CN101845398B - 淡紫拟青霉的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淡紫拟青霉的培养方法及其专用培养基。该培养基由麸皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰和水组成。本发明方法生长周期短，产率高，生产工艺简单，不需要复杂设备。因此，本发明不仅对农业废弃物的利用、促进农业可持续发展、保护生态环境方面意义重大，而且有着切实的经济效益和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种淡紫拟青霉的培养方法。
背景技术
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thom)samson 1974)是一种典型的土壤及多种植物根系的习居菌，被认为是最有前途的防治有害线虫的天敌真菌之一。国际马铃薯中心昆虫系Jatala博士1979年首次报道，淡紫拟青霉能够有效防治南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和白色球孢囊线虫(Heterodera schachii)，对南方根结线虫的卵寄生率高达60％-70％。
淡紫拟青霉菌极少在生产上推广应用，主要原因是缺乏廉价培养基和相应的培养技术。目前，国内外对淡紫拟青霉仍然处于研究阶段，主要目标是筛选稳定高效的生产菌株、解决菌剂培养中的高成本低产率的技术瓶颈、研制稳定高效的实用剂型。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于培养淡紫拟青霉的固体培养基。
本发明所提供的固体培养基，由麸皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰和水组成。
上述固体培养基中，所述麸皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰和水的配比为如下1)或2)或3)或4)所示：
1)麸皮(20kg-35kg)∶玉米(60kg-150kg)∶甘蔗渣(30kg-60kg)∶椰糠(10kg-40kg)∶蔗糖(15g-20g)∶硫酸铵(15g-20g)∶磷酸二氢钾(8g-15g)∶硫酸锰(0.7g-2g)∶水(20L-50L)；
2)麸皮(20kg-35kg)∶玉米(60kg-100kg)∶甘蔗渣(30kg-50kg)∶椰糠(10kg-30kg)∶蔗糖(15g-20g)∶硫酸铵(15g-18g)∶磷酸二氢钾(8g-10g)∶硫酸锰(0.7g-2g)∶水(20L-40L)；
3)麸皮(20kg-35kg)∶玉米(60kg-70kg)∶甘蔗渣(30kg-50kg)∶椰糠(10kg-15kg)∶蔗糖(15g-16.5g)∶硫酸铵(15g-18g)∶磷酸二氢钾(8g-10g)∶硫酸锰(0.7g-1g)∶水(20L-35L)；
4)麸皮30kg∶玉米100kg∶甘蔗渣60kg∶椰糠30kg∶蔗糖20g∶硫酸铵20g∶磷酸二氢钾10g∶硫酸锰2g∶水50L；
或，麸皮35kg∶玉米150kg∶甘蔗渣40kg∶椰糠40kg∶蔗糖20g∶硫酸铵20g∶磷酸二氢钾15g∶硫酸锰1g∶水40L；
或，麸皮30kg∶玉米100kg∶甘蔗渣60kg∶椰糠30kg∶蔗糖15g∶硫酸铵15g∶磷酸二氢钾8g∶硫酸锰0.7g∶水50L；
或，麸皮30kg∶玉米100kg∶甘蔗渣60kg∶椰糠30kg∶蔗糖20g∶硫酸铵18g∶磷酸二氢钾10g∶硫酸锰1g∶水50L；
或，麸皮35kg∶玉米150kg∶甘蔗渣40kg∶椰糠40kg∶蔗糖20g∶硫酸铵20g∶磷酸二氢钾10g∶硫酸锰1g∶水40L；
或，麸皮20kg∶玉米60kg∶甘蔗渣30kg∶椰糠10kg∶蔗糖15g∶硫酸铵15g∶磷酸二氢钾10g∶硫酸锰1g∶水20L；
或，麸皮30kg∶玉米70kg∶甘蔗渣50kg∶椰糠15kg∶蔗糖16.5g∶硫酸铵16.5g∶磷酸二氢钾8.5g∶硫酸锰0.7g∶水35L。
上述固体培养基中，所述麸皮为小麦的麸皮，所述玉米为玉米粉。
本发明的另一个目的是提供一种培养淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法。
本发明所提供的培养淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法，包括如下步骤：将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)接种于上述任一所述固体培养基，固体培养，将容器内的所有物质记作固体培养物质。
