CN101831497A - 一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法，包括以下步骤：1)番茄耐盐主效基因定位；2)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中正向引物：5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物：5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因组的DNA，利用引物对番茄基因组DNA进行PCR扩增，无需特异性内切酶酶切，就可得到有差异的产物条带，利用此标记PCR产物片断的大小可鉴别出番茄耐盐材料和盐敏感材料；4)PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察拍照得耐盐材料PCR产物有1000bp的1条谱带，盐敏感材料有900bp的1条谱带。方法步骤为：定位耐盐基因，选用含有耐盐基因的渐渗系片断，提取幼苗的DNA；建立CAPS反应体系；将PCR产物选用限制性内切酶消化控制等。

Description

一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法
技术领域
本发明涉及番茄耐盐主效基因定位，DNA提取，PCR的扩增，在已有的RFLP标记信息基础上设计PCR引物和限制性内切酶，把操作复杂、成本较高的RFLP标记转化为操作简单、成本适宜的CAPS标记，鉴别其该物种的耐盐的性状。
背景技术
盐分是限制植物生长和产量的主要环境因素之一，土壤盐渍化是一个世界性问题，其中由于过量施用化肥，造成土壤尤其是蔬菜保护地次生盐渍化已是一个极其严重的现象，常障碍蔬菜作物的生长、发育，导致大幅度减产，产品品质下降。作物耐盐新品种的选育，一直是国内外研究的重点，番茄(Lycopersicon esculentum Mill)是茄科番茄属的一年生草本植物，属中度盐敏感型鲜食和加工型蔬菜作物，其在高盐土壤上生育状况差。
国内外对番茄的耐盐性进行了广泛的研究。因此，为了丰富我国番茄品种的遗传资源，改良番茄的耐盐性，选育耐盐性强、品味好的品种一直是番茄育种的重要目标。对番茄进行耐盐性研究和耐盐基因的转化研究，也可为进一步研究其它双子叶植物的耐盐机制和耐盐基因的转化奠定基础。目前番茄主要是以育苗移栽为主，因此番茄苗期耐盐就显的尤为重要，部分野生资源材料及个别栽培种表现出一定程度的耐盐性，为番茄耐盐育种提供了可能。
利用分子标记及生物工程技术深入挖掘这些材料，可加速番茄耐盐遗传改良。经专利文献检索披露：号为CN200910020964.1的《一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法》专利；号为CN200810197310.1的《一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆剂应用》专利；号为CN200510010485.3的《一种鲤鱼抗寒性状的分子标记鉴定技术》的专利都涉及了PCR分子标记的研究，方法都比较复杂。
本研究发明采用简单易操作的PCR分子标记，可快速检测番茄的耐盐材料与盐敏感材料，为利用分子标记辅助选育和基因工程等手段改良番茄耐盐新品种提供了基础，极大地加速了番茄耐盐育种进程。
发明内容
本发明的目在于：获得的PCR标记，可快速检测番茄苗期耐盐基因，且不受生长期，外界环境等的影响，是一种快速鉴定和评价番茄苗期耐盐材料的方法。
本发明的目的是这样实现的：一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法，包括以下步骤：1)耐盐主效基因定位；2)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中：正向引物：5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物：5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因组DNA，以此对引物将番茄基因组DNA进行PCR扩增，无需特异性内切酶酶切，就可得到有差异性的产物条带，利用此引物对的差异性产物条带就可鉴别出番茄耐盐材料和盐敏感材料；4)PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，耐盐材料PCR产物有1000bp的1条谱带，盐敏感材料有900bp的1条谱带。
所述的分子标记方法，利用番茄野生资源S.pennellii LA716的76个渐渗系材料，通过耐盐筛选，将7个耐盐主效基因定位在番茄的5条染色体上，研究所用的渐渗系材料IL7-5-5的片断上含有其中一个耐盐主效基因。
所述的分子标记方法，以CTAB法提取7-8片真叶时幼苗的DNA，用0.1×TE稀释后贮存于-20℃的冰箱中备用。
所述的分子标记方法，CAPS体系的建立采用50ng模板DNA，1.25UTaqDNA聚合酶，Mg2+终浓度为1.5mmol/L，dNTP浓度为0.25mmol/L，每个引物浓度为0.2umol/L，最终体积为25ul的PCR体系。
所述的分子标记方法，PCR反应在MJ PTC-200热循环仪上进行，反应程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共37个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
所述的分子标记方法，对引物的退火温度进行优化筛选，分别设55℃、58℃和60℃的温度梯度，比较结果。
