CN101824096B - 一种首乌藤多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及首乌藤多糖的制备方法，有效解决首乌藤多糖的制备问题，其方法是，将首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与碱溶液混合，然后水浴回流提取，过滤，合并滤液，调pH，浓缩，再加入乙醇，静置，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩，加入乙醇，静置，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖；本发明工艺简单，多糖得率高，含量亦较高，提取的多糖有明显的抗氧化活性。
Description
一、技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种首乌藤多糖的制备方法。
二、背景技术
中药首乌藤(Caulis Polygoni Multiflori)为蓼科植物何首乌的干燥藤茎，又名夜交藤、棋藤，资源丰富，价廉易得。中医用于治疗失眠多梦、血虚身痛、风湿痹痛；外治皮肤瘙痒。具有养血安神、祛风通络的功能。目前对首乌藤的研究仅限于蒽醌类化合物(大黄素、大黄素-6-甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖甙等)。另有报道，首乌藤醇提物能抑制实验性大鼠高脂血症，对鹌鹁实验性动脉粥样硬化(AS)有一定的预防和治疗作用，首乌藤有降低实验动物血脂的功能；复方首乌藤合剂能增强自然衰老小鼠的学习和记忆能力，并对分别由东莨菪碱、亚硝酸钠和40％乙醇引起的小鼠记忆获得、记忆巩固和记忆再现病理模型有较明显的改善作用。
研究表明，首乌藤中的主要活性成分首乌藤多糖可显著增强小鼠SOD和GSH-Px活性，有效降低MDA含量，具有很好的抗氧化作用，将成为新一代抗氧化剂，是一种在治疗肿瘤及抗衰老方面的潜力药。那么，如何将首乌藤多糖从首乌藤中提练出来，提高药用价值，目前国内外无人涉足，因此，如何研制出一种从首乌藤中提取首乌藤多糖，且多糖得率高的制备方法为众所期待。
三、发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种首乌藤多糖的制备方法，可有效解决首乌藤多糖的制备问题。
本发明解决的技术方案是，将首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与碱溶液以1∶5-30的重量体积比混合，然后用80-95℃水浴回流提取2-3次，每次1-5h，过滤，合并滤液，调pH为7，浓缩至首乌藤粉末重量体积的1-2倍，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至首乌藤粉末重量体积的0.5-1倍，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入第二次多糖沉淀物重量体积的1-2倍量的无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖；所说的碱溶液是摩尔浓度为0.05-1mol/L的NaOH水溶液、0.05-1mol/L的KOH水溶液、0.01-1mol/L的Na2CO3水溶液等中的一种；所说的树脂柱，是预处理的树脂柱，树脂柱的预处理方法是，取树脂用乙醇浸泡24小时，湿法装柱，继续用乙醇作流动相清洗树脂，洗至流出的乙醇与水混合不呈白色混浊为止，再以蒸馏水作流动相通过树脂层，洗净乙醇，树脂柱湿态(即预处理的树脂柱)保存备用；所说的树脂为DA-201、D101、HPD-600、AB-8、XDA-6、LSA-20、CAD-45、D860021等中的一种；所说的乙醇为质量浓度95％的乙醇或无水乙醇；所说重量体积是指固体用g计，液体用ml计，以下同。
本发明工艺简单，多糖得率高，含量亦较高，提取的多糖有明显的抗氧化活性。
四、具体实施方式
以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1：
将100克首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与摩尔浓度为0.07-0.8mol/L(具体可采用0.2mol/L)的NaOH水溶液800mL混合，85℃水浴回流提取5h，过滤，得第一次滤液，第一次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.07-0.8mol/L(具体可采用0.2mol/L)的NaOH水溶液550mL，80℃水浴提取4h，过滤，得第二次滤液，并和第一次滤液合并，用盐酸调pH为7，浓缩至120mL，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加100mL蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上DA-201树脂柱或HPD-600树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与DA-201树脂柱或HPD-600树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱DA-201树脂柱或HPD-600树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至100mL，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入20mL的无水乙醇、20mL的丙酮、20mL的乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖干粉10g，用公知的UV检测方法测的多糖含量是41.21％。
实施例2
