CN101873854A - 层粘连蛋白、衍生物和包含它们的组合物以及它们的治疗性应用方法 - Google Patents

Abstract

在各种不同的实施方案中，本公开提供了使用层粘连蛋白或包含层粘连蛋白的组合物治疗对象的方法。在一个实施方案中，方法被用于在对象中增强肌肉的再生、维持或修复。在另一个实施方案中，方法被用于促进创伤愈合。在另一个实施方案中，方法被用于防止或减轻肌肉损伤或受损。在这些方法的具体实施中，以治疗有效的量施用层粘连蛋白或包含层粘连蛋白的组合物。在某些实施中，层粘连蛋白是完整的层粘连蛋白。在其他实施中，层粘连蛋白是层粘连蛋白片段、层粘连蛋白衍生物或层粘连蛋白类似物。

Description

层粘连蛋白、衍生物和包含它们的组合物以及它们的治疗性应用方法

与相关申请的交互参考

本申请要求2007年10月9日提交的美国临时专利申请No.60/998,320的优先权，并将其引为参考。

关于政府支持的陈述

本发明是在来自美国政府下列资助支持下做出的：国立卫生研究院国家研究资源中心(National Institutes of Health(NIH)，NationalCenter for Research Resources)，资助号Nos.NCRR P20 RR018751-01，P20 RR15581-04；国家关节炎和肌肉骨骼与皮肤病研究所(NationalInstitute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)，资助号No.NIAMS R01AR053697-01；以及国家神经障碍和中风研究所(NationalInstitute of Neurological Disorders and Stroke)，资助号No.NINDSR21NS058429-01。美国政府在本发明中具有一定权利。

技术领域

本公开涉及通过向对象施用层粘连蛋白或包含层粘连蛋白的组合物，向对象提供治疗性益处的方法。在具体实施方案中，本公开提供了通过施用层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物，在对象中增强肌肉再生、例如治疗肌营养不良症的方法。

发明背景

成年骨骼肌在外伤或受损后显示出显著的修复和再生能力。骨骼肌的再生能力是由于位于基底层下并与肌纤维膜紧密接近的卫星细胞池。这些细胞在健康的未受损肌肉中保持静止，但是对肌肉损伤、运动或疾病作出响应而快速活化。

活化后，卫星细胞增殖并沿着肌源性途径分化，能够修复损伤的肌肉。模型表明，卫星细胞的一个亚群保留为干细胞，以取代已经沿着肌源性谱系途径进化的活化的细胞。在活化期间，卫星细胞当它们通过发育程序向肌肉修复进化时，表达转录因子Pax3、Pax7、MyoD、成肌蛋白和MRF4。

肌营养不良症是用于指称一组导致进行性肌肉虚弱的遗传病症的术语。肌营养不良症可以引起骨骼肌虚弱和骨骼肌蛋白的缺陷，导致各种不同的受损的生理功能。肌营养不良症不存在令人满意的治疗方法。现有的治疗方法典型地集中在通过例如物理疗法或通过提供整形外科装置来缓解疾病的作用和改进患者的生活质量。

与肌营养不良症相关的突变基因负责编码许多与肋节蛋白(costameric protein)网络相关的蛋白。这样的蛋白包括层粘连蛋白-2，胶原蛋白，肌营养不良蛋白聚糖，整合蛋白，小窝蛋白-3，锚蛋白，肌养蛋白，α-小肌营养蛋白，纽蛋白，网蛋白，BPAG1b，肌肉LIM蛋白，结蛋白，辅肌动蛋白相关的LIM蛋白，α-肌动蛋白，肌联蛋白，视松蛋白，cypher，肌节蛋白和肌聚糖/肌长蛋白复合物。

肌营养不良症的最常见形式杜兴氏(Duchenne)肌营养不良症，由负责产生肌养蛋白的基因中的突变引起。肌养蛋白是参与细胞与细胞外基质、包括基底膜结合的蛋白。先天性肌营养不良症由影响其他肋节蛋白产生的基因突变引起。例如，在欧洲裔人群中，最流行的先天性肌营养不良症由导致α7β1整合蛋白表达缺失的突变引起。与肌养蛋白相似，α7β1整合蛋白参与细胞与细胞外基质的结合。

在某种程度上，编码肌养蛋白或α7β1整合蛋白之一的基因的缺陷，通常通过增强其他或另一种肋节蛋白、例如肌养相关蛋白(utrophin)(肌养蛋白的类似物)的表达来补偿。肌养蛋白、α7β1整合蛋白和肌养相关蛋白都用作层粘连蛋白的受体，层粘连蛋白用作与细胞外基质的连接。层粘连蛋白-2本身的生产缺陷导致分区蛋白缺陷性先天性肌营养不良症(MCMD)或1A型先天性肌营养不良症(MDC1A)。

层粘连蛋白是基底膜的主要成分。已经鉴定到至少15种层粘连蛋白蛋白三体，每个异源三体包含α、β和γ链。层粘连蛋白与许多生理功能相关，包括细胞附着、基因表达、蛋白的酪氨酸磷酸化、细胞分化以及细胞形状和移动。已知层粘连蛋白通过整合蛋白受体与细胞膜结合。此外，层粘连蛋白-2与作为肌养蛋白-糖蛋白复合物的一部分的α-肌营养不良蛋白聚糖结合。

α7β1整合蛋白是骨骼肌中表达的主要层粘连蛋白受体。α7β1整合蛋白在神经-肌肉和肌-腱连接的发育中发挥重要重用。在成年人中，α7β1整合蛋白在连接位点处集中，并发现它在连接外区域中介导肌肉纤维与细胞外基质的黏附。缺乏α7链的小鼠发展出影响肌-腱连接的肌营养不良症。缺乏α7整合蛋白导致在肌-腱连接处基质沉积缺陷。在γ-肌聚糖小鼠中丧失α7整合蛋白导致严重的肌肉病。在mdx小鼠中缺乏α7整合蛋白也引起严重的肌营养不良症，证实了α7β1整合蛋白作为杜兴氏和其他肌营养不良症的主要遗传修饰物。

在人类中，α7基因的突变造成肌营养不良症。筛查患有未确定的肌肉疾病的患者的117个肌肉活检组织，发现了3份缺乏α7整合蛋白链，并具有降低的β1D整合蛋白链水平。这些患者表现出发育重要事件的延迟和活动受损，与α7β1整合蛋白在神经-肌肉和肌-腱连接发育和功能中的作用相一致。

几条线路的证据表明，α7整合蛋白对于肌肉再生可能是重要的。例如，在胚胎发育过程中，α7β1整合蛋白调控成肌细胞向肌纤维形成区域的迁移。已经发现，MyoD(肌源性决定蛋白)在体外反式激活α7整合蛋白的基因表达，这将增加活化的卫星细胞中α7整合蛋白的水平。源自于卫星细胞的人类、小鼠和大鼠成肌细胞系表达高水平的α7整合蛋白。在5周龄mdx小鼠的骨骼肌中检测到升高的α7整合蛋白mRNA和蛋白，其与肌肉的最大退化和再生时间相关联。此外，α7β1整合蛋白与肌肉特异性α1-整合蛋白结合蛋白(MIBP)结合，调节层粘连蛋白在C2C12成肌细胞中的沉积。层粘连蛋白提供了支持成肌细胞迁移和增殖的环境。最后，α7整合蛋白在营养不良的骨骼肌中增加的表达，导致了卫星细胞的数量增加。

到目前为止，许多治愈或缓解肌营养不良症的努力包括增强肋节网络的各种不同成分的表达。但是，这些方法尽管在体外或转基因动物中显示出某些希望，但通常不能证实在人类中的有效结果，也不能提供能够在人类中实现治疗的方法。这样的治疗途径众所周知难以实施。

但是，也已公知，蛋白、特别是大蛋白的直接施用是非常困难的。例如，尺寸大、电荷高、半衰期短、稳定性差、免疫原性高以及膜通透性差，可能限制所施用蛋白的生物利用度。此外，取决于施用途径，对象的天然生理过程可能攻击并降解所施用的蛋白。例如，尽管层粘连蛋白已知在细胞外基质中发挥重用，但它是特别大(典型＞600kD)、高度带电荷的分子，因此将可以预料到它施用于患者的难度。因此，到目前为止的努力集中于更精细的治疗，而不是治疗性物质的直接施用。

发明概述

在各种不同的实施方案中，本公开提供了用层粘连蛋白或含有层粘连蛋白的组合物治疗对象的方法。例如，某些实施方案提供了通过向对象施用有效量的层粘连蛋白或含有层粘连蛋白、包括其片段、衍生物或类似物的组合物，在对象中改善肌肉健康，例如增强肌肉的再生、维持或修复的方法。在具体实施例中，层粘连蛋白是完整的层粘连蛋白。在其他实施例中，层粘连蛋白选自层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-2、层粘连蛋白-4及其组合。在其他实施例中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物包含至少基本上与层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-2或层粘连蛋白-4同源的物质。在其他实施方案中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物包含至少基本上与层粘连蛋白α1链同源的多肽。

在其他例子中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物由层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-2、层粘连蛋白-4及其组合构成。在其他例子中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物由至少基本上与层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-2或层粘连蛋白-4同源的物质构成。在其他实施方案中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物由至少基本上与层粘连蛋白α1链同源的多肽构成。在具体实施例中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物不包括层粘连蛋白片段，例如只包括完整的层粘连蛋白。

在另一个例子中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物基本上由层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-2、层粘连蛋白-4及其组合构成。在其他例子中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物基本上由至少基本上与层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-2或层粘连蛋白-4同源的物质构成。在其他实施中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物基本上由至少基本上与层粘连蛋白α1链同源的多肽构成。在具体实施例中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物不包括层粘连蛋白片段，例如基本上只包括完整的层粘连蛋白。

公开的方法的其他实施包括诊断对象为患有可以通过施用层粘连蛋白或含有层粘连蛋白的组合物治疗的病症。在一个例子中，对象被诊断为患有肌营养不良症，例如先天性肌营养不良症，杜兴氏肌营养不良症或肢带型肌营养不良症。在其他情况下，病症的特点为对象不能表达一种或多种与细胞外基质的形成和维持有关的蛋白，或对象表达这些蛋白的能力降低，例如层粘连蛋白、整合蛋白、肌养蛋白、肌养相关蛋白或肌营养不良蛋白聚糖的生产受损或不能生产。

在具体实施方案中，本公开还提供了在对象中增加肌肉再生的方法。例如，老年对象，患有肌肉病症的对象，以及患有肌肉受损、包括活动诱导的肌肉受损例如运动引起的受损的对象，可以从本实施方案获益。

在公开的方法的其他实施方案中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物以预防性的方式施用，例如预防或减少肌肉损伤或受损(例如活动或运动诱导的受损)。例如，老年对象，易于肌肉损伤的对象，或具有肌肉受损风险的对象例如运动员，可以进行治疗以消除或缓解肌肉损伤、受损或疾病。

本公开的实施也可用于促进伤口愈合。在某些例子中，将层粘连蛋白或包含层粘连蛋白的组合物施用到伤口中或附近。在其他例子中，该物质全身性施用。尽管该物质典型在创伤发生后施加，但在某些例子中可以前瞻性施加所述物质。

在其他实施方案中，本公开的方法包括将层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物与一种或多种附加的药理性物质、例如治疗性药剂一起施用。在某些情况下，附加的治疗性药剂增强了层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物的治疗效果。在其他情况下，治疗性药剂为所治疗的病症提供独立的治疗益处。在各种不同的例子中，附加的治疗性药剂是细胞外基质的成分，例如整合蛋白、肌养蛋白、肌营养不良蛋白聚糖、肌养相关蛋白或生长因子。在其他例子中，治疗性药剂降低或增加能够增强细胞外基质的形成或维持的物质的表达。

