1III，H-2I，H-4III，H-3II，H-3III)，5.03(dd，1H，J3，2＝9.8，J3，4＝9.8，H-3I)，4.82(dd，1H，J2，1＝4.1，J2，3＝10.3，H-2)，4.72(dd，1H，H-2)，4.63(s，2H，CH2O)，4.47-4.41(m，2H)，4.32-3.88(m，9H)，3.31(m，1H，CHO)，2.12(s，6H，OAc)，2.06(s，3H，OAc)，2.03(s，3H，OAc)，2.00(s，3H，OAc)，1.99(s，3H，OAc)，1.98(s，3H，OAc)，1.96(s，3H，OAc)，1.96-0.83(m，31H)，1.82(s，3H，OAc)，0.85(d，3H，J＝6.7，CH3)，0.82(m，6H，CH3)，0.76(s，3H，CH3)，0.60(s，3H，CH3).
4-(胆甾-3-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(75)
按照常规方法将全醋酸酯74(197.2mg)脱去乙酰基，从而得到白色固体状多元醇75(131mg，96％)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
4-(胆甾-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(76)
将多元醇75(131.2mg，137μmol)溶解于DMF(0.02M，6.9mL)中。加入SO3.吡啶(每羟基3当量，4.12mmol，655mg)并在60℃下搅拌该溶液一夜。在冰水中冷却该溶液，然后用5M NaOH(2.1当量/SO3.吡啶，1.73mL)进行中和。蒸发溶剂并在C18 SPE柱(2×1g柱)上纯化该粗制品，然后进行透析(48小时，2000MWCO盒)。冷冻干燥该灰白色溶液，从而得到灰白色固体状全硫酸酯76(156mg，58％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ8.32(s，1H，三唑-H)，6.22(d，1H，J1，2＝7.5，H-1I)，5.69(d，1H，J1，2＝3.4，H-1)，5.63(d，1H，H-1)，5.04-4.17(m，18H)，3.58(m，1H，CHO)，2.03-0.85(m，31H)，0.95(d，3H，J＝6.2，CH3)，0.88(d，6H，CH3)，0.85(s，3H，CH3)，0.71(s，3H，CH3).
实施例17.3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(77)
将2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖基三氯乙酸亚胺酸酯(0.372g，0.502mmol)和3β-胆甾烷醇(0.390g，1.004mmol，2当量)溶解于无水DCM(5mL，0.1M)中。加入粉末状MS
Figure GPA00001139318900521
(120mg刚活化的)。在0℃下搅拌该混合物30分钟。用一个注射器逐滴地滴加TMSOTf(0.018mL，0.100mmol，0.2当量)的DCM(0.3mL)溶液。在0℃下搅拌该混合物同时用TLC(己烷-乙酸乙酯＝83∶17)监测该反应。1.5小时后转化完全，加入Et3N(0.2mL)。过滤该粗制混合物，用DCM(5×1.5mL)冲洗固体物。将合并的滤液和冲洗液在硅胶上蒸发，并用柱层析(硅胶2.5×22cm，己烷-乙酸乙酯200∶20，210∶30，400∶80梯度洗脱)进行纯化，从而得到无色泡沫状糖苷77(368mg，76％)。
3β-胆甾烷基α-D-甘露吡喃糖苷(78)
将上述无色泡沫状物(358mg，0.370mg)溶解于无水THF(5mL)和甲醇(3mL)中，加入11M NaOMe的甲醇(0.4mL)溶液。立即产生白色沉淀。室温下搅拌该混合物o/n。再次加入THF(3mL)，并在室温下再搅拌该浓的混悬液一天。加入AG50WX8树脂(H+型)来中和该混合物从而使该混悬液变成一种澄清溶液。过滤除去树脂，并用甲醇(4×1.5mL)清洗。在5分钟内合并的滤液和洗涤液变成一种胶体(半透明的)。将该混合物蒸发至小体积，使其从乙醇(10mL)中结晶。室温下整个混合物变成一种胶体，对其进行过滤和按压以排出液体。用乙醇(1.5mL)清洗残留物，风干，和P2O5真空干燥o/n，从而得到白色粉末状四醇78(131mg)。滤液产生一种沉淀物，将该滤液加热回流。结果成为澄清的溶液，在硅胶上蒸发该溶液，通过硅胶柱层析(3×8cm，CHCl3 200mL和甲醇-CHCl3 20∶200，20∶160，30∶150梯度洗脱)对其进行纯化。合并产物的级分，浓缩蒸发，并在P2O5真空条件下干燥3天，从而得到第二次得到白色粉末状产物白色粉末(79mg)。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ4.73(d，1H，J＝1.5，H1)，4.64(d，可用D2O交换，1H，J＝4.6，OH)，4.61(br d，可用D2O交换，1H，J＝4.1，OH)，4.48(d，可用D2O交换，1H，J＝5.7，OH)，4.37(t，可用D2O交换，1H，J＝6.0，OH)，3.62(dd，1H，J＝10.3，5.7)，3.56-3.29(m，6H，糖5×H和胆甾烷基的H3)，1.95-0.56(m，46H，胆甾烷基)。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸酯基(sulfonato)-α-D-甘露吡喃糖苷四钠盐(79)
将四醇78(102.8mg，0.187mmol)溶解于无水DMF(4.67mL，0.04M)中。加入SO3.吡啶复合物(357mg，2.244mmol，每羟基3当量，刚刚用水、甲苯、乙醇、DCM清洗的和在P2O5真空干燥器中干燥1小时的)。60℃下搅拌该混合物18小时，将其冷却至0℃。加入5MNaOH(3×0.45mL)。所述混合物(pH＞10)的颜色变成黄橙色。将该混合物蒸发至干。将残留物(浅黄色粉末)溶解于4mL的水(pH＞10)中，并用SPE-C18柱(800mg，分别用MeCN、MeCN-水1∶1，1∶9，1∶99，4mL洗脱预处理)对其进行纯化。上样后，用水(12mL)、1％MeCN水(4.04mL)、5％(4.2mL)、10％(4.4mL)、20％(4.8mL)、30％(5.2mL)、40％(5.6mL)、50％(6mL)、60％(4.8mL)和70％(5.1mL)洗脱该SPE。通过用MBT，Char检验，CE来检测级分，然后将其合并和冻干。从1％～5％MeCN-水中得到少量产物79(25mg的褐色粉末)。多数产物被10％，20％和30％的MeCN水洗脱下来(浅黄色粉末，120mg，67％)。另一些少量产物被40％的MeCN水(浅黄色粉末，4mg)洗脱下来。1H NMR(D2O，400MHz)δ5.16(br s，1H，H1)，4.70(br s，与HOD重叠1H，H2)，4.6(与HOD重叠，1H，H3)，4.35(br m，1H，H4)，4.22(br m，1H，H6)，4.14(br m，1H，H6)，3.96(br m，1H，H5)，3.54(br m，1H，胆甾烷基-H3)，1.90-0.50(m，46H，胆甾烷基)。
实施例18.2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖胺(80)
将叠氮化物67(201mg，0.098mmol)溶解于乙酸乙酯(10mL)中，将其与Pd-C(10％，(w/w)，100mg)一起在H2气氛下搅拌3小时(TLC：甲苯∶乙酸乙酯，7∶1)。用氩气代替氢气然后用硅藻土(甲醇和乙酸乙酯预先洗涤的，5mL)过滤该混合物，乙酸乙酯(5×20mL，+超声处理)洗涤，最后在室温下真空浓缩，从而得到白色固体状胺80(200mg，100％)，将其用于下一步骤而不进行进一步的纯化或鉴定。
N-(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-4-((3R，10S，12S，13R)-3，12-二-O-乙酰基-10，13-二甲基十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基)戊酰胺(81)
将双乙酰脱氧胆酸37(53mg，0.111mmol)和DMAP(cat.)溶解于无水DCM(3mL)中，然后在0℃下加入DCC在DCM(1M，1当量，0.111mL)和HOBt(17mg，0.111mmol)中的溶液，室温下搅拌该混合物30分钟。加入Et3N(2滴)来碱化该溶液以将pH调整至8，然后在0℃下加入胺80(150mg，0.074mmol)在DCM/DMF(5∶1，(w/w)，2.5mL)的混合物中的溶液并在室温下连续搅拌16小时(pH 8)。TLC(甲苯∶乙酸乙酯，3∶1)显示没有进展，所以再加双乙酰脱氧胆酸(53mg，0.111mmol)、DCC的DCM(1M，1当量，0.111mL)、HOBt(17mg，0.111mmol)和Et3N(3滴)并继续搅拌56小时。TLC指示反应结束，因此用硅藻土(预先洗涤过的，2mm)滤过该溶液，用DCM(3×40mL)洗涤。用饱和的NaHCO3-溶液(4×30mL)洗涤该澄清的溶液。用DCM(2×20mL)再次萃取水相，合并有机提取物，用HCl水(3％，5×30mL)、饱和的NaHCO3-溶液(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。在硅胶柱(30×5cm，甲苯-乙酸乙酯，7∶1→5∶1→1∶1)上纯化残留物，从而得到微黄色固体状酰胺81(58mg，32％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.01-8.28(m，65H，13×Bz)，6.31(d，1H，JH1-NH＝9.3，NH)，6.10(dd，1H，JH2-H3＝JH3-H4 10.1，H3IIII)，6.00(dd，1H，JH2-H3＝10.2，JH3-H4＝8.9，H3I)，5.82(m，2H，H3II，H3III)，5.74(d，1H，JHI-H2＝3.9，H1IIII)，5.67(t，1H，H4IIII)，5.61(d，1H，JHI-H2＝4.0，H1III)，5.57(d，1H，JHI-H2＝4.0，H1II)，5.48(t，1H，JH1-H2＝9.4H1I)，5.25(dd，1H，JH2-H3＝10.6，H2IIII)，4.99-5.15(m，4H，3×H2，H3-去氧胆酸.)，4.92(dd，1H，JH6b-H5＝1.7，JH6bH6a＝-12.4，H6b)，4.63-4.81(m，4H，3×H6，H12-去氧胆酸)，4.56(dd，1H，JH6b-H5＝1.7，JH6bH6a＝-12.6，H6b)，4.08-4.52(m，10H，3×H4，4×H5，3H6)，2.07(s，3H，Ac)，2.03(s，3H，Ac)，0.8-2.15(m，26H，10xCH2，6×CH)，0.89(s，3H，CH3)，0.70(d，3H，J＝6.4，CH-CH 3)，0.63(s，3H，CH3).
N-(α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基)-4-((3R，10S，12S，13R)-12-O-乙酰基-10，13-二甲基十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基)戊酰胺(82)
将化合物81(53mg，0.021mmol)溶解于甲醇/THF(7∶1(w/w)，4mL)的混合物中，然后在0℃下加入NaOMe的甲醇溶液(11M，0.040mL)并在室温下不断地搅拌。16小时后仍有10％的部分苯甲酰化的非极性(unpolar)化合物存在(TLC：甲醇∶乙酸乙酯，2∶1)，因此再一次加入NaOMe的甲醇溶液(11M，0.050mL)并继续搅拌1小时(pH 12)。加入强酸性阳离子交换树脂(BioRad AG-X8，H+)来中和该溶液以调整其pH到7，然后过滤溶液，用甲醇(3×30mL，+超声处理)洗涤，真空浓缩。在硅胶柱(10×1cm，乙酸乙酯，→甲醇-乙酸乙酯，2∶1→甲醇，含0.2％Et3N)上纯化具有强烈芳香气味的残留物，从而得到白色固体状多元醇82(23mg，100％)。
N-(2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖基)-4-((3R，10S，12S，13R)-3-O-磺酸钠-12-O-乙酰基-10，13-二甲基十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基)戊酰胺(83)
将多元醇82(22mg，0.020mmol)溶解于无水DMF(0.02M，1.05mL)中，加入刚刚洗涤和干燥过的SO3.吡啶复合物(每OH基团3当量，150mg，0.945mmol)，并在60℃下搅拌该混合物16小时。在0℃下通过一次性加入NaOH水溶液(5M，2.1当量SO3，0.397mL，1.985mmol)来淬灭该反应(pH 12)，并在0℃下搅拌15分钟。在40℃真空浓缩该混悬液，从而得到黄色粉末。将该粉末溶解于水中(11mL)(pH11.5)，使用Slide-A-Lyzer
Figure GPA00001139318900561
盒(2000MWCO，4-12mL)在室温下用水交换透析2小时。在室温下继续进行用水交换的透析(4L，含0.6mL的3M NH4HCO3水溶液，pH 6)16小时。在0℃下继续进行透析46小时，其中每24小时后更换水(4L)和加入NH4HCO3水溶液(3M，0.6mL)以将水的pH调整到～6.0-6.5。然后冷冻干燥已脱盐的溶液从而得到蓬松的白色粉末。CE分析表明出现了3个化合物，分别对应5.228分钟上的一个主峰(80％)，和5.121(5％)及5.278分钟(10％)上两个较小的峰。在C18 HPLC柱上纯化该混合物(～54mg)：溶剂A：100％水；溶剂B：100％乙腈；流速：10mL/min；级分大小：5mL；检测器：ELS；梯度洗脱：5％B。收集仅仅是较弱的吸附在C18基质上，但是纯的级分83并通过CE分析。冷冻干燥得到蓬松的白色粉末状全硫酸酯83(12.1mg，24％，CE纯度98％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ5.96(d，1H，NH)，5.79(d，2H，2×H1IIII，H1III)，5.68(d，1H，H1II)，5.19(s，1H，H3-去氧胆酸)，5.00-5.10(m，3H1，3×H3)，4.67-4.98(m，6H，H1I，4×H2，H3)，4.18-4.60(m，16H，3×H4，4×H5，8×H6，H12-去氧胆酸.)，2.46(m，2H，OCH2)，2.28(s，3H，12-O Ac-去氧胆酸)，1.08-2.13(m，24H，9×CH2，6×CH)，1.05(s，3H，CH3)，0.93(d，3H，J＝6.2，CH-CH 3)，0.88(s，3H，CH3).
