JP2011500576A - ラミニン、派生物、及びそれらを含む組成物並びにそれらの治療用途方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、認可番号NCRR P20 RR018751-01及びP20 RR15581-04のNational Institute of Health (NIH)及びNational Center for Research Resources、認可番号NIAMS R01AR053697-01のNational Institute of
Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases、及び認可番号NINDS R21NS058429-01のNational Institute of
Neurological Disorders and Strokeからの許可の下、合衆国政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明に特定の権限を有する。
PBS リン酸緩衝食塩水
LAM−111 α1β1γ1鎖を含むラミニン−1
NaCl 塩化ナトリウム
NaOH 水酸化ナトリウム
HCl 塩化水素
MCMD、MDC1A メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー
DMSO ジメチルスルホキシド
EDTA エチレンジアミン四酢酸
eMyHC 胚性ミオシン重鎖
BrdU ブロモデオキシウリジン
TA 前脛骨
H&E ヘモキシリン&エオシン
GFP 緑色蛍光たんぱく質
WT 野生型
EBD エバンズブルー染色
DMD デュシェンヌ筋ジストロフィー
CLN 中心核
nmol ナノモル
nM ナノモル
MyoD 筋原定量たんぱく質
MIBP 筋特異α1−インテグリン結合たんぱく質
FACS 蛍光標示式細胞分取
FITC フルオレセインイソチオシアネート
Pax7 Pax7
Pax3 Pax3
Cox−1 シクロオキシゲナーゼ
MRF4 MRF4
本実施例の理解を容易にするために、後述の説明が提供される。
IM)、腹腔内(IP)、静脈(IV)、胸骨内注射又は点滴、経鼻(吸入)、髄空内、腹部注射、皮下注射(SQ及びdepot
SQ)、経皮、局所、及び点眼を含むが、これに限定されない。
Americas, Inc., Wilmington, DE)のような界面活性剤を使用する含水重炭酸ナトリウムでの溶解が含まれ周知されているがこれに限定されない。
物質及び方法
動物
これらの研究に使用される野生型(C57BL/6)、α7インテグリン欠損(C57BL/6 background)、及びネスチンGFPマウス(C57BL/6 background)は、ネバダ州立大学リノ校及びワシントン州立大学、並びにSeattle Institutional Animal Care and Use
Committeesによって認可された手続に従って安楽死させた。
前脛骨筋(TA)は、最適切削温度(OCT)(Tissue-Tek; Sakura Finetek, Torrance, California,
United States)に取り込まれ、10μm凍結切片がLeica CM1850低温保持装置を使用して切り取られ、Surgipath顕微鏡スライド(Surgipath Medical Industries, Richmond, IL)に配置された。組織切片は、非特許文献9「ジストロフィン及びα7インテグリンが欠如している重度の筋ジストロフィーのマウス」ですでに説明されているように、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)を使用して染色された。この特許文献13は、その開示内容に矛盾しない範囲で本明細書に引用して援用する。再生筋肉の中央筋核は、明視野顕微鏡検査により630倍の倍率で数えられた。筋線維ごとの中心核の数は、動物ごとに最低1000筋線維を数えることにより測定された。各遺伝子型から少なくとも5種類の動物が分析された。更に、断面部は、時点ごとグループつきに最低5000筋線維において検査された。結果は、平均線維断面部として報告された。
前脛骨筋(TA)は、Tissue-TEK適温切削温度化合物(Sakura
Finetek USA Inc., Torrance, CA)に取り込まれた。切片は、Leica
CM1850低温保持装置を使用して10μmで切り取られ、Surgipath顕微鏡スライド(Surgipath Medical Industries, Richmond, IL)に配置された。ラミニン−α2鎖は、1:500希釈のラビット坑ラミニン−α2ポリクロナール抗体(Peter Yurchenco, Robert Wood Johnson Medical School,
