CN101817593B

CN101817593B - 一株吲哚和粪臭素降解菌株lpc24的应用

Info

Publication number: CN101817593B
Application number: CN2009100630683A
Authority: CN
Inventors: 李平; 王焰新; 王艳红; 童蕾; 刘珩; 刘琨
Original assignee: China University of Geosciences
Current assignee: China University of Geosciences
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2009-07-06
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2029-07-06
Also published as: CN101817593A

Abstract

本发明涉及一种吲哚和粪臭素降解微生物的应用。一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用，其特征在于所述菌株的应用为恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24 CCTCC NO：M209099应用于含吲哚和粪臭素废水的处理中。具体处理方法为：挑取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24单菌落，于液体MSM培养基中培养过夜，按培养后的恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24∶含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)的体积比为0.5-2∶100取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24接种于含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)中，30-35℃恒温培养，pH值为6.0-8.0，反应3-5天。本发明具有良好的去除畜禽养殖废水中吲哚和粪臭素的能力。

Description

一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用

技术领域

本发明涉及一种吲哚和粪臭素降解微生物的应用。

背景技术

吲哚和粪臭素是畜禽养殖场废水中主要的有恶臭气味的杂环芳香烃类化合物，它们由色氨酸在动物体内分解而产生的。这两种化合物同样出现在医疗用品、杀虫剂、消毒剂、农用化工用品的生产废水中。这些化学物质的大规模的生产和广泛的应用导致了土壤、地表水和地下水的污染，对人体和动物健康造成了严重的威胁。吲哚和粪臭素可以被人体和动物吸收进入血液，经生物活化后产生有毒的中间产物而影响血液中复合胺的产生，甚至产生溶血现象。有研究表明，动物体内雌激素酮浓度的升高与粪臭素含量直接相关。另外，粪臭素还是一种肺炎球菌毒素。暴露在吲哚环境下的植物组织由于蒽醌合成的影响而表现出低色素沉着。吲哚和粪臭素同样对许多微生物存在毒性效应。它们对细菌均有相当广泛的生物抑制作用，同时对瘤胃纤毛微生物也有毒性作用。

由于吲哚和粪臭素的难降解性及其生物毒性，降解这类化合物的细菌很难分离。虽然前人做过一些关于混合微生物降解的研究工作，但关于纯细菌对吲哚或粪臭素的降解还很少见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用，具有良好的去除畜禽养殖废水中吲哚和粪臭素的能力。

本发明所提供一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24，为恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24 CCTCC NO：M 209099，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M 209099。

一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用，其特征在于所述菌株的应用为恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24 CCTCC NO：M 209099应用于含吲哚和粪臭素废水(含有吲哚和粪臭素的废水)的处理中。

所述的恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24 CCTCC NO：M 209099应用于含吲哚和粪臭素废水的处理方法为：挑取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24单菌落，于液体MSM培养基中培养过夜，按培养后的恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24：含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)的体积比为0.5-2∶100取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24接种于含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)中，30-35℃恒温培养，pH值为6-8，反应3-5天。

所述的液体MSM培养基为：(NH₄)₂SO₄，0.33g；NaNO₃，0.85g；K₂HPO₄，0.79g；KH₂PO₄，0.20g；CaCl₂，0.05g；MgCl₂，0.50g；FeCl₂，0.01g；H₂O 1000mL；pH为7.2；高压灭菌后采用过滤除菌后的粪臭素和吲哚(是指粪臭素和吲哚这两种药品，粪臭素与吲哚之间为任意配比；是用来配置含有一定浓度粪臭素和吲哚的液体MSM培养基用的，下同)，使液体MSM培养基中粪臭素和吲哚的浓度为1.0mM(mM表示mmol/L，下同)。

所述的畜禽主要有猪、牛、羊、驴、兔、鸡、鸭、鹅等。

本发明的有益效果是：从畜禽养殖废水的厌氧反应器的活性污泥中筛选到一株在含粪臭素和吲哚条件下具有一定生长能力的新菌株。一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24有良好的去除畜禽养殖废水中吲哚和粪臭素的能力，该菌株能使吲哚和粪臭素的去除效率提高20-30％。在实验中，能在3-5天内去除畜禽养殖废水中的吲哚1.5mg/L以上，粪臭素1.0mg/L以上。

附图说明

图1是一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的PCR产物琼脂糖电泳图(1：核DNA，2：扩增产物，M：Marker)。

图2是一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的电镜图片。

图3是一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24在含有0.5mM吲哚和粪臭素的人工废水中的降解效率图。