(2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)溴化物(84)
在0℃下将麦芽三糖全苯甲酸酯(200mg，207μmol)加入到DCM(1mL)和HBr/HOAc(0.7mL)中。在0℃下搅拌该混合6小时。用DCM稀释该溶液，用冰水(x2)、NaHCO3(饱和的)(x2)以及盐水(x1)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂，从而得到白色固体产物(定量的)，将其用于反应而不进行进一步纯化。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.19(m，2H，Ar)，8.05(m，2H，Ar)，7.95(m，2H，Ar)，7.88-7.85(m，4H，Ar)，7.74-7.70(m，4H，Ar)，7.63-7.09(m，36H，Ar)，6.73(d，1H，J1，2＝3.4，H-1I)，6.13-6.08(m，2H，H-3III，H-3I)，5.95(m，1H，H-3II)，5.76(d，1H，J1，2＝4.1，H-1III)，5.67(m，1H，H-4III)，5.65(d，1H，J1，2＝3.4，H-1II)，5.27(dd，1H，H-2III)，5.11(dd，1H，H-2II)，5.03(dd，1H，H-2I)，4.99(dd，1H，H-6I)，4.76-4.72(m，2H，H-6II，H-6I)，4.66-4.58(m，2H，H-6II，H-5I)，4.55-4.35(m，5H，H-4I，H-4II，H-5II，H-5III，H-6III)，4.23(dd，1H，H-6III)。
实施例19.3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(85)
在氩气气氛下将2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴化物84(200mg，124μmol)，38分子筛(～50mg)和胆甾烷醇(3当量，370μmol，145mg)加入到无水DCM中，并将其冷却至0℃。加入AgOTf(1.5当量，187μmol，48mg)，并在0℃下搅拌该溶液2小时。加入三乙胺(600μL)，并将该溶液升至室温。将该混合物通过一个短的硅胶柱(用1∶1乙酸乙酯∶Hex与0.5％(v/v)三乙胺作洗脱溶剂)。蒸发溶剂(水浴温度保持在室温)。在氩气气氛下将生成的混合物加入到含分子筛的无水DCM中，然后将其冷却到0℃，接着在超过20分钟的时间里慢慢地加入TMSOTf(1.24mL在DCM中的0.1M溶液)。在0℃下搅拌该溶液1小时，然后在室温下用超过15分钟的时间加入另外0.5当量的TMSOTf。再过30分钟后，加入三乙胺(1mL)，过滤溶液并将溶剂蒸发。将该粗制产物用柱层析(SiO2：己烷至35％乙酸乙酯/Hex)进行，纯化从而得到纯的白色固体状糖苷85(91mg，38％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.17(m，2H，Ar)，8.06(m，2H，Ar)，7.96(m，2H，Ar)，7.88(m，2H，Ar)，7.82(m，2H，Ar)，7.72(m，4H，Ar)，7.57(m，4H，Ar)，7.52-7.09(m，32H，Ar)，6.10(t，1H，J＝9.7，H-3III)，5.92(t，1H，H-3II)，5.75(d，1H，J1，2＝3.8，H-1III)，5.71-5.64(m，2H，H-4III，H-3I)，5.58(d，1H，J1，2＝3.8，H-1II)，5.30-5.19(m，2H，H-2III，H-2I)，5.10(dd，1H，H-2II)，4.95(m，1H，H-6II)，4.84(d，1H，J1，2＝7.7，H-1I)，4.77-4.61(m，3H，H-6I，H-6I，H-6II)，4.49-4.34(m，5H，H-6III，H-5I，H-5III，H-4I，H-4II)，4.25(m，1H，H-6III)，4.06(m，1H，H-5II)，3.53(m，1H，CHO)，1.99-0.47(m，31H)，0.91(d，3H，CH3)，0.87(m，6H，CH3)，0.64(s，3H，CH3)，0.62(s，3H，CH3)。
3β-胆甾烷基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(86)
将糖苷85(91mg，47.5μmol)加入到1∶1甲醇∶THF中，并按照常规方法去乙酰基化，从而得到白色固体状多元醇86(48mg)(含微量苯甲酸甲酯)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(87)
将多元醇86(47.8mg，54.6μmol)溶解于DMF(0.02M，2.73mL)中。加入SO3.吡啶(每羟基3当量，1.64mmol，261mg)，并在60℃下搅拌该溶液一夜。在冰水中冷却该溶液，在蒸发掉溶剂之前，用5M NaOH(700μL)中和该溶液。将残留物加入到水中，用甲醇/水作为流动相在C18 SPE柱上对其进行纯化。合并含有产物的部分，在使用40微米注射器式滤器过滤前用2000MWCO透析盒透析48小时以上，冷冻干燥，从而得到灰白色固体状全硫酸酯87(43mg，48％以上两个步骤)。1H NMR(400MHz，D2O)δ5.68(d，1H，H-1)，5.58(d，1H，H-1)，5.05-4.03(m，19H)，3.82(m，1H，胆甾烷基H-3)，2.05-0.65(m，31H)，0.96(d，3H，J＝5.6，CH3)，0.90(d，6H，J＝6.4，CH3)，0.86(s，3H，CH3)，0.71(s，3H，CH3).
实施例20.2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖(88)
将乳糖(5.0221g，13.88mmol)悬浮于无水吡啶(40mL)中，并加入DMAP(50mg)。在0℃下在超过15分钟的时间内向该混悬液中逐滴地滴加醋酸酐(26.24mL，277.6mmol)，在室温下将该混合物搅拌过夜。在0℃下逐滴地加入无水甲醇来淬灭该反应并搅拌所述溶液。蒸发溶剂，然后与无水甲苯(3x50mL)一起洗脱出来，在真空条件下过夜减少剩余的溶剂，从而得到一种白色固体(9g，13.26mmol，95％)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基- -D-吡喃葡萄糖溴化物(89)
将全醋酸酯88(510.3mg，0.75mmol)溶解于无水DCM(1.5mL)中，在0℃下逐滴地加入HBr/醋酸(30％，1mL)。室温下搅拌该混合物3小时，然后用DCM(30mL)将其稀释，用冰水(2x40mL)、冰冷的饱和NaHCO3溶液(3x30mL)和盐水(2x30mL)洗涤。用Na2SO4干燥该溶液，在真空下浓缩从而生产出粗制的溴化物。浓缩后立即进行接下来的反应。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-((1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖叠氮化物(90)
将粗制的糖基溴化物89(0.75mmol)溶解于CHCl3(4mL)中，加入Bu4NHBr(193.42mg，0.6mmol)、NaN3(195.03mg，3.0mmol)和饱和的NaHCO3溶液(7mL)。室温下剧烈地搅拌所述反应物过夜。反应物被还原，在乙酸乙酯中被稀释，并用饱和的NaHCO3溶液(3x30mL)和盐水(3x30mL)对其进行洗涤。用Na2SO4干燥有机层，真空浓缩，并通过用含0.2％Et3N的乙酸乙酯/己烷(1∶1)快速色谱法对其进行纯化，从而得到叠氮化物(348mg，70％，2个步骤)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.33(dd，1H，JH4′，H3′＝3.4Hz，JH4′，H5′＝1.1Hz，H-4′)，5.19(dd，1H，JH3，H4＝9.4Hz，JH2，H3＝9.0Hz，H-3)，5.09(dd，1H，JH2′，H3′＝10.4Hz，JH2′，H1′＝7.8Hz，H-2′)，4.94(dd，1H，JH2′，H3′＝10.4Hz，JH3′，H4′＝3.4Hz，H-3′)，4.84(dd，1H，JH2，H3＝9.5Hz，JH2，H1＝8.8Hz，H-2)，4.61(d，1H，JH2，H1＝8.8Hz，H-1)，4.49(dd，1H，JH6a，H6b＝11.9Hz，JH6a，H5＝2.2Hz，H-6a)，4.46(d，1H，JH1′，H2′＝7.8Hz，H-1′)，4.14-4.03(m，3H，H-6b，H-6a′，H-6b′)，3.87(dd，1H，JH5′，H4′＝1.1Hz，H-5′)，3.80(t，1H，JH4，H5 and H4，H3＝9.4Hz，H-4)，3.68(ddd，1H，JH6a，H5＝2.0Hz，JH6b，H5＝5.0Hz，JH4，H5＝9.9Hz，H-5)，2.13(s，3H，OAc)，2.12(s，3H，OAc)，2.05(s，3H，OAc)，2.05(s，3H，OAc)，2.03(s，3H，OAc)，2.03(s，3H，OAc)，2.02(s，3H，OAc)，1.95(s，3H，OAc)。
4-(胆甾-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(91)
将干燥的叠氮化物90(100mg，0.15mmol)和3β-(丙炔-2-基氧基)胆甾烷醇(129mg，0.302mmol，2当量)溶解于DCM/t-BuOH(3∶2，0.21M)中。将CuSO4水溶液(0.3M，0.1当量，0.015mmol，50μL)加入到该混合物中，然后加入抗坏血酸钠水溶液(1M，0.3当量，0.045mmol，45.3μL)。使该反应避光并将其剧烈地搅拌整夜。在DCM(100mL)中稀释该混合物并用饱和的NaHCO3溶液(3x30mL)对其进行洗涤。用DCM(20mL)再次萃取水相，然后用盐水冲洗(2x30mL)合并的有机层，并用Na2SO4干燥。真空蒸发溶剂，从而得到粗制品。用含有0.2％Et3N的己烷/乙酸乙酯(3∶2)通过快速色谱法对粗制品进行纯化，从而得到白色固体状产物(135.3mg，82％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.67(s，1H，CH-N)，5.79(d，1H，JH1，H2＝9.2，H-1)，5.43-5.37(m，2H，H-2，H-3)，5.35(dd，1H，JH3′，H4′＝3.4，JH4′，H5′＝0.8，H-4′)，5.11(dd，1H，JH2′，H3′＝10.4，JH2′，H1′＝7.8，H-2′)，4.95(dd，1H，JH2′，H3′＝10.4，JH3′，H4′＝3.4，H-3′)，4.64(s，2H，CH2-N)，4.50(d，1H，JH1′，H2′＝7.9，H-1′)，4.46(dd，1H，JH6a′，H6b′＝12.4，JH6a′，H5′＝1.6，H-6a′)，4.16-4.04(m，3H，H-6b′，H-6a，H-6b)，3.96-3.85(m，3H，H-4，H-5，H-5′)，3.39-3.28(m，1H，H-Cho1)，2.14(s，3H，OAc)，2.09(s，3H，OAc)，2.06(s，3H，OAc)，2.05(s，3H，OAc)，2.04(s，3H，OAc)，1.95(s，3H，OAc)，1.88-1.80(m，31H)，1.85(s，3H，OAc)，0.88-0.80(m，3H，CH3-CH)，0.85(d，3H，J＝1.3，CH3-CH)，0.83(d，3H，J＝1.2，CH3-CH)，0.77(s，3H，CH3)，0.62(s，3H，CH3)。
4-(胆甾-3-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(92)
将干燥的N-糖苷91(100mg，0.092mmol)溶解于无水CH3OH中，在0℃氩气气氛下向混合物中逐滴地加入NaOMe/CH3OH溶液(11M，30μL)。室温下搅拌该溶液整夜。用TLC检测后，加入无水CH3OH(2mL)和NaOMe/CH3OH(11M，50μL)，并发现该反应混合物的pH为11。在反应完全后，加入Dowex H+离子交换树脂来中和反应物至pH 6，在所得的混悬液在40℃溶解在CHCl3/CH3OH(1∶1)中。过滤该溶液，浓缩并用P2O5将其干燥，从而得到粗制品。
4-(胆甾(cholestan)-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，七钠盐(93)
在60℃下将SO3-吡啶(124.89mg，0.785mmol，3当量/OH，被预先洗涤和干燥)一次性加到无水DMF(0.02M，1.85mL)中的干燥多元醇92(29.7mg，0.037mmol)中。搅拌所述反应物整夜。将反应物冷却至0℃，在搅拌的同时将冷却的5M NaOH溶液(329.7μL，1.65mmol，2.1当量的SO3-吡啶)一次性加入。立即检测pH，发现其仅稍为碱性。向反应物中加入冷却的5M NaOH溶液(50μL)，发现pH大约为13。0℃下搅拌该混悬液15分钟，然后用HPLC级水(100mL)将其稀释，并缓慢地蒸发溶剂。在C18固相萃取柱(WatersSepPak，1g)用100％HPLC级水至ACN/水(1∶1)梯度洗脱对产物脱盐。加入0.1M NH4HCO3使所述级分保持碱性，并对所有级分进行char检验。用CE分析阳性char级分，合并含有JR245_33的级分，并在C18液相色谱上在大于35分钟的时间内用5-50％ACN水梯度洗脱来分离。用10μL样品与40μL 1，9-二甲基-亚甲蓝水溶液对所有级分都进行了糖检验，并用CE分析了糖呈阳性的级分。收集纯的级分并将其冻干，从而得到灰白色粉末产物(21.1mg，得率37％)CE纯度98％。1H NMR(300MHz，D2O)δ：8.29(s，1H，CH＝C-)，6.27(d，1H，JH1，H2＝8.1Hz，H-1)，5.14(d，1H，JH3′，H4′＝3.0Hz，H-4′)，4.98(t，1H，JH1，H2＝7.8Hz，H-2)，4.91-4.82(m，1H，H-3)，4.89(d，1H，JH1′，H2′＝7.5Hz，H-1′)，4.74(s，2H，CH2)，4.57(dd，2H，JH2′，H3′＝10.2Hz，JH3′，H4′＝3.0Hz，H-3′，H-5′)，4.46(dd，1H，JH2′，H3′＝9.9，JH1′，H2′＝7.5，H-2′)，4.36(m，5H，H-4，H-5，H-6a，H-6a′，H-6b′)，4.18-4.14(m，1H，H-6b)，3.63-3.49(m，1H，Cho1-H)，2.04-0.98(m，31H，Cho1)，0.97-0.83(m，12H，CH3)，0.70(s，3H，CH3).
实施例21.2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖叠氮化物(94)
在0℃下将麦芽糖全醋酸酯(200mg，295μmol)加入到DCM(1mL)和HBr/HOAc(0.7mL)中。在0℃下搅拌该混合4小时。在将其干燥(Na2SO4)前，用DCM稀释该溶液，并用冰水(x2)、NaHCO3(饱和的)(x2)和盐水(x1)洗涤，蒸发溶剂，从而得到白色固体溴化物产物，将该产物加入到乙酸乙酯(5mL)和NaHCO3(饱和的)(5mL)的混合物中。加入NaN3(2.0g)，接着加入Bu4NBr(cat.)。室温下剧烈地搅拌该混合物一整夜。在将其干燥(Na2SO4)前，用乙酸乙酯稀释该溶液，用NaHCO3(饱和的)(x2)和盐水(x1)洗涤，蒸发溶剂，从而得到粗制品，用柱层析(SiO2：己烷至50％乙酸乙酯/己烷，用甲苯载样)对该粗制品进行纯化，从而得到170.6mg的白色固体产物(87％，两步)，将其用于反应而不进行进一步鉴定。
4-(胆甾-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(95)
室温下剧烈地搅拌叠氮化物94(170mg，257μmol)、3β-(丙炔-2-基氧基)胆甾烷醇(2当量，219mg)、CHCl3(2mL)、t-BuOH(2mL)、CuSO4(50μL的0.3M水溶液)和抗坏血酸钠(62.5μL of a 1M水溶液)一整夜。蒸发溶剂，将残留物装载到二氧化硅柱上(SiO2：己烷至50％乙酸乙酯/己烷)，从而得到190mg的纯的物质95(68％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.67(s，1H，三唑-H)，5.85(d，1H，J1，2＝9.3，H-1I)，5.46-5.29(m，4H，H-1II，H-2I，H-4II，H-3II)，5.04(t，1H，J2，3＝10.3，J3，4＝10.3，H-3I)，4.85(dd，1H，J1，2＝4.1，J2，3＝10.8，H-2II)，4.63(s，2H，CH2)，4.45(ddd，1H，H-6I)，4.25-4.19(m，2H，H-5I，H-6II)，4.14-3.92(m，4H，H-5II，H-6I，H-6II，H-4I)，3.32(m，1H，CHO)，2.31-0.53(m，31H)，2.10(s，3H，OAc)，2.08(s，3H，OAc)，2.03(s，3H，OAc)，2.00(s，6H，OAc)，1.98(s，3H，OAc)，1.82(s，3H，OAc)，0.83(d，3H，J＝1.0，CH3)，0.81(d，3H，J＝1.5，CH3)，0.76(s，3H，CH3)，0.61(s，3H，CH3).
