CN101857623A - 一种从生物体中提取gp4g的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从生物体中提取GP4G(四磷酸二鸟苷)的方法，采用以下步骤对GP4G进行提取：原料预处理、脱水、破碎、浸取、中和、吸附、洗脱、脱盐和真空浓缩，借助于本发明提供的技术方案，可以达到收率高、生产成本低，有利于工业化生产的优点。

Description

一种从生物体中提取GP4G的方法

技术领域

本发明涉及一种提取生物体中活性物质的方法，特别涉及一种从生物体中提取GP4G(四磷酸二鸟苷)的方法。

背景技术

GP4G(P¹，P⁴-Di(guanosine 5′)tetraphosphate)，化学名为四磷酸二鸟苷，在化妆界被称为细胞活化再生素，能渗透至真皮层，具有活化肌肤，帮助修复受损细胞，加强细胞的再生功能，让细胞之间的养分疏通效率更高；促进胶原蛋白成分合成，提升细胞整体活力，延缓皱纹产生，改善和淡化皱纹，帮助肌肤恢复紧致与弹性。在化妆品行业具有广阔的市场前景。

目前有报道的关于GP4G的提取方法见于F.J.FINAMORE和A.H.WARNER于1963年在The Journal of Biological Chemistry发表的文章The occurrence of P¹，P⁴-Diguanosine 5′-Tetraphosphate inBrine shrimp eggs。但是根据此文献报道的提取GP4G的方法，其GP4G的收率低，设备要求条件高，生产成本高，不利于工业化生产。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种从生物体中提取GP4G的方法，与文献中方法相比，具有收率高、生产成本低，有利于工业化生产的特点。

本发明采用以下的技术方案：用含有GP4G的生物材料作为原材料，进行以下步骤的操作：

原料预处理：称取1000kg～2000kg生物原材料，用100～200目的筛网进行筛选，去除杂物，再进行清洗；

脱水：将处理后的生物原材料放置到设有100～200目筛网的传送机上进行脱水，并以0.5m/min～2m/min的速度传送；

破碎：将脱水后的生物原材料进行破碎；

浸取：将破碎后的生物原材料的折纯干重与1mol/L～3mol/L的-10℃～20℃的酸性溶液按1∶1～10kg∶L的比例混合，充分搅拌30min～120min，分离上清液；

中和：真空浓缩1～10倍后，用2mol/L～5mol/L碱性溶液调整浸取后的上清液pH至7～8，收集固体析出物，去除清液，将固体析出物按5％～30％浓度采用蒸馏水或去离子水溶解，再采用2mol/L～5mol/L酸性溶液调清液pH至2～5，准备上柱；

吸附：上述溶液用强酸性阳离子交换树脂进行吸附，吸附饱和后，注入脱盐水或去离子水进行压料；

洗脱：用0.5mol/L～2mol/L的酸性洗脱剂进行洗脱解吸，并分段收集目标产物；

脱盐：然后采用弱碱性阴离子交换树脂进行过流工艺脱色脱盐处理；

真空浓缩：在操作压力为-0.085MPa～-0.092MPa，温度为30℃～60℃的真空状态下，当溶液中GP4G的含量达到6％时，开始收集GP4G。

所述含有GP4G的生物材料为含高盐及含高矿物或耐高盐的海洋浮游生物及内陆湖里的壳类生物。优选为含高盐及含高矿物或耐高盐的卤虫或卤虫卵。

所述浸取步骤中用到的酸性溶液为HCl，HClO₄，H₂SO₄，HNO₃，HCOOH，CH₃COOH中的一种或几种。

所述浸取步骤中上清液的分离方法为虹吸、离心、过滤中的一种或几种方式。

所述中和步骤中所用到的碱性溶液为NaOH，KOH，氨水中的一种或几种。

所述洗脱步骤中的酸性洗脱剂为甲酸、乙酸、HCl、H₂SO₄中的一种或几种。

所述最终获得的GP4G产物为液态或固态，优选为液态。

在实际操作中，浸取过程中用到的酸性溶液中经常加入NaCl，(NH₄)₂SO₄，KCl等盐类用来加强浸取的效果；在第一次将上清液浸取完毕后，还有一些固体不溶物剩余，将这些固体不溶物和酸性溶液按1∶1～10的比例进行二次、三次浸取，后两次浸取液可依次作为下一批次的第一次、第二次浸取液进行使用，这样操作的好处可以降低溶剂用量和废水量，同时可以提高浸提收率和节省浸提时间。再将剩余的固体不溶物用板框过滤机，操作压力为10MPa～20MPa进行过滤处理，收集上清液，滤渣用于其他用途。