Department of Pathology, Piscataway, NJからの寄贈)で検出された。ラミニン−α1鎖は、坑ラミニン−α1抗体(sc-5582, Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA)を使用して検出された。主要のウサギ抗体は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)共役坑ウサギ二次抗体の1:500希釈で検出された。
Laboratories, Burlingame, CA)でブロックされた。MyoD及びPax7の発現は、5μg/ml坑MyoD及びanti-Pax7
(Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), Iowa City, IA)を使用することで検出された。eMyHCは、以前に説明されたように検出された(特許文献4)。1μg/ml濃度のテトラメチルローダミン共役コムギ胚芽凝集素(WGA)(Molecular Probes, Eugene, OR)は、筋線維を定義するために使用された。蛍光発光は、Zeiss Axioskop 2 Plus蛍光顕微鏡で観察され、画像はZeiss AxioCam HRcデジタルカメラ及びAxiovision 4.1ソフトウエア(全てCarl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NYで入手可能)により撮影された。複数の隣接部分は、動物ごとに630倍率で20のランダムで非オーバーラップの顕微鏡視野により分析された。
BioSource, Morgan Hill, CA)の1:1000希釈で溶媒された。坑−α7インテグリンラット抗体は、ローダミン標識坑ラット二次抗体を使用して感知された。GFP及びローダミン蛍光発光の両者は、倒立蛍光発光顕微鏡(Nikon eclipse, TE2000-S, Nikon Instruments, Inc.,
Melville, NY)を使用して感知され、画像は、MetaVue Imaging System (Universal Imaging
Corporation, Downingtown, PA)により制御されたCoolSNAPESモノクロームCCDカメラ(Princeton
Instruments Inc., Trenton, NJ)によって取得された。
体重10gにつき50μlの10mg/ml溶液の滅菌エバンズブルー染色(EBD)溶液をマウスに腹腔内注射した。3時間後、前脛骨筋(TA)が採取され、液体窒素で急速冷凍された。10μmの凍結切片が顕微鏡スライドの上に配置され、4%のパラホルムアルデヒドに固定された。筋線維は、組織断片をOregon Green-488共役コムギ胚芽凝集素
(2μg/ml, Molecular Probes, Eugene, OR)で培養することにより要約される。EBDに陽性な筋線維の割合を測定するために一動物につき最低1000繊維が数えられた。各遺伝子型から少なくとも4種類の動物が分析された。画像は撮影され、計測は630倍の倍率で行われた。
筋肉採取の72時間前、48時間前、及び24時間前にBrdU(500mg/kg)が腹腔内に注射された。筋肉凍結切片は、1分の間95%のエタノールの中に固定された。凍結切片はその後、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄され、2N塩酸(HCl)で20分間処置された。凍結切片は20分間50mMの塩化ナトリウムで中和された後、100mMのトリス塩酸で20分間培養され、PBSで洗浄された。組織は坑BrdU抗体(G3G4,
1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), Iowa City, IA)で1時間培養後、PBSで洗浄され、Vectashield
(Vector Labs, Burlingame, CA)に取り付けられた。
マウスは、トリブロモエタノール(Avertin)(体重の0.25μl/g)により麻酔がされ、PBS内の10μl心臓毒溶液(C3987, Sigma, St. Louis, MO)の100μlが、5週齢の雄の野生型α7-/-マウスの左側前脛骨筋に注射された。100μlのPBSが右側の前脛骨筋に注射され、対照として使用された。心臓毒が分析のために注射された後、マウスは安楽死させられ、4日、7日、10日、及び28日の時点の筋肉が採取された。
PBS内の100nMの天然マウスラミニン(Invitrogen,
Carlsbad, CA)が、心臓毒注射の3日前に、麻酔をされた野生型α7-/-マウスの左側前脛骨筋に注射された。PBSの100μlが右側の前脛骨筋に注射され、対照として使用された。筋肉は、心臓毒注射後、0、4、7、10、28日の時点で分析のために採取された。
平均化された全てのデータは、平均値±標準偏差として報告される。複数のグループ間の比較は、パラメータデータのために分散分析(ANOVA)、又はSigmaStat
1.0 software (Jandel Corporation, San Rafael, CA)を使用して非パラメータデータのための段階におけるKruskal-Wallis分散分析によって実施された。P<0.05が、統計的に意味があると思慮された。