将500克首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与摩尔浓度为0.07-0.8mol/L(具体可采用0.2mol/L)的KOH水溶液7500mL混合，90℃水浴回流提取4h，过滤，得第一次滤液，第一次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.07-0.8mol/L(具体可采用0.2mol/L)的KOH水溶液5000mL，85℃水浴提取3h，过滤，得第二次滤液，并和第一次滤液合并，用盐酸调pH为7，浓缩至500mL，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加500mL蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上D101树脂柱或XDA-6树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与D101树脂柱或XDA-6树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱D101树脂柱或XDA-6树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至500mL，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入500mL的无水乙醇、500mL的丙酮、500mL的乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖干粉48g，用公知的UV检测方法测的多糖含量是40.52％。
实施例3
将2000克首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与摩尔浓度为0.03-0.8mol/L(具体可采用0.1mol/L)的Na2CO3水溶液56000mL混合，95℃水浴回流提取2h，过滤，得第一次滤液，第一次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.03-0.8mol/L(具体可采用0.1mol/L)的Na2CO3水溶液40000mL，90℃水浴回流提取2h，过滤，得第二次滤液，第二次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.03-0.8mol/L(具体可采用0.1mol/L)的Na2CO3水溶液30000mL，90℃水浴提取1h，过滤，得第三次滤液，并和第一、第二次滤液合并，用盐酸调pH为7，浓缩至2500mL，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加2000mL蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上AB-8树脂柱或LSA-20树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与AB-8树脂柱或LSA-20树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱AB-8树脂柱或LSA-20树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至1500mL，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入2000mL的无水乙醇、2000mL的丙酮、2000mL的乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖干粉195g，用公知的UV检测方法测的多糖含量是42.18％。
本发明提取的首乌藤多糖，经实验证明，能显著提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，表现出首乌藤多糖具有良好的抗氧化活性，具体实验情况如下：
1首乌藤多糖体内抗氧化活性研究方法
取体重20-24g的昆明种小鼠40只，适应性饲养1周后，随机分成4组，每组10只。分别为空白组、多糖低剂量组(200mg·kg-1，mg·kg-1是指1kg体重的小鼠服用的剂量，剂量以mg计，以下同)、多糖中剂量组(400mg·kg-1)、多糖高剂量组(800mg·kg-1)，连续15天口服给药(空白对照组给等量自来水)，每天小鼠给药体积为0.2ml/10g。末次给药后24h，处死动物，分别取小鼠血清及制备1％肝匀浆液，按照试剂盒规定的测定方法测定首乌藤多糖对小鼠血清和肝组织中的SOD、GSH-PX及MDA的影响。
2首乌藤多糖体内抗氧化活性结果分析
2.1首乌藤多糖对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、MDA的影响见表1
表1首乌藤多糖对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、MDA的影响
从表1可以看出，与空白组比较，大剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性提高极显著(P＜0.01)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)；中剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性显著增高(P＜0.05)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)；小剂量组肝组织中SOD活性显著提高(P＜0.05)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)，但GSH-Px活性与空白组差异不显著(P＞0.05)。
2.2首乌藤多糖对小鼠血清中SOD、GSH-Px的影响见表2
表2首乌藤多糖对小鼠血清中SOD、GSH-Px的影响
从表2可见，与空白组相比，大、中剂量组的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性极显著提高(P＜0.01)，小剂量组小鼠血清中SOD和GSH-Px活性差异无显著性(P＞0.05)。
3实验结果表明，首乌藤多糖大、中剂量组显著提高正常小鼠血清和肝组织中SOD、GSH-Px的活性，明显降低正常小鼠肝组织中MDA水平，说明首乌藤多糖具有显著的抗氧化作用。
综上所述，本发明采用大孔吸附树脂进行粗多糖的纯化，具有条件温和，脱蛋白和脱色彻底的特点，且树脂经再生可以重复利用，本发明的有益效果是：工艺简单，且提取的首乌藤多糖得率高，能显著提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，表现出首乌藤多糖具有良好的抗氧化活性。
Claims (4)