在某些例子中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物被施加到待治疗对象的特定区域上。例如，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物可以注射到待治疗的特定区域中，例如肌肉中。在其他例子中，施用层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物使得它分布到对象的多个区域，例如全身性施用或区域性施用。

层粘连蛋白或包含层粘连蛋白的组合物可以通过任何适合的方法施用，例如表面(topical)、肠胃外(例如静脉内或腹膜内)、或口服。在具体实施例中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物全身性施用，例如通过肠胃外施用，例如胃注射或腹膜注射。

尽管已经针对肌肉再生对所公开的方法进行了一般性描述，但本公开的方法也可用于增强其他组织或器官的修复或维持，或防止它们的损伤。例如，本公开的方法可用于治疗由于骨骼肌之外的细胞或组织的效应，例如脑功能、平滑肌或心肌的受损或改变，而引起的肌营养不良症的症状。

本公开的各种实施方案还具有其他特点和优点。从下面的公开中，它们将变得明显。

就此而言，应该理解，这是本文描述的各种实施方案的简要概述。本公开的任何给定的实施方案不需要提供所有上面提到的特点，也不必须解决上面提到的现有技术中的所有难题或应对所有问题。

附图简述

图1是使用抗α7整合蛋白单克隆抗体，从巢蛋白-GFP转基因小鼠分离到的肌纤维的免疫荧光照片。

图2是心脏毒素诱导的损伤后4、10和28天时，野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠(intergrin null mice)的胫骨前肌的照片。

图3提供的图显示了野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠摄取的伊文思蓝染料。

图4是来自野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠的组织切片的苏木精和曙红染色的显微照片。

图5提供的图显示了野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中位于中心的核的百分率。

图6提供的图显示野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中胚胎肌球蛋白重链的表达。

图7提供了野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠肌纤维的横截面图。

图8提供的图显示了BrdU掺入到野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中。

图9提供的图显示了在野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中的Pax7表达。

图10提供的图显示了在野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中的MyoD表达。

图11是从用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠分离到的肌纤维的免疫荧光照片。

图12是心脏毒素诱导的损伤后4、10和28天时，用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠的胫骨前肌的照片。

图13提供的图显示了用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠摄取的伊文思蓝染料。

图14是来自用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠的组织切片的苏木精和曙红染色的显微照片。

图15提供的图显示了在用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中位于中心的核的百分率。

图16提供了在用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中胚胎肌球蛋白重链的表达的图。

图17提供了用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠肌纤维的横截面图。

图18提供的图显示了BrdU掺入到用层粘连蛋白-1处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中。

图19提供的图显示了Pax7在用整合蛋白处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中的表达。

图20提供的图显示了在用层粘连蛋白处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中的MyoD表达。

图21是X-gal染色照片，证明了α7βgal^+/-成肌细胞表达β-半乳糖苷酶(左图)，该表达在分化成肌管后增加了(右图)。

图22是在从0-72小时分化的α7βgal^+/-细胞中，α7整合蛋白和β-半乳糖苷酶表达的Western分析的照片。

图23是荧光激活的分拣(FACS)图(侧向散射的对数对FITC染色(强度))，证明了α7βgal^+/-成肌细胞在100nM LAM-111处理后表现出增加的β-半乳糖苷酶表达。

图24是在层粘连蛋白-111和磷酸缓冲盐水处理的C2C12和杜兴氏肌营养不良症成肌细胞中，α7B整合蛋白和Cox-1表达的Western分析的照片。

图25提供了在层粘连蛋白-111和磷酸缓冲盐水处理的C2C12和杜兴氏肌营养不良症成肌细胞中，α7B整合蛋白的表达图(像素对平方毫米)。

图26是对照、磷酸缓冲盐水处理的和层粘连蛋白-111处理的肌肉的胫骨前肌的免疫荧光照片(比例尺＝10μm)，显示了在用层粘连蛋白-111或磷酸缓冲盐水处理的mdx肌肉中没有肌养蛋白，并且尽管野生型和磷酸缓冲盐水注射的mdx肌肉缺乏层粘连蛋白-111，但在层粘连蛋白-111注射的mdx肌肉的细胞外基质中检测到了层粘连蛋白-111。

图27是野生型、磷酸缓冲盐水注射的mdx肌肉和层粘连蛋白-111注射的mdx肌肉的苏木精和曙红(上图)染色和伊文思蓝染料(EBD)摄取(下图)的显微照片(比例尺＝10μm)，显示出层粘连蛋白-111注射的肌肉与磷酸缓冲盐水注射的mdx肌肉相比，表现出位于中心的核和EBD摄取减少。

图28提供了野生型、用磷酸缓冲盐水注射的mdx肌肉和用层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉的伊文思蓝染料摄取(左图，阳性纤维的百分率)和位于中心的核(右图，核中心定位阳性的纤维的百分率)的图。

图29是野生型肌肉、磷酸缓冲盐水处理的mdx肌肉和层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉的免疫荧光照片(比例尺＝10μm)，显示了α7整合蛋白、肌养相关蛋白和α-金环蛇毒素的存在或不存在。

图30是野生型肌肉、磷酸缓冲盐水处理的mdx肌肉和层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉中肌养蛋白、肌养相关蛋白、α7A整合蛋白、α7B整合蛋白、β1D整合蛋白和Cox-1表达的Western分析的照片。

图31提供了野生型肌肉、磷酸缓冲盐水处理的mdx肌肉和层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉的α7A整合蛋白/Cox-1(上图)、α7B整合蛋白/Cox-1(中图)和肌养相关蛋白/Cox-1(下图)的比率的图。

图32是野生型肌肉、磷酸缓冲盐水处理的mdx肌肉和层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉的免疫荧光照片(比例尺＝10μm)，显示出在mdx小鼠中腹膜内单次投送1mg/kg剂量的层粘连蛋白-111，导致向心脏、横膈膜和腓肠肌的局部化。

图33是用磷酸缓冲盐水(左边照片)或层粘连蛋白-111(右边照片)处理的mdx小鼠的横膈膜的免疫荧光照片，显示出在用层粘连蛋白-111腹膜内注射后，层粘连蛋白-111遍布于mdx小鼠的横膈膜。

图34提供了野生型肌肉、用磷酸缓冲盐水注射的mdx肌肉和用层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉的肌酸(mg/dl)和血液尿素氮(mg/dl)水平的图。

详细描述

缩写

PBS-磷酸缓冲盐水

LAM-H1-层粘连蛋白-1，其包括链α1β1γ1

NaCl-氯化钠

NaOH-氢氧化钠

HCl-盐酸

MCMD，MDC1A-分区蛋白缺陷型先天性肌营养不良症

DMSO-二甲基亚砜

EDTA-乙二胺四乙酸

eMyHC-胚胎肌球蛋白重链

BrdU-溴代脱氧尿苷

TA-胫骨前肌

H&E-苏木精和曙红

GFP-绿色荧光蛋白

WT-野生型

EBD-伊文思蓝染料

DMD-杜兴氏肌营养不良症

CLN-中心定位的核

nmol-纳摩尔

nM-纳摩尔浓度

MyoD-肌源性决定蛋白

MIBP-肌肉特异性α₁-整合蛋白结合蛋白

FACS-荧光激活的分拣

FITC-荧光素异硫氰酸酯

Pax7-配对框基因7

Pax3-配对框基因3

Cox-1-环加氧酶-1

MRF4-肌源性因子6

术语

为了便于理解提出的实施方案，提供了下面的解释。

除非另有解释，否则所有本文中使用的技术和科学术语，具有与本公开所属技术领域中普通专业人员所通常理解的相同的意义。在有冲突的情况下，以本说明书、包括术语的解释为准。不带数量指示的名词形式包括复数的指称物，除非上下文明确表明不是这样。同样地，单词“或”意指包括“和”，除非上下文明确表明不是这样。术语“包含”意味着“包括”，因此，“包含A或B”意味着包括A或B，或包括A和B。所有本文中给出的数值范围，包括了端点之间的所有值，包括端点(除非专门排除)，以及任何和所有的中间范围。

尽管与本文描述的相似或等价的方法和材料可用于实践或试验本公开，但在本文中仍描述了适合的方法和材料。公开的材料、方法和例子仅仅是说明性的，不打算是限制性的。

“肌肉”是指任何成肌细胞、肌细胞、肌纤维、肌管或其他由肌肉细胞构成的结构。肌肉或肌细胞可以是骨骼肌、平滑肌或心肌。在本公开的具体实施中，肌肉也可以是指能够形成肌细胞的细胞或其他材料，例如干细胞和卫星细胞。

“细胞外基质”是指组织的细胞外结构或其层，包括一种或多种基质成分的排列、组成和形成，这些成分例如蛋白，包括结构蛋白如胶原蛋白和弹性蛋白，蛋白例如纤连蛋白和层粘连蛋白，以及蛋白聚糖。基质可以含有纤维胶原蛋白，具有纤维的网络。在某些例子中，细胞外基质通过肋节蛋白网络与细胞相连。

“组织”是指细胞、通常为特定种类的，与它们的细胞间物质一起的聚集体，形成了动物中的一种结构性材料，在动物中包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。

“对象”是指对其的处理是施用的生物体，例如动物。对象包括哺乳动物，例如人类、猪、大鼠、奶牛、小鼠、狗、猫和灵长动物。

“层粘连蛋白”是指通常参与细胞外基质的形成和维持的糖蛋白家族的任何一种。层粘连蛋白是由α链、β链和γ链形成的异源三体。具体的层粘连蛋白的各种链可以影响分子的性质。在本公开的某些情况下，可以使用各种不同层粘连蛋白的片段、衍生物或类似物，例如至少一部分与层粘连蛋白α1链至少基本上同源的层粘连蛋白。

在本公开中使用的“至少基本上同源”，是指同源性程度足以产生参照物质在肌肉再生、维持或修复或伤口愈合中的至少一部分活性。在某些实施例中，当物质与参照物质至少大约95％、至少大约98％或至少大约99％同源时，它们是至少基本上同源的。

本文中使用的“片段”是指物质例如层粘连蛋白的一部分。在某些实施例中，片段可以是蛋白的特定结构域或链。例如，本公开的具体实施方案包括施用层粘连蛋白-1的片段，它对应于层粘连蛋白α1链的至少一部分(或全部)。片段可以是合成的，或可以源自于较大的母体物质。

本文中使用的“衍生物”是指物质例如层粘连蛋白或其部分的一种形式，它与母体化合物相比具有至少一个改变、添加或移除的官能团。

“官能团”是指向物质添加物理或化学性质的烃类基团之外的基团。

本文中使用的“类似物”是指与一种化合物足够同源，使得其具有与原始化合物相似的用于所需目的的功能活性的化合物。类似物包括与特定物质相比具有一个或多个氨基酸取代的多肽。

在某些情况下，层粘连蛋白可以作为层粘连蛋白的混合物来施用，所述层粘连蛋白包括其片段、类似物和衍生物。用于制备层粘连蛋白结构域类似物的适合方法公开在美国专利No.6,933,280，在此以其不与本公开冲突的程度引为参考。

本公开的层粘连蛋白物质或组合物可以单独作为分子投送，或者可以与另一种物质复合或结合投送。例如，层粘连蛋白可以与载体组合，例如以帮助将层粘连蛋白投送到目标位点，或增加层粘连蛋白的生理摄取或掺入。

