CN101817876B - 一种花生种子中凝集素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及营养与食品加工领域，尤其是一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：(1)花生粉的制备；(2)滤渣的制备；(3)初次沉淀物的制备；(4)透析溶液的制备；(5)洗脱液的制备；(6)花生种子中凝集素纯品的制备。本发明的有益效果是：本发明方法提取的凝集素吸附快、解吸快、吸附容量大、所得产品纯度高、花生种子中凝集素的活性能够得到有效抑制、适用于大规模工业化生产。以本发明制得的凝集素能够显著地凝集唾液酸酐酶处理后的人的A、B、O型血细胞。
Description
技术领域
本发明涉及营养与食品加工领域，尤其是一种花生种子中凝集素的纯化方法。
背景技术
植物凝集素是一种含有非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的植物(糖)蛋白。凝集素最早于1888年由俄国Porpat大学的Stillmark最先在植物种子蓖麻籽中发现，当时取名为蓖麻素(ricin)。后来经对凝集素的深入研究了解而几经改名，目前仍沿用的名称有lectin和agglutinin。植物的种子含有最大量的凝集素，但在根、叶、皮、花、鳞茎、根茎等部位也都发现有凝集素。凝集素广泛存在于各种植物当中，除了豆科植物，其它植物如禾本科的稻、麦的种胚，延命菊的叶，黄瓜、南瓜、甜瓜等的韧皮部，马铃薯的块根，蕃茄果实的汁，萌发期稻的胚芽、胚根等都能检测到凝集素的存在。一种植物并不是只含有一种凝集素，有些植物体内存在多种凝集素。
凝集素最大的特点是能促使细胞凝集。比较直观的表现是使红血球凝集，但来源不同的凝集素能凝集的红血球也不一样。此外，凝集素的其它作用还有：促使细胞有丝分裂，在其所在的机体内还有许多生理功能，如细胞与细胞间粘着，变体介导的胞饮，细菌感染宿主，巨噬细胞清除入侵的细菌，胚胎发育和机体代谢的调节控制，精子与卵细胞间的识别与结合，分子或离子的传递，雌蕊受粉，共生固氮，植物防御病原体侵入等，都可能包含了凝集素的作用。
凝集素是广泛存在于生物体内的蛋白或糖蛋白(sugar binding protein)，它们能使细胞凝集和(或)沉淀糖蛋白。在植物界的各种组织和器官中含有多种形式的植物凝集素，它们在进化过程中高度保守，而且表现出严格的时间和空间专一性。虽然凝集素的研究已逾百年，但直到本世纪60年代，人们认识到凝集素在生物体内具有多种重要生理功能，在医药、农业上具有巨大应用前景，凝集素的研究文献才开始大量涌现。目前植物凝集素已被广泛的应用于细胞分裂、白细胞的分离、血浆的制备、含糖基生物大分子的检测和癌化学的研究领域。纯化和研究花生中凝集素的功能和应用，对于了解花生的生理生长特性非常重要，同时也会有巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于公开一种可以纯化花生种子中凝集素的新方法，利用这种方法对凝集素进行纯化，凝集素吸附量大、产品纯度高、纯化倍数高。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)花生粉的制备：将原料花生清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为纯化花生种子中凝集素的花生粉；
(2)滤渣的制备：将所得花生粉加入石油醚，恒温水浴振荡处理一定时间，抽滤，弃滤液，保留滤渣，并将滤渣通风橱中晾干；
(3)初次沉淀物的制备：在上述制得的滤渣中加入缓冲液溶解得到溶液，静置12小时以上；然后对溶液以10000转超速离心20分钟，弃上清液，保留初次沉淀物；
(4)透析溶液的制备：初次沉淀物中再次加入缓冲液溶解，得到混和溶液，混和溶液再用缓冲液透析12小时以上，得到透析溶液；
(5)洗脱液的制备：将透析溶液以1-1.5ml/min的流速通过半乳糖苷-琼脂糖亲和填充柱；用缓冲液洗脱除去杂质，再用含有乳糖的缓冲液洗脱得到洗脱液，洗脱流速为1-1.5ml/min；
(6)花生种子中凝集素纯品的制备：将洗脱液浓缩、冷冻干燥，得到花生种子中凝集素纯品。
上述所述花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(2)第一滤渣的制备中所述的石油醚，其加入量为花生粉质量的20-30倍，恒温水浴处理花生粉的温度为30-50℃，处理时间为3-5h。
上述所述花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(3)初次沉淀物的制备中所述的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000。
上述所述花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(4)透析溶液的制备中第一次加入的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000；第二次加入的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000。
上述所述花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(5)洗脱液的制备中第一次使用的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000；第二次使用的缓冲液，其原料成份及重量比为：乳糖∶氯化钠∶磷酸一氢钠∶磷酸二氢钾∶纯水＝200∶8∶1.81∶0.24∶1000。