所述的分子标记方法，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用1.5％的琼脂糖凝胶(0.5×TBE缓冲液)，每样品加5ul PCR产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测PCR产物，如果PCR扩增产物与预期结果一致，进一步将PCR产物用限制性内切酶消化。
所述的分子标记方法，研究所用的限制性内切酶，除Taq I的限制性酶切反应温度为65℃外，其余的限制性内切酶酶切反应温度均为37℃，反应时间为4小时以上。
所述的分子标记方法，限制性内切酶反应体系为：1.5ul限制性内切酶缓冲液，0.2ul限制性内切酶，3.3ul ddH2O，10ul PCR产物。
所述的分子标记方法，1.5％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，每样品加8ul酶切产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测酶切产物。
所述的分子标记方法，研究所用的RFLP标记的序列来源于Cornell大学，所有用作CAPS分析的引物，由上海生物技术工程服务有限公司合成，CAPS标记的名称仍用原来的RFLP标记的名称。
本发明方法依据已定位耐盐主效基因，根据已有的RFLP标记信息，设计PCR引物和限制性内切酶，把操作复杂、成本较高的RFLP标记转化为操作简单实用，成本适宜的CAPS标记，并直接利用这个CAPS标记对含耐盐基因的植株进行筛选，从而进行番茄耐盐的分子标记辅助育种，转化CAPS标记后，大大提高了这些分子标记的应用范围和作用效率。CAPS标记作为PCR和限制性内切酶酶切技术相结合的分子标记技术，可以从单个的碱基差异进行区分，并且可以把相同或相近的其他物种的RFLP、AFLP或COS标记转化而来，这为创建稳定、可靠、简便实用的共显性标记提供了一条捷径，在精密的分子图谱构建、新的基因定位以及分子标记辅助育种中具有广阔的应用前景。
本方法对耐盐渐渗系IL7-5-5(所属片断在番茄第7条染色体2.0-2.9cM之间)上的5个RFLP标记进行了CAPS引物设计、PCR体系优化和限制性内切酶分析，最终获得了1个有多态性、可快速检测耐盐基因的CAPS标记。该标记(TG418)的PCR产物，在耐盐材料中可扩增出长度为1000bp的片段，在盐敏感材料中可扩增出长度为900bp的片段，此标记用于番茄耐盐材料的鉴定与筛选，并建立了该标记的PCR优化体系，充分展现了该标记在标记辅助选择等实际应用中的实用性。
本发明构思鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法，包括番茄基因组DNA的提取、PCR引物设计，PCR扩增，通过PCR反应，无需特异性内切酶酶切，就得到有差异性的产物条带，利用此标记PCR扩增产物的大小可鉴别出番茄耐盐材材料和盐敏感材料。该方法用于番茄苗期耐盐性筛选，能极大地加速番茄耐盐育种进程，彰显技术进步。
附图说明
附图1、野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系群体第一个独立试验耐盐数值分布，图中横坐标表示耐盐数值，纵坐标表示耐盐值频率。
附图2、野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系群体第二个独立试验耐盐数值分布，图中横坐标表示耐盐数值，纵坐标表示耐盐值频率。
附图3、野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系群体第三个独立试验耐盐数值分布，图中横坐标表示耐盐数值，纵坐标表示耐盐值频率。
附图4、野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系群体第四个独立试验耐盐数值分布，图中横坐标表示耐盐数值，纵坐标表示耐盐值频率。
附图5、野生番茄S.pennellii LA716的76个渐渗系群体耐盐成活率分布以及与盐敏感材料M82耐盐值的对比，图中横坐标表示渐渗系材料，纵坐标表示耐盐成活率。
附图6、番茄第2条染色体上两个耐盐基因定位图。红色箭头表示所定位的耐盐基因位点。
附图7、番茄第6、7、8条染色体上四个耐盐基因定位图。红色箭头表示所定位的耐盐基因位点。
附图8、番茄第10条染色体上一个耐盐基因定位图。红色箭头表示所定位的耐盐基因位点。
附图9、TG61标记的PCR扩增产物凝胶电泳图：前4个泳道为耐盐渐渗系材料IL7-5-5的电泳结果，后2个泳道为盐敏感材料M82的电泳结果。
附图10、TG61标记的PCR扩增产物经限制性内切酶Dra I酶切后的凝胶电泳图：前4个泳道为耐盐渐渗系材料IL7-5-5的电泳结果，后2个泳道为盐敏感材料M82的电泳结果。
附图11、TG418标记PCR扩增产物的凝胶电泳图，第一泳道为Marker，第2、3、4、5泳道为耐盐渐渗系材料IL7-5-5的电泳结果，第6、7泳道为盐敏感材料M82的电泳结果。
附图12、TG418标记PCR扩增产物的凝胶电泳图，前3个泳道为盐敏感材料M82的电泳结果，后3个泳道为耐盐渐渗系材料IL7-5-5的电泳结果。如图所示PCR标记TG418在耐盐材料IL7-5-5与耐敏感材料M82之间可扩增出明显的差异性条带，在耐盐材料IL7-5-5中可扩展出一条约1000bp的谱带，在盐敏感材料M82中可扩增出一条约900bp的条带。
附核苷酸的序列表及光盘。
具体实施方式
实施例
鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法，包括以下步骤：1)耐盐主效基因定位，2)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中：正向引物：5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物：5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因组的DNA，以引物对番茄基因组DNA进行PCR扩增，无需特异性酶切，就可得到有差异性的产物条带，利用此标记中产物的大小可鉴别出番茄耐盐材材料和感疫病材料；4)PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察拍照的耐盐植株PCR产物有1000bp的1条谱带，盐敏感植株有900bp的1条谱带。
一、耐盐基因定位
1材料与方法
1.1材料
栽培种S.lycopersicumM82及来自S.pennellii LA716的76个渐渗系(表1)。渐渗系群体是基于普通番茄S.lycopersicum M82遗传背景，利用侧翼标记，将野生种S.pennellii LA716片段渗入构建，包括初始含有较长染色体片段的50个品系，及后来开发的含有较短片段的26个品系，这些含有较短片断的品系与50个品系中的一些品系基本完全重叠，为精细定位提供了基础。全套渐渗系基本覆盖了野生种LA716的整个基因组，片段平均长度约12.3cM(Eshed等1992)。
表1  76个渐渗系材料及其片断在染色体上的位置
  76lines   S.pennelli   IntrogressionLines   76lines   S.pennelli   IntrogressionLines
  427-1   LA4028   IL 1-1   427-39   LA4089   IL 10-2
  427-2   LA4031   IL 1-2   427-40   LA4091   IL 10-3
  427-3   LA4032   IL 1-3   427-41   LA4092   IL 11-1
  427-4   LA4033   IL 1-4   427-42   LA4093   IL 11-2
  427-5   LA4037   IL 2-2   427-43   LA4094   IL 11-3
  427-6   LA4038   IL 2-3   427-44   LA4095   IL 11-4
  427-7   LA4039   IL 2-4   427-45   LA4097   IL 12-1
  427-8   LA4040   IL 2-5   427-46   LA4099   IL 12-2
  427-9   LA4041   IL 2-6   427-47   LA4100   IL 12-3
  427-10   LA4043   IL 3-1   427-48   LA4102   IL 12-4
  427-11   LA4044   IL 3-2   427-49   LA4029   IL 1-1-2
  427-12   LA4046   IL 3-4   427-50   LA4030   IL 1-1-3
  427-13   LA4047   IL 3-5   427-51   LA4034   IL 1-4-18
  76lines   S.pennelli   IntrogressionLines   76lines   S.pennelli   IntrogressionLines
  427-14   LA4048   IL 4-1   427-52   LA4035   IL 2-1
  427-15   LA4050   IL 4-2   427-53   LA4036   IL 2-1-1
  427-16   LA4051   IL 4-3   427-54   LA4042   IL 2-6-5
  427-17   LA4053   IL 4-4   427-55   LA4045   IL 3-3
  427-18   LA4054   IL 5-1   427-56   LA4049   IL 4-1-1
  427-19   LA4055   IL 5-2   427-57   LA4061   IL 6-2-2
  427-20   LA4056   IL 5-3   427-58   LA4068   IL 7-4-1
  427-21   LA4057   IL 5-4   427-59   LA4072   IL 8-1-1
  427-22   LA4058   IL 5-5   427-60   LA4073   IL 8-1-5
  427-23   LA4059   IL 6-1   427-61   LA4079   IL 9-1-2
  427-24   LA4060   IL 6-2   427-62   LA4080   IL 9-1-3
  427-25   LA4062   IL 6-3   427-63   LA4082   IL 9-2-5
  427-26   LA4063   IL 6-4   427-64   LA4083   IL 9-2-6
  427-27   LA4064   IL 7-1   427-65   LA4085   IL 9-3-1
  427-28   LA4065   IL 7-2   427-66   LA4086   IL 9-3-2
  427-29   LA4066   IL 7-3   427-67   LA4088   IL 10-1-1
  427-30   LA4067   IL 7-4   427-68   LA4090   IL 10-2-2
  427-31   LA4069   IL 7-5   427-69   LA4096   IL 11-4-1