在具体实施方案中，施用的层粘连蛋白包括层粘连蛋白-1(LAM-111)或由其构成，所述层粘连蛋白-1包含链α1β1γ1。在其他实施例中，施用的层粘连蛋白包括层粘连蛋白-2或由其构成，所述层粘连蛋白-2包含链α2β1γ1。在其他实施例中，施用的层粘连蛋白包含层粘连蛋白-4或由其构成，所述层粘连蛋白-4包含链α2β2γ1。

层粘连蛋白可以从任何适合的来源获得。例如，层粘连蛋白-1可以从胎盘组织或从Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤获得。分离各种不同层粘连蛋白的适合的方法，公开在美国专利No.5,444,158中，在此以其不与本公开冲突的程度引为参考。

“生物学来源”是指可以从其获得生物学材料的生物体，例如动物，例如哺乳动物或其一部分。这样的材料的例子包括组织样品，例如胎盘材料或肉瘤；细胞，例如卫星细胞；细胞外材料，包括层粘连蛋白或其其他成分；或在生物体中发现的其他有机或无机材料。

“改进肌肉健康”是指与现有状态相比或与不治疗情况下会发生的状态相比，肌肉健康的改善。例如，改进肌肉健康可以包括增强肌肉再生、维持或修复。改进肌肉健康还可以包括前瞻性治疗对象，以预防或降低肌肉损伤或受损。

“再生”是指细胞或组织，例如肌肉细胞或包含肌肉细胞的组织(或器官)，在受损或损伤后的修复，以将肌肉或组织至少部分恢复到与在发生受损或损伤之前细胞或组织存在的相似的状态。再生也指在患有影响这些细胞或组织的疾病的对象中促进细胞或组织的修复，以消除或缓解疾病的影响。在更具体的实施例中，再生将细胞或组织置于与受损或损伤发生之前相同的状态或改进的生理状态下，或在不发生疾病的情况下将存在的状态下

细胞或组织，例如肌肉细胞或包含肌肉细胞的组织(或器官)的“维持”，是指将细胞或组织维持在至少基本上相同的生理状态下，例如即使在存在一般将引起损伤、受损或疾病的刺激物的情况下维持这样的状态。

细胞或组织，例如肌肉细胞或包含肌肉细胞的组织(或器官)的“修复”，是指在损伤或其他创伤后治愈细胞或组织的损伤的生理过程。

“施用”是指向对象提供一种或多种物质，使得对象可以从该物质获得治疗性益处。层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性物质，一般表面、经鼻、静脉内、经口、颅内、肌肉内、肠胃外或作为植入物施用，但是原则上甚至直肠或阴道使用也是可能的。层粘连蛋白或其组合物也可以使用这些技术的组合施用于对象。

适合的固体或液体药物制剂形式是例如气溶胶，(微)胶囊，霜剂，滴液，安瓿形式的滴液或可注射溶液，乳液，颗粒，粉末，栓剂，悬液，糖浆，片剂，包衣片，以及具有活性化合物的延长释放的制剂，在所述制剂中，如上所述惯常使用赋形剂和添加剂和/或辅助剂，例如粘合剂，包衣剂，崩解剂，调味剂，润滑剂，助溶剂，甜味剂或溶胀剂。药物组合物适合用于各种不同的药物投送系统。对于药物投送的各种不同方法的简要综述，参见Langer，“药物投送的新方法”(NewMethods of Drug Delivery)，Science 249：1527-1533(1990)，在此以其不与本公开冲突的程度引为参考。

本公开的层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂，可以配制成能够肠胃外或口服施用于对象的治疗活性药物组合物。肠胃外施用途径包括但不限于表皮，动脉内，肌肉内(IM和埋置IM)，腹膜内(IP)，静脉内(IV)，胸骨内注射或输注技术，鼻内(吸入)，鞘内，注射到胃中，皮下注射(皮下(SQ和埋置SQ)，透皮，表面和眼部。

层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗药剂可以与适合的可药用赋形剂混合或组合，以制备药物组合物。可药用赋形剂包括但不限于，例如氧化铝，硬脂酸铝，缓冲剂(例如磷酸盐)，甘氨酸，离子交换剂(以例如帮助带电荷物质的受控释放)，卵磷脂，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，山梨酸钾，血清蛋白(例如人血清白蛋白)，山梨酸，水，盐或电解质例如基于纤维素的物质，胶体二氧化硅，磷酸氢二钠，三硅酸镁，聚丙烯酸酯，聚亚烷基二醇例如聚乙二醇，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙烯吡咯烷酮，磷酸氢钾，硫酸鱼精蛋白，1族卤化物盐例如氯化钠，羧甲基纤维素钠，蜡，羊毛脂和锌盐。脂质体悬液也可以适用作可药用载体。

在混合或添加层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂后，所得到的混合物可以是固体、溶液、悬液、乳液等。它们可以按照本技术领域的普通专业人员已知的方法来制备。所获得的混合物的形式取决于多种因素，包括计划的施用方式和药剂在选择的载体中的溶解性。

适合于层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂施用的药物载体，包括已知的任何这类适合于具体施用方式的载体。此外，层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性物质，也可以与其他不损害所需作用的无活性或活性物质混合，或与补充所需作用或具有其他作用的物质混合。

当药剂在载体中表现出溶解性不足时，可以使用增溶方法。这样的方法是已知的，包括但不限于在碳酸氢钠水溶液中溶解，使用助溶剂例如二甲基亚砜(DMSO)，以及使用表面活性剂例如

(ICIAmericas，Inc.，Wilmington，DE)。

层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂，可以与保护它们免于从身体中快速消除的载体制备在一起，例如包衣或延时释放制剂。这样的载体包括受控释放制剂，例如但不限于微包囊投送系统。层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂以足以在被治疗的对象上执行治疗有用效果的量，典型以避免不想要的副作用的量，包含在可药用载体中。治疗有效浓度可以通过在用于被治疗病症的已知体外和体内模型系统中测试化合物而凭经验进行确定。例如，可以使用肌营养不良症的小鼠模型来确定有效量或浓度，然后可针对其他对象例如人类加以转换，这是本技术领域已知的。

可注射溶液或悬液可以使用适合的无毒性、肠胃外可用的稀释剂或溶剂进行配制，例如1，3-丁二醇，等张氯化钠溶液，甘露糖醇，林格氏(Ringer′s)溶液，盐水溶液或水；或适合的分散或润湿和悬浮剂，例如无菌的、温和的、不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二脂，以及脂肪酸，包括油酸；天然存在的植物油例如椰子油、棉籽油、花生油、芝麻油等；甘油；聚乙二醇；丙二醇；或其他合成溶剂；抗微生物剂例如苯甲醇和对-羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐；螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)；用于调节张力性的药剂例如氯化钠和右旋糖；及其组合。肠胃外制剂可以封装在由玻璃、塑料或其它适合材料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可以根据需要掺入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。当静脉内施用时，适合的载体包括生理盐水，磷酸缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和助溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物的溶液。脂质体悬液，包括组织定向脂质体，也可以适合用作可药用载体。

对于表面应用来说，层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂可以制成在适合的水性或非水性载体中的霜剂、洗液、油膏、溶液或悬液。表面应用也可以通过包含治疗性物质的透皮贴片或绷带来进行。也可以包含添加剂，例如缓冲剂如偏亚硫酸氢钠或依地二钠；防腐剂例如杀细菌剂和杀真菌剂，包括乙酸苯汞或硝酸苯汞，苯扎氯铵或氯已定；以及增稠剂例如羧丙基甲基纤维素。

如果层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂作为悬液口服施用，药物组合物可以按照药物制剂技术领域中公知的技术来制备，并可以包含悬浮剂，例如藻酸或藻酸钠，增量剂例如微晶体纤维素，增粘剂例如甲基纤维素，以及甜味剂/调味剂。口服液体制剂可以包含常规添加剂，例如悬浮剂，例如明胶，葡萄糖浆，氢化可食用脂肪，甲基纤维素，山梨糖醇和糖浆；乳化剂，例如阿拉伯树胶，卵磷脂或失水山梨糖醇单油酸酯；非水性载体(包括食用油)，例如杏仁油，分馏的椰子油，油状酯例如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂例如对羟基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯；以及，如果需要的话，常规的调味剂或着色剂。当配制成立即释放片剂时，这些组合物可以包含磷酸二钙，乳糖，硬脂酸镁，微晶纤维素，以及淀粉和/或其他粘合剂、稀释剂、崩解剂、赋形剂、膨胀剂和润滑剂。

如果需要口服施用，层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性物质可以提供在能够保护它抵抗胃的酸性环境的组合物中。例如，层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂可以用能够在胃中维持其完整性并在肠中释放出活性化合物的肠溶包衣配制。层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂也可以与抗酸剂或其他这样的成分组合配制。

口服组合物一般包含惰性稀释剂或可食用载体，并可以压缩成片剂或包封在明胶胶囊中。出于口服治疗性施用的目的，层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性物质可以与赋形剂掺在一起，以胶囊、片剂或锭剂的形式使用。可以包含药物相容的佐剂材料或粘合剂作为组合物的一部分。

胶囊、丸剂、片剂、锭剂等可以包含任何下述成分或性质相似的化合物：粘合剂例如但不限于阿拉伯树胶，玉米淀粉，明胶，黄蓍胶，聚乙烯吡咯烷酮或山梨糖醇；填充剂例如磷酸钙，甘氨酸，乳糖，微晶体纤维素或淀粉；崩解剂例如但不限于藻酸和玉米淀粉；润滑剂例如但不限于硬脂酸镁，聚乙二醇，二氧化硅或滑石；助流剂(gildant)例如但不限于胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；崩解剂例如土豆淀粉；分散或润湿剂例如月桂基硫酸钠；以及调味剂例如胡椒薄荷，水杨酸甲酯或水果香料。

当剂量单位形式是胶囊时，它除了上面类型的材料之外，还可以包括液体载体，例如脂肪油。此外，剂量单位形式可以包含各种其他能够修饰剂量单位的物理形式的材料，例如糖衣和其他肠溶剂。层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性药剂也可以作为酏剂、悬液、糖浆、威化饼干、茶、口香糖等的成分施用。糖浆除了活性化合物之外，还可以包含蔗糖或甘油作为甜味剂，以及某些防腐剂、染料和着色剂，和香料。

当口服施用时，化合物可以以常用于口服施用的剂型施用。这些剂型包括常用的片剂和胶囊的固体单位剂型，以及液体剂型例如溶液，悬液和酏剂。当使用固体剂型时，它们可以是缓释类型的，以便化合物需要较不频繁地施用。

正如在本公开的别处解释的，出人意料并与先前的预期相反，已经确定层粘连蛋白容易被对象吸收并可以生理利用。例如，已经证实，注射到对象胃中的层粘连蛋白在对象中全身性掺入，例如在各种肌肉类群中。腹膜内注射也产生层粘连蛋白的全身性分布，包括层粘连蛋白在横膈肌、腓肠肌和心肌中的分布。在其他例子中，当通过肌肉内注射进行施用时，已经发现层粘连蛋白渗透到附近的肌肉类群中。因此认为，层粘连蛋白的施用可能不遭受困扰其他蛋白、特别是大蛋白的某些严重投送问题。用于施用包含蛋白的药治疗性物质的方法和组合物的例子，包括在下列文献中讨论的：Banga，《治疗性肽和蛋白：配制、加工和投送系统》(第二版)(Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems 2ed.(2005))；Mahato，《用于蛋白和核酸的投送和定向的生物材料》(Biomaterials for Deliveryand Targeting of Proteins and Nucleic Acids(2004))；McNally，《蛋白配制和投送》(第二版)(Protein Formulation and Delivery，2ed.(2007))；以及Kumar等，“蛋白和肽治疗药物的新投送技术”(Novel DeliveryTechnologies for Protein and Peptide Therapeutics)，Current Pharm.Biotech.，7：261-276(2006)；它们每个在此以其不与本公开冲突的程度引为参考。