本发明提供了利用半乳糖苷-琼脂糖亲和层析柱对花生种子中凝集素进行特异性吸附，再根据乳糖和半乳糖与凝集素结合的能力不同，利用乳糖进行洗脱，从而达到凝集素纯化的目的。本方法的优点是吸附快、解吸快、吸附容量大、所得产品纯度高、花生种子中凝集素的活性能够得到有效抑制、适用于大规模工业化生产。以本发明制得的凝集素能够显著地凝集唾液酸酐酶处理后的人的A、B、O型血细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1
一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)花生粉的制备：取无霉烂、无虫蛀的花生种子用清水清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为纯化花生种子中凝集素的花生粉；
(2)滤渣的制备：将所得花生粉加入石油醚，其加入量为花生粉质量的20倍，恒温水浴处理花生粉的温度为30℃，处理时间为5h；恒温水浴振荡处理一定时间，抽滤，弃滤液，保留滤渣，并将滤渣通风橱中晾干；
(3)初次沉淀物的制备：在上述制得的滤渣中加入缓冲液溶解得到溶液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000，静置12小时以上；然后对溶液以10000转超速离心20分钟，弃上清液，保留初次沉淀物；
(4)透析溶液的制备：初次沉淀物中再次加入缓冲液溶解，缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000；得到混和溶液，混和溶液再用缓冲液透析12小时以上，该次加入的缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000；得到透析溶液；
(5)洗脱液的制备：将透析溶液以1ml/min的流速通过半乳糖苷-琼脂糖亲和填充柱；用缓冲液洗脱除去杂质，缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000；再用含有乳糖的缓冲液洗脱得到洗脱液，该次使用的缓冲液原料成份及重量比为：乳糖∶氯化钠∶磷酸一氢钠∶磷酸二氢钾∶纯水＝200∶8∶1.81∶0.24∶1000，洗脱流速为1ml/min；
(6)花生种子中凝集素纯品的制备：将洗脱液浓缩、冷冻干燥，得到花生种子中凝集素纯品。
实施例2
一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)花生粉的制备：取无霉烂、无虫蛀的花生种子用清水清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为纯化花生种子中凝集素的花生粉；
(2)滤渣的制备：将所得花生粉加入石油醚，其加入量为花生粉质量的25倍，恒温水浴处理花生粉的温度为40℃，处理时间为4h；恒温水浴振荡处理一定时间，抽滤，弃滤液，保留滤渣，并将滤渣通风橱中晾干；
(3)初次沉淀物的制备：在上述制得的滤渣中加入缓冲液溶解得到溶液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000，静置12小时以上；然后对溶液以10000转超速离心20分钟，弃上清液，保留初次沉淀物；
(4)透析溶液的制备：初次沉淀物中再次加入缓冲液溶解，缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝6∶1.6∶0.15∶1000；得到混和溶液，混和溶液再用缓冲液透析12小时以上，该次加入的缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝6∶1.6∶0.15∶1000；得到透析溶液；
(5)洗脱液的制备：将透析溶液以1ml/min的流速通过半乳糖苷-琼脂糖亲和填充柱；用缓冲液洗脱除去杂质，缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝6∶1.6∶0.15∶1000；再用含有乳糖的缓冲液洗脱得到洗脱液，该次使用的缓冲液原料成份及重量比为：乳糖∶氯化钠∶磷酸一氢钠∶磷酸二氢钾∶纯水＝200∶8∶1.81∶0.24∶1000，洗脱流速为1.5ml/min；
(6)花生种子中凝集素纯品的制备：将洗脱液浓缩、冷冻干燥，得到花生种子中凝集素纯品。
实施例3
一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)花生粉的制备：取无霉烂、无虫蛀的花生种子用清水清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为纯化花生种子中凝集素的花生粉；
(2)滤渣的制备：将所得花生粉加入石油醚，其加入量为花生粉质量的30倍，恒温水浴处理花生粉的温度为50℃，处理时间为3h；恒温水浴振荡处理一定时间，抽滤，弃滤液，保留滤渣，并将滤渣通风橱中晾干；
(3)初次沉淀物的制备：在上述制得的滤渣中加入缓冲液溶解得到溶液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000，静置12小时以上；然后对溶液以10000转超速离心20分钟，弃上清液，保留初次沉淀物；
(4)透析溶液的制备：初次沉淀物中再次加入缓冲液溶解，缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝10∶2.0∶0.25∶1000；得到混和溶液，混和溶液再用缓冲液透析12小时以上，该次加入的缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝10∶2.0∶0.25∶1000；得到透析溶液；