衛星細胞においてα7インテグリンが発現することを裏付けるために、ネスチン−GFP導入マウスから隔離された筋線維は、坑α7インテグリン単クローン抗体(図1)を使用する蛍光抗体法を受けた。ネスチン−GFPは特に、静止衛星細胞において発現する。筋線維表面の全てのネスチン−GFP陽性細胞はまた、α7インテグリンに対しても陽性である(図1)。画像分析は、衛星細胞の基底面でのα7インテグリンのより強い局在を示した。これらのデータは、静止衛星細胞がα7インテグリンを発現し、また筋線維に面する基底面で局在が高まることを裏付ける。
最近の研究は、α7インテグリンは、衛星細胞の活性及び/又は増殖において役割を果たすことを説いている。α7β1インテグリンが筋肉修復に必要であるかどうかを試すために、野生型及びα7インテグリン欠損マウスの前脛骨筋は心臓毒由来損傷を受け、4、10、及び28日後に検査された(図2)。心臓毒損傷の4日後、野生型前脛骨筋は健康な様子であり、この状態は28日間続いた。対照的に、α7インテグリン欠損筋肉は、損傷後4日及び10日の時点で白い大きな損傷筋肉箇所を示した。28日後の時点で、筋肉損傷箇所は、まだα7インテグリン欠損マウスにおいて明らかであった。これらのデータは、骨格筋におけるα7インテグリンの損失が筋肉再生の深刻な遅延を引き起こすことを示している。
心臓毒処置後の細胞膜統合性を検査するために、野生型及びα7インテグリン欠損マウスにエバンズブルー染色(EBD)が注射された。心臓毒注射前に、EBD取り込みは両グループには存在していなかった。心臓毒注射前、α7インテグリン欠損マウスはEBD取り込みに対して陰性であったが、4日後の時点で野生型と比較して7倍以上の筋線維がEBD陽性であった。障害後4日の時点において、野生型の8.5%及びα7インテグリン欠損筋線維の66%がEBD陽性であった。10日後、4%以下の野生型筋線維がEBD取り込みに対して陽性であり、一方でα7インテグリン欠損筋線維の40%がEBD陽性であった。心臓毒注射後28日の時点では、17%のα7インテグリン欠損筋線維がEBD陽性のままであり、一方で野生型の筋肉においてはEBDは観測されなかった(P<0.05)(図3)。これらの結果は、心臓毒由来損傷後、α7インテグリンの欠損が筋鞘脆弱性の増加を引き起こすことを示している。
ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色は、心臓毒注射後、単核細胞湿潤及び中心核を検査するために使用される(図4、尺度図は10μmを示す)。心臓毒損傷の4日後、野生型筋肉は単核細胞湿潤と中心核を有した筋線維とを示した(図4)。10日目に至っては、野生型筋肉はほとんど単核湿潤を示さず、ほとんどの筋線維は中心核を有していた。28日までには、野生型筋肉において修復は完了しており、ほとんどの筋線維は中心核を有していて、単核湿潤はほとんど示されなかった。対照的に、心臓毒由来損傷の4日後、α7インテグリン欠損筋肉は広域の単核湿潤と心臓毒損傷の10日後まで及んだ発育不全の筋線維とを示した。28日目までに、α7インテグリン欠損筋肉は、中心核及び単核湿潤を有した発育不全の筋線維を示した。
α7インテグリンの損失が損傷後の筋肉修復に影響したかどうかを究明するために、筋線維断面部が測定された(図7)。野生型マウスの再生筋線維は、心臓毒損傷後4日目のα7インテグリン欠損筋線維より31%大きかった(図7)。10日目においては、α7インテグリン欠損筋線維と比較すると野生型筋線維は45.1%大きかった(図7)。28日目には、野生型筋肉は様々な筋線維サイズを示した。しかしながらこれは、100-600μm2範囲における線維の大部分の小さい断面を引き続き示したα7インテグリン欠損筋肉に対比したものであった。これらの結果は、α7インテグリンの損失が再生能力の低下を引き起こし、発育不全の筋線維を生じさせることを示している。
衛星細胞増殖がα7インテグリン欠損マウスにおいて減少したかどうかを究明するために、衛星細胞の核へのBrdUの取り込みが数値化された(図8)。損傷後4日目では、α7インテグリン欠損筋肉は、野生型動物と比較して3倍少ないBrdU陽性核を有していた。しかしながら、BrdU陽性核は、野生型と比較して10日目及び28日目で、α7インテグリン欠損マウスにおいて増加した(図8)。これらの結果は、衛星細胞増殖が心臓毒由来損傷後、α7インテグリン欠損筋肉において遅延することを示す。
ラミニン−111治療は、α7インテグリン欠損マウスにおいて筋鞘統合性を修復する。
最近の研究は、α7インテグリンの損失がラミニン発現の減少を引き起こすことを示している。ラミニン沈着の減少が、α7インテグリン欠損マウスで観察される筋肉再生表現型欠損の主な原因になったかどうかを研究するために、心臓毒損傷の3日前に、前脛骨筋にラミニン−111が注射された。
筋肉再生を改善するためのラミニン−111の能力を測定するために、5週齢の野生型及びα7インテグリン欠損前脛骨筋にラミニンが注射され、心臓毒由来障害を受けた。筋肉部位は、H&Eで染色され、単核細胞湿潤及び中心核が検査された(図14)。障害後、4日、10日、28日後のラミニン−111で処置された野生型及びα7インテグリン欠損筋肉において筋線維サイズの差、中心核、又は単核細胞湿潤は観測されなかった。
