CN101829227A - 一种具有治疗原发性痛经的中药复方挥发油部位及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油及其制备方法和其应用，该中药复方挥发油是由当归8～10份、川芎8～10份、熟地8～10份、白芍8～10份、桃仁8～10份、红花5～7份的原料通过水蒸气蒸馏的方法制备得到，本发明根据中医药理论和原发性痛经的发病机制选取原料配伍组方，通过药理实验表明，本发明提供的中药复方经水蒸气蒸馏方法制备所得挥发油具有很好的防治原发性痛经的作用，且长期使用无不良反应，有望开发成为新一代治疗原发性痛经的药物。

Description

一种具有治疗原发性痛经的中药复方挥发油部位及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种中药复方，具体涉及一种具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油及其制备方法和其应用。

背景技术

痛经为妇科最常见的症状之一，约有75％的妇女发生痛经。痛经分为原发性和继发性两大类；原发性痛经是指月经前及行经期间，下腹及腰部痉挛性疼痛，严重时伴有恶心、呕吐、肢冷，尤其多见于未婚青年妇女。流行病学研究表原发性痛经是目前妇科最常见疾病，国外报道妇女原发性痛经的比例高达43％～90％，国内报道痛经发病率为33.1％，其中原发性痛经占53.2％，中医药治疗妇科疾病有悠久的历史，其治则为发时攻邪治标，未发之时扶正治本，从目前临床原发性痛经治疗来看，以辨证辨病结合，中医药愈加显现其独特的治疗优势，但目前治疗痛经的复方药物多存在使用不便、用药量大、有效部位不明确，并存在一定的不良反应等问题，因此很有必要在中医药理论的指导下开发出一种疗效确切，副作用小、服用方便的治疗痛经的药物。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种疗效好、副作用小、有效成分明确、服用方便的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油，本发明另一个目的是提供该中药复方挥发油的制备方法和其在制备治疗原发性痛经药物中的应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油，它是由下列重量份数的原料通过水蒸气蒸馏的方法制备得到，当归8～10份、川芎8～10份、熟地8～10份、白芍8～10份、桃仁8～10份、红花5～7份。

作为优选方案，本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油，它是由下列重量份数的原料通过水蒸气蒸馏的方法制备得到，当归9份、川芎9份、熟地9份、白芍9份、桃仁9份、红花6份。

本发明在前期对古今治疗原发性痛经方剂进行筛选，在中医药理论的指导下，辨证施治，结合原发性痛经的发病机理和发病症状，以活血化瘀为治疗依据进行筛选处方，确定以当归、川芎、白芍、熟地配伍活血祛瘀药桃仁、红花六味中药进行组方，整方具有活血化瘀、养血补血的双重功效，主用于妇科血虚血瘀病症，方中当归补血活血，调经止痛；熟地黄滋阴补血，益精填髓；白芍养血柔肝，缓急止痛；川芎活血祛瘀，行气止痛，四药相配，动静结合，滋而不腻，温而不燥，补而不滞，刚柔相济，阴阳调和，营血得生，共奏补血和血之功，再配伍桃仁和红花药对使组方补血而不留瘀，行血而不伤血。组方六位中药中富含挥发性成分，挥发性成分在中医药理论中具有升发特点，具有行血、活血、通经络功效，用于治疗血瘀疼痛，本发明在中医药辨证施治的指导下组方，并根据组方药味的理化性质特点，采用水蒸气蒸馏方法制备得到挥发油，根据药理实验表明，所得的挥发油部位去除了大量其它非挥发性成分，活性成分更明确，活血化瘀作用强。

本发明提供的制备具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油的方法，其包括以下步骤：

(1)称取组方中相应重量份数的原料，混合、粉碎，置于圆底烧瓶中，加总原料6～10倍量的纯净水，振摇混合，浸泡20～60分钟；

(2)将圆底烧瓶连接挥发油提取器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入圆底烧瓶时为止，然后将圆底烧瓶置电热套中缓缓加热至水沸腾，并保持水微沸至提取器中油量不再增加，停止加热，放置冷却，开启挥发油提取器下端活塞，将水缓缓放出，收集挥发油，并量取挥发油的量；