  427-32   LA4071   IL 8-1   427-70   LA4098   IL 12-1-1
  427-33   LA4074   IL 8-2   427-71   LA4101   IL 12-3-1
  427-34   LA4076   IL 8-3   427-72   LA4103   IL 12-4-1
  427-35   LA4078   IL 9-1   427-73   LA4052   IL 4-3-2
  427-36   LA4081   IL 9-2   427-74   LA4070   IL 7-5-5
  427-37   LA4084   IL 9-3   427-75   LA4075   IL 8-2-1
  76lines   S.pennelli   IntrogressionLines   76lines   S.pennelli   IntrogressionLines
  427-38   LA4087   IL 10-1   427-76   LA4077   IL 8-3-1
1.2方法
番茄种子播种在草炭、珍珠岩、蛭石(1∶1∶1)基质中，按常规田间管理。待幼苗长到4片真叶时，将幼苗根部的草炭、珍珠岩和蛭石清洗干净，然后移栽到盛有1/2浓度的Hoagland标准营养液。每一个塑料容器15株，每一个塑料容器包括至少1株M82作为对照，日补充空气三次、每次30分钟，并每隔两天将蒸发掉的水分用无离子水补充到原体积，一周后开始加盐。每天按50mM NaCl+5mM CaCl2增加盐浓度，直至终盐浓度达到700mM NaCl+70mM CaCl2为止。共设置4次独立的生物学重复试验。
耐盐性调查参照Foolad(2001)和Dasgan(2002)等方法。当盐浓度达到终浓度后分别于第4天、第8天、第12天调查耐盐级数，根据盐害的症状(萎黄、坏疽、枯萎)按照耐盐程度分为11个等级。具体分级标准如下：0级：完全致死。1级：植株叶枯萎，茎干直立。2级：植株叶枯萎，茎干直立且绿色。3级：植株叶一半萎黄，一半枯萎。4级：植株叶大部分萎黄，有少许萎缩绿叶。5级：植株叶1/3绿色、2/3萎黄，绿叶萎缩严重。6级：植株叶一半绿，一半萎黄，绿叶有萎缩。7级：植株叶2/3叶绿色、1/3萎黄，绿叶有萎缩。8级：叶全绿色，有萎缩。9级：叶全绿色，有轻微萎缩。10级：植株健康，没有任何盐害症状。
1.3数据统计分析
用SPSS 13.0对分级数进行统计分析。根据Foolad等(2001)方法，首先将分级数转换为成活百分率(成活百分率％＝级数/11×100)。表型值利用普通线性模型(General linear Model，GLM)进行计算，成活百分率％＝常数+基因型+试验+基因型×试验。试验相关性采用Pearson correlation进行。利用Dunnett两尾测验进行方差分析，渐渗品系与对照M82耐盐性差异达到显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)即判定为包含耐盐基因。根据Semel等(2006)方法，每个耐盐渐渗系片段包含位点被认为是一个耐盐基因。
2结果与分析
2.1番茄4个独立耐盐试验数据群体变异分析
对上述76个渐渗系及M82进行了4个独立试验的耐盐性鉴定。结果表明，4个试验间存在一定差异(表2)，成活百分率介于32.5±1.2％与52.3±0.69％。每试验76个渐渗系的变异符合正态分布(图1、2、3、4)，说明来自野生种番茄S.pennellii LA716的耐盐性属于数量性状，受多基因控制。
表2  S.pennellii LA716渐渗系群体4个独立耐盐试验均值
2.2番茄4个独立耐盐试验之间的相关性分析
由表3知，试验1、2、4相互间相关性都达到了极显著，试验3与试验2之间的相关性达到显著，而与试验1和试验4的相关性未达到显著。这与上述试验间变化结论相一致，说明不同试验间存在一定差异。根据相关性，试验1、2、4用于终结果方差分析(表4)。结果表明，试验3缺失只影响耐盐QTL的显著性。试验间和品系间差异均达到极显著。说明不同试验间存在一定的差异，而且不同品系耐盐性也不同。
利用线性模式对选取的3个试验进行分析结果表明，对照M82的成活百分率为31.89％，76个渐渗系苗期耐盐存活率介于15.28％-61.52％之间，其中65个株系的耐盐性比对照高，其成活百分率介于32.07％-61.52％之间(图5)。
表3  4个耐盐试验之间的相关性分析
Figure GSA00000116941700072
注：**相关性在0.01水平达到显著  *相关性在0.05水平达到显著
表4  3个独立试验线性模型方差分析结果
Figure GSA00000116941700081
2.3苗期耐盐QTL定位
利用Dunnett两尾测验方差分析结果表明，10个渐渗系(IL2-1-1、IL2-6、IL6-2、IL6-4、IL7-1、IL7-5、IL7-4-1、IL7-5-5、IL8-3-1、IL10-1-1)与M82成活百分率差异达到显著或极显著水平(表5)，这些渐渗系应该包含耐盐位点。由于来自S.pennellii LA716的渐渗系群体由50个片段较长的IL和26个片段间断的亚渐渗系(Sub-IL)组成，而26个Sub-IL是基于50个初渐渗系构建的，因此Sub-IL均与50个IL的一些品系所包含的片段重叠，重叠区域不仅可用于验证所包含的耐盐基因位点，而且还可以进一步确定耐盐基因所在的区段(图6、图7、图8)。本研究所鉴定的10个耐盐渐渗系中，IL2-1-1、IL7-4-1、IL10-1-1、IL7-5-5、IL8-3-1均为Sub-IL，与它们有部分或者全部重叠的IL详列表4。通过不同品系重叠区域确定，鉴定出来自S.pennellii的8个耐盐基因可明显提高番茄苗期成活率，它们可较对照M82增加18.9％-83.8％，分布在番茄2、6、7、8、10等5条染色体上。例如包含耐盐基因Stq7a的IL7-1，耐盐成活率与M82达到了极显著差异，IL7-2与其完全重叠，IL7-2也表现较好的耐盐性且P值较低，因此确认该区段包含此耐盐基因位点。而耐盐基因Stq6比较特殊，虽然IL6-4表现很好的耐盐性，但是与其完全重叠的IL6-3却表现为对盐极其敏感，因此该基因位点有待于更多的试验进一步确定。