得到真空浓缩的GP4G后，可按最终产品不同的规格要求，分别作后续加工。

本发明与文献中提到的方法相比，具有以下优点：(1)本发明没有采用直接调pH沉淀的方法，而是采取先浓缩后调pH，这样大大提高了收率，同时也节省了碱的用量；(2)在采用阳离子柱吸附时是在吸附饱和后才进行压水洗脱，这样增加了树脂吸附量，提高了使用效率，降低了成本；(3)脱盐时是采用弱碱性阴离子交换树脂进行过流工艺脱色脱盐处理，而不是文献中提到的木炭吸附或透析除盐，这样可以同时起到脱盐和脱色的作用，提高了效率。另外，在实际操作中还采用板框过滤替代高速离心和布氏漏斗的工艺，操作条件要求低，利于工业化、规模化生产。综上所述，本发明具有收率高、生产成本低，利于工业化生产的特点。

具体实施方式

结合具体实施例进行说明。

实施例1

通过以下步骤进行GP4G的提取：

第一步：称取1000kg盐水丰年虫卵，用100目筛网的机械振动筛振动，去除尘土和细小的固体杂质，卤虫卵及比较大的固体杂质留在筛上，然后进入单向流动清洗池，利用比重不同，在池另一端将浮在水面的卤虫卵采用120目的筛网进行捞取；

第二步：将捞取的盐水丰年虫卵放置在有120目筛网、30°倾角的带式传送机上，以2m/min的速度进行传送，使卤虫卵带有的水份通过筛网漏下，而且传送机的另一端与粉碎机进料口相连，使得滴干水的卤虫卵直接进入粉碎机；

第三步：通过粉碎机将虫卵破碎到其颗粒大小能通过140目的筛网为佳；

第四步：将破碎后的盐水丰年虫卵的折纯干重与1mol/L的-4℃的酸性溶液HCl按1∶1kg∶L的比例混合，充分搅拌30min，采用离心方式分离上清；

第五步：真空浓缩2倍后，用2mol/L碱性溶液调整浸取后的上清液pH至7～8，收集固体析出物，去除清液，将固体析出物按30％浓度用蒸馏水或去离子水溶解，再用2mol/L酸性溶液调清液pH至2～5，准备上柱；

第六步：上述中和后的溶液以0.5BV/h速度在732强酸性阳离子交换树脂进行上柱吸附，吸附饱和后，停止上柱，然后采用脱盐水进行压料，压液颜色变淡停止，压料水进行串柱吸附；

第七步：用0.5mol/L的HCl酸性洗脱剂进行洗脱解吸，分段收集目标产物；

第八步：上柱速度为0.5BV/h，采用弱碱性阴离子交换树脂进行过流工艺脱色脱盐处理；至收集溶液pH为6.5时停止脱盐处理；

第九步：在真空操作压力为-0.090MPa，温度为40℃的真空状态下，当溶液中GP4G的含量达到6％时，开始收集GP4G。

用1000kg盐水丰年虫卵采用文献中的方法进行提取，将所得的GP4G收率与本发明中GP4G的收率进行对比，见下表：

方法	收率
		文献方法	10％(固态)
本发明	78％(液态)

实施例2

通过以下步骤进行GP4G的提取：

第一步：称取1500kg的Artemia Salina虫卵，用100目筛网的机械振动筛振动，去除尘土和细小的固体杂质，卤虫卵及比较大的固体杂质留在筛上，然后进入单向流动清洗池，利用比重不同，在池另一端将浮在水面的卤虫卵采用120目的筛网进行捞取；

第二步：将捞取的卤虫卵放置在有120目筛网、30°倾角的带式传送机上，以1m/min的速度进行传送，使卤虫卵带有的水份通过筛网漏下，而且传送机的另一端与粉碎机进料口相连，使得滴干水分的卤虫卵直接进入粉碎机；

第三步：通过粉碎机将虫卵破碎到其颗粒大小能通过140目的筛网为佳；

第四步：将破碎后的卤虫卵的折纯干重与1.5mol/L的0℃的酸性溶液HCl按1∶3kg∶L的比例混合，充分搅拌70min，采用虹吸的方式分离上清；

第五步：真空浓缩4倍后，用3mol/L碱性溶液调整浸取后的上清液pH至7～8，收集固体析出物，去除清液，将固体析出物按25％浓度用蒸馏水或去离子水溶解，再用2mol/L酸性溶液调清液pH至2～5，准备上柱；

第六步：上述中和后的溶液以1BV/h速度在732强酸性阳离子交换树脂进行上柱吸附，吸附饱和后，停止上柱，然后采用离子水进行压料，压液颜色变淡停止，压料水进行串柱吸附；

第七步：用1mol/L的H₂SO₄酸性洗脱剂进行洗脱解吸，分段收集目标产物；

第八步：上柱速度为1BV/h，采用弱碱性阴离子交换树脂进行过流工艺脱色脱盐处理至收集溶液pH为7时停止脱盐；

第九步：在真空操作压力为-0.092MPa，温度为50℃的真空状态下，当溶液中GP4G的含量达到6％时，开始收集GP4G。

用1500kg的Artemia Salina虫卵采用文献中的方法进行提取，将所得的GP4G收率与本发明中GP4G的收率进行对比，见下表：

方法	收率
		论文方法	10％(固态)
本工艺	75％(液态)