“抑制”疾病或病症是指在例如具有疾病风险或患有特定疾病的对象中，抑制疾病或病症的发展。本公开的具体方法提供了用于抑制肌营养不良症的方法。“治疗”是指在疾病或病症开始发展后，缓解其征兆或症状的治疗性干预。正如本文中使用的，术语“缓解“对于疾病或病症来说，是指任何可观察到的治疗有益效应。有益效应可以显示为例如在易感性对象中延迟疾病或病症的临床症状的发作，降低疾病或病症的某些或所有临床症状的严重性，疾病或病症的较慢进展，疾病或病症复发的次数降低，对象的总体健康或良好状态的改进，显示为本技术领域中公知的其他对特定疾病或病症特异性的参数，以及这些因素的组合。

“治疗有效量“是指对于减轻、缓解、消除、预防或抑制所治疗的疾病、病症或病况的至少一种症状有效的量，可以根据经验确定。在本公开的各种不同实施方案中，“治疗有效量”是“促进肌肉再生的量”，即足以获得与对照相比组织或细胞再生、例如肌肉细胞再生的统计学显著的促进的量。

具体来说，肌肉健康，例如肌肉细胞再生、维持或修复的指标，可以通过各种不同手段进行评估，包括监测肌肉再生的标志物，例如转录因子，例如Pax7、Pax3、MyoD、MRF4和成肌蛋白。例如，这些标志物的增加的表达可以表明肌肉再生正在发生或最近发生过。肌肉再生的标志物，例如胚胎肌球蛋白重链(eMyHC)的表达，也可用于衡量肌肉再生、维护或修复的程度。例如，eMyHC的存在可以表明肌肉再生最近在对象中发生过。

肌肉细胞再生、维持或修复也可以通过测定肌肉细胞的围长或平均横截面积或肌肉纤维的密度来监测。肌肉状况的其他指标包括肌肉重量和肌肉蛋白含量。有丝分裂指数(例如通过测量BrdU的掺入)和肌生成也可用于评估肌肉再生的程度。

在具体实施例中，肌肉状况的改进例如再生，与对照相比为至少大约10％，例如至少大约30％，或至少大约50％或以上。

在某些实施中，有效量的层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物在每个时间期间，例如每3或4个月、每月、每周或每天，作为单剂施用，或它可以在一段时间内分成至少两个单位剂量施用。治疗可以持续长达获得所需结果所必需的长度。例如，治疗可以持续大约3或4周，直到大约12-24个月或更长，包括进行性治疗。化合物也可以间歇地以几剂施用，例如每几天(例如至少大约每2、3、4、5或10天)或每几周(例如至少大约每2、3、4、5或10周)。

具体的剂量方案可以根据具体的对象、待治疗的病症或所需的结果来定制。例如，当使用本公开的方法来治疗肌营养不良症或类似病症时，可以使用起始治疗方案来遏制病症。这样的起始治疗方案可以包括施用较高剂量的层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物，或较频繁，例如每日施用这样的物质。在获得所需的治疗结果，例如所需水平的肌肉再生后，可以施行第二种治疗方案，例如施用较低剂量的层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物，或以较低频率，例如每月、每两月、每季度或每半年施用这些物质。在这种情况下，第二种治疗方案可以用作“加强剂”，以恢复或维持所需的肌肉再生水平。同样的治疗方案可用于其他具有降低的或受损的肌肉再生能力的对象，例如老年对象。

当本公开的具体方法被用于预防或减轻肌肉损伤，例如由用力或受损引起的损伤时，对象在用力或受损之前典型地治疗了足够长的时间，以便提供治疗效果。例如，对象在预计的活动或可能的受损之前可以治疗至少大约24小时，例如之前至少大约48小时，大约72小时，大约1周，大约2周，大约3周或大约4周。

当本公开的方法的实施方案被用于促进伤口愈合时，层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性物质可以直接施加到待治疗的区域或其附近。例如，物质可以注射到区域中或附近。在其他实施例中，物质可以表面施加到待治疗区域。治疗典型情况下在受损之前到受损后几周开始。在更具体的实施方案中，治疗在受损后大约12小时到大约72小时之间开始，例如在受损后大约24到大约48小时之间开始。在某些情况下，单次施用所述物质有效地提供了所需的治疗效果。在其他例子中，提供了附加的施用以便获得所需治疗效果。

当然，对于本公开的各种不同的治疗性疗法来说，有效量可能依赖于疾病的严重性和对象的体重和总体状态，以及治疗活性化合物或成分的吸收、失活和排泄速度，剂量日程安排和施用量，以及本技术领域的普通专业人员公知的其他因素。对于本技术领域的普通专业人员来说，显然，施用的准确剂量和频率将取决于施用的具体层粘连蛋白、层粘连蛋白组合物或其他治疗性物质，所治疗的具体病症，所治疗病症的严重性，具体对象的年龄、体重、总体身体状况，以及对象可能正在服用的其他药物。典型地，体外使用的剂量可以为药物组合物的体内施用的有效量提供有用的指导，动物模型可用于确定具体病症治疗的有效剂量。例如，肌营养不良症的小鼠模型可用于确定有效剂量，然后按照本技术领域所知，转变成其他对象、例如人类的剂量。在剂量确定中的各种考虑，描述在例如Gilman等主编的《Goodman和Gilman′s：治疗药物的药理学基础》(第八版)(Goodman And Gilman′s：The Pharmacological Bases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press(1990))；以及《Remington′s药物学》(第17版)(Remington′sPharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990))，它们每个在此以其不与本公开冲突的程度引为参考。

在具体实施例中，施用于对象的层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物的量，足以提供剂量在大约10fmol/g到大约500nmol/g之间的层粘连蛋白，例如大约2nmol/g到大约20nmol/g之间，或大约2nmol/g到大约10nmol/g之间。在其他实施例中，施用于对象的层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物的量，足以提供剂量在大约0.01μg/kg到大约1000mg/kg之间，或大约0.1mg/kg到大约1000mg/kg之间的层粘连蛋白，在具体实施例中，该量每天或每周提供。在另一个实施例中，施用于对象的层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物的量，足以提供剂量在大约0.2mg/kg到大约2mg/kg之间的层粘连蛋白。在其他实施例中，施用于对象的层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物的量，足以在施用的材料中提供浓度在大约5nM到大约500nM之间的层粘连蛋白，例如在大约50nM到大约200nm之间，或大约100nM。

提供上面的术语说明仅仅是为了帮助读者，而不应该被解释为具有小于本技术领域的普通专业人员所理解的范围，或作为对随附的权利要求书的范围的限制。

描述

总的来说，本公开提供了用于增强细胞或组织修复、再生或维持，包括针对随后的受损、损伤或疾病的前瞻性治疗的方法和组合物的实施方案。在各种不同实施方案中，本公开提供了治疗肌营养不良症，加强受损或损伤后肌肉修复，或降低肌肉受损或损伤的严重性的方法。其他的实施方案提供了增强伤口愈合的方法。

在某些实施方案中，方法包括施用有效量的层粘连蛋白或包含有效量层粘连蛋白的组合物。在方法的具体实施中，层粘连蛋白是层粘连蛋白-1。在方法的其他具体实施中，层粘连蛋白是层粘连蛋白-2或层粘连蛋白-4。

不打算受限于特定的作用机制，层粘连蛋白被认为通过活化卫星细胞以增殖和分化成新的肌肉细胞和肌管来帮助肌肉再生。因此，与对象的天然状态相比，可以增强肌肉修复。

具体来说，当方法用于治疗肌营养不良症时，同样也不受作用理论的束缚，层粘连蛋白也可以帮助结合细胞外基质的成分，例如结合肌养蛋白或α7β1整合蛋白。例如，在杜兴氏肌营养不良症中，增加量的层粘连蛋白可以通过结合α7β1整合蛋白或另一种受体，例如与肌养蛋白同源的肌养相关蛋白，来帮助与基底膜的连接。层粘连蛋白的施用也可以上调肋节网络的一种或多种成分的表达，例如肌养相关蛋白或α7β1整合蛋白，潜在地在细胞外基质与剩余的肋节之间提供附加的联系点。层粘连蛋白也可以提供增加组织完整性的结构环境。

在其他实施方案中，本公开提供了用于促进肌肉再生的方法。肌肉再生可以有益于例如老年人或肌肉修复能力降低的其他患者群体，或简单地加速本来生理无损伤的患者的肌肉修复过程。在具体实施方案中，施用层粘连蛋白可以在运动员或其他具有活动诱导的肌肉受损或损伤的人中帮助肌肉修复，或减少肌肉损伤。在其他实施中，在患有例如由意外或受损引起的肌肉损伤的患者中，可以通过施用层粘连蛋白来增加肌肉修复。

在本公开的实施方案的各种不同例子中，层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物与一种或多种其他成分，例如细胞外基质的成分一起施用。例如，附加的物质可以包括聚集蛋白聚糖，制管张素，钙粘着蛋白，胶原蛋白(包括胶原蛋白I、胶原蛋白III或胶原蛋白IV)，饰胶蛋白聚糖，弹性蛋白，议定菌素，内皮抑制素，纤维蛋白，纤连蛋白，骨桥蛋白，肌腱蛋白，血小板反应蛋白，玻璃体结合蛋白及其组合。也可以施用双糖链蛋白聚糖，糖胺聚糖(例如肝素)，糖蛋白(例如肌营养不良蛋白聚糖)，蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素)及其组合。特定的层粘连蛋白可以与其他形式的层粘连蛋白、层粘连蛋白类似物、层粘连蛋白衍生物或任何上述物质的片段一起施用。

生长刺激物可以与层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物一起加入。生长刺激物的例子包括细胞因子，多肽和生长因子，例如脑源性神经营养因子(BDNF)，CNF(纤毛神经营养因子)，EGF(表皮生长因子)，FGF(成纤维细胞生长因子)，神经胶质细胞生长因子(GGF)，神经胶质细胞成熟因子(GMF)，神经胶质细胞源神经营养因子(GDNF)，肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素，胰岛素样生长因子，角质细胞生长因子(KGF)，神经生长因子(NGF)，神经营养因子-3和-4，PDGF(血小板衍生的生长因子)，血管内皮生长因子(VEGF)，以及它们的组合。

可以添加其他的治疗性药剂以增强层粘连蛋白或层粘连蛋白组合物的治疗效果。例如，可以添加肌肉细胞源以帮助肌肉再生和修复。在本公开的某些情况下，与层粘连蛋白疗法相组合向对象施用卫星细胞。美国专利出版物2006/0014287，在此以其不与本公开冲突的程度引为参考，提供了在肌源性细胞中富集细胞集合体，以及向对象施用那些细胞的方法。

在其他情况下，向对象施用干细胞，例如脂肪源干细胞。制备和施用脂肪源干细胞的适合方法，公开在美国专利公布2007/0025972中，在此以其不与本公开冲突的程度引为参考。在某些实施例中，也可以施用其他细胞材料，例如成纤维细胞。

提供了下面的实施例来说明某些具体的特点和/或实施方案。这些实施例不应该被解释为将本发明局限于所描述的具体特点或实施方案。

实施例1

材料与方法

动物

在这些研究中使用的野生型(C57BL/6)、α7整合蛋白缺失型(C57BL/6背景)和巢蛋白-GFP小鼠(C57BL/6背景)，按照内华达大学(University of Nevada，Reno)、华盛顿大学(University ofWashington，Seattle)动物护理和使用管理委员会(Institutional AnimalCare and Use Committees)批准的方案进行安乐死。