上述方法中，所述固体培养的条件为：所述固体培养包括如下步骤：在湿度为30％-70％和温度为24℃-26℃的条件下，培养2-3天；将所有固体培养物质捣碎，再在湿度为50％-70％、温度为24℃-26℃的条件下，培养3-4天；
上述方法中，所述固体培养中所用的容器为培养架；所述培养架为腔内设有若干尼龙纱网隔层的柱体；所述固体培养物质位于所述尼龙纱网隔层上。
上述方法中，所述固体培养在无菌条件下进行。
上述方法中，在所述固体培养前，包括如下种子培养的步骤：将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)接种于种子培养基中，进行种子培养，将种子培养产物再进行所述固体培养；
上述方法中，所述种子培养基由壳聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆饼粉、KH2PO4、MnSO4、醋酸和水组成；所述壳聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆饼粉、KH2PO4、MnSO4、醋酸和水的配比为：壳聚糖20g∶蔗糖15g∶蛋白胨10g∶豆饼粉15g∶KH2PO4 0.5g∶MnSO4 0.05g∶醋酸0.5ml∶水1L。
上述方法中，所述种子培养的条件：27℃-29℃摇床振荡培养48-72小时，接种浓度为105个孢子/ml。
上述方法中，将种子培养产物再进行所述固体培养中，接种量为20％-30％(体积百分含量)，具体为20％、25％或30％。
上述方法中，所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)为淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)E7，保藏编号为ACCC 32494。
与现有技术相比，本发明利用液体培养快速生长的大量菌丝体，转接到固体营养基质上产生气生分生孢子，从而缩短菌丝生长周期，提高产率，避免前期污染；其次，本发明框架式培养室培养，生产工艺简单，显著减少了培养过程中的污染机率，缩短了发酵时间，而且不需要复杂设备，对湿度的要求降低；第三，原料主要为农副产品麸皮、玉米粉、甘蔗渣、椰糠，来源广泛、充足，成本低廉，易调控，成功率高；第四，在培养原料中添加部分甘蔗渣和椰糠，不仅可以使农业废弃物得到有效利用，而且明显改善了培养基的粘度、空隙率和疏松度，培养过程中不用额外通气。因此，本发明不仅对农业废弃物的利用、促进农业可持续发展、保护生态环境方面意义重大，而且有着切实的经济效益和广阔的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的菌株为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E7，分离自线虫土壤的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，保藏编号为ACCC 32494。
实施例1、
1.斜面菌种：
固体斜面培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、蛋白胨10g、KH2PO4 0.5g、MnSO4 0.05g、琼脂18g、水1L。
将淡紫拟青霉菌接种于试管斜面培养基，在28℃传代培养、活化，至斜面长满淡紫色孢子。
2.种子培养：
种子培养基组成：壳聚糖20g、蔗糖15g、蛋白胨10g、豆饼粉15g、KH2PO4 0.5g、MnSO4 0.05g、醋酸0.5ml，水1L。壳聚糖购自浙江金壳生物化学有限公司，产品目录号为K071113289，脱乙酰度为95％；蛋白胨购自海南青鸟生物科技有限公司，产品目录号为050170；豆饼粉购自农贸市场。
每个250ml三角瓶中放入60ml种子培养基，121℃蒸汽灭菌20分钟。
从固体斜面中挑出一小块菌苔，用种子培养基配置分生孢子悬浮液，再将分生孢子悬浮液接入250ml三角瓶，初始浓度为105个/ml，一只斜面可接6-8个瓶子；在27℃摇床振荡培养48小时，至长成淡紫色粘稠菌丝体。
3、固体培养：
培养架：腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子，长3.5m、宽0.6m、高2.5m，用尼龙纱网隔成6层结构，层间距30cm，四立柱材质是碳钢喷塑。
a.固体培养基：小麦麸皮20kg，玉米粉60kg、甘蔗渣30kg、椰糠10kg、蔗糖15g、硫酸铵15g、磷酸二氢钾10g、硫酸锰1g、自来水20L。