(3)取步骤(2)得到的挥发油经无水硫酸钠干燥，得黄色透明挥发油。

作为优选方案，以上所述的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油的制备方法，其中步骤(1)中加入纯净水的量是总原料的10倍，使提取溶液和药材之间达到足够大的浓度差，增加挥发性成分的溶出率，并且振摇混合后浸泡30分钟，使药材充分溶涨，可以提高挥发性成分溶出，提高得油率。

作为优选方案，其中步骤(2)中圆底烧瓶置于电热套后加热至110℃使圆底烧瓶内溶液沸腾，并保持微沸8小时，此操作步骤，加热温度不能太高，因为挥发油成分在高温下容易发生结构改变，或者聚合成其它结构从而失去原有的活性，降低功效。

本发明采用水蒸气蒸馏方法制备所得中药复方挥发油的得率为总原料的0.106％，现有技术中一般采用水蒸气蒸馏法提取单位药材中的挥发油成分，本发明首次采用水蒸气蒸馏方法提取由六位中药组成的复方中的挥发油成分，提取效率高。

本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油在制备原发性痛经药物中的应用。作为优选方案，把中药复方挥发油和药学上可接受的载体制成胶囊剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油在制成片剂时把中药复方挥发油和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油制成胶囊剂时把中药复方挥发油和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油制成颗粒剂时，把中药复方挥发油和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

有益效果：本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油具有以下优点：

(1)本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油，根据中医药理论和原发性痛经的发病机制选取原料配伍组方，各组份配比科学合理，通过药理实验表明，本发明提供的中药复方经水蒸气蒸馏方法制备所得挥发油具有很好的活血化瘀、止痛作用，且长期使用无不良反应，本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油可以方便的和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，方便服用。

(2)本发明提供的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油的制备方法，可操作性强，可以很好的提出由六位中药组成的复方中的挥发油成分，提取效率高，且制备方法成本低、环保、可实现工业化大生产。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一种中药复方挥发油的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)取当归180g，川芎180g，熟地180g，白芍180g，桃仁180g和红花120g组成全方共1020g，粉碎后置于20000mL圆底烧瓶中，加总药材量10倍量的纯净水，振摇混合后，浸泡30min；

(2)将圆底烧瓶连接挥发油提取器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，将圆底烧瓶置电热套中缓缓加热至110℃沸腾，并保持微沸8小时，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5mm处时关闭测定器下端活塞，放置1小时，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，收集挥发油成分，经无水硫酸钠干燥后得黄色透明油状挥发油1.2mL，具有特殊浓郁气味。

实施例2

一种中药复方挥发油的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)取360g，川芎360g，熟地360g，白芍360g，桃仁360g，红花240g组成全方共2040g，粉碎后置于20000mL圆底烧瓶中，加总药材量8倍量的纯净水，振摇混合后，浸泡40min；

(2)将圆底烧瓶连接挥发油提取器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，将圆底烧瓶置电热套中缓缓加热至110℃沸腾，并保持微沸10小时，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5mm处时关闭测定器下端活塞，放置1.5小时，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，收集挥发油成分，经无水硫酸钠干燥后得黄色透明油状挥发油2.5mL，具有特殊浓郁气味。

实施例3

本发明提供的中药复方挥发油治疗原发性痛经的实验研究

选取健康ICR雌性小鼠36只，体重18～22g，随机分为空白组、模型组、中药复方挥发油组，各12只，以雌激素和缩宫素联合制造原发性痛经模型。具体方法为：实验周期为7d，第1-6d给小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇1mg/kg，第5-7d灌胃给挥发油24μl/kg/d(20g生药kg/d)，模型组灌同体积蒸馏水，第6d晚至第7d给药前禁食不禁水。第7d给药30min后腹腔注射缩宫素2U/只，造成小鼠“痛经”模型，观察记录小鼠扭体潜伏期和40min内的扭体次数，具体实验结果如表1所示：

表1中药复方挥发油对原发性痛经模型小鼠扭体潜伏期和扭体次数的影响情况

正常对照组与模型组比较，^**P＜0.01；给药组与模型组比较，^**P＜0.01

由以上实验结果显示，本发明提供的中药复方挥发油能够明显延长小鼠扭体潜伏期(P＜0.01)，降低小鼠的扭体次数(P＜0.01)，与模型组相比本发明提供的中药复方挥发油对小鼠原发性痛经具有很好的防治作用，且未见不良反应。