筋線維断面部位は、心臓毒由来損傷前後、ラミニン処置された野生型及びα7インテグリン欠損マウスにおいて検査された。損傷後4日目では、野生型マウスの筋線維断面部位は、α7インテグリン欠損筋肉よりたった13%大きいだけであった。心臓毒損傷後10日目及び28日目には、α7インテグリン欠損筋肉の筋線維断面部位は野生型動物に類似していた(図17)。これらのデータは、ラミニン−111での処置がα7インテグリン欠損筋肉の筋肉修復及び筋線維サイズを戻したことを示す。
ラミニン処置が、衛星細胞増殖を改善したかどうかを研究するために、筋肉損傷後のBrdU取り込みが計測された(図18)。心臓毒損傷後0日、4日、及び10日目では、野生型及びα7インテグリン欠損筋肉においてBrdU陽性衛星細胞の数において差は観測されなかった(図18)。損傷後28日目には、α7インテグリン筋肉において、野生型よりかなり多いBrdU陽性衛星細胞が存在した。これらの結果は、ラミニンによる処置が衛星細胞増殖を野生型レベルまで修復したことを示す。
ラミニン−111による処置が、α7インテグリン欠損筋肉の筋芽細胞修復プログラムを修復したかを調べるために、Pax7及びMyoDの発現が測定された(図19及び図20)。心臓毒損傷の前に、野生型及びα7インテグリン欠損筋肉は、少しのPax7陽性細胞を示し、それはラミニン注射による若干の被害に起因する場合がある(図19)。心臓毒損傷後4日目では、野生型と比較して20%少ないPax7陽性細胞がラミニン処置α7インテグリン欠損筋肉に存在した(図19)。心臓毒損傷後10日目及び28日目において、α7インテグリン欠損筋肉のPax7陽性細胞のレベルは、野生型に類似していた(図19)。
本例は、α7インテグリン欠損マウスが、心臓毒損傷後に骨格筋再生不全を示すことを明らかにする。ラミニンによる処置は修復表現型不全を修正した。筋芽細胞発達プログラムのいくつかの特徴は、骨格筋再生の間に解明されてきてはいるが、細胞外マトリックス及びインテグリン細胞表面受容体が筋芽細胞修復に参加するメカニズムは、一般的によく理解されていない。
動物
C57BL/10ScSn(野生型)及びC57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(mdx)染色(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) マウスは、ネバダ州立大学リノ校Animal Care
and Use Committeeにより承認されたアニマルプロトコルに従ったこれらの研究に使用された。
腓腹筋は、10週齢のα7βgal+/-マウスから取り除かれ、組織はハサミで刻まれた。細胞は、1.25mg/mlコラーゲンタイプII(Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ)により37℃で1時間、酵素的に解離された。スラリーは徐々に粉末にされナイロンメッシュを介してろ過された。細胞は、筋肉細胞切片から分画遠心法により分離され組織培養皿に固定された。筋芽細胞は、増殖媒体(10%のウシ胎児血清(FBS)、0.5%ニワトリ胚抽出物、1%L−グルタミン、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補完されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM))に維持された。
筋芽線維又は筋管は、4%のパラホルムアルデヒドに5分間固定され、1倍のPBSで洗浄され、デオキシコール酸ナトリウム/NP40混合物に30分間浸透された。X-gal(50nMのフェロシアン化カリウム、50nMのフェリシアン化カリウム、1MのMgCl2及び100mg/mlのX-gal)が皿に添加され、37℃で2時間培養された。皿はPBSで洗浄された。画像は解剖用顕微鏡及びSpotデジタルカメラで撮影された。
約1x106α7βgal+/-筋芽細胞は、0.1%のゼラチンで覆われた100mmの細胞培養皿に散布され、37°Cで一晩培養される。培養基が取り除かれ、細胞はPBSの中で100nMのLAM-111で16時間から24時間の間処理される。細胞はトリプシン処理後、計数されてペレット状にされ、そして20%FBS培養基を含む30mlのDMEMが加えられた。200nMの30mlのFDG(Molecular Probes,
Eugene, OR)が、細胞に加えられ37℃で1分培養された。反応を止めるために、60mlの冷たい培養基が各サンプルに加えられ、氷の上で20分間培養された。サンプルは、ベックマン培養XL/MCI流動血球計算器にかけられ、FlowJoソフトウエアを使用して分析された。