实施例3

通过以下步骤进行GP4G的提取，然后进行固体结晶：

第一步：称取2000kg卤虫卵，用100目筛网的机械振动筛振动，去除尘土和细小的固体杂质，卤虫卵及比较大的固体杂质留在筛上，然后进入单向流动清洗池，利用比重不同，在池另一端将浮在水面的卤虫卵采用120目的筛网进行捞取；

第二步：将捞取的卤虫卵放置在有120目筛网、30°倾角的带式传送机上，以2m/min的速度进行传送，使卤虫卵带有的水通过筛网漏下，而且传送机的另一端与粉碎机进料口相连，使得滴干水的卤虫卵直接进入粉碎机；

第三步：通过粉碎机将虫卵破碎到其颗粒大小能通过140目的筛网为佳；

第四步：将破碎后的卤虫卵的折纯干重与3mol/L的15℃的酸性溶液HCOOH按1∶10(kg∶L)的比例混合，充分搅拌120min，采用虹吸的方式分离上清；

第五步：真空浓缩5倍后，用4mol/L碱性溶液调整浸取后的上清液pH至7～8，收集固体析出物，去除清液，将固体析出物按30％浓度用蒸馏水或去离子水溶解，再用2mol/L酸性溶液调清液pH至2～5，准备上柱；

第六步：上述溶液以2BV/h速度在732强酸性阳离子交换树脂进行上柱吸附，吸附饱和后，停止上柱，然后采用离子水进行压料，压液颜色变淡停止，压料水进行串柱吸附；

第七步：用1mol/L的H₂SO₄酸性洗脱剂进行洗脱解吸，分段收集目标产物；

第八步：上柱速度为2BV/h，采用弱碱性阴离子交换树脂进行过流工艺脱色脱盐处理至收集溶液pH为7停止；

第九步：在操作压力为-0.085MPa，温度为60℃的真空状态下，当溶液中GP4G的含量达到6％时，开始收集GP4G；

第十步：采用95％乙醇，按体积比1∶3(V/V(乙醇))，向浓缩液缓慢边搅拌边加入酒精结晶，让晶体自然析出。-4℃低温育晶2～10小时；

第十一步：采用离心速度4000rpm进行离心，收集晶体，母液返回第五步工序；

第十二步：干燥采用小型真空双锥干燥机，温度50℃，真空操作压力-0.092MPa，水分≤1％时出料；

第十三步：经过60目的振动筛筛分，检验合格后进行包装。

用2000kg卤虫卵采用文献中的方法进行提取，将所得的GP4G收率与本发明中GP4G的收率进行对比，见下表：

方法	收率
		论文方法	10％(固态)
本工艺	50％(固态)

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种从生物体中提取GP4G的方法，其特征在于：采用含有GP4G的生物材料作为原材料，进行以下步骤的操作：

原料预处理：称取1000kg～2000kg生物原材料，用100～200目筛网进行筛选，去除杂物，再进行清洗；

脱水：将处理后的生物原材料放置到设有100～200目筛网的传送机上进行脱水，并以0.5m/min～2m/min的速度传送；

破碎：将脱水后的生物原材料进行破碎；

浸取：将破碎后的生物原材料的折纯干重与1mol/L～3mol/L的-10～20℃的酸性溶液按1∶1～10kg∶L的比例混合，充分搅拌30min～120min，分离上清液；

中和：真空浓缩1～10倍后，采用2mol/L～5mol/L碱性溶液调整浸取后的上清液pH至7～8，收集固体析出物，去除清液，将固体析出物按5％～30％浓度用蒸馏水或去离子水溶解，再用1～5mol/L酸性溶液调清液pH至2～5，准备上柱；

吸附：溶液用强酸性阳离子交换树脂进行吸附，吸附饱和后，注入脱盐水或去离子水进行压料；

洗脱：用0.5mol/L～2mol/L的酸性洗脱剂进行洗脱解吸，并分段收集目标产物；

脱盐：然后采用弱碱性阴离子交换树脂进行过流工艺脱色脱盐处理；

真空浓缩：在真空操作压力为-0.085MPa～-0.092MPa，温度为30℃～60℃的真空状态下浓缩，当溶液中GP4G的含量达到6％时，开始收集GP4G。

2.根据权利要求1所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述含有GP4G的生物材料为含高盐及含高矿物或耐高盐的海洋浮游生物及内陆湖里的壳类生物。

3.根据权利要求2所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述含有GP4G的生物材料为含高盐及含高矿物或耐高盐的卤虫或卤虫卵。

4.根据权利要求1所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述浸取步骤中用到的酸性溶液为HCl，HClO₄，H₂SO₄，HNO₃，HCOOH，CH₃COOH中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述浸取步骤中上清液的分离方法为虹吸、离心、过滤中的一种或几种方式。

6.根据权利要求1所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述中和步骤中所用到的碱性溶液为NaOH，KOH，氨水中的一种或几种。

7.根据权利要求1所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述洗脱步骤中的酸性洗脱剂为甲酸、乙酸、HCl、H₂SO₄中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述最终获得的GP4G产物为液态或固态。

9.根据权利要求8所述的提取GP4G的方法，其特征在于：所述最终获得的GP4G产物为液态。