表5  耐盐QTL的鉴定及重叠片段耐盐性分析
Figure GSA00000116941700082
Figure GSA00000116941700091
二、一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法
1、材料与方法
1.1试验材料
试验材料为M82和以M82为遗传背景的渐渗系材料IL7-5-5，其中渐渗系IL7-5-5在第7条染色体2.0-2.9cM的片断上，此片断已被证实含有一个耐盐的主效基因。
1.2引物设计
实验所用RFLP标记的序列来源于Cornell大学；人工设计CAPS引物序列；由上海生物技术工程服务有限公司合成；CAPS标记的名称仍用原来的RFLP标记的名称(见表6)。
表6  根据RFLP标记序列设计的CAPS引物
Figure GSA00000116941700092
1.3DNA提取
实验材料播种于温室，待幼苗长到7-8片真叶时，参照姜静(2003)的《分子生物学实验原理与技术》的CTAB法提取嫩叶DNA，用0.1×TE稀释后贮存于-20℃的冰箱中备用。
1.4CAPS体系的建立
CAPS体系参照王孝宣等(2004)方法，并进行了一定程度的优化，最终采用50ng模板DNA，1.25UTaqDNA聚合酶，Mg2+终浓度为1.5mmol/L，dNTP浓度为0.25mmol/L，每个引物浓度为0.2umol/L，最终体积为25ul的PCR体系。PCR反应在MJ PTC-200热循环仪上进行，反应程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共37个循环，最后72℃延伸10min。
实验对PCR的退火温度进行优化筛选，分别设55℃、58℃和60℃的温度梯度，比较结果。
1.5电泳检测
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，1.5％的琼脂糖凝胶(0.5×TBE缓冲液)，每样品加5ul PCR产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测PCR产物，如果PCR扩增产物与预期结果一致，就对PCR产物用限制性内切酶消化。
1.6限制性内切酶消化
根据PCR的引物序列与限制性内切酶的切割位点的多少和位置决定对引物序列采用哪种或哪几种限制性内切酶。
限制性内切酶反应体系为：1.5ul限制性内切酶缓冲液，0.2ul限制性内切酶，3.3ul ddH2O，10ul PCR产物。
试验中除Taq I的限制性酶切反应温度为65℃外，其余的限制性酶切反应温度均为37℃，反应时间为4小时以上；1.5％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，每样品加8ul酶切产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色。
2、试验结果
标记TG61、TG113、CT52经过PCR体系的优化筛选，退火温度均为58℃时获得了预期的PCR产物，但是经过设计的相应限制性内切酶消化后，在IL7-5-5和M82之间没有显示切开，这可能需更多的限制性内切酶进行消化分析(表7，图9、图10)。
标记TG418经过PCR体系的优化筛选，在退火温度60℃时获得了预期的PCR产物，在酶切前进行PCR产物检测，在IL7-5-5与M82之间产生了多态性，在IL7-5-5产生一条带，其特征普带分子量约为1000bp，在M82也得到一条带，其特征普带分子量约为900bp，这种在酶切前进行的PCR产物检测，其多态性称为ALP，此标记更简单实用，比需用限制性内切酶酶切的CAPS标记成本更低廉、操作更简单。此结果与预期的RFLP标记一致，说明该RFLP标记可转化为PCR标记(表7，图11、图12)。
表7  番茄RFLP标记转化为CAPS的结果
Figure GSA00000116941700101
Figure GSA00000116941700111
序列表
RFLP标记序列信息及CAPS引物设计结果
1、TG61
Insert size：2100
Vector：pUC
Cutting Site：PST1
Drug Resistance：AMP
Forward sequence：
NAACCATAAATATCAGGAAAAGAATACATGATTGTATAATCCTGACAAATATCTGAT
GATTAAGAGTATAAGAACCTATAAGCTTTAGTTCTTGCAACAACTACAACAAAATCA
CAGTATAACAATTTGATCCCTATTTTCCATTTAAAACCTTTGCCAGACTAAAAGTTG
TGCGGCCACAATCTCATAAACAGGAAACAAGTAATATCAGCTTCAGAATTTATCATA
TCATTAATTATGCTCCTGTCTTGTATGAATCAACGCGCACCAGTAATCAAGCACTTT
AAGTTTTCATCCCTACAGTACTAGCCACCTTCCTTTTCCTGACTGATGATAGGTCAT
AAGTCATCTGATACACACTAGAAAGGAGTTTCACTCCCTTTAAGAGGTCCACCTTGC
AAATAGCTGCGAGA
Reverse sequence：