PBS内の100nMの自然派生マウスラミニン(Invitrogen)が、10日齢のmdxマウスの左前脛骨筋に注射された。対側の右前脛骨筋には対照の役割を果たすPBSが注射された。マウスは解剖され筋肉は5週齢で採取された。全身運搬のために、PBS内の1mg/kgのラミニン−111が10日齢のマウスの腹腔内に注射され、5週齢で組織が分析のために採取された。対照mdxマウスには、同量のPBSが注射された。
マウスの体重10gにつき50mlの滅菌エバンズブルー染色溶液(10mg/ml)がマウスの腹腔内に注射された。3時間後、前脛骨筋が採取され液体窒素で急速冷凍された。10mmの凍結切片が顕微鏡スライドに配置され、4%のパラホルムアルデヒドに固定された。筋線維を説明するために、組織断片が、2μg/mlのOregon Green-488共役コムギ胚芽凝集素(WGA) (Molecular Probes, Eugene, OR)で培養された。動物ごとに、エバンズブルー染色取り込みに対して陽性の筋線維の割合を測定するために最低1000繊維が数えられた。各遺伝子型から少なくとも5種類の動物が分析された。画像は撮影され、630倍の倍率で数えられた。
5週齢のマウスから血液が採取され、室温で最低30分かけて凝固された。3000rpmでの遠心分離後、血清が採取された。採取された血清は、クレアチンキナーゼ、クレアチン、及び血中尿素窒素(BUN)を分析するためにカリフォルニア州立大学デービス校のComparative Pathology Laboratoryに送られた。
組織は、Tissue-TEK Optimal Cutting Temperature compound (Sakura Finetek USA
Inc., Torrance, CA)に包埋された。ライカCM1850(Leica Microsystems, Wetzlar, DE)を使用して、10ミクロン断片がSurgipat顕微鏡スライド(Surgipath Medical
Industries, Richmond, IL)に配置された。α7インテグリンは、1:1000希釈の坑CA5.5マウス単クローン抗体(Sierra Biosource, Morgan Hill, CA) で検出され、その後1:1000希釈のFITC共役坑マウス二次抗体で検出された。β1Dインテグリンは、1:500希釈の坑ウサギ多クローン抗体で検出された後、1:500希釈のFITC共役坑ウサギ抗体で検出された。ラミニン−α1は、1:500希釈のMAB1903(Chemicon
International, Temecula, CA)で検出された。ジストロフィンは、マウス単クローンDys2抗体(Novacastra Laboratories, Ltd, Newcastle upon Tyne, UK)で検出され、ユートロフィンは、1:200の希釈のユートロフィンにするMANCHO7 7F3単クローン抗体(Glenn Morris, Center
for Inherited Neuromuscular Disease, Shropshire, UK)で検出された。マウス単クローン抗体は、マウス免疫グロブリン阻止するためにmouse-on-mouse (MOM) immunodetection kit (Vector Laboratories,
Burlingame, CA)と1:500希釈のFITC共役坑マウス二次抗体と併せて使用された。アセチルコリン受容体は、1:1000のRhodamine-labeled α-bungarotoxin (Molecular Probes, Eugene, OR)で検出された。蛍光発光は、Zeiss Axioskop
2 Plus蛍光発光顕微鏡で検出され、画像は、Zeiss AxioCam HRcデジタルカメラ及びAxiovision 4.1 ソフトウエア(全てCarl
Zeiss MicroImaging, Thornwood, NYから入手可能)で撮影された。
組織切片は、冷たい95%エタノールに2分間固定された後、70%エタノールで2分間固定され、その後流水で5分間再水和された。この切片は、Gill’s hematoxylin (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)で染色され、水で5分間洗浄された。切片は、Scott’s
solution (0.024 M NaHCO3, 0.17 M MgSO4)に3分間浸され、水で5分間洗浄された。切片はその後、エオシン(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)で2分間染色された。切片は、冷たい70%及び95%エタノールでそれぞれ30分連続的に再水和された後、100%エタノールに2分間、そしてDePeX mounting medium (Electron Microscopy Sciences, Washington, PA)に実装される前にキシレンで5分間洗浄された。再生筋肉の中心筋核は、明視野顕微鏡法の630倍率で数えられた。筋繊維ごとの中心核の数は、動物ごとに最低1000の筋肉繊維を数えることで測定された。各遺伝子型から少なくとも5種類の動物が分析された。