组织学

将胫骨前肌(TA)包埋在Optimal Cutting Temperature(OCT)中(Tissue-Tek；Sakura Finetek，Torrance，California，United States)，使用Leica CM1850低温恒温器，切出10μm的冷冻切片(分隔≥50μm)，放置在Surgipath显微镜玻片上(Surgipath Medical Industries，Richmond，IL)。按照以前在Rooney等，“缺乏肌养蛋白和α7整合蛋白的小鼠的严重肌营养不良症”(Severe muscular dystrophy in mice that lackdystrophin and alpha7 intergrin)，J.Cell Sci.119：2185-2195(2006)所述，将组织切片用苏木精和曙红(H&E)染色，该文献在此以其不与本公开冲突的程度引为参考。再生肌肉中的中央肌核通过亮视野显微镜以630X放大倍数进行计数。每个肌纤维的中央核数量通过对每个动物计数最少1000个肌纤维来确定。每种基因型至少分析了5只动物。此外，在每个时间点，在每个组的至少5000个肌纤维中检测了横截面积。结果被报告为平均纤维横截面积。

免疫荧光

将TA肌肉包埋在Tissue-TEK的Optimal Cutting Temperature化合物中(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)。使用Leica CM1850低温恒温器切出10μm的切片，放置在Surgipath显微镜玻片上(SurgipathMedical Industries，Richmond，IL)。层粘连蛋白-α2链使用1∶500稀释的兔抗层粘连蛋白-α2(2G)多克隆抗体(来自Robert Wood JohnsonMedical School，Department of Pathology，Piscataway，NJ的PeterYurchenco的好意馈赠)进行检测。层粘连蛋白-α1链使用抗层粘连蛋白-α1抗体(sc-5582，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)进行检测。兔第一抗体使用1∶500稀释的荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联的抗兔第二抗体进行检测。

对于小鼠单克隆抗体来说，使用小鼠-小鼠试剂盒(mouse-on-mouse(MOM)kit)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)阻断内源小鼠免疫球蛋白。MyoD和Pax7的表达使用5μg/ml抗MyoD抗体和抗Pax7抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)，Iowa City，IA)进行检测。eMyHC按照以前的描述进行检测(Rooney等，2006)。使用1μg/ml浓度的四甲基罗丹明偶联的麦胚凝集素(WGA)(MolecularProbes，Eugene，OR)来确定肌纤维。荧光使用Zeiss Axioskop 2 Plus荧光显微镜来观察，图像使用Zeiss AxioCam HRc数字相机和Axiovision4.1软件来捕获(都可以从Carl Zeiss Microimaging，Thornwood，NY获得)。对于每只动物，以630X放大倍数在20个随机的、不重叠的显微镜视野中分析多个相邻的切片。

按照以前的描述，从10周龄巢蛋白-GFP转基因小鼠的趾长伸肌用胶原蛋白酶消化后分离了单个肌纤维，并在Matrigel包被的孔中单独培养(Shefer等，“骨骼肌卫星细胞可以自发进入可选间充质途径”(Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternativemesenchymal pathway)，J.Cell Sci.117：5393-5404(2004)；Shefer等，“分离和培养骨骼肌肌纤维作为分析卫星细胞的工具”(Isolation andculture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells)，Methods Mol.Biol.290：281-304(2005)；它们每个在此以其不与本公开冲突的程度引为参考)。将黏附性单个肌纤维固定在4％聚甲醛中，与1∶1000稀释的抗α7整合蛋白大鼠单克隆抗体(CA5.5)(SierraBioSource，Morgan Hill，CA)温育。抗α7整合蛋白大鼠抗体使用罗丹明标记的抗大鼠第二抗体进行检测。GFP和罗丹明的荧光使用倒置荧光显微镜(Nikon eclipse，TE2000-S，Nikon Instruments，Inc.，Melville，NY)检测，图像使用MetaVue成像系统(Universal Imaging Corporation，Downingtown，PA)控制的CoolSNAP_ES单色CCD相机(PrincetonInstruments Inc.，Trenton，NJ)获取。

伊文思蓝染料分析

对于小鼠，每10g体重腹膜内注射50μl 10mg/ml的无菌伊文思蓝染料(EBD)溶液。3小时后，收获TA肌肉，在液氮中速冻。将10μm的冷冻切片放置在显微镜玻片上，在4％聚甲醛中固定。通过将组织切片与俄勒冈绿-488偶联的麦胚凝集素(2μg/ml，Molecular Probes，Eugene，OR)温育来显示肌纤维的轮廓。对每只动物计数至少1000个纤维，以确定对EBD阳性的肌纤维的百分率。每种基因型至少分析4只动物。以630X放大倍数捕获图像并进行计数。

溴脱氧尿苷(BrdU)的掺入

在收获肌肉前72小时、48小时和24小时，腹膜内注射BrdU(500mg/kg)。将肌肉冷冻切片在95％乙醇中固定1分钟。然后将切片在磷酸缓冲盐水(PBS)中清洗，并用2N盐酸(HCl)处理20分钟。将切片在50mM氯化钠(NaCl)中中和20分钟，然后在100mM Tris-HCl中温育20分钟，在PBS中清洗。将组织在抗BrdU抗体(G3G4，1∶1000，Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)，Iowa City，IA)中温育1小时，在PBS中清洗，并固定在Vectashield中(Vector Labs，Burlingame，CA)。

心脏毒素诱导的肌肉受损

将小鼠用阿佛丁(0.25μl/g体重)麻醉，将100μl 10μm的心脏毒素在PBS中的溶液(C3987，Sigma，St.Louis，MO)注射到5周龄雄性野生型和α7^-/-小鼠的左侧TA肌肉中。右侧TA肌肉用100μl PBS注射，并用作对照。在心脏毒素注射后第4、7、10和28天，将小鼠安乐死并收获肌肉用于分析。

层粘连蛋白-111注射

在注射心脏毒素之前3天，将在PBS中的100nM天然小鼠层粘连蛋白(Invitrogen，Carlsbad，CA)注射到麻醉的野生型和α7^-/-小鼠的左侧TA肌肉中。右侧TA肌肉用100μl PBS注射，并用作对照。在心脏毒素注射后第0、4、7、10和28天，收获肌肉用于分析。

统计学分析

所有平均的数据均被报告为平均值±标准偏差。多个组之间的比较，对于参数型数据通过单因素方差分析(ANOVA)进行，或对于非参数型数据通过Kruskal-Wallis组间行单因素方差分析进行，使用了SigmaStat 1.0软件(Jandel Corporation，San Rafael，CA)。P＜0.05被认为是统计学显著的。

整合蛋白在静止卫星细胞中的表达

为了证实α7整合蛋白在卫星细胞中表达，使用抗α7整合蛋白单克隆抗体，对来自巢蛋白-GFP转基因小鼠的分离的肌纤维进行了免疫荧光(图1)。巢蛋白-GFP在静止卫星细胞中特异性表达。所有肌纤维表面上的巢蛋白-GFP阳性细胞对于α7整合蛋白也是阳性的(图1)。图像分析显示出α7整合蛋白在卫星细胞的基底表面上定位更强。这些数据证实，静止的卫星细胞表达α7整合蛋白，而定位集中在朝向肌纤维的基底表面上。

整合蛋白缺失型小鼠中的肌肉修复

最近的研究表明，α7整合蛋白在卫星细胞活化和/或增殖中发挥作用。为了检验α7β1整合蛋白是否为肌肉修复所需，对野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉进行了心脏毒素诱导的损伤，并在4、10和28天后进行检查(图2)。心脏毒素损伤后4天，野生型TA肌肉外观健康，这种外观持续了28天。相反，α7整合蛋白缺陷的肌肉在受损后第4和10天表现出损伤肌肉的大的白色区域。在28天时，在α7整合蛋白缺陷的肌肉中，肌肉损伤区域仍然非常明显。这些数据表明，在骨骼肌中失去α7整合蛋白导致肌肉再生的显著延迟。

α7整合蛋白的丧失导致受损后降低的膜完整性

为了研究心脏毒素处理后膜的完整性，用伊文思蓝染料(EBD)对野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠进行注射。在心脏毒素注射前两个组中都不存在EBD摄入(图3)。尽管在心脏毒素注射前α7整合蛋白缺陷肌肉对于EBD摄入是阴性的，但是与野生型相比，在第4天时EBD阳性的肌纤维高7倍。在受损后第4天，8.5％的野生型和66％的α7整合蛋白缺陷的肌纤维是EBD阳性的。10天后，不到4％的野生型肌纤维对EBD摄入是阳性的，而40％的α7整合蛋白缺陷肌纤维是EBD阳性的。在心脏毒素注射后28天时，17％的α7整合蛋白缺陷肌肉纤维仍然是EBD阳性的，而在野生型肌肉中没有观察到EBD(P＜0.05)(图3)。这些结果表明，α7整合蛋白的丧失导致心脏毒素诱导的损伤后肌膜脆性增加。

在α7整合蛋白缺失型小鼠中肌肉修复降低

苏木精和曙红(H&E)染色被用于检测心脏毒素诱导的损伤后单核细胞的浸润和中央定位的核(图4，比例尺表示10μm)。在心脏毒素损伤后4天，野生型肌肉表现出单核细胞浸润和含有中央定位的核的肌纤维(图4)。到第10天，野生型肌肉表现出很少的单核细胞浸润和大多数肌纤维包含中央定位的核。到28天，在野生型肌肉中，修复完成，明显是大多数肌纤维包含中央定位的核，很少的单核细胞浸润。相反，在心脏毒素诱导的损伤后4天，α7整合蛋白缺陷的肌肉表现出广泛的单核细胞浸润和营养不良的肌纤维，这持续到心脏毒素损伤后10天(图4)。到28天，α7整合蛋白缺陷肌肉表现出含有中央定位的核的营养不良的肌纤维，以及单核细胞浸润。

为了对肌肉修复进行定量，计算了具有中央定位的核的肌纤维的百分率(图5)。在野生型小鼠中，在心脏毒素损伤后4天，81.8％的肌纤维含有中央定位的核。相反，在α7整合蛋白缺陷肌肉中，只有28.1％的肌纤维对中央定位的核是阳性的(P＜0.05)。到第10和28天时，在野生型小鼠中，分别有95.5％和97.5％的肌纤维显示出中央定位的核。到第10和28天时，在α7整合蛋白缺陷肌肉中，分别有82％和95.5％的肌纤维显示出中央定位的核，低于野生型(P＜0.05)。这些结果表明，丧失α7整合蛋白导致延迟的肌肉再生。

胚胎肌球蛋白重链(eMyHC)在肌肉修复后短暂表达，被用作最近肌肉再生的标志物。在第0天，在野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中都不存在eMyHC(图6)。在心脏毒素处理后第4和10天时，在超过99％的野生型肌纤维中检测到了eMyHC的表达(图6)。形成鲜明对照的是，在心脏毒素损伤后第4和10天时，分别只有2.2％和9.9％的α7整合蛋白缺陷肌纤维表达eMyHC(图6)。到第28天，只有11.3％的α7整合蛋白缺陷的肌纤维是eMyHC阳性的，而18.5％的野生型肌肉是eMyHC阳性的(^*P＜0.001)。这些结果证实了，通过eMyHC的暂时表达进行度量，α7整合蛋白的丧失导致了肌肉修复的缺陷。