(5)洗脱液的制备：将透析溶液以1.5ml/min的流速通过半乳糖苷-琼脂糖亲和填充柱；用缓冲液洗脱除去杂质，缓冲液原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝10∶2.0∶0.25∶1000；再用含有乳糖的缓冲液洗脱得到洗脱液，该次使用的缓冲液原料成份及重量比为：乳糖∶氯化钠∶磷酸一氢钠∶磷酸二氢钾∶纯水＝200∶8∶1.81∶0.24∶1000，洗脱流速为1.5ml/min；
(6)花生种子中凝集素纯品的制备：将洗脱液浓缩、冷冻干燥，得到花生种子中凝集素纯品。
上述所述任一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(2)滤渣的制备中所述的石油醚，其加入量为花生粉质量的20-30倍，恒温水浴处理花生粉的温度为30-50℃，处理时间为3-5h。
上述所述任一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(3)初次沉淀物的制备中所述的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000。
上述所述任一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(4)透析溶液的制备中第一次加入的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000；第二次加入的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000。
上述所述任一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(5)洗脱液的制备中第一次使用的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000；第二次使用的缓冲液，其原料成份及重量比为：乳糖∶氯化钠∶磷酸一氢钠∶磷酸二氢钾∶纯水＝200∶8∶1.81∶0.24∶1000。
上述所述任一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于步骤(5)洗脱液的制备中，透析溶液通过半乳糖苷-琼脂糖亲和填充柱的流速为1-1.5ml/min；洗脱流速为1-1.5ml/min。
本发明提供了利用半乳糖苷-琼脂糖亲和层析柱对花生种子中凝集素进行特异性吸附，再根据乳糖和半乳糖与凝集素结合的能力不同，利用乳糖进行洗脱，从而达到凝集素纯化的目的。本方法的优点是吸附快、解吸快、吸附容量大、所得产品纯度高、花生种子中凝集素的活性能够得到有效抑制。以本发明制得的凝集素能够显著地凝集唾液酸酐酶处理后的人的A、B、O型血细胞。
当然，本发明方法还适用于其它含脂量丰富的物质的凝集素的纯化提出，如大豆、黄豆等。
本文具体说明了本发明示例性实施实例和目前的优选实施方式，应当理解，本发明的构思可以按其他种种形式实施运用，它们同样落在本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种花生种子中凝集素的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)花生粉的制备：将原料花生清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为纯化花生种子中凝集素的花生粉；
(2)滤渣的制备：将所得花生粉加入石油醚，恒温水浴振荡处理一定时间，抽滤，弃滤液，保留滤渣，并将滤渣通风橱中晾干；
(3)初次沉淀物的制备：在上述制得的滤渣中加入缓冲液溶解得到溶液，静置12小时以上；然后对溶液以10000转超速离心20分钟，弃上清液，保留初次沉淀物；
(4)透析溶液的制备：初次沉淀物中再次加入缓冲液溶解，得到混和溶液，混和溶液再用缓冲液透析12小时以上，得到透析溶液；
(5)洗脱液的制备：将透析溶液以1-1.5ml/min的流速通过半乳糖苷-琼脂糖亲和填充柱；用缓冲液洗脱除去杂质，再用含有乳糖的缓冲液洗脱得到洗脱液，洗脱流速为1-1.5ml/min；
(6)花生种子中凝集素纯品的制备：将洗脱液浓缩、冷冻干燥，得到花生种子中凝集素纯品；
其中：
步骤(2)滤渣的制备中所述的石油醚，其加入量为花生粉质量的20-30倍，恒温水浴处理花生粉的温度为30-50℃，处理时间为3-5h；
步骤(3)初次沉淀物的制备中所述的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝8∶1.81∶0.24∶1000；
步骤(4)透析溶液的制备中第一次加入的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000；第二次加入的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000；
步骤(5)洗脱液的制备中第一次使用的缓冲液，其原料成份及重量比为：NaCl∶Na2HPO4∶KH2PO4∶H2O＝(6～10)∶(1.6～2.0)∶(0.15～0.25)∶1000；第二次使用的缓冲液，其原料成份及重量比为：乳糖∶氯化钠∶磷酸一氢钠∶磷酸二氢钾∶纯水＝200∶8∶1.81∶0.24∶1000。
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