α7インテグリンを分析するために、200mMのoctyl-β-D-グルコピラノシド(Sigma Aldrich, St Louis, MO)、50mMのTris-HCl pH 7.4、150mMの塩化ナトリウム、1mMの塩化カルシウム、1 mMの塩化マグネシウム、 2 mMのフッ化フェニルメチルスフホニル、及び 1:200希釈のProtease Inhibitor Cocktail Set III (Calbiochem, EMD Biosciences,
San Diego, CA)を使用してたんぱく質が抽出された。可溶化液が収集され10,000×gで15分間遠心分離され、そして上澄みが新しい管に移された。たんぱく質はBradford分析により数値化され、非減少状態で40μgの総たんぱく質が7.5%のSDS-PAGEゲルの上に分離され、そしてニトロセルロース膜上に移された。膜は、リン酸緩衝食塩水(PBS)の中で1:1に希釈されたOdyssey Blocking Buffer (LiCor Biosciences, Lincoln, NE)において遮断された。α7インテグリンは、1:500希釈のウサギ坑α7B(B2 347)多クローン抗体で検出された。ブロットは、1:5000希釈のAlexa Fluor 680-coupled
goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes, Eugene, OR)で、一次抗体を検出するために培養された。
Neuromuscular Disease, Shropshire, UK)で培養され、その後1:50,000希釈の西洋わさびペルオキシザーゼ(HRP)標識ヤギ坑マウス二次抗体で培養された。395kDa ユートロフィンバンドは化学発光により検出され、同じブロットをanti-Cox-1 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)で検査することでたんぱく質負荷のために基準化された。バンド強度は、ImageQuant TL software (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を使用して定量化された。
全ての平均化されたデータは、平均値±標準偏差値として報告される。複数のグループ間の比較は、パラメータデータに対して一元配置分散分析(ANOVA)によって実行され、又はSigmaStat 1.0 software (Jandel Corporation, San Rafael, CA)を使用して非パラメータデータに対して順位によるKruskal-Wallis一元配置分散分析によって実行された。P<0.05は統計的に重要であると思慮された。
デュシェーヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィンをコード化する遺伝子の変異により引き起こされる深刻な神経筋疾患である。α7β1インテグリン及びユートロフィンは、DMD患者の筋肉及びmdxマウスモデルにおいて発現増加させられたラミニン結合たんぱく質である。ジストロフィーのマウスにおけるユートロフィン及びα7インテグリンの遺伝子導入の大量発現は、これらの遺伝子ターゲットを薬理学的介入にする筋肉疾患を緩和する。ラミニンがα7インテグリン発現を制御するかどうかを究明するために、培養マウス及びヒト筋芽細胞がラミニンで処置され、α7インテグリン発現が分析された。この例は、胚発生過程で多く発現するラミニンの形状であるラミニン−111が、マウス及びDMD患者からの培養筋芽細胞においてα7インテグリンの発現を増加させたことを示す。mdxマウスに対するラミニン−111の筋肉内注射は、β7インテグリン及びユートロフィン発現を増加させ、筋鞘を安定させ、筋肉病変を予防した。全身性ラミニン−111たんぱく質治療は、mdxマウスにおける血清クレアチンキナーゼレベルを通常範囲まで修復した。これらの発見は、ラミニン−111は、DMDのマウスモデルに対して非常に強力であり且つ新種のたんぱく質治療であることを示し、また遺伝子疾患に対する治療として細胞外マトリックスたんぱく質の全身運搬のための新しい模範であることを意味する。
ラミニン−111の全身伝達が効果的であるかどうかを測定するために、ラミニン−111が注射された3週間後に血清が収集され、クレアチンキナーゼレベルが測定された。血清クレアチンキナーゼは、筋肉損傷によるDMD患者において極めて上昇する。そしてクレアチンキナーゼレベルは診断及び予後目的で使用される。この例は、ラミニン−111治療が、PBS制御(図34、*P<0.05, n=5 mice/group)と比べて、血清クレアチンキナーゼレベルの2.6倍減少という結果をもたらした。これらのレベルは野生型マウスのクレアチンキナーゼレベルと統計的には変わらなかった。これらの結果は、ラミニン−111たんぱく質がジストロフィー病変を防ぐためにmdxマウスの主要筋肉システムに全体的に伝達されることができることを明らかにした。
Claims (33)
- 少なくともラミニンの一部の治療効果のある量を被検体に投与することを含む、被検体の筋肉再生を促進し、修復し、又は維持する方法。