具体实施方式

一、一株吲哚和粪臭素降解菌的筛选方法：

(一)、材料准备：

1、实验废水(畜禽养殖废水)取自湖北省鄂州市湖北省原种猪场排污口，活性污泥取自中国地质大学(武汉)环境学院特殊废水处理实验室，一台处理畜禽养殖废水的厌氧反应器中(厌氧反应器中实验废水取自湖北省鄂州市湖北省原种猪场排污口)。

2、培养基：

液体MSM培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄，0.33；NaNO₃，0.85；K₂HPO₄，0.79；KH₂PO₄，0.20；CaCl₂，0.05；MgCl₂，0.50；FeCl₂，0.01，H₂O 1000mL；pH为7.2；高压灭菌后采用过滤除菌后的粪臭素和吲哚，使液体MSM培养基中粪臭素和吲哚的浓度为1.0mM。

固体MSM培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄，0.33；NaNO₃，0.85；K₂HPO₄，0.79；KH₂PO₄，0.20；CaCl₂，0.05；MgCl₂，0.50；FeCl₂，0.01，H₂O 1000mL；琼脂15g，pH为7.2；高压灭菌后采用过滤除菌后的粪臭素和吲哚，使液体MSM培养基中粪臭素和吲哚的浓度为1.0mM。

LB液体培养基为：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

LB固体培养基为：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15g，pH7.0。

3、实验仪器和设备：

国华SHA-B恒温振荡器，

SHH150G光照生物培养箱，

卧式压力蒸汽灭菌器------上海医用核子仪器厂，

WMX-1型微波密封消解COD速测仪/-----汕头市环海工程总公司，

722S分光光度计-----上海棱光技术有限公司，

光学显微镜-----Olympus有限公司，

pH计等-----Hana有限公司，

超净工作台，

鼓风干燥箱，

JEM-100CX11透射电子显微镜，

PTC200型PCR仪，

电泳仪及电泳槽，

凝胶紫外观测仪，

DDS-11型电导仪，

(二)、菌株的筛选分离与纯化：

1)、初筛：采用直接涂布法

取稳定运行三个月以上的厌氧反应器中的活性污泥1g{反应器中所运行的实验废水(畜禽养殖废水)取自于鄂州市湖北省原种猪场排污口}，加入50mL无菌蒸馏水，以5000转/分的速度离心，离心后去除上清液；再加入50mL无菌蒸馏水，以5000转/分的速度离心，如此重复操作三次，得到沉淀物；

然后将沉淀物用无菌水稀释至100mL，得到菌悬液；然后取上述菌悬液20μL涂布于含有1.0mM的粪臭素和吲哚的固体MSM培养基，30℃培养一周，挑选平板(即涂有固体 MSM培养基的平皿)上不同形态的单菌落在液体MSM培养基中扩大培养，并进一步进行涂布分离，经3-5次纯化、分离{纯化、分离：用无菌的接种环取培养物(LB平板上的菌落)少许在平板上进行划线；当接种环在LB固体培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落，即得到纯化后的单菌落}，最后得到不同菌落形态的纯平板；挑取纯平板的单菌落于LB液体培养基中，30℃恒温培养过夜，得分离菌悬液，得到初筛菌悬液；

2)、二次筛选：取初筛菌悬液1mL，5000转/分的速度离心5分钟，弃上清，用无菌水重悬，加入100mL含有1.0mM粪臭素和吲哚的液体MSM培养基内，30℃恒温培养7天，检测培养基中吲哚、粪臭素的去除效率；选取去除效率大于50％的菌株的菌悬液，取复筛菌悬液20μL涂于固体MSM培养基，30℃恒温培养一周天，观察并记录细菌生长情况以及菌落形态；获得一株编号为LPC24的菌株(菌株LPC24)，即一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24。

二、吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的鉴定：

1、对一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的鉴定：

对一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24进行了生理生化的鉴定以及16S rRNA分子的鉴定，从分子水平确定菌株LPC24的种属。

16S rRNA序列分析主要按照以下步骤：

1)提取细菌核DNA，

a)集菌：用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液管内培养15小时，取其菌悬液1mL于1.5mL的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。

b)加STE 1mL洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min，弃上清液。

c)加600μLTE，剧烈振荡重悬细菌，加入10％的SDS 65μL，65℃水浴5-10min。

d)加等体积酚氯仿抽提三次。

e)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3MNaAc，12000rpm离心10min。彻底弃上清。

f)DNA沉淀用70％乙醇洗一次，风干后溶于20μLTE备用。

TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)；

STE缓冲液：0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA

(pH8.0)；

2)16S rRNA基因的PCR扩增，

PCR扩增引物参照Weisburg等人的方法合成。

P1：正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’