实施例4

本发明提供的中药复方挥发油对原发性痛经小鼠子宫组织匀浆中Ca²⁺、NO、MDA、SOD和GSH-PX浓度的影响

在小鼠原发性痛经模型中，观察记录小鼠扭体潜伏期和40min内的扭体次数后，将小鼠脱颈处死，迅速剖腹，取出子宫，按试剂盒要求，以冰冻的生理盐水洗净拭干称重，制成10％的子宫组织匀浆，以3000rpm/min低温离心15min，取上清液冷藏保存待测。采用南京建成生物有限公司试剂盒测定小鼠子宫匀浆中NO、MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)和GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)浓度测定。均按试剂盒说明书的实验步骤严格操作，具体实验结果如表2和表3所示：

表2中药复方挥发油对原发性痛经小鼠子宫组织匀浆中Ca²⁺、NO浓度的影响

正常对照组与模型组比较，^**P＜0.01；给药组与模型组比较，^**P＜0.01，^*P＜0.05

由表2实验结果表明，与模型组相比，中药复方挥发油组中Ca²⁺浓度明显低于模型组，具有统计学意义。痛经时，子宫发生缺血-再灌注损伤，使钙离子大量进入细胞内，细胞内钙离子超载引起细胞的能量耗竭、细胞膜受损，此处还可以导致子宫肌挛缩。研究表明，钙离子超载可导致细胞核钙离子稳态失衡，这一切均引起并加重了子宫肌缺血-再灌注损伤。药物通过降低组织内钙离子浓度，使子宫组织趋向正常化，本发明提供的中药复方挥发油组可以很好的降低子宫组织中的Ca²⁺浓度，从而具有防治痛经的功效，已有实验证实，子宫中存在左旋精氨酸-NO-环磷鸟苷(cGMP)系统，并调节子宫收缩性。NO在细胞内形成后通过旁分泌作用可迅速扩散到细胞外，作用于邻近的平滑肌细胞，激活细胞膜上的鸟苷酸环化酶，使该酶活性增大50～200倍，导致细胞内cGMP生成增多，cGMP进而激活cGMP依赖性蛋白激酶，或直接作用于细胞膜上的钙通道，引起钙离子外流或加速细胞内游离钙的的结合，从而引起平滑肌细胞舒张和血管扩张。并且由实验结果表明中药复方挥发油组小鼠子宫中的NO含量明显高于模型组，从而起到防治血瘀和治疗原发性痛经的作用。

表3中药复方挥发油对原发性痛经小鼠子宫组织匀浆中MDA、SOD、GSH-PX的影响

由表3实验结果表明，与模型组相比，中药复方挥发油组中小鼠子宫组织匀浆中的SOD和GSH-PX的浓度明显高于模型组接近与正常组。痛经时，子宫平滑肌阵发性的收缩导致肌间血管受压而出现子宫肌层及内膜的暂时性缺血，使子宫组织细胞由于缺血-再灌注而生成较多的自由基，清除自由基的酶系(如SOD)会相应降低，使组织细胞内微粒体及质膜上的脂加氧酶与环加氧酶被激活，催化花生四烯酸代谢，形成具有高度生物活性的物质。另外在GSH-PX的催化下，GSH可还原细胞内产生的过氧化氢，使其变成水。通过GSH-PX的作用，可以有效降低子宫肌缺血-再灌注损伤时产生的大量过氧化物，通过这种方式对子宫肌缺血-再灌注损伤引起的痛经起到良好的保护作用。此外细胞膜磷脂中多聚不饱和脂肪酸和脂肪酸的不饱和双键极易受到氧自由基攻击，导致脂质过氧化反应，激起自由基的连锁、增殖反应，形成一系列的脂质自由基及其降解产物MDA，将进一步引起膜的流动性降低，通透性增高，线粒体肿胀，溶酶体破坏及溶酶体酶的释放，更进一步加重了子宫内膜的损伤，加快了细胞死亡。而中药复方挥发油组中小鼠子宫组织匀浆中的MDA的浓度低于模型组。因此本发明提供的中药复方挥发油可以有效通过降低小鼠子宫组织匀浆中的MDA和增加小鼠子宫组织匀浆中的SOD和GSH-PX的浓度来达到防治原发性痛经的作用。