- 前記ラミニンは、少なくともラミニン−1の一部を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、ラミニン−1を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、少なくともラミニン−2の一部を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、ラミニン−2を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、少なくともラミニン−4の一部を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、ラミニン−4を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、ラミニン−1、ラミニン−2、ラミニン−4、これらの全て又は一部、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、ラミニンのα1鎖を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、少なくともラミニンのα1鎖の一部を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくともラミニンの一部の治療効果のある量を前記被検体に投与する前に、筋肉再生障害を特徴とする前記被検体を診断することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記被検体は、コスタメア成分の生成の低下により特性づけられる状態を有している、請求項1に記載の方法。
- 前記被検体は、ジストロフィン生成障害を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記被検体は、ラミニン生成障害を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記被検体は、α7β1インテグリン生成障害を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは付随の治療薬として投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記付随の治療薬は、コスタメトリックたんぱく質、成長因子、衛星細胞、幹細胞、及び筋細胞から選択される請求項16に記載の方法。
- 前記ラミニンは、被検体が筋肉損傷又は疾患を受ける前に投与される請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは被検体に全身的に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは腹部への注射により被検体に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは非経口で被検体に投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは筋肉内注射により投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは腹腔内注射により投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、ラミニン派生物、類似物、又は断片から選択される請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、約50nMから約200nMの間の濃度で投与される請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、約100nMの濃度で投与される請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、前記被検体の体重の約1nmol/gから約50nmol/gの間の量が投与される請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、前記被検体の体重に対しての約2nmol/gから約20nmol/gの間の量が投与される請求項1に記載の方法。
- 前記ラミニンは、前記被検体の体重に対しての約2nmol/gから約10nmol/gの間の量が投与される請求項1に記載の方法。
- 被検体に治療効果のある量のラミニンを投与することを含む、前記被検体の創傷治癒を促進する方法。
- 被検体に治療効果のある量のラミニンを投与することを含む、前記被検体における筋肉障害又は損傷の予防又は減少方法。
- 少なくともラミニンの一部の治療効果のある量を被検体に投与することを含む、前記被検体の創傷治癒促進の方法。
- 少なくともラミニンの一部の治療効果のある量を被検体に投与することを含む、被検体を治療する方法。
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