P2：反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’

在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(终浓度为0.5μM)，1μLdNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。

3)PCR产物的纯化回收

将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5mL离心管中加2倍体积TF，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。

4)16S rDNA的全序列测定和分析

PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人方法合成。

P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；

P-r：GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。

加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。

2、16S rRNA序列测定：

本发明采用对16SrRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1431bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。

<110>中国地质大学(武汉)

<120>一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用

<160>1431

<210>1

<211>1431bp

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

<400>1

CCGTGGTAAC CGTCCTCCCG AAGGTTAGAC TAGCTACTTC TGGTGCAACC CACTCCCATG 60

GTGTGACGGG CGGTGTGTAC AAGGCCCGGG AACGTATTCA CCGCGACATT CTGATTCGCG 120

ATTACTAGCG ATTCCGACTT CACGCAATCG AGTTGCAGAC TGCGATCCGG ACTACGATCG 180

GTTTTGTGAG ATTAGCTCCA CCTCGCGGCT TGGCAACCCT CTGTACCGAC CATTGTAACA 240

CGTGTGTAGC CCAGGCCGTA AGGGCCATGA TGACTTGACG TCATCCCCAC CTTCCTCCGG 300

TTTGTCACCG GCAGTCTCCT TAAAGTGCCC ACCATTACGT GCTGGTAACT AAGGACAAGG 360

GTTGCGCTCG TTACGGGACT TAACCCAACA TCTCACGACA CGAGCTGACG ACAGCCATGC 420

AGCACCTGTG TCAGAATTCC CGAAGGCACC AATCCATCTC TGGAAAGTTC TCTGCATGTC 480

AAGGCCTGGT AAGGTTCTTC GCGTTGCTTC CAATTAAACC ACATGCTCCA CCGCTTGTGC 540

GGGCCCCCGT CAATTCATTT GAGTTTTAAC CTTGCGGCCG TACTCCCCAG GCGGTCAACT 600

TAATGCGTTA GCTGCGCCAC TAAAATCTCA AGGATTCCAA CGGCTAGTTG ACATCGTTTA 660

CGGCGTGGAC TACCAGGGTA TCTAATCCTG TTTGCTCCCC CACGCTTTCG CACCTCAGTG 720

TCAGTATCAG TCCAGGTGGT CGCCTTCGCC ACTGGTGTTC CTTCCTATAT CTACGCATTT 780

CACCGCTACA CAGGAAATTC CACCACCCTC TACCGTACTC TAGCTTGCCA GTTTTGGATG 840

CAGTTCCCAG GTTGAGCCCG GGGCTTTCAC ATCCAACTTA ACAAACCACC TACGCGCGCT 900

TTACGCCCAG TAATTCCGAT TAACGCTTGC ACCCTCTGTA TTACCGCGGC TGCTGGCACA 960

GAGTTAGCCG GTGCTTATTC TGTCGGTAAC GTCAAAACAG CAAGGTATTA ACTTACTGCC 1020

CTTCCTCCCA ACTTAAAGTG CTTTACAATC CGAAGACCTT CTTCACACAC GCGGCATGGC 1080

TGGATCAGGC TTTCGCCCAT TGTCCAATAT TCCCCACTGC TGCCTCCCGT AGGAGTCTGG 1140

ACCGTGTCTC AGTTCCAGTG TGACTGATCA TCCTCTCAGA CCAGTTACGG ATCGTCGCCT 1200

TGGTGAGCCA TTACCCCACC AACTAGCTAA TCCGACCTAG GCTCATCTGA TAGCGCAAGG 1260

CCCGAAGGTC CCCTGCTTTC TCCCGTAGGA CGTATGCGGT ATTAGCGTTC CTTTCGAAAC 1320

GTTGTCCCCC ACTACCAGGC AGATTCCTAG GCATTACTCA CCCGTCCGCC GCTGAATCAA 1380

GGAGCAAGCT CCCGTCATCC GCTCGACTTG CATGTGTTAG GCCTGCCGCC A 1431

三、菌落形态特征以及生理生化特性：

对菌株LPC24的菌落形态进行了仔细的观察，该菌落形态：菌落呈米白色(老龄菌呈米黄色)、规则圆形、缘齐、不透明、表面光滑、球状凸起、粘稠状，菌株生理特征：呈直或微弯的杆状，0.7～1.1μm×2.0～4.0μm，单个或成对排列，革兰氏阴性；主要生化特征：兼性厌氧，化能异养菌，能利用硝酸盐，氧化酶阳性，产生精氨酸双水解酶和脲酶，运动，不生孢子，最适生长温度25～37℃。细菌表观见透射电镜图2。