配制方法：先用水将硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰溶解，搅拌均匀，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌60分钟。再将其与其余物质混匀。
b.接种：按20％(体积百分比)接种量，将种子培养的产物倒入固体培养基中，搅拌均匀，置于培养架的尼龙纱网上，一起置于发酵室内(发酵室预先消毒)；
c.培养方法：在温度24℃、发酵室内湿度30％(体积百分含量)和密闭条件下培养2天，至长满淡紫色菌丝；然后将培养架上的所有物质捣碎，在温度24℃、培养室内湿度50％的条件下继续培养3天。
从培养室中将所有物质拿出，放在阴凉通风处晾干或空调抽湿，即得到粗品。
4、血球计数板计数：1.31×1010个孢子/克粗品；平板计数：1.31×1010个孢子/克粗品。
上述步骤1-3均在无菌条件下操作。
实施例2：
1、斜面菌种：
固体斜面培养基：与实施例1中所述一致。
将淡紫拟青霉菌接种于试管斜面培养基，在28℃传代培养、活化，至斜面长满淡紫色孢子。
2、种子培养
种子培养基组成：与实施例1中所述一致。
每个1000ml三角瓶中放入450ml培养基，121℃蒸汽灭菌20分钟；从固体斜面中挑出一小块菌苔，用种子培养基配置分生孢子悬浮液，再将分生孢子悬浮液接入250ml三角瓶，初始浓度为105个/ml，一只斜面可接6-8个瓶子；在28℃摇床振荡培养64小时，至长成白色粘稠菌丝体。
3、固体培养：
培养室：与实施例1中所述一致。
a.固体培养基：小麦麸皮30kg，玉粉70kg、甘蔗渣50kg、椰糠15kg、蔗糖16.5g、硫酸铵16.5g、磷酸二氢钾8.5g、硫酸锰0.7g、自来水为35L。
配制方法：与实施例1中所述一致。
b.接种：按25％(体积百分比)接种量，将种子培养的产物倒入固体培养基中，搅拌均匀，装入发酵室的培养架(发酵室预先消毒)；
c.培养方法：在温度25℃、发酵室内湿度50％和厌氧密闭条件下培养3天，至长满淡紫色菌丝；然后将培养架上的所有物质轻轻捣碎，在温度25℃、发酵室内湿度60％的条件下继续培养4天。
从培养室中将所有物质拿出，放在阴凉通风处晾干或空调抽湿，即得到粗品。
4、血球计数板计数：3.24×1010个孢子/克粗品；平板计数：3.21×1010个孢子/克粗品。
上述步骤1-3均在无菌条件下操作。
实施例3：
1、斜面菌种：
固体斜面培养基：与实施例1中所述一致。
将淡紫拟青霉菌接种于试管斜面培养基，在28℃传代培养、活化，至斜面长满淡紫色孢子。
2、种子培养
种子培养基组成：与实施例1中所述一致。
每个1000ml三角瓶中放入450ml培养基，121℃蒸汽灭菌20分钟；
从固体斜面中挑出一小块菌苔，用种子培养基配置分生孢子悬浮液，再将分生孢子悬浮液接入250ml三角瓶，初始浓度为105个/ml，一只斜面可接6-8个瓶子；在29℃摇床振荡培养72小时，至长成白色粘稠菌丝体。
3、固体培养：
培养室：与实施例1中所述一致。
a.固体培养基：如表1中3所示。配制方法：与实施例1中所述一致。
b.接种：按30％(体积百分比)(表1中3所示)接种量，将种子培养的产物倒入固体培养基中，搅拌均匀，装入发酵室的培养架(发酵室预先消毒)；
c.培养方法：在温度26℃、发酵室内湿度70％和厌氧密闭条件下培养2天，至长满淡紫色菌丝；然后将培养架上的所有物质轻轻捣碎，在温度26℃、发酵室内湿度70％的条件下继续培养4天。
从培养室中将所有物质拿出，放在阴凉通风处晾干或空调抽湿，即得到粗品。
4、血球计数板计数：5.21×1010个孢子/克粗品；平板计数：5.21×1010个孢子/克粗品。
上述步骤1-3均在无菌条件下操作。
表1
发酵周期由同类技术的12-14天缩短到6-7天，发酵水平多100亿/克粗品。不仅明显缩短了发酵周期，而且不需要复杂设备，对湿度的要求降低。
Claims (10)
1.一种固体培养基，由麸皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰和水组成。
2.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于：所述麸皮、玉米、甘蔗渣、椰糠、蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰和水的配比为如下1)或2)或3)或4)所示：
1)麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝20kg-35kg∶60kg-150kg∶30kg-60kg∶10kg-40kg∶15g-20g∶15g-20g∶8g-15g∶0.7g-2g∶20L-50L；