4-(胆甾)-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(96)
将全醋酸酯95(190mg)溶解于THF/甲醇(1∶1)中。加入甲醇中的NaOMe(11M，20μL)，在室温下搅拌该溶液3小时。用H+树脂中和该溶液，过滤，蒸发溶剂，从而得到125mg(90％)的灰白色固体产物，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
4-(胆甾-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，七钠盐(97)
将多元醇96(124.5mg，157μmol)溶解于DMF(0.02M，7.84mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，3.3mmol，525mg)，在60℃下搅拌该溶液一整夜。将所述溶液冷却至0℃，用5M NaOH(2.1当量/SO3.吡啶，1.4mL)将其中和。将混合物用水转移到一个大圆底烧瓶中，蒸发和用纯水(5L，每12小时换水)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)24小时。冻干溶液，并将其加入到水中，然后在制备C18 RP-HPLC系统上(5％至95％乙腈水超过20分钟)将其纯化。HPLC纯化后，用CE检测收集到的每个级分的纯度。合并纯度超过90％的级分，并将其冻干，从而得到白色固体产物(55mg，23％)。1H NMR(300MHz，D2O)δ：8.25(s，1H，三唑)，6.20(d，1H，J1，2＝6.0，H-1I)，5.65(d，1H，H-1II)，5.04-4.94(m，3H，H-3I，H-3II，H-2I)，4.80(s，2H，CH2)，4.73(m，1H，H-2II)，4.58(dd，1H，H-4II)，4.49-4.23(m，7H，H-4I，H-5I，H-5II，4xH-6)，3.57(m，1H，CHO)，2.09-0.56(m，46H).
实施例22.2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(98)
在0℃下将麦芽糖(2.0g，5.84mmol)溶解于无水吡啶(40mL)中。加入DMAP(cat.)。逐滴地加入苯甲酰氯(2.5当量，14.6mmol，16.4g，13.6mL)，并在室温下搅拌该溶液一整夜。将所述溶液倒入冰水和DCM的混合物中。用NaHCO3(饱和的)(x7)、盐水、H2SO4(5％)(x2)，然后盐水洗涤有机层。干燥(Na2SO4)该溶液，并蒸发溶剂。使产物通过一个短的硅胶柱以除去剩余的苯甲酰氯，蒸发溶剂从而得到3.5g(51％)的白色固体产物，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酸亚胺酸酯(99)
将全苯甲酸酯98(0.5g)溶解于吡啶(5mL)中。加入二甲胺(3.5mL；乙醇中5.6M)。在室温下下搅拌该反应混合物1小时。加入甲苯(10mL)，用盐水、H2SO4(5％)(x2)、盐水、NaHCO3(饱和的)以及盐水冲洗该溶液。干燥(Na2SO4)该溶液，并蒸发掉溶剂。将粗制的半缩醛与分子筛、碳酸钾(200mg)和碳酸铯(70mg)一起加入到无水DCM中。在加入三氯乙腈(120μL)前，将该溶液冷却至0℃。室温下搅拌所述混合物3小时。过滤混合物并蒸发溶剂。用柱层析(SiO2：己烷至50％乙酸乙酯/己烷)纯化粗制品，从而得到白色固体产物(336mg，66％超过两步)，将其用于反应而不进行进一步的鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(100)
在氩气气氛下将三氯乙酸亚胺酸酯99(336.2mg，280μmol)、胆甾烷醇(3当量，326mg)和分子筛加入到无水DCM中。在缓慢地加入TMSOTf(DCM中的0.1M溶液，0.33当量，924μL)之前，搅拌该溶液15分钟。30分钟后，慢慢地加入另一当量的TMSOTf(2.77mLDCM中的0.1M溶液)，并再搅拌所述溶液40分钟。加入三乙胺(200μL)，蒸发掉溶剂。将该粗制的产物用柱层析(SiO2：己烷至15％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，但洗脱接近于过量的胆甾烷醇起始物料。因此将混合物去苯甲酰化，乙酰化，并再纯化，以使得分离充分。将化合物加到甲醇/THF(1∶1)中。加入11M NaOMe的甲醇(50μL)溶液，并在室温下搅拌该溶液5小时。用H+树脂中和该溶液，过滤，蒸发溶剂。将粗制的多元醇产物加入到吡啶(5mL)和醋酸酐(5mL)中。加入DMAP(cat.)并在室温下搅拌该溶液一整夜。将该混合物加到冰水中，用DCM对其进行萃取，然后5％H2SO4、接着用盐水对其进行洗涤。干燥(Na2SO4)溶液并蒸发溶剂，然后将该粗制的样品用柱层析(SiO2：己烷至50％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，从而得到118mg的白色固体状全乙酰化的产物(42％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.40(d，1H，J1，2＝4.1，H-1II)，5.35(dd，1H，J3，2＝10.6，J3，4＝9.5，H-3II)，5.23(dd，1H，J3，2＝9.0，J3，4＝9.0，H-3I)，5.03(dd，1H，J4，3＝10.0，J4，5＝10.0，H-4II)，4.83(dd，1H，J2，1＝3.9，J2，3＝10.3，H-2II)，4.76(dd，1H，J2，1＝8.0，J2，3＝9.3，H-2I)，4.60(d，1H，J1，2＝8.0，H-1I)，4.42(dd，1H，H-6I)，4.26-4.20(m，2H，H-6I，H-6II)，4.04-3.92(m，3H，H-4I，H-5II，H-6II)，3.64(ddd，1H，H-5I)，3.53(m，1H，CHO)，2.12(s，3H，OAc)，2.09(s，3H，OAc)，2.03(s，3H，OAc)，2.01(s，3H，OAc)，2.00(s，3H，OAc)，1.99(s，3H，OAc)，1.98(s，3H，OAc)，1.96-0.52(m，31H)，0.87(d，3H，J＝6.4，CH3)，0.86(d，3H，J＝1.5，CH3)，0.83(d，3H，J＝1.3，CH3)，0.76(s，3H，CH3)，0.63(s，3H，CH3)。
3′-胆甾烷基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(101)
将糖苷100(118mg)溶解于THF/甲醇(1∶1)中。加入甲醇中的NaOMe(11M，30uL)并在室温下搅拌该溶液3小时。用H+树脂中和该溶液，过滤，蒸发溶剂，从而得到一种定量得率的灰白色固体，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，七钠盐(102)
将多元醇101(99.5mg，140μmol)溶解于DMF(0.02M，7mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，2.9mmol，467mg)并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将溶液冷却至0℃，用5M NaOH(2.1当量/SO3.吡啶，1.23mL)将其中和。将该混合物用水转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，用水(5L，每12小时更换水)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)48小时。冻干该溶液，将其加入到水中，然后在制备C18RP-HPLC系统(水中的5％至95％乙腈，超过20分钟)上进行纯化。在HPLC纯化后，用CE测定收集的每个级分的纯度。合并纯度超过90％的部分并冷冻干燥，从而得到白色固体状产物(27mg，14％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ：5.59(d，1H，J1，2＝3.4，H-1II)，5.09(d，1H，J1，2＝5.0，H-1I)，4.89(m，1H，H-3II)，4.73(m，1H，H-3I)，4.61(dd，1H，H-2II)，4.53-4.42(m，3H，H-2I，H-4II，H-6II)，4.37-4.14(m，6H，H-4I，H-5II，H-5I，3xH-6)，3.85(m，1H，CHO)，2.08-0.64(m，46H).
实施例23.2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(103)
在0℃下将纤维二糖(1.0g，2.92mmol)溶解于无水吡啶(20mL)中。加入DMAP(cat.)。逐滴地加入苯甲酰氯(2.5当量，58mmol，6.8mL)并在室温下搅拌该溶液一整夜。将该溶液倒在冰水和DCM的混合物中。用NaHCO3(饱和的)(x7)、盐水、H2SO4(5％)(x2)、接着用盐水洗涤有机层。干燥(Na2SO4)所述溶液，并蒸发溶剂。将该产物通过一个短的硅胶柱以除去剩余的苯甲酰氯，蒸发掉溶剂从而得到740mg(22％)的白色固体状产物，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酸亚胺酸酯(104)
将全苯甲酸酯103(740mg，0.63mmol)溶解于吡啶(5mL)中。在加入二甲胺(3.1mL；乙醇中5.6M)之前，将该溶液冷却至0℃。在室温下搅拌该反应混合物2小时。加入甲苯(20mL)，用盐水、H2SO4(5％)(x2)、盐水、NaHCO3(饱和的)以及盐水洗涤该溶液。干燥(Na2SO4)溶液并蒸发溶剂。将该粗制的半缩醛与分子筛和碳酸钾(1.17g)一起加入到无水DCM(5mL)中。在加入三氯乙腈(782μL)前，将该溶液冷却至0℃。室温下搅拌该混合物2小时。滤该混合物，蒸发溶剂。通过柱层析(SiO2；甲苯∶乙酸乙酯(5∶1)至100％乙酸乙酯)纯化该粗制品，从而得到白色泡沫状产物(566mg，75％超过两步)，将其用于反应而不进行进一步的鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(105)
在氩气气氛下将三氯乙酸亚胺酸酯104(250mg，210μmol)、胆甾烷醇(2当量，163mg)和分子筛加入到无水DCM中。在慢慢地加入TMSOTf(DCM中的0.4M溶液，0.5当量，260μL)之前，在0℃下搅拌该溶液30分钟。30分钟后，慢慢地加入另一当量的TMSOTf(130μL的DCM中的0.4M溶液)，并再搅拌该溶液20分钟。加入三乙胺(15μL)，过滤该溶液，蒸发溶剂。通过用柱层析(SiO2；甲苯∶乙酸乙酯，10∶1至5∶1)纯化该粗制的产物，从而得到208mg的白色固体产物(69％)。1H nmr(300MHz，CDCl3)δ：7.99-7.16(m，35H，Ar)，5.73(m，2H，H-3I，H-3II)，5.51(dd，1H，J2，1＝7.9，J2，3＝9.8，H-2II)，5.37(m，2H，H-4II，H-2I)，4.93(d，1H，J1，2＝7.9，H-1II)，4.76(d，1H，J1，2＝7.9，H-1I)，4.59(dd，1H，H-6)，4.45(dd，1H，H-6)，4.19(dd，1H，J4，3＝9.5，J4，5＝9.5，H-4I)，4.07(dd，1H，H-6)，3.84-3.79(m，2H，2xH-5)，3.72(dd，1H，H-6)，3.46(m，1H，CHO)，1.95-0.45(m，31H)，0.88(d，3H，J＝7.3，CH3)，0.86(d，3H，J＝1.4，CH3)，0.84(d，3H，J＝1.4，CH3)，0.62(s，3H，CH3)，0.60(s，3H，CH3)。
3′-胆甾烷基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(106)
将糖苷105(152mg)溶解于THF/甲醇(1∶1)中。加入甲醇中的NaOMe(11M，30uL)，并在室温下搅拌该溶液24小时。用H+树脂中和该溶液，过滤，蒸发溶剂，从而得到23mg(30％)的灰白色固体，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，七钠盐(107)
将多元醇106(23mg，32μmol)溶解于DMF(0.02M，1.6mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，672μmol，107mg)，并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃，用5M NaOH(2.1当量/SO3.吡啶，0.282mL)中和该溶液。用水将该混合物转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，并用水(5L，每12小时更换水)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)48小时。冻干该溶液，将其加入到水中，然后在制备C18RP-HPLC系统(水中的5％至95％乙腈，超过20分钟)上对其进行纯化。在HPLC纯化后，用CE测定所收集的每个级分的纯度。合并纯度超过90％的部分，冻干，从而得到白色固体状产物(11.6mg，25％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ：5.06(d，1H，J1，2＝6.3，H-1II)，4.86(d，1H，J1，2＝6.3，H-1I)，4.72-4.66(m，2H，H-3I，H-3II)，4.57-4.48(m，2H，H-4II，H-6)，4.40-4.35(m，3H，H-2I，H-2II，H-6)，4.30(dd，1H，H-6)，4.24-4.20(m，2H，H-4I，H-6)，4.08(m，2H，H-5I，H-5II)，3.62(m，1H，CHO)，2.00-0.67(m，31H)，0.93(d，3H，CH3)，0.87(d，3H，CH3)，0.86(d，3H，CH3)，0.83(s，3H，CH3)，0.68(s，3H，CH3)。
实施例24.2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖(108)
在0℃下将乳糖(1.0g，2.92mmol)溶解于无水吡啶(20mL)中。加入DMAP(cat.)。逐滴地加入苯甲酰氯(2.5当量，58mmol，6.8mL)并在室温下搅拌该溶液一整夜。将该溶液倒在冰水和DCM的混合物中。用NaHCO3(饱和的)(x7)、盐水、H2SO4(5％)(x2)、接着用盐水洗涤有机层。干燥(Na2SO4)溶液并蒸发溶剂。将该产物通过一个短的硅胶柱以除去剩余的苯甲酰氯，蒸发掉溶剂从而得到3.67g(定量的)的白色固体产物，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酸亚胺酸酯(109)
将全苯甲酸酯108(500mg，0.43mmol)溶解于吡啶(3.5mL)中。在加入二甲胺(2.1mL；乙醇中5.6M)前，将该溶液冷却至0℃。室温下搅拌该反应混合物2小时。加入甲苯(20mL)，用盐水、H2SO4(5％)(x2)、盐水、NaHCO3(饱和的)以及盐水洗涤该溶液。干燥(Na2SO4)该溶液并蒸发掉溶剂。将粗制的半缩醛与分子筛和碳酸钾(871mg)一起加入到无水DCM(5mL)中。在加入三氯乙腈(582μL)之前，将该溶液冷却至0℃。室温下搅拌该混合物2小时。过滤该混合物并蒸发溶剂。用柱层析(SiO2；甲苯∶乙酸乙酯(5∶1)至100％乙酸乙酯)纯化该粗制品，从而得到白色泡沫状产物(152mg，29％超过两步)，将其用于反应而不进行进一步的鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(110)
在氩气气氛下将三氯乙酸亚胺酸酯109(250mg，210μmol)、胆甾烷醇(2当量，163mg)和分子筛加入到无水DCM中。在慢慢地加入TMSOTf(0.4M溶液in DCM，0.5当量，260μL)之前，在0℃下搅拌该溶液30分钟。30分钟后，慢慢地加入另一当量的TMSOTf(130μL的DCM中的0.4M溶液)，再搅拌该溶液20分钟。加入三乙胺(12μL)，过滤溶液，然后蒸发掉溶剂。将该粗制的产物用柱层析(SiO2；甲苯∶乙酸乙酯，15∶1至7∶1)进行纯化，从而得到237mg的白色固体产物(78％)。1H nmr(400MHz，CDCl3)δ：8.02-7.11(m，35H，Ar)，5.77(dd，1H，J3，2＝9.6，J3，4＝9.6，H-3I)，5.74-5.69(m，2H，H-2II，H-4II)，5.43-5.35(m，2H，H-2I，H-3II)，4.86(d，1H，J1，2＝7.9，H-1II)，4.78(d，1H，J1，2＝7.9，H-1I)，4.57(dd，1H，H-6I)，4.47(dd，1H，H-6I)，4.20(dd，1H，J4，3＝9.6，J4，5＝9.6，H-4I)，3.89(ddd，1H，H-5II)，3.83(ddd，1H，H-5I)，3.75(dd，1H，H-6II)，3.65(dd，1H，H-6II)，3.49(m，1H，CHO)，1.94-0.47(m，31H)，0.88(d，3H，J＝6.5，CH3)，0.86(d，3H，J＝1.7，CH3)，0.84(d，3H，J＝1.9，CH3)，0.63(s，3H，CH3)，0.60(s，3H，CH3).