GTATAGCTTTTTTATTTAGGCAAAGCTTATTTGATCCGGAAAATCATTGAAATTCTT
GTACGGCTATGAAGTGGTACGGTTAAGACTGGTTTATAGCTGTAGGATCAAGAATAA
CATTGTAGTTGCGTAAAACAGATTTTGCTAATTGGTCATTTTAAATTTTCTGTCCAT
CTCGTTGGTAGTCTTCGAAAAGAATATAGTTGACTTAGGGATTGACTGAATACGCTG
CCCAAACCAGATTGTTGTCAGATGCATATCAGAAATGCAATGCCTTAATCAGTGACC
AAAAATGGACAAAATTTTCTCATGAGCTGCCTCAAAGAATGAGTGAGTGGAACAGGG
AGCTGACTTAATGCAGTACTTTGAAGTGTTTAGGCAGTTTCTAGGGTGATTTTATAT
ATATATATATATATATATATACACTATTGCCAGATATGTATGAAGGATCAAATAAGC
TATTTGAATTTAGTTATCGAGGAAGTTGTAT
CAPS引物设计结果
Forward：TTAAGAGGTCCACCTTGCAAAT
Reverse：GGAACAGGGAGCTGACTTAATG
2、TG113
Insert size：900
Vector：pUC
Cutting Site：HindIII/EcoR1
Drug Resistance：AMP
Forward sequence：
GATCTAAGTTATGGCTATAAATTAAATTTGTTATCCGGAGTCAAAAGTTCAAGACCA
AACACCCTTTTAAAGGAAATTTCCCTTTTATTTTAGGAAAAATTACTGAAATACGCG
TCTTATAATTTTTTTATTTTCAATATCCCCTTCTATTTCTAAAAACCTCTAAAATTT
ATTTTTTCTCTTTTAATGTATTTAATGTATCTGAGCTACATATTAATGTATCAGAGC
TACTATTGAATATATCTGAACTATATATTATGTATCCGATTTATTTTATAATGTATC
TGAGCTAGTTTTTAATGTAAGCAATTTATGTTATAATGTATCTGAGATACTCTTTAA
TGTATTATAAATTTTAAGCGATTATAATTTAAAAAATGAGAAGGAAAAGTAATTTAC
TTTTTATACTATGTGATATACTTTAACAATTTTAAAAGCCACACTTAGCCCATTGGA
CTAAGGGGGACATAATTCAAAGAGTAGCCTATAAAAGGCCATTTGGTCAAATATATG
TATAATTCATGTATAACATATGCATCATTATGCATAATTAATATATAAACTATGTAT
ATCGATTAGAAAGATATATTAAATCTGTTTAGTTATTTATGTGAAGGTCTGTTCCGA
AAGAGGTAAAAAACATACTTATATATATAACACATGAAGAACACAAACCTGGAT
Reverse sequence：
AAATATCAACAAGATCAATTCAAGAAACCAATGTCTCGATTAAGGCGAATTTCGTCT
TTTTTATGTTCACCTTTTGATTTGAGCTCAAGAAAGAAGAGTTCAAGATTTCAAAAT
GGAAACTAAACAAATGTCTCCATTGAAGTGTTTTAGCTATGAGGAGATTGCAAGTTC
TACAAATTATTTTCATCCAGGTTTGTGTTCTTCATGTGTTATATATATAAGTATGTT
TTTTACCTCTTTCGGAACAGACCTTCACATAAATAACTAAACAGATTTAATATATCT
TTCTAATCGATATACATAGTTTATATATTAATTATGCATAATGATGCATATGTTATA
CATGAATTATACATATATTTGACCAAATGGCCTTTTATAGGCTACTCTTTGAATTAT
GTCCCCCTTAGTCCAATGGGCTAAGTGTGGCTTTTAAAATTGTTAAAGTATATCACA
TAGTATAAAAAGTAAATTACTTTTCCTTCTCATTTTTTAAATTATAATCGCTTAAAA
TTTATAATACATTAAAGAGTATCTCAGATACATTATAACATAAATTGCTTACATTAA
AA
CAPS引物设计结果
Forward：ATCCGGAGTCAAAAGTTCAAGA
Reverse：CTCTTTCGGAACAGACCTTCAC
3、TG418
Insert size：1400
Vector：pGEM4Z
Cutting Site：PST1
Drug Resistance：AMP
Forward sequence：
ACCTCAGTTAGCAAAACAATGGCTCCAATATGCCTGACCCAACTCTAGAAAACTTCA
TTTGTCATCATTACAGCCTGAACAAGGAGTAGTAGTATAGTGCGCCTAAATTCAGTT
AATATGGAGTATAATTTTAGCTAAACACCACACAATTTAAGCCAATCCAAACAAACC
ATCAGCTGAAGAACAGCGAGAGGGCAACCACCATTAATAACTCCCCAATGCCTCTCT
CGTCGTCCAGAGTTTCATTAACACAAACTTTGATTTAGTACATGTAGTATCTTCCTG
TTACATTTCTACTTAGTCACATTTCTATTTTAAAAGTATACCTAATAAGTTTGATAA