实施例5

本发明提供的中药复方挥发油对缩宫素刺激离体小鼠子宫组织作用实验

选取健康ICR雌性小鼠20只，实验前连续3d腹腔注射(1mg/kg)苯甲酸雌二醇，以增加子宫对缩宫素的敏感性。于第4天取出小鼠子宫，置Locke’s溶液中清洗，用细线分别扎住子宫颈端及两侧卵巢端，一端固定于浴槽底部，另一端连接在张力换能器上。置于Locke’s液20mL恒温浴槽中，温度为(37±0.1)℃，持续供氧，pH7.3，通过调节螺母加1g的负荷(10mN)，平衡40min，待子宫收缩稳定，自发节律恢复后，开始进行实验。预先记录5～10min正常收缩曲线，随后加入缩宫素注射剂10μl，作用15min后再加入中药复方挥发油20g生药/ml(终浓度为1g生药/ml)并观察记录各组小鼠子宫组织收缩频率、收缩幅度、平均收缩肌张力的情况，计算抑制子宫收缩的百分率(IR％)。计算公式：IR(％)＝(给药前参数-给药后参数)/给药前参数×100。具体实验结果如表4所示：

表4中药复方挥发油对缩宫素刺激离体小鼠子宫组织作用情况

正常对照组与模型组比较，^**P＜0.01；给药组与模型组比较，^**P＜0.01，^*P＜0.05

由表4结果表明，与模型组相比，中药复方挥发油可以明显的降低小鼠离体子宫收缩频率、收缩幅度和平均收缩肌张力，从而可以起到治疗痛经的作用。

实施例6

本发明提供的中药复方挥发油对缩宫素刺激原代小鼠子宫内膜细胞作用实验

取20只健康ICR雌性小鼠，体重18～22g，脱椎处死，置75％酒精浸泡5min移入无菌室超净台，剖开腹腔取出子宫，正常小鼠子宫为“Y”型，较小，包埋于脂肪组织中，仔细将子宫与周围脂肪等组织分离，放入预先准备好的4℃无菌PBS液中洗一遍，在解剖镜下小心将子宫沿中线纵向剖开于PBS液中洗两遍，然后置含酶液的10ml离心管中消化。10ml7.5mg/ml胰蛋白酶和25mg/ml胰酶0℃消化60min，室温消化45min，37℃消化2min。待消化结束后，倒出含有酶液的PBS，加入含10％FBS的DMEM/F-12培养基3ml终止消化，5min后倒出培养基加入10mlPBS振摇1min，取出子宫组织，此时悬液中富含上皮细胞，悬液比较粘稠以1ml/支分装于10支10ml离心管中用PBS补足到10ml，于1500转离心3min，倒去上清液，加入12mlPBS静置5min，上清液2ml弃去，1500转离心5min，然后弃去上清液，加入DMEM/F-12培养基(含10％FBS，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，台盼蓝染色计算细胞存活率，以200μl每孔种到96孔板，放入CO₂培养箱培养。在倒置显微镜下观察可见，胰酶消化后的子宫内膜上皮细胞呈卵圆状或葡萄串状，接种24h后仍有部分漂浮。3天后细胞成团生长，排列紧密，单个的上皮细胞呈蝌蚪状或棒状，细胞将生长汇合至培养孔面积的80％左右。生长至第4天，细胞铺满板底，第6～7天后，上皮细胞已经完全生长汇合，继续培养可维持2周左右。

实验分为空白组、模型组、中药复方挥发油组。每组设6个复孔。MTT检测细胞存活率，10^-7U/ml缩宫素刺激子宫内膜细胞造模，中药挥发油组给予用培养液配制的终浓度为1g生药/ml挥发油，模型组给予同等体积的培养液，继续放置培养箱中培养72h，然后加入20μl的MTT，继续孵育4h后终止培养，弃去上清液，加入二甲基亚枫(DMSO)150μl振荡，用酶标仪在490nm波长处测定吸光度(A值)，以A值代表细胞活性，取A值均值。