3′-胆甾烷基β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(111)
将糖苷110(231mg)溶解于THF/甲醇(1∶1)中。加入甲醇中的NaOM(11M，150uL)并在室温下搅拌该溶液24小时。用H+树脂中和该溶液，过滤，蒸发溶剂，从而得到61mg(54％)的白色固体，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，七钠盐(112)
将多元醇111(30mg，42μmol)溶解于DMF(0.02M，2.1mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，882μmol，140mg)并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃，并用5M NaOH(2.5当量/SO3.吡啶，0.442mL)将其中和。将该混合物用水转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，用水(5L，每12小时更换水)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)48小时。冻干该溶液，将其加入到水中，然后在制备C18 RP-HPLC系统上(水中的5％至95％乙腈超过20分钟)对其进行纯化。在HPLC纯化后，用CE测定收集的每个级分的纯度。合并纯度超过90％的部分，并将其冻干，从而得到灰白色固体产物(13mg，22％)。1H NMR(300MHz，D2O)δ：5.15(d，1H，H-1)，4.70(d，1H，H-1)，4.55-3.88(m，12H)，3.50(m，1H，CHO)，1.88-0.44(m，46H).
实施例25.1，2，3，4-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖(113)
将6-O-三苯甲基-1，2，3，4-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖(5g，6.0mmol)，溶解于甲醇中。小心地加入H2SO4(conc.)(150μL)，并在室温下搅拌该溶液一整夜。将该溶液倒入冰水(300mL)中，用乙酸乙酯(80mL)进行萃取。分离有机层，并用盐水(80mL)、接着用NaHCO3(饱和的)对其进行冲洗。干燥(Na2SO4)该溶液，过滤，并蒸发溶剂。用柱层析(SiO2；Hex∶乙酸乙酯，500∶50至200∶200)纯化该粗制品，从而得到1.79g的白色固体产物(50％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.20-8.12(m，4H，Ar)，8.02-7.98(m，2H，Ar)，7.87-7.84(m，2H，Ar)，7.70-7.26(m，27H，Ar)，6.63(d，1H，J1，2＝2.1，H-1)，6.12(dd，1H，J3，2＝3.3，J3，4＝10.2，H-3)，6.02(dd，1H，J4，3＝10.0，J4，5＝10.0，H-4)，5.89(dd，1H，J2，1＝1.8，J2，3＝3.1，H-2)，4.25(ddd，1H，H-5)，3.90-3.76(m，2H，H-6).
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酸亚胺酸酯(114)
在0℃下将麦芽三糖全苯甲酸酯(400mg)溶解于THF(3mL)中。加入饱和的NH3的甲醇(6mL)溶液，并在0℃下搅拌该溶液4小时。用DCM稀释该溶液，用0.5M冰HCl、然后用盐水洗涤，蒸发掉溶剂。用柱层析(SiO2：10-50％乙酸乙酯/己烷)纯化粗制品，从而得到211mg的纯的半缩醛，将其与分子筛、碳酸钾(129mg)和碳酸铯(45mg)一起加入到无水DCM中。在加入三氯乙腈(93μL)之前，在0℃下搅拌该混合物。将该混合物升至室温，并搅拌5小时。过滤溶液，蒸发溶剂。用柱层析(SiO2：己烷至50％乙酸乙酯/己烷)纯化该粗制品，从而得到149.2mg的白色固体产物(36％，两步)，将其用于反应而不进行进一步的鉴定。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-1，2，3，4-四-O-苯甲酰基-D-甘露吡喃糖(115)
将三氯乙酸亚胺酸酯114(279μmol，435mg)、1，2，3，4-四-O-苯甲酰基甘露吡喃糖113(1.2当量，200mg，335μmol)和分子筛加入到DCM中，在慢慢逐滴地加入TMSOTf(1.1当量，68.2mg，600μL DCM中的56μL)之前，在0℃下将其搅拌30分钟。在用三乙胺(200μL)进行中和之前，在0℃下搅拌该混合90分钟，过滤并蒸发掉溶剂从而得到粗制品，通过柱层析(SiO2：己烷至50％乙酸乙酯/己烷)对该粗制品进行纯化，从而得到312.8mg的白色固体产物(53％)，将其用于反应而不进行进一步的鉴定。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苯甲酰基-D-甘露吡喃糖基三氯乙酸亚胺酸酯(116)
将全苯甲酸酯115(312.8mg)溶解于吡啶(4.5mL)中。加入二甲胺(3mL；乙醇中5.6M)。室温下搅拌该反应混合物2小时。加入DCM(10mL)并用盐水、H2SO4(5％)(x2)、盐水、NaHCO3(饱和的)洗涤溶液。干燥(Na2SO4)该溶液并蒸发掉溶剂。将粗制的半缩醛与分子筛、碳酸钾(600mg)和碳酸铯(100mg)一起加入到无水DCM中。在加入三氯乙腈(200μL)之前，将该溶液冷却至0℃。室温下搅拌该混合物4小时。过滤该混合物并蒸发溶剂。用柱层析(SiO2：己烷至60％乙酸乙酯/己烷)纯化所述的粗制品，从而得到白色的固体产物(153.9mg，48％，2个步骤)，将其用于反应而不进行进一步的鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露吡喃糖苷(117)
在雅琪气氛下将三氯乙酸亚胺酸酯116(153.9mg，71.1μmol)、胆甾烷醇(3当量，83mg)和分子筛加入到无水DCM中。在慢慢地加入TMSOTf(1.1当量，200uL DCM中的17.4μL)之前，在0℃下搅拌该溶液15分钟。在0℃下搅拌该溶液90分钟。加入三乙胺(20μL)并蒸发掉溶剂。用柱层析(SiO2：己烷至40％乙酸乙酯/己烷；用甲苯载样)纯化该粗制产物，从而得到71.4mg的白色固体产物(42％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.00-6.94(m，65H，Ar)，5.94(dd，1H，J3，2＝9.7，J3，4＝9.7，H-3IV)，5.76(dd，1H，J3，2＝10.0，J3，4＝7.9，H-3III)，5.68(dd，1H，J3，2＝3.3，J3，4＝10.0，H-3I)，5.59(d，1H，J1，2＝3.8，H-1IV)，5.57-5.49(m，3H，H-3II，H-4IV，H-4I)，5.42(d，1H，J1，2＝3.8，H-1III)，5.35(dd，1H，J2，1＝1.8，J2，3＝3.3，H-2I)，5.16(dd，1H，J2，1＝7.4，J2，3＝9.5，H-2II)，5.12(dd，1H，J2，1＝3.8，J2，3＝10.5，H-2IV)，4.93(dd，1H，J2，1＝3.8，J2，3＝10.0，H-2III)，4.76(dd，1H，H-6III)，4.73(d，1H，J1，2＝1.8，H-1I)，4.71(d，1H，J1，2＝7.7，H-1II)，4.53(dd，1H，H-6II)，4.48-4.41(m，2H，H-6II，H-6III)，4.32-4.16(m，6H，H-5IV，H-5II，H-5I，H-4II，H-4III，H-6IV)，4.11-4.03(m，2H，H-6I，H-6IV)，3.88(ddd，1H，H-5III)，3.60(dd，1H，H-6I)，3.23(m，1H，CHO)，1.87-0.38(m，31H)，0.77(d，3H，J＝6.4，CH3)，0.74(d，3H，J＝1.3，CH3)，0.72(d，3H，J＝1.5，CH3)，0.61(s，3H，CH3)，0.51(s，3H，CH3).
3′-胆甾烷基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-甘露吡喃糖苷(118)
将糖苷117(80mg)溶解于甲醇/THF 1∶1中。加入NaOMe(200μL的11M溶液)并在室温下搅拌该溶液一整夜。用酸性树脂中和该混合物，过滤溶液，蒸发掉溶剂，从而得到白色固体产物，将该产物与乙酸乙酯一起磨碎，并轻轻地倒出溶剂(x3)。在真空下干燥该固体，从而得到定量的白色固体产物，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-2，3，4-三-O-磺基-α-D-甘露吡喃糖苷，十三钠盐(119)
将多元醇118(72.8mg，70.2μmol)溶解于DMF(0.02M，3.5mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，2.7mmol，436mg)，并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃，用5M NaOH(2.1当量/SO3.吡啶，1.15mL)将其中和。将该混合物用水转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，用水(5L，每12小时更换水)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)24小时。冻干该溶液，在制备C18 RP-HPLC系统(水中5％至95％乙腈，大于20分钟)上对其进行纯化前将其加入到水中。在HPLC纯化后，用CE测定收集的每个部分的纯度。合并纯度超过90％的部分，并将其冻干，从而得到白色固体产物(25mg，15％)。1H NMR(300MHz，D2O)δ：5.70(d，1H，J1，2＝3.5，H-1)，5.55(d，1H，H-1)，5.36(m，2H，H2xH-1)，5.03-4.05(m，24H)，3.88(m，1H，CHO)，2.00-0.70(m，31H)，0.94(d，3H，J＝6.4，CH3)，0.89(d，3H，J＝1.3，CH3)，0.86(s，3H，CH3)，0.86(d，3H，J＝1.3，CH3)，0.70(s，3H，CH3).
实施例26.3-叠氮基丙基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(120)
将三氯乙酸亚胺酸酯114(2g，1.3mmol)、3-叠氮基丙醇(2当量，260mg)和分子筛加入到DCM(10mL)中，并将其冷却至0℃。逐滴地加入TMSOTf(1.1当量，318mg，260μL)(逐滴地，每30分钟一次1/3，在2.6mL DCM中)。在用三乙胺(300μL)将其中和前，在0℃下搅拌该溶液90分钟，过滤，用水洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发掉溶剂，从而得到粗制品。通过柱层析(SiO2：甲苯至5％乙酸乙酯/甲苯，用甲苯装载)将其纯化，从而得到2.06g的澄清的油状产物120(97％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.18(m，2H，Ar)，8.04(m，2H，Ar)，7.95(m，2H，Ar)，7.87(m，2H，Ar)，7.84(m，2H，Ar)，7.74-7.70(m，4H，Ar)，7.61-7.10(m，36H，Ar)，6.09(t，1H，J3，2＝10.2，J3，4＝10.2，H-3III)，5.92(dd，1H，J3，2＝9.9，J3，4＝8.2，H-3II)，5.75(d，1H，J1，2＝3.8，H-1III)，5.70-5.64(m，2H，H-3I，H-4III)，5.60(d，1H，J1，2＝4.1，H-1II)，5.30-5.23(m，2H，H-2III，H-2I)，5.08(dd，1H，J2，1＝3.8，J2，3＝9.9，H-2II)，4.99(dd，1H，H-6I)，4.75-4.59(m，3H，H2xH-6II，H-6I)，4.74(d，1H，J1，2＝7.5，H-1I)，4.48-4.36(m，5H，H-5III，H-5II，H-4I，H-4II，H-6III)，4.23(dd，1H，H-6III)，4.05(ddd，1H，H-5I)，3.92(m，1H，CH2O)，3.57(m，1H，CH2O)，3.19(m，2H，CH2N3)，1.74(m，2H，CH2).
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(121)
将糖苷120(2g，1.23mmol)溶解于THF(10mL)中。加入三苯膦(3当量，966mg)并氩气气氛，室温下搅拌该混合物1小时。加入水(30当量，665μL)并在50℃下搅拌该溶液4.5小时。蒸发掉溶剂，将该粗制的胺加入到DCM中。加入硬酯酰氯(3当量，1.18g，1.25mL)，接着加入三乙胺(3.1当量，386mg，532μL)，室温下搅拌该溶液一整夜。蒸发掉溶剂，通过柱层析(SiO2：甲苯至8∶1甲苯∶乙酸乙酯，甲苯载样)纯化该粗制品，从而得到1.65g的澄清的油状产物121(72％，2步)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.16(m，2H，Ar)，8.05(m，2H，Ar)，7.95(m，2H，Ar)，7.86(m，2H，Ar)，7.82(m，2H，Ar)，7.74-7.70(m，4H，Ar)，7.63-7.10(m，36H，Ar)，6.10(t，1H，J3，2＝10.2，J3，4＝10.2，H-3III)，5.98-5.91(m，2H，H-3II，NH)，5.76(d，1H，J1，2＝4.1，H-1III)，5.73-5.65(m，2H，H-3I，H-4III)，5.61(d，1H，J1，2＝4.1，H-1II)，5.29-5.20(m，2H，H-2III，H-2I)，5.11-5.05(m，2H，H-2II，H-6I)，4.79(dd，1H，H-6II)，4.71(d，1H，J1，2＝7.5，H-1I)，4.68-4.61(m，2H，H-6II，H-6I)，4.49-4.38(m，5H，H-5III，H-5II，H-4I，H-4II，H-6III)，4.23(dd，1H，H-6III)，4.04(ddd，1H，H-5I)，3.92(m，1H，CH2O)，3.57(m，1H，CH2O)，3.27(m，1H，CH2N)，3.13(m，1H，CH2N)，2.11(t，2H，CH2CO)，1.72(m，2H，CH2)，1.56(m，2H，CH2)，1.30-1.24(m，28H，14xCH2)，0.88(t，3H，CH3).