四、菌株LPC24为新的菌株：

采用BLAST分析法对菌株LPC24的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株LPC24与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的同源性高达99.0％。

综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株LPC24命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)LPC24。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LPC24为新的菌株，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M 209099。

本发明从畜禽养殖废水厌氧反应器的活性污泥中分离出这一株细菌，并发现其较强的降解吲哚和粪臭素的功能。这拓宽了人们对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含吲哚和粪臭素类废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。

五、菌株LPC24的应用：

(一)、挑取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24单菌落，于液体MSM培养基中培养过夜，按培养后的恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24：含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)的体积比为0.5-2∶100取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24接种于含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)中，30-35℃恒温培养，pH值为6.0-8.0，反应3-5天。

所述的液体MSM培养基为：(NH₄)₂SO₄，0.33g；NaNO₃，0.85g；K₂HPO₄，0.79g；KH₂PO₄，0.20g；CaCl₂，0.05g；MgCl₂，0.50g；FeCl₂，0.01g；H₂O 1000mL；pH为7.2；高压灭菌后采用过滤除菌后的粪臭素和吲哚，使液体MSM培养基中粪臭素和吲哚的浓度为1.0mM(即mmol/L)。

(二)、菌株LPC24对吲哚、粪臭素的降解能力：

为了考察菌株对吲哚、粪臭素的降解能力，研究了在人工废水MSM中，细菌降解吲哚、粪臭素的能力。取人工废水MSM{人工废水MSM(g/L)：(NH₄)₂SO₄，0.33；NaNO₃，0.85；K₂HPO₄，0.79；KH₂PO₄，0.20；CaCl₂，0.05；MgCl₂，0.50；FeCl₂，0.01，pH为7.2；加入粪臭素和吲哚使其终浓度为1.0mM}100mL加入250mL的锥形瓶中，加入菌株LPC24的菌悬液(菌悬液配制：用接种环挑取LPC24菌落于10mL LB液体培养基中，30℃震摇培养12小时)1mL，30℃、静止培养18d，定期检测剩余吲哚、粪臭素的量。结果表明。该菌株能在10天内将0.5mM的吲哚降解99％以上，将0.5mM的粪臭素在19天内降解99％以上。

为了考察该菌株在实际处理畜禽养殖废水的中吲哚和粪臭素的能力，研究了该菌株投加到畜禽养殖废水厌氧反应器中，吲哚和粪臭素的降解效率。在长期(稳定运行三个月以上)稳定运行的反应器中加入菌株LPC24的菌悬液10mL(菌悬液配制：用接种环挑取LPC24菌落于10mL LB液体培养基中，30℃震摇培养12小时)，反应器中含吲哚和粪臭素废水{实验废水(畜禽养殖废水)取自湖北省鄂州市湖北省原种猪场排污口}为1000mL(粪臭素的浓度约为1.0mg/L，吲哚的浓度约为1.5mg/L)，30℃、静止一周，再稳定运行30天，在反应器稳定运行期间定期检测吲哚、粪臭素的去除效率，与未投加该菌株的对照反应器对比，结果表明，去除畜禽养殖废水中的吲哚约为1.5mg/L，粪臭素约为1.0mg/L；该菌株能使该反应器处理吲哚和粪臭素的去除效率提高20-30％(反应器原始去除率为70-75％，加入菌株LPC24后处理效率为96-99％)。

Claims

1.一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用，其特征在于所述菌株的应用为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LPC24CCTCC NO：M 209099应用于含吲哚和粪臭素废水的处理中。

2.根据权利要求1所述的一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用，其特征在于：所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LPC24CCTCC NO：M 209099应用于含吲哚和粪臭素废水的处理方法为：挑取恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LPC24单菌落，于液体MSM培养基中培养过夜，按培养后的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LPC24∶含吲哚和粪臭素废水的体积比为0.5-2∶100取恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)LPC24接种于含吲哚和粪臭素废水中，30-35℃恒温培养，pH值为6.0-8.0，反应3-5天。

3.根据权利要求1所述的一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的应用，其特征在于：所述的液体MSM培养基为：(NH₄)₂SO₄，0.33g；NaNO₃，0.85g；K₂HPO₄，0.79g；KH₂PO₄，0.20g；CaCl₂，0.05g；MgCl₂，0.50g；FeCl₂，0.01g；H₂O 1000mL；pH为7.2；高压灭菌后采用过滤除菌后的粪臭素和吲哚，使液体MSM培养基中粪臭素和吲哚的浓度为1.0mmol/L。