流式细胞检测细胞内钙离子浓度，给药24h后，弃去培养板中的液体，D-Hank’s液洗涤2次。加入Fluo-3/AM(终浓度为10μmol/L)，37℃、5％CO₂避光精确孵育1小时，用D-Hank’s液液冲洗2次；用细胞刮轻轻将细胞从板上刮下，收集细胞悬液，离心，D-Hank’s液洗涤一次，300目尼龙网过滤后上流式细胞原发性痛经离体器官模型和细胞模型的建立及应用流式细胞仪检测。激发波长为488nm，发射波长为520nm，检测10000个细胞，取荧光强度平均值。

Griess试剂检测NO含量取MTT检测细胞存活率小鼠子宫内膜细胞培养上清液100μl，加入Griess试剂(含1％对氨基苯磺酸，0.1％N-1-奈乙二胺盐酸盐，2.5％磷酸)100pl，室温放置10分钟，用酶标仪读取550nm处OD值，根据标准曲线计算NO含量。

表5中药复方挥发油对缩宫素刺激原代小鼠子宫内膜细胞的细胞数目、Ca²⁺、NO的影响

正常对照组与模型组比较，^**P＜0.01；给药组与模型组比较，^**P＜0.01，^*P＜0.05

由表5实验结果表明，与模型组相比，中药复方挥发油能抑制子宫内膜细胞过度增殖，且能降低子宫内膜细胞中的Ca²⁺浓度，并增加NO的含量，Ca²⁺浓度的降低和NO的含量的增加均有利于扩张血管，舒展平滑肌，从而起到防治原发性痛经的作用。

本发明根据中医药理论辨证施治，根据原发性痛经的发病机理，进行科学组方，并采用优选的水蒸气蒸馏方法提取得到挥发油，经实验结果表明本发明提供的中药复方挥发油可以很好的舒展子宫平滑肌，扩张血管，保持子宫组织血液流畅，抑制血瘀形成，从而起到很好的防治原发性痛经的作用，且实验过程中未见不良反应，因此本发明提供的中药复方挥发油有望开发成为新一代防治原发性痛经的药物。

Claims (8)

1.一种具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油，其特征在于，它是由下列重量份数的原料通过水蒸气蒸馏的方法制备得到，当归8～10份、川芎8～10份、熟地8～10份、白芍8～10份、桃仁8～10份、红花5～7份。

2.根据权利要求1所述的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油，其特征在于，它是由下列重量份数的原料通过水蒸气蒸馏的方法制备得到，当归9份、川芎9份、熟地9份、白芍9份、桃仁9份、红花6份。

3.一种制备权利要求1所述的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)称取权利要求1所述的重量份数的原料，混合、粉碎，置于圆底烧瓶中，加总原料6～10倍量的纯净水，振摇混合，浸泡20～60分钟；

(2)将圆底烧瓶连接挥发油提取器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入圆底烧瓶时为止，然后将圆底烧瓶置电热套中缓缓加热至水沸腾，并保持水微沸至提取器中油量不再增加，停止加热，放置冷却，开启挥发油提取器下端活塞，将水缓缓放出，收集挥发油，并量取挥发油的量；

(3)取步骤(2)得到的挥发油经无水硫酸钠干燥，得黄色透明挥发油。

4.根据权利要求3所述的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油的制备方法，其特征在于，步骤(1)中加入纯净水的量是总原料的10倍，振摇混合后浸泡30分钟。

5.根据权利要求3所述的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油的制备方法，其特征在于，步骤(2)中圆底烧瓶置于电热套中加热至110℃，并保持微沸8小时。

6.根据权利要求3所述的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油的制备方法，其特征在于，步骤(3)所得干燥后的挥发油的得率为总原料的0.106％。

7.权利要求1或2所述的具有治疗原发性痛经作用的中药复方挥发油在制备治疗原发性痛经药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的中药复方挥发油在制备治疗原发性痛经药物中的应用，其特征在于把中药复方挥发油和药学上可接受的载体制成胶囊剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。