3-硬酯酰胺丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(122)
将糖苷121(1.61g，861μmol)溶解于甲醇/THF 1∶1(40mL)中。加入NaOMe(1mL of a 6M溶液)并在室温下搅拌该溶液48小时。在蒸发溶剂前，用酸性树脂中和该混合物，过滤溶液，从而得到白色固体产物，将其与乙酸乙酯一起进行研磨并轻轻地倒出溶剂(x3)。在真空下干燥该固体，从而得到651mg的白色固体产物(91％)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，十钠盐(123)
将多元醇122(200mg，242μmol)溶解于DMF(0.02M，12.1mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，7.26mmol，1.16g)并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃并用5M NaOH(3当量/SO3.吡啶，4.4mL)将其中和。在-20℃下冷却该混合物一小时。轻轻地倒出上清液并弃去。用水将沉淀物转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，用水(5L，含有1mL 1.7M NH4HCO3)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)72小时。冻干该溶液，从而得到黄色固体产物(177mg，40％)。1H NMR(D2O，400MHz)δ5.69(d，1H，J1，2＝3.4，H-1)，5.59(d，1H，J1， 2＝2.7，H-1)，4.99-4.92(m，2H)，4.85-4.08(m，17H)，4.01(ddd，1H，CH2O)，3.75(ddd，1H，CH2O)，3.32(t，2H，J＝6.7，CH2N)，2.27(t，2H，CH2CO)，1.87(m，2H，CH2)，1.61(m，2H，CH2)，1.37-1.29(m，28H，CH2)，0.91(t，3H，CH3)。
实施例27.2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酸亚胺酸酯(124)
在0℃下将麦芽四糖全苯甲酸酯66(12.4g)溶解于吡啶(47mL)中。加入二甲胺(5.6M，在乙醇中)(28.3mL)并在室温下搅拌该溶液2小时。将该溶液倒入0.5M冰HCl中，过滤产生的沉淀物，并在干燥前用水洗涤。用柱层析(SiO2：5-70％乙酸乙酯/己烷)纯化该粗制品，从而得到6.7g的纯的半缩醛，将其与分子筛和碳酸钾(6.6g)一起加入到无水DCM中。在加入三氯乙腈(4.4mL)前，在0℃下搅拌该混合。将该混合物升至室温，并搅拌2小时。过滤该溶液，蒸发溶剂。将该粗制品(7.2g，57％)用于反应而不进行进一步纯化或鉴定。
3-叠氮基丙基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(125)
将三氯乙酸亚胺酸酯124(1.476g，0.682mmol)、3-叠氮基丙醇(2当量，137mg)和分子筛加入到DCM(10mL)中，并将其冷却至0℃。逐滴地加入TMSOTf(0.5当量，850μL DCM中的62μL)。在用三乙胺(300μL)将其中和前，在0℃下搅拌该溶液90分钟，过滤，用水洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发掉溶剂，从而得到粗制品。通过柱层析(SiO2：甲苯至24∶3甲苯∶乙酸乙酯，用甲苯载样)纯化该粗制品，从而得到660mg的白色固体产物(46％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.25-7.05(m，35H，Ar)，6.12(dd，1H，J3，2＝9.9，J3，4＝9.9，H-3IV)，6.00(dd，1H，H-3)，5.87(dd，1H，H-3)，5.76(d，1H，J1，2＝3.7，H-1IV)，5.71-5.64(m，3H，H-1，H-3I，H-4IV)，5.60(d，1H，J1，2＝3.7，H-1)，5.29-5.23(m，2H，H-2I，H-2IV)，5.14-5.05(m，2H，2xH-2)，5.01(dd，1H，H-6)，4.85(dd，1H，H-6)，4.76-4.69(m，2H，2xH-6)，4.75(d，1H，J1，2＝7.5，H-1I)，4.59(m，2H，2xH-6)，4.47-4.33(m，7H，3xH-4，3xH-5，H-6)，4.19(dd，1H，H-6)，4.05(ddd，1H，H-5I)，3.91(m，1H，CH2O)，3.57(m，1H，CH2O)，3.19(m，2H，CH2N)，1.74(m，2H，CH2).
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(126)
将糖苷125(660mg，0.314mmol)溶解于ACN(21mL)中。加入三苯膦(3当量，247mg)并在室温下，氩气气氛下搅拌该混合物1小时。加入水(30当量，169μL)并在50℃下搅拌该溶液7小时。蒸发溶剂并将粗制的胺加入到DCM中。加入硬酯酰氯(3当量，317μL)，接着加入三乙胺(3当量，131μL)，并在室温下搅拌该溶液3天。蒸发溶剂，通过柱层析(SiO2：甲苯至15∶3甲苯∶乙酸乙酯，用甲苯载样)纯化该粗制品，从而得到403mg的澄清的油状产物(55％，2steps)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.21-7.05(m，35H，Ar)，6.09(dd，1H，J3，2＝9.8，J3，4＝9.8，H-3IV)，6.02(t，1H，NH)，5.97(dd，1H，H-3)，5.90(dd，1H，H-6)，5.86(dd，1H，H-3)，5.75(d，1H，J1，2＝3.9，H-1IV)，5.71-5.63(m，3H，H-1，H-3I，H-4IV)，5.59(d，1H，J1，2＝3.9，H-1)，5.27-5.18(m，2H，H-2I，H-2IV)，5.12-5.04(m，3H，H-6I，2xH-2)，4.72-4.66(m，2H，2xH-6)，4.70(d，1H，J1，2＝7.8，H-1I)，4.58(m，2H，H2xH-6)，4.45-4.31(m，6H，3xH-4，3xH-5，H-6)，4.17(dd，1H，H-6)，4.02(ddd，1H，H-5I)，3.91(m，1H，CH2O)，3.56(m，1H，CH2O)，3.28(m，1H，CH2N)，3.13(m，1H，CH2N)，2.13(m，2H，CH2CO)，1.76-1.58(m，4H，CH2)，1.26-1.24(m，28H，CH2)，0.88(t，3H，CH3).
3-硬酯酰胺丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(127)
将糖苷126(377mg，161μmol)溶解于甲醇/THF 1∶1(10mL)中。加入NaOMe(60μL，11M溶液)并在室温下搅拌该溶液24小时。在蒸发溶剂前，用酸性树脂中和该混合物，过滤溶液，从而得到白色固体产物，将其与乙酸乙酯一起进行研磨并轻轻地倒出溶剂(x3)。在真空下干燥该固体，从而得到159mg的白色固体产物(定量的)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，十三钠盐(128)
将多元醇127(159mg，161μmol)溶解于DMF(0.02M，8.1mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，6.3mmol，1.0g)并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃，用5M NaOH(3当量/SO3.吡啶，3.8mL)将其中和。将该混合物冷却至-20℃一小时。轻轻地倒出上清液并弃去。用水将沉淀物转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，用水(5L，含有1mL 1.7M NH4HCO3)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)72小时。冻干该溶液，从而得到黄色固体产物(227mg，61％)。1H NMR(D2O，400MHz)δ5.89(d，1H，J1，2＝3.4，H-1)，5.72(d，1H，J1，2＝2.7，H-1)，5.67(d，1H，H-1)，5.06-4.09(m，18H)，4.01(ddd，1H，CH2O)，3.75(ddd，1H，CH2O)，3.33(t，2H，J＝6.1，CH2N)，2.28(t，2H，J＝7.4，CH2CO)，1.87(m，2H，CH2)，1.62(m，2H，CH2)，1.37-1.29(m，28H，CH2)，0.91(t，3H，CH3).
实施例28.叔-丁基2-(胆甾-3-基氧)醋酸酯(129)
将胆甾烷醇(0.662g，1.703mmol)溶解于甲苯(13mL)中。在一部分中加入叔丁醇钾(573mg，5.11mmol)。室温下搅拌该混合物3小时。逐滴地加入叔-丁基溴乙酸乙酯(503μL，3.406mmol)并在室温搅拌该混合物一整夜。加入甲苯(20mL)，用盐水冲洗(50mL)该溶液。在合并有机相之前，用甲苯(30mL)萃取水相，干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂。用柱层析(SiO2；己烷∶乙酸乙酯，200∶1至200∶20)纯化该粗制品，从而得到白色固体产物(0.65g，76％得率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.98(s，2H，CH2O)，3.30(m，1H，CHO)，1.97-0.56(m，31H)，1.46(s，9H，CH3)，0.89(d，3H，J＝6.1，CH3)，0.85(d，3H，J＝2.0，CH3)，0.84(d，3H，J＝1.4，CH3)，0.79(s，3H，CH3)，0.64(s，3H，CH3).
2-(胆甾-3-基氧)醋酸(130)
在加入TFA(1mL)前，将叔丁基2-(胆甾-3-基氧)醋酸酯129(634mg，1.26mmol)加入到DCM(4mL)中。室温下搅拌该溶液90分钟。蒸发掉溶剂，用一个短的硅胶柱(SiO2：DCM至100∶5 DCM∶甲醇)纯化残留物，然后从己烷中重结晶，从而得到439mg的白色固体产物(78％)。1H nmr(400MHz，CDCl3)δ：4.25(s，2H，CH2O)，3.37(m，1H，CHO)，1.99-0.58(m，31H)，0.89(d，3H，J＝6.6，CH3)，0.85(d，3H，J＝2.0，CH3)，0.84(d，3H，J＝1.4，CH3)，0.80(s，3H，CH3)，0.64(s，3H，CH3)。
2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基异硫氰酸酯(131)
将溴化物84(1.8g，1.12mmol)、KSCN(3当量，326mg)、分子筛和Bu4NI(cat.)加入到无水乙腈中，并在75℃下搅拌一整夜。蒸发溶剂，将残留物加入到DCM中，在干燥(Na2SO4)和蒸发溶剂前，用NaHCO3(饱和的)对其进行洗涤。用柱层析(SiO2：己烷至35％乙酸乙酯/己烷，用甲苯载样)纯化该粗制品，从而得到1.15g的白色固体产物(65％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.23-7.12(m，50H，Ar)，6.16(dd，1H，J3，2＝9.6，J3，4＝9.6，H-3III)，5.96(dd，1H，J3，2＝9.6，J3，4＝8.2，H-3II)，5.81(d，1H，J1，2＝4.1，H-1III)，5.75-5.68(m，2H，H-3I，H-4III)，5.65(d，1H，J1，2＝4.1，H-1II)，5.40(dd，1H，J2，1＝8.2，J2，3＝8.2，H-2I)，5.32(dd，1H，J2，1＝4.1，J2，3＝10.2，H-2III)，5.28(d，1H，J1，2＝8.2，H-1I)，5.13(dd，1H，J2，1＝4.1，J2，3＝10.2，H-2II)，5.00(dd，1H，H-6I)，4.77(dd，1H，H-6II)，4.72-4.65(m，2H，H-6I，H-6II)，4.53-4.41(m，5H，H-5II，H-5III，H-4I，H-4II，H-6III)，4.30(dd，1H，H-6III)，4.13(ddd，1H，H-5I)。
2-(胆甾-3-基氧)乙酰胺基2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(132)
将异硫氰酸酯131(0.5g，315μmol)和2-(胆甾(cholestan)-3-基氧)醋酸130(141mg，315μmol)溶解于甲苯(6.3mL)中。加入三乙胺(20μL)，在室温下搅拌该溶液4天。蒸发溶剂，通过柱层析(SiO2：甲苯至10％乙酸乙酯/甲苯)纯化残留物，从而得到358mg的白色固体产物(58％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.23-7.09(m，50H，Ar)，7.50(d，1H，NH)，6.09(dd，1H，J3，2＝10.2，J3，4＝9.9，H-3III)，5.91(dd，1H，J3，2＝9.9，J3，4＝7.8，H-3II)，5.82(dd，1H，J3，2＝9.5，J3，4＝9.2，H-3I)，5.74(d，1H，J1，2＝4.1，H-1III)，5.67(dd，1H，J4，3＝9.9，J4，5＝9.9，H-4III)，5.60(d，1H，J1，2＝4.1，H-1II)，5.51(dd，1H，J1，2＝9.5，J1，NH＝8.5，H-1I)，5.27(dd，1H，J2，1＝4.1，J2，3＝10.6，H-2III)，5.24(dd，1H，J2，1＝9.5，J2，3＝9.5，H-2I)，5.08(dd，1H，J2，1＝4.1，J2，3＝10.2，H-2II)，4.92(dd，1H，H-6)，4.70-4.64(m，2H，H2xH-6)，4.56(dd，1H，H-6)，4.46-4.31(m，5H，H-5III，H-4I，H-4II，2xH-6)，4.22(ddd，1H，H-5II)，4.15(ddd，1H，H-5I)，3.95(dd，1H，CH2O)，3.73(dd，1H，CH2O)，3.11(m，1H，CHO)，1.47-0.50(31H)，0.90(d，3H，J＝6.8，CH3)，0.86(d，3H，J＝6.8，CH3)，0.86(d，3H，J＝6.8，CH3)，0.77(s，3H，CH3)，0.64(s，3H，CH3).
2-(胆甾-3-基氧)乙酰胺基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(133)
将酰胺132(345mg，175μmol)溶解于甲醇/THF 1∶1(16mL)中。加入NaOMe(500μL，6M溶液)并在室温下搅拌该溶液24小时。在蒸发溶剂前，用酸性树脂中和该混合物并过滤该溶液，从而得到白色固体产物，将其与乙酸乙酯一起进行研磨并轻轻地倒出溶剂(x3)。在真空下干燥该固体从而得到124mg的白色固体产物(76％)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
2-(胆甾-3-基氧)乙酰胺基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，十钠盐(134)
将多元醇133(118mg，127μmol)溶解于DMF(0.04M，4.4mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，5.3mmol，838mg)并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃并用5M NaOH(3当量/SO3.吡啶)将其中和。在-20℃冷却该混合物1小时。轻轻地倒出上清液并弃去。用水将沉淀物转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，用水(5L，含有1mL1.7M NH4HCO3)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)72小时。冻干该溶液从而得到黄色固体产物(195mg，79％)。1H NMR(D2O，400MHz)δ5.67(d，1H，J1，2＝2.9，H-1)，5.57(d，1H，J1，2＝1.2，H-1)，5.35(d，1H，J1，2＝7.3，H-1I)，5.06-4.06(m，20H)，3.48(m，1H，CHO)，2.07-0.68(m，46H).