心脏毒素损伤在α7整合蛋白缺失型小鼠中导致营养不良的肌纤 维

为了确定α7整合蛋白的丧失是否影响损伤后肌肉的修复，测量了肌纤维的横截面积(图7)。在心脏毒素损伤后4天，野生型小鼠中再生性肌纤维比α7整合蛋白缺陷的肌纤维大31％(图7)。在第10天，再生性野生型肌纤维与α7整合蛋白缺陷的肌纤维相比大45.1％(图7)。到第28天，野生型肌肉显示出肌纤维尺寸的变化。而这与α7整合蛋白缺陷肌肉形成对比，后者继续显示出小的横截面积，其中绝大部分纤维在100-600μm²的范围内。这些结果表明，α7整合蛋白的丧失导致再生能力降低，产生营养不良的肌纤维。

损伤后α7整合蛋白缺陷的肌肉中卫星细胞的增殖和分化降低

为了确定在α7整合蛋白缺失型小鼠中卫星细胞的增殖是否降低，对掺入到卫星细胞的核中的BrdU进行了定量(图8)。在损伤后第4天，α7整合蛋白缺陷肌肉含有的BrdU阳性的核与野生型动物相比少3倍(图8)。但是，在第10天和28天，α7整合蛋白缺失型小鼠中的BrdU阳性的核与野生型相比增加了(图8)。这些结果显示，在心脏毒素诱导的损伤后，α7整合蛋白缺陷肌肉中卫星细胞的增殖延迟了。

为了检测调控肌肉修复的发育程序是否受到α7β1整合蛋白丧失的影响，检测了Pax7和MyoD的表达(图9和10)。Pax7在静止和活化的卫星细胞中都表达，而MyoD只在分化的成肌细胞中表达。与野生型肌肉相比，在心脏毒素损伤后第4和10天时，α7整合蛋白缺失型小鼠显示出比野生型少2到3倍的Pax7阳性细胞(图9)。到第28天时，在野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中观察到了相似数量的Pax7阳性细胞。

MyoD表达的分析显示，在心脏毒素诱导的损伤后第4和10天时，α7整合蛋白缺陷肌肉与野生型肌肉相比，分别含有少28和50倍的MyoD阳性成肌细胞(图10)。到第28天，在野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中观察到了类似数量的MyoD阳性细胞。

这些结果合在一起，表明α7整合蛋白的丧失导致损伤的骨骼肌中较少的活化卫星细胞，以及调控肌源性分化的发育程序中的延迟响应。

α7整合蛋白缺失型小鼠的层粘连蛋白处理

层粘连蛋白-111处理在α7整合蛋白缺失型小鼠中恢复了肌膜完整 性

最近的研究显示，α7整合蛋白的丧失导致层粘连蛋白表达降低。为了研究层粘连蛋白沉积的减少是否能够解释在α7整合蛋白缺失型小鼠中观察到的缺陷性肌肉再生表型，在心脏毒素损伤之前3天，用层粘连蛋白-111注射TA肌肉。

将层粘连蛋白-111注射到2周龄野生型和α7整合蛋白缺陷的幼仔的TA肌肉中，使用抗层粘连蛋白-α1抗体通过免疫荧光对组织进行分析。肌肉也用不含层粘连蛋白-111的单独的PBS注射。到第4天时，层粘连蛋白-111富集在肌纤维周围的细胞外基质中，并坚持到28天以上。在培养的肌纤维中层粘连蛋白-111的滴度，在浓度为200nM及以上时显示出增加的毒性(数据未显示)。

令人吃惊的是，注射的层粘连蛋白-111在24-72小时内快速渗透整个TA肌肉(图11和补充数据)，并在整个肌肉中维持至少31天(图11)。在心脏毒素损伤后所有时间点处，用层粘连蛋白-111处理的α7整合蛋白缺陷肌肉外观表现与野生型肌肉相同(图12)。

心脏毒素诱导的损伤后EBD摄入的分析显示，在所有时间点处，在层粘连蛋白处理的野生型或α7整合蛋白缺陷肌肉之间EBD阳性肌纤维的百分率没有差别(图13)。这些结果证实，在心脏毒素诱导的损伤之前注射层粘连蛋白-111，恢复了α7整合蛋白缺陷肌肉的肌膜完整性。

层粘连蛋白在整合蛋白缺失型小鼠中介导肌肉再生

为了研究层粘连蛋白-111增强肌肉再生的能力，用层粘连蛋白注射5周龄野生型和α7整合蛋白缺陷的TA肌肉，并进行心脏毒素诱导的损伤。将肌肉切片用H&E染色，并检查了单核细胞浸润和中央定位的核(图14)。在损伤后第4、10或28天，在用层粘连蛋白-111处理的野生型和α7整合蛋白缺陷肌肉中没有观察到肌纤维尺寸、中央定位的核或单核细胞浸润的差异(图14)。

中央定位的核的定量，证实了层粘连蛋白-111处理将肌肉再生恢复到野生型水平(图15)。在所有时间点处，在层粘连蛋白处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中分析到的中央定位的核的百分率，彼此之间没有显著差异。这些结果表明，在α7整合蛋白缺陷肌肉中，层粘连蛋白-111将肌肉修复恢复到野生型水平。

通过测量eMyHC表达，检测了层粘连蛋白-111恢复α7整合蛋白缺陷肌肉的再生能力的能力(图16)。在第0天，作为用层粘连蛋白注射的结果，7.3％的野生型纤维和9.7％的α7整合蛋白缺陷纤维是eMyHC阳性的(图16)。在心脏毒素处理后第4和10天，野生型和α7整合蛋白缺陷肌肉显示出相似的eMyHC表达水平(图16)。在损伤后第28天，在野生型肌肉中只存在可忽略量的eMyHC，而在α7整合蛋白缺陷肌肉中，34.4％的肌纤维是eMyHC阳性的(图16)。这些结果证明了注射层粘连蛋白-111极大地增强了α7整合蛋白缺陷肌肉的再生能力。

层粘连蛋白疗法在α7整合蛋白缺失型小鼠中恢复了肌纤维面积

在心脏毒素诱导的损伤之前和之后，测量了层粘连蛋白处理的野生型和α7整合蛋白缺失型小鼠中肌纤维的横截面积(图17)。在损伤后第4天，发现野生型小鼠中肌肉的肌纤维横截面积只比α7整合蛋白缺陷肌肉的大13％(图17)。到心脏毒素损伤后第10和28天时，α7整合蛋白缺陷肌肉中肌纤维的横截面积与野生型动物相似(图17)。这些数据合在一起，表明用层粘连蛋白-111处理在α7整合蛋白缺陷肌肉中恢复了肌肉修复和肌纤维尺寸。

层粘连蛋白在α7整合蛋白缺陷的损伤肌肉中促进卫星细胞增殖

为了研究层粘连蛋白处理是否提高卫星细胞的增殖，测量了肌肉损伤后BrdU的掺入(图18)。在心脏毒素损伤后第0、4和10天，在野生型和α7整合蛋白缺陷肌肉中没有观察到BrdU阳性卫星细胞数量的差异(图18)。在损伤后第28天，在α7整合蛋白缺陷肌肉中，与野生型相比存在明显更多的BrdU阳性卫星细胞(图18)。这些结果表明，用层粘连蛋白处理将卫星细胞的增殖恢复到野生型水平。

层粘连蛋白处理恢复了α7整合蛋白缺陷肌肉的成肌细胞分化

为了研究用层粘连蛋白-111处理是否在α7整合蛋白缺陷肌肉中恢复肌源性修复程序，检测了Pax7和MyoD的表达(图19和20)。在心脏毒素损伤之前，野生型和α7整合蛋白缺陷肌肉显示出少量Pax7阳性细胞，这可以归因于来自层粘连蛋白注射的小量损伤(图19)。在心脏毒素损伤后第4天，在层粘连蛋白处理的α7整合蛋白缺陷肌肉中，与野生型相比，Pax7阳性细胞少20％(图19)。在心脏毒素损伤后第10和28天，在α7整合蛋白缺陷肌肉中Pax7阳性细胞的水平与野生型肌肉相似(图19)。

MyoD的分析显示，在第0天时，在层粘连蛋白处理的野生型和α7整合蛋白缺陷的TA肌肉中有少量阳性细胞(图20)。在心脏毒素损伤后第4和10天时，在层粘连蛋白处理的α7整合蛋白缺陷肌肉中MyoD阳性细胞的数量比野生型低大约20-25％(图20)。但是，到第28天时，野生型和α7整合蛋白缺陷肌肉具有相似数量的MyoD阳性细胞(图20)。这些数据表明，层粘连蛋白处理在α7整合蛋白缺陷肌肉中基本上恢复了肌源性细胞的数量，并促进了参与肌肉修复的肌源性程序的活化。

讨论

本实施例证明了α7整合蛋白缺失型小鼠在心脏毒素诱导的损伤后表现出缺陷的骨骼肌再生。用层粘连蛋白处理校正了缺陷的修复表型。尽管在骨骼肌再生过程中肌源性发育程序的某些方面已经被阐明，但总的来说，细胞外基质和整合蛋白细胞表面受体参与肌源性修复的机制还没有被很好地了解。

肌肉损伤后，卫星细胞快速活化。在活化后，这些细胞增殖并激活肌源性发育程序，以修复损伤的肌肉。模型表明，卫星细胞的亚群体保持作为干细胞，以代替已经沿着肌源性谱系途径进化的细胞。在活化过程中，卫星细胞表达转录因子Pax3、Pax7、MyoD、成肌蛋白和MRF4。

本实施例证明了α7整合蛋白的丧失导致了卫星细胞增殖的降低，正如通过在心脏毒素处理的α7整合蛋白缺陷肌肉中减少的BrdU掺入和Pax7表达所确定的。此外，在损伤的α7整合蛋白缺陷肌肉中，成肌细胞的分化明显降低，正如通过MyoD表达所测量的。这些数据表明，α7β1整合蛋白调控肌肉再生早期的关键过渡时期，其中卫星细胞被活化以增殖和分化成能够修复肌肉的肌源性细胞。

本实施例中显示的结果，证明了在损伤的α7整合蛋白缺陷的肌纤维中，中央定位的核的存在显著减少，并且eMyHC的表达延迟。中央定位的核的存在和eMyHC的表达表明α7整合蛋白缺陷的成肌细胞能够在体内融合。这些观察支持了体外研究，在体外研究中证明了原代α7整合蛋白缺陷的成肌细胞在细胞培养中能够融合以形成肌管。这些观察合在一起，表明在体内肌肉修复的延迟，主要是由于成肌细胞增殖和分化的缺陷，致使能够修复受损肌肉的肌源性细胞较少。

因为骨骼肌的再生能力取决于卫星细胞与细胞外基质之间错综复杂的相互作用，因此α7整合蛋白缺乏可能导致肌源性修复所需的最适的富含层粘连蛋白的微环境的丧失。为了确定层粘连蛋白沉积的降低是否造成了在α7整合蛋白缺失型小鼠中观察到的肌肉再生表型的减少，在损伤前将层粘连蛋白-111注射到小鼠肌肉中。正常情况下，层粘连蛋白由骨骼肌细胞产生，并分泌到周围的基底层中。有趣的是，在48-72小时内，注射的层粘连蛋白-111扩散到整个TA肌肉中，并在基底膜中保持了31天以上。在心脏毒素诱导的损伤之前用层粘连蛋白-111注射肌肉，在α7整合蛋白缺失型小鼠中将肌肉再生恢复到野生型水平。这些数据证明，在α7整合蛋白缺陷的骨骼肌中丧失层粘连蛋白微环境，是在这些动物中观察到的肌肉修复缺陷的潜在原因。