1.一种首乌藤多糖的制备方法，其特征在于，将首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与碱溶液以1∶5-30的重量体积比混合，然后用80-95℃水浴回流提取2-3次，每次1-5h，过滤，合并滤液，调pH为7，浓缩至首乌藤粉末重量体积的1-2倍，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至首乌藤粉末重量体积的0.5-1倍，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入第二次多糖沉淀物重量体积的1-2倍量的无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖；所说的碱溶液是摩尔浓度为0.05-1mol/L的NaOH水溶液、0.05-1mol/L的KOH水溶液、0.01-1mol/L的Na2CO3水溶液中的一种；所说的树脂柱，是预处理的树脂柱，树脂柱的预处理方法是，取树脂用乙醇浸泡24小时，湿法装柱，继续用乙醇作流动相清洗树脂，洗至流出的乙醇与水混合不呈白色混浊为止，再以蒸馏水作流动相通过树脂层，洗净乙醇，树脂柱湿态保存备用；所说的树脂为DA-201、D101、HPD-600、AB-8、XDA-6、LSA-20、CAD-45、D860021中的一种。
2.根据权利要求1所述的首乌藤多糖的制备方法，其特征在于，将100克首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与摩尔浓度为0.07-0.8mol/L的NaOH水溶液800mL混合，85℃水浴回流提取5h，过滤，得第一次滤液，第一次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.07-0.8mol/L的NaOH水溶液550mL，80℃水浴提取4h，过滤，得第二次滤液，并和第一次滤液合并，用盐酸调pH为7，浓缩至120mL，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加100mL蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上DA-201树脂柱或HPD-600树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与DA-201树脂柱或HPD-600树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱DA-201树脂柱或HPD-600树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至100mL，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入20mL的无水乙醇、20mL的丙酮、20mL的乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖干粉10g。
3.根据权利要求1所述的首乌藤多糖的制备方法，其特征在于，将500克首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与摩尔浓度为0.07-0.8mol/L的KOH水溶液7500mL混合，90℃水浴回流提取4h，过滤，得第一次滤液，第一次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.07-0.8mol/L的KOH水溶液5000mL，85℃水浴提取3h，过滤，得第二次滤液，并和第一次滤液合并，用盐酸调pH为7，浓缩至500mL，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加500mL蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上D101树脂柱或XDA-6树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与D101树脂柱或XDA-6树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱D101树脂柱或XDA-6树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至500mL，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入500mL的无水乙醇、500mL的丙酮、500mL的乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖干粉48g。
4.根据权利要求1所述的首乌藤多糖的制备方法，其特征在于，将2000克首乌藤干燥、粉碎，得首乌藤粉末，首乌藤粉末与摩尔浓度为0.03-0.8mol/L的Na2CO3水溶液56000mL混合，95℃水浴回流提取2h，过滤，得第一次滤液，第一次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.03-0.8mol/L的Na2CO3水溶液40000mL，90℃水浴回流提取2h，过滤，得第二次滤液，第二次回流提取后的药渣再加入摩尔浓度为0.03-0.8mol/L的Na2CO3水溶液30000mL，90℃水浴提取1h，过滤，得第三次滤液，并和第一、第二次滤液合并，用盐酸调pH为7，浓缩至2500mL，再加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第一次多糖沉淀物，第一次多糖沉淀物加2000mL蒸馏水溶解，得多糖溶解液，上AB-8树脂柱或LSA-20树脂柱，直到流出液在473nm处的吸收度与AB-8树脂柱或LSA-20树脂柱上层溶液的吸收度相同，即大孔吸附树脂吸附达到饱和，用蒸馏水洗脱AB-8树脂柱或LSA-20树脂柱至molish反应无紫色环时停止收集，将洗脱液浓缩至1500mL，加入乙醇至含醇量达到80％，静置12小时，离心去除上清液，得第二次多糖沉淀物，再依次加入2000mL的无水乙醇、2000mL的丙酮、2000mL的乙醚洗涤，离心去除上清液，去除上清液后的沉淀物真空干燥，得首乌藤多糖干粉195g。
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