实施例29.3-(胆甾-3-基氧)丙腈(135)
将胆甾烷醇(1.554g，3.998mmol)溶解于DCM(6mL)中。向该溶液中加入KOH(水中40％w/w，1.2mL)和丙烯腈(0.8mL)，接着加入18-crown-6(104mg)。室温下搅拌该混合物一整夜。在蒸发溶剂前，用盐水冲洗有机层并干燥(Na2SO4)。从热甲醇中重结晶。残留物从而得到纯的无色结晶固体产物(1.42g，80％得率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.68(t，2H，CH2O)，3.29(m，1H，CHO)，2.57(t，2H，CH2CN)，1.98-0.58(m，31H)，0.89(d，3H，J＝6.6，CH3)，0.87(d，3H，J＝1.8，CH3)，0.85(d，3H，J＝2.0，CH3)，0.79(s，3H，CH3)，0.64(s，3H，CH3)。
1-氨基-3-(胆甾-3-基氧)-丙烷(136)
将3-(胆甾-3-基氧)丙腈135(442mg，1mmol)加入到甲苯(1mL)、氯仿(1.5mL)、乙醇(1mL)和浓HCl(200μL)的混合物中。加入氧化铂水合物(46mg)。在室温，氢气气氛(80psi)下搅拌该混合物48小时。蒸发溶剂并将残留物与DCM(40mL)和NaHCO3(饱和的)(40mL)混合。分离有机相，并在将其干燥(Na2SO4)前用NaHCO3(饱和的)(30mL)，接着用，盐水(20mL)对其进行洗涤，蒸发溶剂，从而得到白色泡沫状产物，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
1-[(胆甾-3-基氧)丙基]-3-[2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷]硫脲(137)
将3-(胆甾-3-基氧)丙烷-1-胺136(0.5mmol)加入到甲苯(3mL)中。加入异硫氰酸酯131(403mg，0.254mmol)。在室温下搅拌该溶液3天。蒸发溶剂，并用柱层析(SiO2；甲苯至180∶30甲苯∶乙酸乙酯)纯化该粗制品，从而得到纯的白色固体产物(355mg，35％)。1H nmr(400MHz，CDCl3)δ：8.23-7.09(m，50H，Ar)，6.90(dd，1H，J＝4.9，J＝4.9，NH)，6.09(dd，1H，J3，2＝10.2，J3，4＝9.8，H-3III)，5.89(m，2H，H-3II，H-3I)，5.74(d，1H，J1，2＝3.9，H-1III)，5.67(dd，1H，J4，3＝9.8，J4，5＝9.8，H-4III)，5.58(d，1H，J1，2＝3.9，H-1II)，5.28(dd，1H，J2，1＝3.9，J2，3＝10.7，H-2III)，5.19(dd，1H，J2，1＝9.3，J2，3＝9.3，H-2I)，5.09(dd，1H，J2，1＝3.9，J2，3＝10.2，H-2II)，4.92(dd，1H，H-6)，4.70(dd，1H，H-6)，4.67(dd，1H，H-6)，4.58(dd，1H，H-6)，4.46-4.34(m，5H)，4.27-4.18(m，2H)，3.50(dd，2H，CH2)，3.18(m，1H，CHO)，1.98-0.56(35H)，0.90(d，3H，J＝6.8，CH3)，0.87(d，3H，J＝6.8，CH3)，0.86(d，3H，J＝6.8，CH3)，0.80(s，3H，CH3)，0.64(s，3H，CH3)。
1-[(胆甾-3-基氧)丙基]-3-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷]硫脲(138)
将硫脲137(345mg，171μmol)溶解于甲醇/THF 1∶1(16mL)中。加入NaOMe(500μL 6M溶液)并在室温下搅拌该溶液24小时。在蒸发掉溶剂前，用酸性树脂中和该混合物并过滤该溶液，从而得到白色固体产物，将其与乙酸乙酯一起进行研磨并轻轻地倒出溶剂(x3)。在真空下干燥该固体从而得到169mg的白色固体产物(定量的)，将其用于反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
1-[(胆甾-3-基氧)丙基]-3-[2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷]硫脲，十钠盐(139)
将多元醇138(169mg，171μmol)溶解于DMF(0.04M，4.4mL)中。加入SO3.吡啶(3当量/OH，5.13mmol，816mg)并在60℃下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃并用5M NaOH(3当量/SO3.吡啶)将其中和。将该混合物冷却至-20℃1小时。轻轻地倒出上清液并弃去。用水将沉淀物转移到一个大的圆底烧瓶中，蒸发，用水(5L，含有1mL1.7M NH4HCO3)交换透析(2000MWCO盒，Pierce)72小时。在用制备C18 RP-HPLC系统(水中5％至95％乙腈大于20分钟)对其进行纯化前，冻干该溶液，将其加入到水中。在HPLC纯化后，用CE测定收集的每个部分的纯度。合并纯度超过90％的部分，并将其冻干，从而得到白色固体状产物(7mg，2％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ：6.00-5.56(m，3H，3xH-1)，4.98-3.14(m，21H)，2.04-0.72(m，50H).
实施例30.3′-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-((1-吡啶-1-基)-2，3，5，6-四-O-磺基-D-葡萄糖苷，十三钠盐(140)
将多元醇64(3.552)溶解于无水DMF(46mL)中，加入刚刚洗涤和干燥过的SO3.吡啶复合物(21.24g)，并在60℃下搅拌该混合物16小时。将反应混合物冷却至0℃10分钟，然后在0℃下在一部分中通过加入冰冷的NaOH水溶液(5M，54mL)将其中和(达到pH 12)。在0℃搅拌该混悬液15分钟，用水(10mL)将其稀释，并在40℃下真空浓缩。得到一种浅黄色粉末，将该粉末溶解于水中(10mL)得到pH11.5的溶液。通过加入NaOH水溶液(5M，5滴)将该溶液的pH调到12.5，用4x Slide-A-Lyzer
Figure GPA00001139318900851
盒(2000MWCO，4-12mL)，在室温下用水(4L)交换透析16小时。继续在0℃用水(4L)交换透析3天，其中每24小时候更换水，和向水中加入NH4HCO3水溶液(3M，0.6mL)以将pH调到～6.0-6.5。然后冷冻干燥已脱盐的溶液从而得到主要为65和140的混合物，在制备C18 RP-HPLC系统上(水中5％至30％的乙腈大于20分钟)对其进行纯化。在HPLC纯化后，用CE测定收集的每个部分的纯度。合并纯度超过90％的部分，并将其冻干，从而得到白色固体状产物(30mg，从约1g的粗制原料中纯化得到)。1H NMR(400MHz，D2O)δ：9.09(m，2H，Ar)，8.39(m，1H，Ar)，7.93(m，2H，Ar)，6.40(d，1H，H-1I)，5.56(d，1H，J1，2＝3.4，H-1II)，5.54(d，1H，J1，2＝2.3，H-1III)，5.45(d，1H，J1，2＝3.3，H-1IV)，5.00(ddd，1H，H-5I)，4.86(dd，1H，H-3II)，4.79(dd，1H，H-3III)，4.77(dd，1H，H-2I)，4.77(dd，1H，H-4I)，4.64(dd，1H，H-2III)，4.58(dd，1H，H-3IV)，4.49(dd，1H，H-3I)，4.40(m，1H，H-6I)，4.32(m，1H，H-6I)，4.31(dd，1H，H-4IV)，4.29(dd，1H，H-2II)，4.29(dd，1H，H-2IV)，4.20-4.10(m，6H，H6xH-6)，4.13(ddd，1H，H-5II)，4.12(dd，1H，H-4II)，4.10(dd，1H，H-4III)，4.07(ddd，1H，H-5III)，3.81(ddd，1H，H-5IV)，2.00-0.67(m，31H)，0.93(d，3H，CH3)，0.87(d，3H，CH3)，0.86(d，3H，CH3)，0.83(s，3H，CH3)，0.68(s，3H，CH3)。
实施例31.8-十五烷基(Pentadecanyl)2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖苷(141)
向D-葡萄糖全醋酸酯(250mg，640μmol)的DCE(1mL)溶液中加入8-十五烷醇(220mg，960μmol)。在将混合物倒在短硅胶柱上和用乙酸乙酯洗脱之前，加入BF3.O(Et)2(134μL，1.1mmol)并在室温下搅拌该混合物一整夜。蒸发掉溶剂，然后通过柱层析(SiO2，用DCM载样，用DCM(100mL)，然后20％乙酸乙酯/己烷至35％乙酸乙酯/己烷洗脱)纯化粗制的原料，从而得到白色固体状糖苷141(179mg，50％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：5.19(dd，1H，J2，3＝9.5，J3，4＝0.0，H-3)，5.06(dd，1H，J4，5＝9.7，H-4)，4.96(dd，1H，J1，2＝8.0，J2，3＝9.6，H-2)，4.52(d，1H，H-1)，4.21(dd，1H，J5，6b＝5.2，J6a，6b＝12.1，H-6b)，4.12(dd，1H，J5，6a＝2.6，H-6a)，3.66(ddd，1H，J4，5＝10.0，H-5)，3.53(m，1H，CH2CHOCH2)，2.07(s，3H，OCOCH3)，2.02(s，6H，OCOCH3)，2.00(s，3H，OCOCH3)，1.60-1.20(m，～24H，CH2)，0.88(t，3H，J＝7.0，CH3)，0.87(t，3H，J＝7.0，CH3).
8-十五烷基D-吡喃葡萄糖苷(142)
按照常规方法将糖苷141(70mg)脱去乙酰基，从而得到白色固体状多元醇142(50mg，定量的)，将其进行反应而不进行进一步的纯化或鉴定。
8-十五烷基2，3，4，6-四-O-磺基-D-吡喃葡萄糖苷，四钠盐(143)
将多元醇142(50mg)溶解于DMF(5mL)中。加入SO3.吡啶(250mg)并在室温下搅拌该溶液一整夜。将该溶液冷却至0℃，并用2M NaOH将其中和达到pH 10。蒸发溶液至干。将残留物溶解于4mL的水中，用Bio-Gel P-2柱层析(用0.1M NH4HCO3，以196mL/h速度洗脱，每次收集6分钟)对其进行纯化。用MBT和CE来鉴定产物级分。冷冻干燥生产得到浅黄色粉末状产物143(33mg，32％)。1H NMR(400MHz，D2O)δ：4.79(d，1H，J1，2＝5.3，H-1)，4.67(br，1H)，4.45(br，1H，H-2)，4.28(m，2H)，4.28(m，2H)，3.68(s，1H)，1.52-1.38(m，4H)，1.32-1.10(m，～24H)，0.76-0.71(m，6H).