尽管层粘连蛋白-211和层粘连蛋白-221表达在成年肌肉中，但层粘连蛋白-111只出现在胚胎骨骼肌中。对层粘连蛋白处理的α7整合蛋白缺陷肌肉中肌肉再生改善的一种可能的解释，是注射层粘连蛋白-111可能在成年骨骼肌中重演了胚胎肌源性程序。这种胚胎程序的活化，可以导致增加的成肌细胞活化和增殖，以及改进的肌肉修复。但是，将层粘连蛋白-111注射到野生型骨骼肌中没有增加再生能力，表明层粘连蛋白-111发挥作用以代替α7整合蛋白缺陷的骨骼肌中的层粘连蛋白-211/221的作用。这些结果表明，在卫星细胞中表达有其他层粘连蛋白受体，它们与层粘连蛋白正常相互作用，促进了肌源性修复，或可发挥作用以补偿成肌细胞中α7整合蛋白的丧失。

本实施例表明，带有α7整合蛋白突变的对象患有先天性肌肉病，是由于减少的层粘连蛋白-211/221沉积而引起的肌肉再生能力降低的结果。这些数据还证明，直接注射纯化的层粘连蛋白-111，可以用作α7整合蛋白先天性肌肉病患者的可能疗法。因为再生能力的丧失涉及许多不同的肌营养不良症，包括MDC 1A和DMD，因此层粘连蛋白-111蛋白疗法可能在其它类型的肌营养不良症中也是有益的。

实施例2

材料与方法

动物

在这些研究中，C57BL/10ScSn(野生型)和C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(mdx)种系小鼠(Jackson Laboratories，BarHarbor，ME)，按照内华达大学(University of Nevada，Reno)动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)批准的动物方案使用。

α7βgal ^+/- 成肌细胞的分离

从10日龄α7βgal^+/-小鼠取出腓肠肌肌肉，将组织用剪刀切碎。细胞用1.25mg/ml II型胶原蛋白(Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ)在37℃酶法解离1小时。将浆液轻柔研磨，通过尼龙筛网过滤。通过差速离心将细胞与肌纤维片段分离，铺于100mm组织培养板上。成肌细胞在增殖培养基(添加有10％胎牛血清(FBS)，0.5％鸡胚提取物，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基(DMEM))中维持。

β-半乳糖苷酶染色

将成肌细胞或肌管在4％聚甲醛中固定5分钟，用1X PBS洗涤，用去氧胆酸钠/NP40混合物通透化30分钟。向板中加入X-gal(50mM亚铁氰化钾，50mM铁氰化钾，1M MgCl₂和100mg/ml X-gal)，在37℃温育2小时。将板在PBS中清洗。图像使用解剖显微镜和Spot数字相机捕获。

荧光活化的流式分拣(FACS)

将大约1x10⁶个α7βgal^+/-成肌细胞接种到100mm包被有0.1％明胶的细胞培养板上，在37℃温育过夜。除去生长培养基，将细胞用PBS中的100nM LAM-111处理16-24小时。将细胞用胰蛋白酶处理，计数，沉淀，并加入30μl含有20％FBS的DMEM生长培养基。向细胞中加入30μl 200nM的FDG(Molecular Probes，Eugene，OR)，在37℃温育1分钟。为了停止反应，向每个样品加入600μl冰冷的生长培养基，在冰上温育20分钟。样品在Beckman Coulter XL/MCI流式细胞仪上运行，使用FlowJo软件分析。

层粘连蛋白-111的注射

将在PBS中的100nM天然小鼠层粘连蛋白(Invitrogen)注射到10日龄mdx小鼠的左侧胫骨前肌(TA)肌肉中。对侧的右侧TA肌肉用100μl PBS注射，并用作对照。在5周龄时，将小鼠处死，收获肌肉。对于全身性投送来说，在10日龄时腹膜内注射PBS中的1mg/kg层粘连蛋白-111，在5周龄时收获组织用于分析。对照mdx小鼠用同样体积的PBS注射。

伊文思蓝染料摄入

对于小鼠，每10g体重腹膜内注射50μl无菌伊文思蓝染料溶液(10mg/ml)。3小时后，收获TA肌肉，在液氮中速冻。将10μm的冷冻切片放置在显微镜玻片上，在4％聚甲醛中固定。将组织切片与2μg/ml俄勒冈绿-488偶联的麦胚凝集素(WGA)(Molecular Probes，Eugene，OR)温育，来显示肌纤维的轮廓。对每只动物计数至少1000个纤维，以确定对伊文思蓝染料摄入阳性的肌纤维的百分率。每种基因型至少分析5只动物。以630X放大倍数捕获图像并进行计数。

血液化学

在5周龄时收集血液，允许其在室温凝结最少30分钟。以3000rpm离心后，收集血清。将血清送往戴维斯的加利福尼亚大学比较病理学实验室(Comparative Pathology Laboratory at the University of California，Davis)，分析肌酸激酶、肌酸和血液尿素氮(BUN)。

免疫荧光

将组织包埋在Tissue-TEK的Optimal Cutting Temperature化合物中(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)。使用Leica CM1850低温恒温器(Leica Microsystems，Wetzlar，DE)，将10μm的切片放置在Surgipath显微镜玻片上(Surgipath Medical Industries，Richmond，IL)。α7整合蛋白使用1∶1000稀释的抗CA5.5大鼠单克隆抗体(SierraBiosource，Morgan Hill，CA)，然后使用1∶1000稀释的FITC偶联的抗大鼠第二抗体进行检测。β1D整合蛋白使用1∶500稀释的兔多克隆抗体，然后使用1∶500稀释的FITC偶联的抗兔抗体进行检测。层粘连蛋白-α1使用1∶500稀释的MAB 1903(Chemicon International，Temecula，CA)检测。肌养蛋白使用小鼠单克隆Dys2抗体(Novacastra Laboratories，Ltd，Newcastle upon Tyne，UK)检测，肌养相关蛋白使用针对肌养相关蛋白的MANCHO7 7F3单克隆抗体(Glenn Morris，Center for InheritedNeuromuscular Disease，Shropshire，UK)1∶200稀释检测。将小鼠单克隆抗体与用于阻断小鼠免疫球蛋白的小鼠-小鼠(mouse-on-mouse(MOM))免疫检测试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)、和1∶500稀释的FITC偶联的抗小鼠第二抗体组合使用。乙酰胆碱受体使用1∶1000的罗丹明标记的α-金环蛇毒素(Molecular Probes，Eugene，OR)检测。荧光使用Zeiss Axioskop 2 Plus荧光显微镜观察，图像用Zeiss AxioCam HRc数字相机和Axiovision 4.1软件捕获(都可以从CarlZeiss Microimaging，Thornwood，NY获得)。

组织学

将组织切片在冰冷的95％乙醇中固定2分钟，然后用70％乙醇固定2分钟，然后在流水中重新水合5分钟。将切片用Gill′s苏木精(FisherScientific，Fair Lawn，NJ)染色，在水中清洗5分钟。将切片放置在Scott′s溶液(0.024M NaHCO₃，0.17M MgSO₄)中3分钟，在水中清洗5分钟。然后将切片用曙红(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)染色2分钟。将切片在冰冷的70％和95％乙醇中各30秒，然后在100％乙醇中2分钟，进行逐次脱水，并在二甲苯中清洁5分钟，然后用DePeX固定介质(Electron Microscopy Sciences，Washington，PA)固定。再生肌肉中的中央肌核通过亮视野显微术以630X放大倍数计数。通过对每只动物计数最少1000个肌纤维来确定每个肌纤维的中央核的数量。分析了来自每种基因型的至少5只动物。

免疫印迹

为了分析α7整合蛋白，使用200mM辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma Aldrich，St Louis，MO)，50mM Tris-HCl pH 7.4，150mMNaCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，2mM PMSF和1∶200稀释的蛋白酶抑制剂混合物套装III(Protease Inhibitor Cocktail Set III)(Calbiochem，EMD Biosciences，San Diego，CA)，提取了蛋白。收集裂解液，以10,000xg离心15分钟，将上清液转移到新的管中。蛋白通过Bradford分析定量，将总共40μg蛋白在非还原条件下在7.5％SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在用磷酸缓冲盐水(PBS)1∶1稀释的Odyssey阻断缓冲液(LiCor Biosciences，Lincoln，NE)中阻断。α7整合蛋白使用1∶500稀释的兔抗α7B(B2347)多克隆抗体进行检测。将印迹与1∶5000稀释的Alexa Fluor 680偶联的山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)温育，以检测第一抗体。

为了检测肌养相关蛋白的表达，从注射PBS和LAM-111的mdx和野生型胫骨前肌，使用RIPA缓冲液(50mM Hepes pH 7.4，150mMNaCl，1mM Na₃VO₄，10mM NaF，0.5％Triton X-100，0.5％NP40，10％甘油，2mM PMSF和1∶200稀释的蛋白酶抑制剂混合物套装III)提取了蛋白，通过Bradford分析方法(BioRad Laboratories Inc.，Hercules，CA)定量。将总共80μg蛋白在7.5％SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。将印迹与1∶200稀释的抗肌养相关蛋白小鼠单克隆抗体(MANCHO3 8A4，来自Center for Inherited NeuromuscularDisease，Shropshire，UK的Glenn Morris的好意馈赠)温育，然后与1∶50,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠第二抗体温育。395kDa的肌养相关蛋白条带通过化学发光检测，通过使用抗Cox-1抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)探测同样印迹，对蛋白载量进行归一化。条带强度使用ImageQuant TL软件(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)定量。

统计学分析

所有平均的数据被报告为平均值±标准偏差。多个组之间的比较，对于参数型数据通过单因素方差分析(ANOVA)进行，或者对于非参数型数据通过Kruskal-Wallis组间行单因素方差分析进行，使用了SigmaStat 1.0软件(Jandel Corporation，San Rafael，CA)。P＜0.05被认为是统计学显著的。

讨论

杜兴氏肌营养不良症(DMD)是由编码肌养蛋白的基因中的突变引起的破坏性神经肌肉疾病。α7β1整合蛋白和肌养相关蛋白是在DMD患者和mdx小鼠模型的肌肉中上调的层粘连蛋白结合蛋白。肌养相关蛋白或α7整合蛋白在营养不良小鼠中的转基因过表达缓解了肌肉疾病，使得这些基因成为药物干预的靶。为了确定层粘连蛋白是否调节α7整合蛋白的表达，将培养的小鼠和人类成肌细胞用层粘连蛋白进行处理，并分析了α7整合蛋白的表达。本实施例证明了层粘连蛋白-111，一种在胚胎发育过程中高度表达的层粘连蛋白形式，增加了来自小鼠和DMD患者的培养的成肌细胞中α7整合蛋白的表达。将层粘连蛋白-111肌肉内注射到mdx小鼠中，增加了β7整合蛋白和肌养相关蛋白的表达，稳定了肌膜，防止了肌肉疾病。全身性层粘连蛋白-111蛋白疗法，将mdx小鼠中血清肌酸激酶水平恢复到正常范围内。这些发现证明了层粘连蛋白-111对于DMD的小鼠模型来说是高度有力的新的蛋白治疗物，代表了全身性投送细胞外基质蛋白作为遗传疾病疗法的新范例。

杜兴氏肌营养不良症(DMD)是最常见的X染色体连锁疾病，在每3,500个男性中有1人患病。DMD患者表现出严重的、进行性的肌肉消瘦，症状在2到5岁首次出现。随着疾病发展，患者被限制于轮椅上，需要呼吸器帮助，在它们生命的第二个或第三个十年中死亡。到目前为止，对于这种破坏性的神经肌肉疾病，没有有效的治疗或治愈方法。