2)麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝20kg-35kg∶60kg-100kg∶30kg-50kg∶10kg-30kg∶15g-20g∶15g-18g∶8g-10g∶0.7g-2g∶20L-40L；
3)麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝20kg-35kg∶60kg-70kg∶30kg-50kg∶10kg-15kg∶15g-16.5g∶15g-18g∶8g-10g∶0.7g-1g∶20L-35L；
4)麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝30kg∶100kg∶60kg∶30kg∶20g∶20g∶10g∶2g∶50L；
或，麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝35kg∶150kg∶40kg∶40kg∶20g∶20g∶15g∶1g∶40L；
或，麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝30kg∶100kg∶60kg∶30kg∶15g∶15g∶8g∶0.7g∶50L；
或，麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝30kg∶100kg∶60kg∶30kg∶20g∶18g∶10g∶1g∶50L；
或，麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝35kg∶150kg∶40kg∶40kg∶20g∶20g∶10g∶1g∶40L；
或，麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝20kg∶60kg∶30kg∶10kg∶15g∶15g∶10g∶1g∶20L；
或，麸皮∶玉米∶甘蔗渣∶椰糠∶蔗糖∶硫酸铵∶磷酸二氢钾∶硫酸锰∶水＝30kg∶70kg∶50kg∶15kg∶16.5g∶16.5g∶8.5g∶0.7g∶35L。
3.根据权利要求2所述的固体培养基，其特征在于：所述麸皮为小麦的麸皮，所述玉米为玉米粉。
4.一种培养淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)的方法，包括如下步骤：将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)接种于权利要求1-3中任一所述固体培养基，固体培养，将容器内的所有物质记作固体培养物质。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述固体培养包括如下步骤：在湿度为30％-70％和温度为24℃-26℃的条件下，培养2-3天；将所述固体培养物质捣碎， 再在湿度为50％-70％和温度为24℃-26℃的条件下，培养3-4天。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述固体培养中所用的容器为培养架；所述培养架为腔内设有若干尼龙纱网隔层的柱体；所述固体培养物质位于所述尼龙纱网隔层上；
所述固体培养在无菌条件下进行。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述固体培养前，包括如下种子培养的步骤：将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)接种于种子培养基中，进行种子培养，将种子培养产物再进行所述固体培养；
所述种子培养基由壳聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆饼粉、KH2PO4、MnSO4、醋酸和水组成；所述壳聚糖、蔗糖、蛋白胨、豆饼粉、KH2PO4、MnSO4、醋酸和水的配比为：20g∶15g∶10g∶15g∶0.5g∶0.05g∶0.5ml∶1L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述种子培养的条件：27℃-29℃振荡培养48-72小时，接种浓度为105个孢子/ml。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述将种子培养产物再进行所述固体培养中，接种量为20％-30％。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述将种子培养产物再进行所述固体培养中，接种量为20％、25％或30％。
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