化合物的生物试验
生长因子结合试验
使用基于表面等离激元(SPR)的溶液亲合力试验9来测量化合物对于生长因子FGF-1、FGF-2和VEGF的结合亲合力。通过固定包被着抗生蛋白链菌素的传感器芯片上的生物素化的BSA-肝素，或通过使用己二酸二酰肼或1，4-二氨基丁烷进行醛耦合来制备用于该试验的包被着肝素的传感器芯片9。就每个Kd的测量而言，溶液被制备为在缓冲液中含有固定浓度的蛋白和变化浓度的所述配体。在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3.0mM EDTA和0.005％(v/v)聚山梨醇酯20)中测量结合于FGF-1和VEGF的配体，而在含有0.3MNaCl的HBS-EP缓冲液中测量结合于FGF-2的配体。在注射前，将样品保持在4℃下从而使蛋白的稳定最大化。对于每个试验混合物而言，以5-40μL/分钟注射50-200μL溶液并测定相对的结合响应。所有的表面结合试验都在25℃进行。通过以40μL/分钟注射40μL的4M NaCl，接着以40μL/分钟注射40μL的缓冲液来使表面再生。
使用BIA评价软件(BIAcore)和如前面所述的测定的Kd值来分析传感器克(Sensorgram)数据9。其中测定一式两份的Kd值，该值表示的是两份测量结果的平均值。其结果如表1所示。
类肝素酶抑制试验
通过测定磺达肝素底物的裂解可以检测类肝素酶的酶活性39，40。可以通过将其与单四唑盐WST-1(Auspep Pty Ltd，墨尔本，澳大利亚)反应从而产生蓝色(可以在584nm用微板读板器进行测定)来检测新生成的还原二糖。在存在抑制剂的情况下，类肝素酶的催化活性降低，产生的二糖数量和溶液的光密度都会减少。抑制剂的抑制百分数和IC50是通过在抑制剂浓度范围测定光密度(OD)来测定的。
在pH 5.0的40mM醋酸钠缓冲液中，按照下述方法进行该试验。在预先涂上BSA的96孔板(Costar EIz/RIA，Corning)中混合最终的体积为100μL的磺达肝素(100μM)和各种浓度的抑制剂以及缓冲液。然后加入纯化的重组人类肝素酶(2.55nM)以启动该试验。在37℃孵育该板24小时，通过加入WST-1溶液(100μL)来终止该试验。在60℃孵育该板60分钟而产生蓝色。在584nm用微板读板器(Fluostar)测定OD，用作为还原糖标准的D-半乳糖绘制的标准曲线来定量。评价各个化合物的IC50值并用以下表达式将其转换成Ki(抑制常数)
测定磺达肝素的Km(导致半最大速度的底物浓度)为33±6μM。该结果如表1所示。
生长因子诱导的内皮细胞增殖试验
内皮细胞培养
按照基本上如Lonza.所述的标准细胞培养协议养护和传代培养HUVEC细胞。简单地说，在Lonza内皮生长培养基(EGM)中与推荐的补充物和生长因子(VEGF、FGF2、EFG、IGF、氢化可的松、胎牛血清(FBS)、抗坏血酸、肝素以及庆大霉素)一起养护细胞。当其达到70-80％汇聚时，通过胰蛋白酶化和在新培养瓶中的新鲜生长培养基中以2500至5000细胞/cm2容器表面积进行再播来传代培养细胞。用血球计数器进行细胞计数，用锥虫蓝使活细胞显影。
使用仅含2％FBS和庆大霉素的EGM来制备用于增殖研究的培养基。在随后的研究中，完全EGM被用于VEGF组以试图增加VEGF-刺激组的增殖指数。就管腔生成试验(tube formation assay)而言，使用仅省略了肝素的完全培养基。从粉末原料中称出研究中的化合物，并在PBS中稀释成为10mM的原液，并将其储存于-80℃条件下。就试验而言，接着在EBM-2培养基(用2％FBS和庆大霉素增补)中稀释化合物以达到各种所需的使用浓度。
增殖试验
使用各种浓度的生长因子VEGF、FGF-1或FGF-2在72小时的时间内诱导HUVEC增殖。在首个系列试验中，可通过检查细胞密度和由生长因子诱导最大增殖所需的生长因子浓度来进一步优化该试验。简单地说，以每孔1-3×103的浓度向各个孔中加100μL的细胞。然后以特定的浓度以50μL的体积加入生长因子和试验化合物从而得到最终的200μL体积。接着孵育70小时，在490nm读取吸收度以获得OD值之前的2小时，加入20μL的CellTitre 96
Figure GPA00001139318900891
Aqueous细胞增殖检测单溶液(Promega)。该数据列在表2中。
MatrigelTM微管形成试验
基本上按照如Malinda等人所述的方法进行管腔形成试验41，有一些改动。采集第四或第五次以70-80％汇聚传代的HUVEC，并以每mL4×105细胞的细胞密度，将其再次悬浮于含有除肝素外的所有生产商所示补充物的Lonza内皮生长培养基(EGM2)中。每组一式三份孔板，用等量体积的化合物处理200μL的细胞(4×105/mL)从而获得10、50或100μM的最终浓度(从而保证了每种情况可得1×300μL)。然后将100μL等分的细胞植入预先涂布了生长因子减少的MatrigelTM的96-孔板上(50μL 30分钟，接着另外30μL 1小时)并将其孵育18-22小时。通过相差显微镜检查检测管腔形成，用Olympus C5050数字式相机采集图像。通过记录图像中连接3或更多小管的节点总数来人工定量管腔形成抑制作用。以与对照组相比的抑制百分数来表示该结果，该结果列在表2中。未处理的HUVECs作为对照用于Matrigel中的正常细胞生长和管腔形成。
内皮细胞迁移试验
将BD BioCoat血管生成系统用作体外，定量的内皮细胞迁移试验平台。该系统由一个BD Falcon 24-Multiwell Insert Plate(和一个非-TC处理的24-孔接收器板和盖子)构成，其含有一种均匀涂布人类纤连蛋白的荧光阻断微孔性(孔径3.0μm)PET膜(BD FluoroBlok)。该纤连蛋白的浓度和涂布程序进行了最优化处理，从而不会使孔隙被堵塞。这使得内皮细胞可粘附在该膜上并向该孔板较低隔室中的血管生成刺激物上自由地迁移。不用进一步处理，用荧光读板仪(fluorescence plate reader)定量迁移细胞。在这种情况下，在迁移后这些细胞用荧光染料示踪。
简单地说，将2.5×105/mL浓度200μL的HUVHCs涂在试剂盒的24-孔板的各个孔的上隔室中。然后仅与作为未处理的对照组的培养基(EBM-2)一起以各种浓度(通常为10和/或50μg/mL)加入化合物。由于在我们的实验室中用FGF-2或VEGF刺激HUVEC的弱迁移表现，因此使用10％胎牛血清(FCS)，因为这同样会使与在不含FCS的培养基中培养的HUVEC相比，HUVEC迁移的增加超过6倍。因此，向下隔室加入含10％FCS的750μL培养基以发挥迁移刺激物的作用，在37℃/5％CO2条件下过夜孵育该孔板18小时。在孵育时间之后，将上板转移到一个新的24-孔底板上，并加入500μL钙黄绿素AM从而在37℃，将迁移的在多孔膜下的细胞染色90分钟。用具有分别为485nm和520nm激发和发射滤器的FLUOstar Optima(BMG实验室)来测定荧光。数据用与FCS-诱导的HUVEC相比的迁移抑制百分比来表示(表3)。
离体血管生成萌芽试验
通过用修改的如前文所述的方案来制备大鼠主动脉外植块42-45。在本模型中，大鼠的主动脉内皮暴露于一种立体的ECM-衍生蛋白(MatrigelTM)基质中，转变成一种微血管表型，产生微血管分支网络。通过解剖操作引起的损伤触发血管生成且不需要由外源性生长因子刺激。
简单地说，从2-至4-个月大的Sprague Dawley大鼠上切离胸主动脉并修除其剩余的脂肪和结缔组织。在每一个阶段都进行非常小心的护理以减少主动脉的物理损伤。将组织转移到含有2％FCS和除肝素以外的所有singlequotsTM(Cambrex)试剂的完全EBM-2培养基(Cambrex)中。同时，在冰上使MatrigelTM(BD Biosciences)冷却，并在成为液体形式之后，将180μL移入到48-孔组织培养皿(Nunc)中。在37℃孵育该培养皿30分钟以使MatrigelTM固化。
切下1mm环形截面来准备主动脉，然后将其平分。小心地将主动脉段置于每个孔中心MatrigelTM的顶部并在按照需要进行定位之后，另外60μL MatrigelTM被加到顶部，并将该培养皿重新放回到培养箱中20分钟。然后用1.0mL的不存在(对照组)或存在试验化合物的培养基补充每个孔，化合物浓度通常在1-50μM范围内，其取决于特定的化合物/试验。每48小时酌情补充培养物并在不同的时间点直到8-10天进行微血管评分。通过使用0-5的一种评分系统来测定微血管萌芽的范围，其中0＝无微血管至5＝如前所述的弥漫血管生成45。4×物镜与Olympus C-7070相机和对目镜转换接头为萌芽血管照相。
在某些情况下，为了确定本试验化合物的潜在毒性，通过在第6或7天撤消培养物中的化合物/培养基和加入含VEGF(通常10ng/mL)的完全培养基直到另外7天来评价组织活力。在没有毒性的情况下，作为对外源性生长因子的响应，有活力的组织应长出微血管萌芽。
使用如上所述的血管生成萌芽/微血管生成(大鼠主动脉)试验来对本发明化合物对血管生成的抑制作用进行分析。在不存在任何抑制剂的情况下(对照组)将大鼠主动脉组织埋植在MatrigelTM中产生了广泛的血管生成萌芽(如同评分5表示的弥漫血管生成)，如图1所示。
以10和50μM加入PI-88和PG524(一种较低亲脂性类似物)导致了强烈的抑制反应。然而，本发明化合物表现出了更强的抑制血管生成效力，其以10μM加入则抑制高达100％。该结果列在下面的表4中。
为了测定用上述化合物处理后主动脉组织活力，在第6天或第7天撤消这些化合物(取决于单个试验)，接着用VEGF进行处理直到另外7天。微血管芽的出现表明本发明化合物是通过抗血管生成机制而不是诱导组织毒性发挥其抑制作用的(下文图2)。
抗凝血作用
通过测定各种浓度化合物(在PBS中0-100μg/mL)对提高混合正常人血浆的活化部分凝血激酶时间(APTT)的影响，来测定试验化合物的抗凝血作用。使用生产商技术说明书所述的标准协议在STAGOSTA-紧凑型血凝分析器上测量APTT。用未分级的肝素(UFH)作为对照。混合正常人血浆的APTT正常范围为26-36秒。结果列于表5中，该结果表明该新化合物仅具有弱的抗凝血作用，该效力显著小于PI-88。
体内 小鼠黑色素瘤模型
B16黑素瘤是一种诱导同基因C57/BL6小鼠肿瘤的常用细胞系。其为一种非转移性，快速生长的，对大多数抗癌剂无应答的肿瘤。
在含有10％FCS、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、2-巯基乙醇(mercapoethanol)的完全DMEM培养基中培养B16F1细胞。采集细胞用于肿瘤接种，用胰蛋白酶/EDTA分裂B16F1细胞，用HBSS清洗，并以1500rpm离心5分钟。然后将细胞再悬浮于PBS中以保证以50μL的一个体积注射5×105个细胞。将该肿瘤种植在颈正后。肿瘤接种3天后，各个治疗组每天在不同部位和以50或100μL的一个注射体积中的不同浓度进行皮下注射。注射一直持续到第15天其提供了一个12天的治疗期。从开始注射时起每天对小鼠进行监测，并每目测定可触及的肿瘤。肿瘤的大小由平面尺寸确定，l×w，其中l＝最长尺寸和w＝最短尺寸。使用公式0.5×l×(w2)来估计肿瘤体积。数据以肿瘤生长的中值和肿瘤生长抑制百分数(％TGI)来表示。进行％TGI计算是为了校正试验间差别。
由于本文表明本发明化合物会抑制生成血管的萌芽形成，并且由于肿瘤的发展是血管生成-依赖性的，因此如上所述对这些化合物对原发肿瘤生长和总存活数的影响进行分析。图3提供了在B16黑素瘤模型中从本发明各种研究试验化合物观察到的典型的肿瘤体积中值的图解。
对直接比较的数据而言，图4所示结果表明荷瘤小鼠的肿瘤尺寸与相应的对照组相比相对减小并以称作肿瘤生长抑制百分数(％TGI)的参数来表示。使用公式TGI＝[1-(ΔT/ΔC)]x100来计算TGI值，其中ΔT和ΔC代表分别在样品化合物治疗组(T)和载体对照(C)组中治疗的最后一天与治疗的第一天间平均肿瘤质量的变化。
小鼠体内肺转移模型
当将如上所述为B16实体瘤小鼠黑色素瘤模型培养的B16F1细胞通过尾静脉被注射到小鼠上时，结果导致形成肺转移性瘤。由于该肿瘤细胞是黑色的，所以转移性结节观察很容易辨认。图5所示为对照组和化合物治疗的小鼠肺部，在形成肺部菌落(黑斑)方面有明显的可见差异。
在该转移模型中，B16细胞(2x105)是通过C57/BL6小鼠的尾静脉以50mL的体积在第0天被注射的。在第0天用试验化合物治疗开始，并持续12天。在试验的第12天计数肺转移灶的数量。图6中的结果表明所选化合物保持了由PI-88所显示出的肺转移的有效抑制作用。该数据是以观察到的肺转移性瘤与盐水对照组相比的百分数来表示的。
体内HT29结肠直肠癌异种移植模型
在RPMI1640细胞培养介质中培养HT-29人结肠直肠腺癌细胞(从日常储存VP-Stock 325起第4代)，该培养介质被补充以10％FBS和青霉素-链霉素(50IU/mL最终浓度)。通过胰蛋白酶化采集细胞，在HBSS中将其洗涤两次并计数。然后将该细胞悬浮于HBSS中，并调正最终体积至含有2x107细胞/mL。在向注射部位接种前，用酒精大面积擦拭背部右翼，针穿过皮肤进入到动物右肩正下部的皮下间隙，在那里释放出100μL的细胞(2x106个细胞)。治疗小鼠开始平均肿瘤体积为大约155mm3。。以两个维度测定肿瘤(长度和直径)并使用以下等式计算肿瘤体积：
V(mm3)＝长度x直径2xπ/6.
对溶剂对照组给予无菌的PBS，以10mL/kg的给药量，s.c.给药每日一次进行21天。每天即将给药前测定每只动物的体重。实际给予每只小鼠的给药体积是以体重为基础来计算和调整的。使用直肠结肠癌鼠类肿瘤模型的图7中的结果表明所选化合物具有抗癌活性。所有的化合物都显示出比PI-88增强的活性，PI-88在该模型中并不特别有效。
抗病毒活性
抗病毒试验的结果显示于表6-10中。
细胞和病毒
在补充以2％小牛血清、0.05％Primaton RL物质(Kraft Inc.，Norwich，USA)和抗生素的Eagle′s最低基础培养基(EMEM)中培养非洲绿猴肾(GMK AH1)细胞46。在补充以10％胎小牛血清和抗生素的Dulbecco′s修饰EMEM(DMEM)中培养人上皮癌(HEp-2)细胞。所用的HSV菌株为HSV-1 KOS321，野生株KOS病斑纯化的分离物47，HSV-1KOS gC-null变种gC-3948、以及HSV-2菌株33349的纯化噬斑。使用RSV菌株A-25051。按照Hallak等人的描述制备RSV原料51并将其储存于-70℃存在40％蔗糖52的条件下。
病毒纯化和病毒结合细胞试验
如前面所述通过三级不连续蔗糖梯度的离心分离将甲基-[3H]胸苷标记的胞外HSV病毒粒子进行纯化53，54。如前面所述分析试验化合物对4℃下纯化的甲基-[3H]胸苷标记的病毒与GMK AH1细胞结合的影响17。简单地说，用PBS-A(补充以1mM CaCl2和0.5mM MgCl2的PBS)清洗该细胞，然后用含有1％BSA的PBS-A在室温下将其阻断1小时。连续5倍稀释的PBS-A中的试验化合物与纯化的病毒粒子混合，并在4℃孵育15分钟。用PBS-A清洗该细胞一次，加入病毒-化合物混合物，在4℃在适当搅拌下与细胞一起孵育2小时。接着，用PBS-A清洗该细胞3次，用0.2mL含有5％SDS的PBS-A溶解将其溶解，并最后将其转移到用于量化放射性的闪烁瓶中。
病毒灭活试验
混合HSV-1 KOS321或HSV-2 333菌株的大约105个噬斑形成单位和200μL无血清EMEM中特定浓度的试验化合物，并在37℃将其孵育15分钟。将该混合物稀释至试验化合物的非抑制浓度，然后依照病毒噬斑减少数试验所述的进行感染效价测定。就RSV而言，该试验以使用补充2％热灭活胎牛血清的DMEM以替代EMEM的类似的方式进行。为了评估低pH值或宫颈分泌物存在的影响；在低pH缓冲液(4.5)中将该病毒(HSV-2 333)和化合物进行稀释或在与病毒(HSV-2333)混合前向该化合物稀释液中加入宫颈分泌物。宫颈分泌物是从产生于3个不同个体的宫颈拭子制备的。用蒸馏水清洗所述拭子并以5000×g离心10分钟。在-20℃下保存该上清液。就RSV而言，以类似的方式使用补充以2％热灭活胎牛血清的DMEM代替EMEM来进行该试验。
病毒菌斑试验
用前面所述方法进行病毒传染力(斑块数量减少)试验和斑块尺寸减少试验17。简单地说，就斑块数量减少试验而言，在添加细胞和37℃下病毒感染细胞的1小时期之前，在室温下孵育该病毒-化合物混合物15分钟。接着，用2mL EMEM清洗该细胞，和用1％甲基纤维素的EMEM溶液将其覆盖。在37℃孵化2(HSV-2)或3(HSV-1)天后，用结晶紫溶液染色使斑块可见。通过剂量-反应曲线插值得到试验化合物抑制50％病毒斑块数的浓度(IC50)。当筛选该化合物抗-HSV或抗-RSV活性时，在加入到细胞和在病毒感染细胞和病毒斑块发展的整个期间之前，在室温下将200PFU的病毒和无血清EMEM中的试验化合物(100μg/mL)的混合物孵育10分钟。在斑块尺寸减小试验中，在不存在抑制剂的情况下在病毒感染细胞的2小时时间之后，将该化合物加入到细胞(在甲基纤维素覆盖培养基中)中。37℃孵化2-3天后，用1％结晶紫溶液染色使病毒斑块可见。就每个试验化合物而言，使用Leica DC300数字式相机连接Leitz-Wetzlar Diavert显微镜来捕捉20个相邻噬斑的图像。使用IM500图像软件(Leica)测定每个噬斑的面积。类似的规程被用于RSV，除了进行该试验在HEp-2细胞中进行和补充以2％热灭活胎牛血清的DMEM被用来代替EMEM之外。
细胞毒性试验
该试验在被播种在96孔组板中的GMK AH1细胞中进行，在培养的第2天达到约80-90％的汇聚(confluence)。用EMEM洗涤细胞，并在无血清的EMEM中用100μL的系列二倍稀释试验化合物，在37℃将其孵育24小时。该试验化合物对细胞活力的影响通过使用按照生产商拟定的以四唑盐为基础的CellTiter96分析(Promega，Madison，WI，USA)来测定。
表1.如前面章节所述的生长因子结合和类肝素酶抑制试验结果.