DMD患者和mdx小鼠(DMD的小鼠模型)在编码肌养蛋白的基因中具有突变，导致肌养蛋白的丧失。肌养蛋白是位于肌纤维细胞质内膜上的427kDa的蛋白。通过其N-末端棒状结构域重复序列，肌养蛋白可以与细胞骨架的F-肌动蛋白相互作用。肌养蛋白的C-末端区域与由α-和β-肌营养不良蛋白聚糖、小肌营养蛋白、α-和β-肌养蛋白结合蛋白(syntrophin)和肌聚糖构成的跨膜复合物相互作用。肌养蛋白糖蛋白复合物在肌肉的细胞外基质中细胞骨架和层粘连蛋白之间提供跨膜连接。肌养蛋白的丧失导致不能形成这种关键的层粘连蛋白结合复合物，引起损伤和进行性的肌肉虚弱。

在缺少肌养蛋白的情况下，在DMD患者和mdx小鼠的骨骼肌中两种其他的层粘连蛋白结合复合物，α7β1整合蛋白和肌养相关蛋白糖蛋白复合物，上调了。在骨骼肌中转基因增加肌养相关蛋白或α7整合蛋白，在营养不良的小鼠中缓解了肌肉疾病。另一方面，在mdx小鼠中丧失肌养相关蛋白或α7整合蛋白导致了更严重的表型和降低的生存力。这些结果合在一起，表明肌养相关蛋白和α7β1整合蛋白是疾病发展的遗传调节物，并且是用于增加它们表达的基于药物的疗法的靶。

为了特定分子是否增加α7整合蛋白的表达，开发了基于肌肉细胞的分析方法。产生了α7整合蛋白缺陷小鼠，其中编码α7整合蛋白的基因的外显子1被LacZ报告基因取代。在这些小鼠中，所有转录调节元件被保留，允许通过β-半乳糖苷酶报告α7整合蛋白启动子活性。从10日龄α7^+/-幼仔分离了原代成肌细胞(命名为α7βgal^+/-)。α7βgal^+/-成肌细胞表达的β-半乳糖苷酶在分化后增加(图21和22)，与成肌细胞和肌管中α7整合蛋白的表达样式一致。通过β-半乳糖苷酶将不发荧光的化合物荧光素二β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)切割成荧光素，测量了α7整合蛋白启动子的活性。

几条线路的证据表明了在层粘连蛋白和α7整合蛋白表达的调控中的正反馈。编码层粘连蛋白-α2的基因中的突变，导致了1A型先天性肌营养不良症(MDC1A)。MDC1A患者和层粘连蛋白-α2缺陷小鼠都具有急剧降低的α7整合蛋白水平，这可能造成了严重的肌肉疾病。此外，在α7整合蛋白缺陷的骨骼肌中，层粘连蛋白-α2降低了。为了确定层粘连蛋白与α7整合蛋白表达之间的关系，将α7βgal^+/-成肌细胞在0-200nM的各种层粘连蛋白-111浓度中暴露24小时。研究表明，层粘连蛋白-111在功能上类似层粘连蛋白-211，与α7β1整合蛋白相互作用。荧光激活的细胞分拣(FACS)分析表明，在100nM层粘连蛋白-111时，α7整合蛋白启动子的活性最高(图23)。

对层粘连蛋白-111处理的C2C12小鼠成肌细胞和DMD原代成肌细胞中的α7整合蛋白进行了定量。对来自层粘连蛋白处理的成肌细胞的蛋白提取物进行了Western分析以检测α7B整合蛋白。层粘连蛋白-111在C2C12和DMD成肌细胞中产生了2倍增加的α7B整合蛋白(图24和25)。这些数据表明，层粘连蛋白-111增加了人类和小鼠肌肉细胞中α7整合蛋白的表达。

然后确定了是否上述使用层粘连蛋白-111的体外结果可以适用于体内，以增加骨骼肌中α7整合蛋白的表达。将10日龄的mdx小鼠的左侧胫骨前肌(TA)肌肉用100μl100nM层粘连蛋白-111进行注射，而右侧TA肌肉用100μl PBS注射，并用作对侧对照。在5周龄时，将小鼠处死，收获TA肌肉。层粘连蛋白-111一般不在成年肌肉中表达，注射的蛋白用抗层粘连蛋白-α1抗体检测。免疫荧光显示，注射的层粘连蛋白-111蛋白沉积在5周龄mdx小鼠的TA肌肉的整个基底层中(图26)。照片也证实肌养蛋白存在于野生型肌肉中，但是在PBS和层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉中都不存在。

为了确定层粘连蛋白-111是否在mdx小鼠中预防肌肉疾病，在来自PBS和层粘连蛋白-111注射的TA肌肉的冷冻切片上进行了伊文思蓝染料(EBD)摄入和苏木精与曙红(H&E)染色(图27)。分析显示，用层粘连蛋白-111注射的mdx肌肉与对侧对照相比，EBD阳性的纤维的百分率降低了12倍(图28，^*P＜0.05，^**P＜0.001，n＝5只小鼠/组)。此外，用层粘连蛋白-111注射的mdx肌肉显示出具有中央定位的核的肌肉纤维的百分率降低了4倍(图28，^*P＜0.05，^**P＜0.001，n＝5只小鼠/组)。这些结果表明，层粘连蛋白-111蛋白疗法极大增加了肌膜的完整性，降低了对肌肉修复的需要。

为了确定层粘连蛋白-111蛋白疗法保护肌养蛋白缺陷肌肉免于损伤的机制，进行了肌养相关蛋白和α7整合蛋白的免疫荧光分析。结果显示出在层粘连蛋白-111处理的mdx小鼠的肌肉中，与对照相比，α7整合蛋白和肌养相关蛋白的表达和接头外定位增加(图29)。

为了验证和定量这些观察，对PBS和层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉进行了Western分析(图30)。在层粘连蛋白-111处理的mdx肌肉中，与对照相比，观察到α7A和α7B整合蛋白同工型分别增加了1.6和2.6倍(图31，^*P＝＜0.05，^**P＝＜0.001，n＝5只小鼠/组)。蛋白载量被归一化为环加氧酶-1(cox-1)。此外，在层粘连蛋白-111处理的肌肉中，观察到肌养相关蛋白增加了1.3倍(图31，^*P＝＜0.05，^**P＝＜0.001，n＝5只小鼠/组)。没有观察到β1D整合蛋白水平的显著变化，与在α7整合蛋白转基因小鼠中报道的结果一致。这些结果显示，层粘连蛋白-111增加了α7整合蛋白和肌养相关蛋白二者的表达，这两种蛋白当在营养不良肌肉中转基因过表达时，已知能减轻肌肉疾病。

DMD患者遭受普遍化的肌肉消瘦。因此，有效的疗法应该靶向所有肌肉，包括心脏和横膈膜。然后，确定了层粘连蛋白-111是否能够全身性投送到这些肌肉。以1mg/kg对10日龄mdx幼仔腹膜内注射一剂层粘连蛋白-111，在5周龄时对组织进行分析。免疫荧光分析显示，在层粘连蛋白-111注射的小鼠的横膈肌和腓肠肌的整个基底层中存在层粘连蛋白-α1，而对照是阴性的(图32和33)。心肌的分析显示出层粘连蛋白-111围绕着心肌细胞(图32)。

为了确定层粘连蛋白-111的全身性投送是否是治疗性的，在层粘连蛋白-111注射后3周收集血清，并测量肌酸激酶水平。在DMD患者中，由于肌肉损伤，血清肌酸激酶极大升高，肌酸激酶的水平被用于诊断和预后目的。该实施例证明了层粘连蛋白-111疗法导致与PBS对照相比血清肌酸激酶水平降低了2.6倍(图34，^*P＜0.05，n＝5只小鼠/组)。这些水平与野生型小鼠中肌酸激酶水平没有统计学差异。这些结果证明了层粘连蛋白-111可以全身性投送到mdx小鼠的主要肌肉系统中，以预防营养不良疾病。

因为层粘连蛋白-111相对大，可能对肾功能有不利影响，因此测量了血清肌酸和血液尿素氮(BUN)。分析显示，在层粘连蛋白-111处理的mdx和对照小鼠之间，肌酸和BUN没有统计学差异(图34，^*P＜0.05，n＝只小鼠/组)。这些数据表明，层粘连蛋白-111蛋白疗法对肾功能没有不利影响。

本实施例第一次证明了单次全身性层粘连蛋白-111给药，在遗传上注定要发生肌营养不良症的小鼠中，将肌肉疾病的发作阻止了至少3周。这些发现合在一起，证明了层粘连蛋白-111可能是用于杜兴氏肌营养不良症的高度有力的、新的蛋白治疗物。此外，层粘连蛋白-111蛋白疗法在其他肌肉疾病的治疗中可能也被证明是有效地，这些疾病包括1A型先天性肌营养不良症、肢带型肌营养不良症和α7整合蛋白先天性肌病。层粘连蛋白-111注射在营养不良小鼠中的有效性代表了一种新的范例，证明了全身性投送细胞外基质蛋白可以被开发成用于遗传病的疗法。

应该理解，上面的讨论提供了各种不同实施方案的详细描述。上面的描述将使本技术领域的专业人员能够作出与上面描述的具体实施例的许多偏离，以提供按照本公开构建的装置。实施方案是说明性的，不打算限制本公开的范围。相反，本公开的范围由发布的权利要求书及其等价物的范围所决定。

Claims (33)

1.在对象中增强肌肉再生、修复或维持的方法，包括向所述对象施用治疗有效量的层粘连蛋白的至少一部分。

2.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白-1的至少一部分。

3.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白-1。

4.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白-2的至少一部分。

5.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白-2。

6.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白-4的至少一部分。

7.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白-4。

8.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白-1、层粘连蛋白-2、层粘连蛋白-4或其组合的全部或一部分。

9.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白的α1链。

10.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白包含层粘连蛋白α1链的至少一部分。

11.权利要求1的方法，还包含在向对象施用治疗有效量的层粘连蛋白的至少一部分之前，对患有特征为肌肉再生受损的病症的对象进行诊断。

12.权利要求1的方法，其中对象患有特征为肋节成分的产生受损的病症。

13.权利要求1的方法，其中对象患有肌养蛋白的产生受损。

14.权利要求1的方法，其中对象患有层粘连蛋白的产生受损。

15.权利要求1的方法，其中对象患有α7β1整合蛋白的产生受损。

16.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白与附加的治疗性药剂一起施用。

17.权利要求1的方法，其中附加的治疗性药剂选自肋节蛋白、生长因子、卫星细胞、干细胞和肌细胞。

18.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白在对象经历肌肉损伤或疾病之前施用。

19.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白全身性施用于对象。

20.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白通过注射到胃中施用于对象。

21.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白肠胃外施用于对象。

22.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白通过肌肉内注射施用。

23.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白通过腹膜内注射施用。

24.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白选自层粘连蛋白的衍生物、类似物或片段。

25.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白以大约50nM到大约200nm之间的浓度施用。

26.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白以大约100nM的浓度施用。

27.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白以大约1nmol/g到大约50nmol/g对象体重之间的量施用。

28.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白以大约2nmol/g到大约20nmol/g对象体重之间的量施用。

29.权利要求1的方法，其中层粘连蛋白以大约2nmol/g到大约10nmol/g对象体重之间的量施用。

30.在对象中促进伤口愈合的方法，包括向对象施用有效量的层粘连蛋白。

31.在对象中前瞻性预防或减轻肌肉受损或损伤的方法，包括向对象施用有效量的层粘连蛋白。

32.在对象中增强伤口愈合的方法，包括向对象施用治疗有效量的层粘连蛋白的至少一部分。

33.治疗对象的方法，包括向对象施用治疗有效量的层粘连蛋白的至少一部分。

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