TGCATATTTTCACTCTTAGAATTCATAGTTAGCAAATAGATATAGCAATTGTTCGGA
GCTCATTAATAATCATCAGGTGTTGTAACTGAGAGCGTGTTTGTCTTTCTTTTGTTC
ATAGCTTGATATGCTGAACAGTAAACAGATATCTTTTATAATGAGG
Reverse sequence：
CCATGGGGGGTGCATTGTCTCCTTCGCCTCGATTATACTTATCTGAGCCTTAATGAA
GTCCAATTTGCTTTGCAGTACCTTTTTCCTCAGTCAATACTAGCTCTGTTTGCAGCA
AGTAAGCATCATTACTTATGTTTCTGCTTATCTGTAGGCTGTGATGATATAGAGCTT
ATTGAGTTAATCGGGTTTTGCTCAGCTCAAACCCAAATCTTGGTAAGGATAACTAAA
CTGTGTTTTAAATGGTGCAACGACTATTGGGACGTGATTGAGTGGAAGAGATATTAG
GAATTCATTTAGCTTATCCAACTAGATTGTTGTTGTATGCTATTCTGGTTTGCAGCT
ATGGAGGTATCCCTTTCATTTTCCCGATTTCGTGACATATCTGAGCCTAGTTGATTA
CTCAACTGAGAATAATTCGTCGAGAGTAGAACACTGGAGAATATGAATTAGGCAGCA
TTGTGATGGGCAGTTTTTAGCAATATATGAATGTTAATAGTTTTATGTTATCATGGA
AATGGTGGCATTCGTT
CAPS引物设计结果
Forward：GCCAATCCAAACAAACCA
Reverse：CATTGTCTCCTTCGCCTCG
4、TG131
Insert size：3700
Vector：pUC
Cutting Site：PST1
Drug Resistance：AMP
Forward sequence：
CGGGGATCTCTAAGTCATTCAGGGTCAAGAGAGAACCCATCTCAACTTATTAGTTTC
CAATAGAACAAGCTTTATAGACATGCTCAATTAGAGAAATTAAGGCCAGCACAAGCA
CAACTATGGCCTAACGGTCAACGAAACTGGGCAGAAAAATTAGATGATGCTTTCCAG
GTGGTGGATAGAGCTACCAAAACATGAACACCAGCGTTAAAATTTATTTTTTTTTTT
TTAAAAAAAAAAAGTAGAATTTGCGTTTTTACTTCCCGCAGCGTTTGCAGCAAAAAA
TTCTCCCTAAATTTGTAAAAAGCAACTCAACATTTCCAAAGTCCCATACGAAAAAAT
GGAGTGAATGCAAAGCACTAATCACATTTTCAAAGAAAAAGGAATCGAAAAATAAAC
AGAGAAAATGAAGAAGATCATACCAGCCCTCGTCCGAAGAATCATAGCCAGAAGTAG
ACTGCCGAA
Reverse sequence：
ATAACTTGCATTCTCATGTGATCCATTGCAGAGATTTCTATCTCCGTGTTCTGAAGT
AGTTGCATCCTGACCCGACTTTCTGCAAGCATGTACAATGCTCATTATGTCACCAGA
AGTCCTGTCTTGAGGCAAATGCTCAATTAAGCCAACCTTGCGGTTCCAATTCAGAAG
ATGAATTCCCAAGTACGAGGGCTCTAAATTTAGTAGTTTATGGACATCCACATCAAC
CGTATATACAAACTTCTGTTCCTTTTGCAACTGTAATGAGGTTAATGTAGAAGTTAA
GTACATCAACAACTGTACCTATTATATATTTTGTTTCAAGCAATTCAATGCTAAGGC
TACATTATCACTAGTATCATCGTCCCTACAGTCCTACACTATAATCAAGGATACATC
CATAATAAGCTCAATTACATGAGCATCCTAATATGGTAGAAATAA
CAPS引物设计结果
Forward：GCCAGCACAAGCACAACT
Reverse：GTCCCTACAGTCCTACAC
5、CT52
Insert size：700
Vector：pBLUESC
Cutting Site：EcoR1
Drug Resistance：AMP
Forward sequence：
TTGTCTGAGGAGGAAATTCGAATGAGAAGCAATGAAATTCTTGAGAATGATGATATG
CAACATTTGCTAAGACTTTTCAGCATGGGAGGCCATGGTTCTATAAATGTGCCTGAA
GATGGATATGGTTTCCCATCTTTCATGCCTTCGCCATCTCCTAGTTTCAGTTATGAT
GAAGACCGCACACGGCCAGGAAAAGCTGTTGTTGGTTGGCTGAAAATTAAGGCTGCA
ATGAGGTGGGGGTTCTTTGTGCGGAAGAAGGCAGCTGAGAGGCGTGCACAGCTCGTG
GAACTGGATGATGAATAAAATCTGGTGTGGAAACATTAGGGCATTTAGACTTAACCA
TCGACCATTTGAATAACTATTCACAAGGCCGTGGTCATGCAGGCCCGAGTAATTAGC
TTTCGACTCTAGACGGTATATTTTCCGAGGGATTAGTCAATTCGATTGTTTTTCTTT
TTTCATG
Reverse sequence：
CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTGAAAGCATATTTCCCTTGGGTCTGCAGGACTTA
TACATTACATTACTTCTTGAAACAAATAAAGAGAGTAAGCCCGATGGAGTTAACAAT
GAGAGGGTTAAAAAAAAATTTACTGTACAGGCTTCTGTACATGAAAAAAAAAAAACA
ATCGAATTGACTAATCCCTCGGAAAATATACCGTCTAAAGTCAAAAGCTAATTACTC
GGGCCTGCATGACCACGGCCTTGGGAATAGTTATTCAAATGGCCGATGGTTAAGTCT
AAATGCCCTAATGTTTCCACCCCAAATTTTATTCATCATCCAGTTCCACGAGCTGGG
CACGCCTCTCAGTTGCCTTCTTCCGCACAAAAAACCCCCACCTCATTGCAGCCTTAA
TTTTCAGCCAACCAACAACAGTTTTTCCTGGCCGGGGGCG
CAPS引物设计结果
Forward：TGTGCCTGAAGATGGATA
Reverse：TATTTCCCTTGGGTCTGC

Claims (11)

1.一种鉴别番茄耐盐性状的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：1)耐盐主效基因定位；2)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特定序列的寡聚体，其中：正向引物：5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物：5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因组DNA，以此对引物将番茄基因组DNA进行PCR扩增，无需特异性内切酶酶切，就可得到有差异性的产物条带，利用此引物对的差异性产物条带就可鉴别出番茄耐盐材料和盐敏感材料；4)PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，耐盐材料PCR产物有1000bp的1条谱带，盐敏感材料有900bp的1条谱带。
2.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：利用番茄野生资源S.pennellii LA716的76个渐渗系材料，通过耐盐筛选，将7个耐盐主效基因定位在番茄的5条染色体上，研究所用的渐渗系材料IL7-5-5的片断上含有其中一个耐盐主效基因。
3.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：以CTAB法提取7-8片真叶时幼苗的DNA，用0.1x TE稀释后贮存于-20℃的冰箱中备用。
4.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：CAPS体系的建立采用50ng模板DNA，1.25UTaqDNA聚合酶，Mg2+终浓度为1.5mmol/L，dNTP浓度为0.25mmol/L，每个引物浓度为0.2umol/L，最终体积为25ul的PCR体系。
5.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：PCR反应在MJ PTC-200热循环仪上进行，反应程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共37个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
6.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：对引物的退火温度进行优化筛选，分别设55℃、58℃和60℃的温度梯度，比较结果。
7.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用1.5％的琼脂糖凝胶(0.5×TBE缓冲液)，每样品加5ul PCR产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测PCR产物，如果PCR扩增产物与预期结果一致，进一步将PCR产物用限制性内切酶消化。
8.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：研究所用的限制性内切酶，除Taq I的限制性酶切反应温度为65℃外，其余的限制性内切酶酶切反应温度均为37℃，反应时间为4小时以上。
9.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：限制性内切酶反应体系为：1.5ul限制性内切酶缓冲液，0.2ul限制性内切酶，3.3ul ddH2O，10ul PCR产物。
10.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：1.5％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，每样品加8ul酶切产物，3ul上样缓冲液，溴化乙锭染色，在Gel doc 1000凝胶成像系统下检测酶切产物。
11.按照权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于：研究所用的RFLP标记的序列来源于Cornell大学，所有用作CAPS分析的引物，由上海生物技术工程服务有限公司合成，CAPS标记的名称仍用原来的RFLP标记的名称。
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