化合物  Kd VEGF     Kd FGF-1     Kd FGF-2    Ki类肝素酶
        (nM)        (nM)         (nM)        (nM)
4       12±3       6±3         480±70     4.2±0.5
8       5.1±1.8    2.3±1.3     253±25     3.5±0.4
11      0.79±0.24  0.19±0.10   73±23      4.8±1.8
17      24±6       3.2±0.5     ND          ND
20      22±6       0.60±0.50   160±40     5.8±1.5
24      40±17      0.44±0.04   108±11     6.0±2.1
27      1.04±0.19  0.24±0.10   39±6       5.5±2.6
33      1300±300   270±30      1570±150   22.3±1.6
39      319±19     18.5±1.8    631±4      6.4±2.5
44      2.7±0.5    0.17±0.07   80±40      4.4±1.4
48      460±30     22.6±1.0    480±40     8.50±0.14
56      90±30      16±7        490±40     10.5±1.7
60      260±130    14.3±3.0    474.0±1.4  8.4±2.6
65      28.9±2.3   8±4         390±80     6.1±2.5
70      95±8       9.7±0.8     390±90     3.7±0.8
76      790±230    50±8        610±60     16±4
79      3000±400   3600±600    ＞3000      111±28
化合物  Kd VEGF     Kd FGF-1     Kd FGF-2  Ki类肝素酶
        (nM)        (nM)         (nM)      (nM)
83      7.95±0.07  1.25±0.07   50±4     20±5
87      190±60     24.8±2.3    547±50   9.1±2.5
化合物  Kd VEGF     Kd FGF-1    Kd FGF-2     Ki类肝素酶
        (nM)        (nM)        (nM)         (nM)
93      1600±300   610±210    1800±300    30±7
97      1930±230   840±130    3400±300    ND
102     1200±400   560±30     2200±400    ND
107     1350±70    870±60     2000±400    ND
112     430±140    900±150    2100±300    ND
119     7.9±0.7    5.9±1.6    286±25      ND
123     380±110    32.2±2.3   530±50      11.3±0.4
128     14±4       4.94±0.08  311±25      9.1±0.3
134     1080±200   13±3       630±30      ND
139     379±13     72±12      880±110     ND
140     12±2       1.3±0.6    380±40      ND
表2.生长因子诱导的内皮细胞增殖试验和MatrigelTM微管形成试验中所选化合物的数据.a)由FGF-1、FGF-2和VEGF诱导的HUVEC增殖抑制的IC50值(μM)；b)以10μM相对于对照组的抑制微管形成百分数
化合物  FGF-1        FGF-2        VEGF         10μM的微管形成抑制％
        (IC50，μM)  (IC50，μM)  (IC50，μM)
PI-88   42           10           20           29％
4       25           10           6.54         ND
8       10.1         8.1          5.4          27％
11      33           17.0         19.5         ND
17      4.29         3.44         5.75         71％
20      1.29         0.847        1.18         73％
24      1.54         0.665        0.580        90％
27      0.990        0.390        0.220        74％
33      ＞10         2.22         1.85         14％
化合物  FGF-1        FGF-2        VEGF        10μM的微管形成抑制％
        (IC50，μM)  (IC50，μM)  (IC50，μM)
39      4.44         2.27         0.951       74％
44      3.79         0.349        1.18        95％
48      3.81         1.74         2.08        64％
56      2.52         1.80         1.72        67％
60      2.61         1.22         1.44        49％
65      1.2          0.65         0.50        53％
70      2.3          0.64         2.2         52％
76      2.1          1.2          1.8         22％
79      2.20         2.90         2.24        增加3％
83      ＞50.0       ＞50.0       ＞50.0      ND
87      2.5          2.3          1.6         20％
93      2.69         2.43         2.62        ND
97      4.09         4.17         1.13        ND
102     3.95         ＞10         5.17        ND
107     5.75         5.59         5.56        ND
119     4.04         2.69         2.01        32％
123     1.69         1.7          1.1         33％
128     0.47         0.77         0.24        ND
134     1.47         1.28         2.14        63％
139     2.16         1.5          2.31        36％
140     0.56         0.005        1.1         37％
表3：浓度为10和50μM的对照组PI-88、一种较低亲脂性的类似物(PG524)和所选化合物的抑制百分率表示的HUVEC迁移抑制
Figure GPA00001139318900991
Figure GPA00001139318901001
表4：PI-88、一种亲脂性较低的类似物(PG524)和所选试验化合物对大鼠主动脉血管生成试验中血管生成萌芽形成的影响.
表5：所选化合物的抗凝血作用。加入0.1mg/mL的试验化合物后，APTT和Heptest试验中正常混合人血浆的凝结时间
Figure GPA00001139318901003
Figure GPA00001139318901011
表6.筛选试验中发现的化合物抗-HSV和抗-RSV活性.
化合物     剩余的传染性(％)a
           HSV-1  HSV-2  RSV
PI-88      5      3      19
4          2      0.7    0
8          7      0.2    3
11         0      0      0
20         0      0      0
a药物治疗病毒(100μg/mL)的病毒斑块数与模拟治疗对照组的病毒斑块数相比的百分数
表7.试验化合物的抗病毒活性和细胞毒性
化合物     细胞毒性CC50 a      IC50(选择指数CC50/IC50)b
           GMK AH1   HEp-2    HSV-1       HSV-2       RSV
PI-88      ＞1000    ＞400    7(＞143)    1.1(＞909)  9.9(＞40)
4          ＞400     ＞400    2.1(＞190)  0.9(＞444)  4.6(＞87)
11         ＞400     NT       1.8(＞222)  0.9(＞444)  5.7
20         110       113      2.1(52)     1.1(100)    1.7(66)
a可减少50％GMK AH1或HEp-2细胞活力的化合物(μg/mL)的浓度
b减少50％GMK AH1细胞中HSV斑块或HEp-2细胞系中RSV斑块数量的试验化合物浓度。括号中是选择指数的值。
表8.试验化合物的病毒灭活活性a
病毒    化合物浓度(μg/ml)     化合物
                               PI-88    4       20
HSV-1   100                    100.3    83.8    0
        10                     108.0    79.4    0
        1                      99.8     83.9    88.6
HSV-2   100                    107.7    68.1    0
        10                     102.9    97.5    0.3
        1                      95.1     98.6    120.3
RSV     100                    94.0     47.3    13.3
        20                     95.0     82.2    79.0
        4                      105.8    85.2    102.2
a在1∶500或1∶1000稀释混合物和病毒噬斑滴定之前，将大约2×105PFU的各自病毒与PI-88(μg/mL)、试验化合物或稀释的培养基(对照)一起在37℃下共-孵育15分钟。该结果是以化合物-处理病毒所检测到的病毒斑块数与模拟处理的对照组相比的百分数来表示的。
表9.试验化合物的抗-HSV活性
化合物    HSV-2 IC50(μg/ml)a    RSV IC50(μg/ml)a
24        1.8                    0.45
27        0.52                   0.28
33        0.7                    1.8
39        1.1                    0.61
44        0.41                   0.33
48        0.18                   0.25
56        0.3                    0.45
60        0.24                   0.39
65        0.45                   0.35
70        0.15  0.25b            0.23
76        0.07  0.20b            0.37
79        0.28                   2.9
83        6.0                    3.0
87        0.53                   0.77
93        0.27                   0.4
97        0.26                   0.58
102       0.43                   1.8
107       0.43                   1.9
112       0.45                   2.4
119       2.1                    0.62
128       1.0                    1.4
a减少GMK AH1细胞中病毒斑块数量50％的试验化合物浓度。
b减少GMK AH1细胞中HSV-1 KOS321菌株斑块数量50％的试验化合物浓度。
表10.在低pH和存在人宫颈分泌物条件下PI-88和化合物20病毒灭活活性的调幅a
病毒    化合物浓度  化合物
        (μg/ml)    PI-88             20
                    低pHb    CSc      低pHb   CSc
HSV-2   100         111.5    90，3    0.0     0，3
        10          110.8    98，3    6.8     78，5
        1           101.1    88，4    93.7    82，6
a在1∶500或1∶1000稀释和病毒噬斑滴定之前，将大约2×105PFU的各自病毒与PI-88(μg/mL)、试验化合物或稀释的培养基(对照)一起在37℃下(水浴)共-孵育15分钟。该结果是以化合物-处理病毒所检测到的病毒斑块数与模拟处理的对照组相比的百分数来表示的。
b病毒-化合物孵化期间的pH值是4.5。
c稀释1∶2.2的宫颈分泌物出现在病毒-化合物的15分钟期间。
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Claims (9)

1.一种通式化合物：
            [X]n-Y-ZR1R2  I
其中：
X和Y各自是单糖单元，其中不参与形成糖苷键的各个羟基独立地被SO3M或H所取代，其中M是任何可药用的阳离子；
X和Y是任何D-或L-己糖或戊糖；
Y是环状或开环形式；
当Y是还原单糖时，Z是O、N、S或C或其更高的氧化态，或是一个键，和与端基碳相连；
R1是选自包括烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂芳基、酰基、芳酰基、烷基酰胺基、烷基硫酰胺基、三唑基的组的联结子，或是一个键；
R2是选自包括胆甾醇基、胆甾烷基、胆酸、脱氧胆酸、直链烷基、支链烷基、取代烷基、直链酰基、支链酰基、取代酰基的组的一个亲脂部分；
n是0-6的整数；
每个化合物的硫酸化程度为总羟基的70至100％，其中
当R1是一个键时，则R2不为甘草次酸或其衍生物；
当R1是一个键，和n＝0或1，和Z是S时，则R2不为C8或C18直链烷基；
当n是3-6，和R1是一个键，及X和Y是α(1→4)连接的葡萄糖时，则R2不为C12至C18直链烷基；
当n是3-5，和R1是一个键，及X和Y是β(1→3)-连接的葡萄糖时，则R2不为C4至C12直链烷基或胆甾醇基；和
当X和Y是核糖，和R1是一个键时，则R2不为C18基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R2是胆甾烷基。
3.如权利要求1所述的化合物，其中R2是丙基硬脂酰胺。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的化合物，其中R1是氧甲基[1，2，3]-三唑-1-基联结子。
5.一种选自由3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物65)；4-(胆甾烷-3-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物70)；4-(胆甾烷-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物76)；3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物87)；3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，十钠盐(化合物123)；和3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，十三钠盐(化合物128)组成的组中的化合物。
6.一种用于预防或治疗哺乳动物受试者的由血管生成、转移、发炎、凝血/血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染和/或心血管疾病引起的病症的药物或兽药组合物，所述组合物包含至少一种如权利要求1或权利要求5所述的化合物和一种用于至少一种所述化合物的可药用或兽用的载体或稀释剂。
7.如式II所示的化合物在用于生产预防或治疗哺乳动物受试者的由血管生成、转移、发炎、凝血/血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染和/或心血管疾病引起的病症的药物中的用途：
[X]n-Y-ZR1R2   II
其中：
X和Y各为一个单糖单元，其中不参与形成糖苷键的各个羟基独立地被SO3M或H所取代，其中M是任何可药用的阳离子；
X和Y是任何D-或L-己糖或戊糖；
Y是环状或开环的形式；
当Y是还原单糖时，Z是O、N、S或C或其更高的氧化态，或是一个键，和与端基碳相连；
R1是选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂芳基、酰基、芳酰基、烷基酰胺基、烷基硫酰胺基、三唑基的联结子，或是一个键；
R2是选自胆甾醇基、胆甾烷基、胆酸、脱氧胆酸、直链烷基、支链烷基、取代烷基、直链酰基、支链酰基、取代酰基的亲脂部分；
n是0-6的整数；和
各个化合物的硫酸化程度为总羟基的70至100％。
8.一种预防或治疗哺乳动物受试者的由血管生成、转移、发炎、凝血/血栓形成、血液甘油三酯浓度升高、微生物感染和/或心血管疾病引起的病症的方法，其中所述方法包含给予受试者有效量的至少一种如式II的化合物，或包含至少一种所述化合物的组合物：
[X]n-Y-ZR1R2  II
其中：
X和Y各为一个单糖单元，其中不参与形成糖苷键的各个羟基独立地被SO3M或H所取代，其中M是任何可药用的阳离子；
X和Y是任何D-或L-己糖或戊糖；
Y是环状或开环的形式；
当Y是还原单糖时，Z是O、N、S或C或其更高的氧化态，或是一个键，和与端基碳相连；
R1是选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂烷基、杂芳基、酰基、芳酰基、烷基酰胺基、烷基硫酰胺基、三唑基的联结子，或是一个键；
R2是选自胆甾醇基、胆甾烷基、胆酸、脱氧胆酸、直链烷基、支链烷基、取代烷基、直链酰基，支链酰基、取代酰基的亲脂部分；
n是0-6的整数；和
各个化合物的硫酸化程度为总羟基的70至100％。
9.如权利要求7所述的用途或如权利要求8所述的方法，其中所述的化合物选自3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物65)；4-(胆甾烷-3-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物70)；4-(胆甾烷-3β-基-氧甲基)[1，2，3]三唑-1-基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-1-脱氧-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物76)；3β-胆甾烷基2，3，4，6-四-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺酸钠-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物87)；3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，十钠盐(化合物123)；和3-硬酯酰胺丙基2，3，4，6-四-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖苷，十三钠盐(化合物128)。
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