CN101815444A - 天然防腐剂和抗菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含甘蔗提取物的防腐剂和抗微生物试剂。

Description

天然防腐剂和抗菌剂
技术领域
本发明涉及防腐剂和抗菌剂。具体说，本发明涉及由源自甘蔗的提取物得到的防腐剂和由源自甘蔗的提取物得到的抗菌剂，所述防腐剂可用于食品、化妆品、药品和其他类似组合物的防腐，所述抗菌剂可用于口腔卫生产品。
发明背景
对于本说明书中参考或讨论的文件、法案或知识条款，这种参考或讨论不是承认该文件、法案或知识条款或者其任意组合在优先权日、公众可得、公众已知、构成常规知识的一部分；或者已知与试图解决本说明书所涉及的任何问题的尝试相关。
防腐剂
防腐剂是一种天然或合成的化学品，可加入诸如食品、药品、生物样品、木材等产品中可防止微生物生长或不希望的化学变化导致的分解。
食品防腐是保存其食用和营养价值的食品加工和处理过程。主要目的是阻止或者显著减缓腐败以防止食物传染疾病(例如，通过盐腌、冷却、蒸煮)。然而，一些方法利用有益的细菌、酵母或真菌以添加特定品质和保存食品(例如奶酪、葡萄酒)。虽然在保存其作为食品的价值方面维持或产生营养价值、质地和口味至关重要；但这又是一种文化依赖的决定因素，符合一种文化的食品品质可能在另一种文化中并不恰当。
防腐通常包括阻止细菌、真菌和其他微生物生长，以及延缓导致腐败的脂肪氧化。还包括抑制食品制备期间可能发生的天然老化和脱色的方法，例如苹果中的酶性褐变反应，切割苹果时导致褐变。一些防腐方法要求食品在处理后密封以防止被微生物再次污染；诸如干燥等其他工艺使食品无需特殊容器即可长期储存。
应用这些工艺的常规方法包括：干燥、喷雾干燥、冻干、冷冻、真空包装、罐装、糖浆防腐、糖结晶、食品辐照、添加防腐剂或惰性气体如二氧化碳。不仅有助于食品防腐，而且能够增加风味的其他方法包括酸洗、盐腌、烟熏、糖浆或酒精防腐、糖结晶和固化。
食品防腐添加剂可单独使用或与其他食品防腐方法联用。防腐剂可以是抗微生物的防腐剂，能够抑制细菌和真菌生长，或者是抗氧化剂如氧吸收剂，能够抑制食品组分发生氧化。常用的抗微生物防腐剂包括：丙酸钙、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸盐(二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)和EDTA二钠。常用的抗氧化剂包括：BHT(丁基化羟基甲苯)和BHA(丁基化羟基茴香醚)。其他防腐剂包括甲醛(通常是溶液形式)、戊二醛(杀死昆虫)、乙醇和甲基氯代异噻唑啉酮。许多人造食品添加剂(包括防腐剂)的效果和安全性是食品科学和毒理学专业的学术派和权威们争论的话题。
各种各样的食品中均使用了抗氧化剂来抑制脂肪和油或其氧化产物的分解，这些食品包括但不限于：肉、家禽、脂肪、油、人造奶油、鱼、海鲜和烘焙食品。目前市场被合成防腐剂如BHT和BHA垄断。并且开始被天然防腐剂如迷迭香、茶提取物、生育酚和抗坏血酸盐所替代。然而，目前天然防腐剂非常昂贵，限制了其在食品中的广泛应用，导致合成防腐剂的继续使用。
目前食品工业中也使用抗微生物剂作为防腐剂来延长产品保存期，改善产品安全性、维持产品品质、降低加工成本并提高在复杂供应链中全球分销产品的能力。由于消费者关注合成添加剂的使用，合成抗微生物的市场份额在下降，正在被天然抗微生物剂取代。
诸如盐、糖、醋和硅藻土等天然物质也可用作传统的防腐剂。另一类防腐剂以水果和蔬菜切割后在水果和蔬菜中继续代谢的酶为目标。例如，柠檬或其他柑桔汁的柠檬酸和抗坏血酸可抑制导致切开的苹果和马铃薯表面发生褐变的酚酶作用。
酸败
酸败作用是脂肪、油和其他脂质通过水解或氧化或这两种作用发生分解。水解导致脂肪酸链从甘油酯的甘油主链上分裂开。然后，这些游离的脂肪酸经历进一步的自氧化。氧化主要是不饱和脂肪通过自由基介导的过程进行。这些化学过程可以在酸败食品和油中产生高度反应性分子，负责产生令人不快和有害的气味和口味。这些化学过程也可破坏食品营养价值。在一些条件下，酸败以及维生素的破坏发生得非常快。
当脂肪物质接触空气，其不饱和组分转化为氢过氧化物，分解形成挥发性醛、酯、醇、酮和烃，其中一些具有令人不快的气味。黄油通过上述过程并通过水解发生酸败，释放挥发性恶臭的酸，尤其是丁酸。饱和脂肪如牛脂耐受氧化，在常温下很少发生酸败。
加速脂肪氧化的因素包括痕量金属(铁、锌等)、盐、光、水、细菌和霉菌。使用诸如鼠尾草(sage)和迷迭香等香料，将脂肪和油储存在极少接触氧或自由基的冰凉暗室中可延缓脂肪氧化，因为热和光可加速脂肪与氧的反应速率。
含脂肪的食品中常常加入抗氧化剂来延缓氧化导致的酸败的发展。天然抗氧化剂包括：类黄酮、多酚、抗坏血酸(维生素C)和生育酚(维生素E)。合成抗氧化剂包括：BHA、BHT、3，4，5-三羟基苯甲酸丙酯(也称为没食子酸丙酯)和乙氧喹。天然抗氧化剂储存期较短，所以在需要较长的储存期时使用合成抗氧化剂。水溶性抗氧化剂在防止脂肪内发生直接氧化方面的有效性有限，但在阻断通过食品含水部分运动的自由基方面有价值。
天然抗氧化剂
一些现代的合成防腐剂存在争议，因为已证明它们可导致呼吸或其他健康问题。一些研究针对在那些存在健康问题的患者中加剧ADD和ADHD症状的合成防腐剂和人造着色剂。一些主要的研究表明，当学校食品规划中去除人造成分(包括防腐剂)时，大多数非ADD学生人群中学科表现提高而纪律问题下降。食品或药品中的变应性防腐剂可导致敏感个体发生过敏性休克，如果不进行急救，常常在几分钟内即可导致死亡。
因此，现在倾向于使用天然抗氧化剂。植物包含植物化学物质，其中许多已知具有抗氧化性质。多酚是许多植物中天然产生的一类植物化学物质的通称，包括类黄酮、花色苷和酚酸。大多数多酚有色，在植物果实或植物其他部分中负责产生颜色。其生物活性主要是作为抗氧化剂，帮助保护植物免于微生物导致的组织损伤和侵入。
关于植物酚类化合物的文献很多，与不同植物类别有关的各种多酚已得到充分表征和研究。许多这种多酚消化产生的生理学作用也已得到临床验证，发现它们不仅具有抗氧化剂活性而且具有抗炎和血管舒张性质。
日常消耗的食品如咖啡、茶、可可(巧克力)、红酒、浆果(蓝莓、黑莓、草莓)和水果(山竹、Noni、石榴、Acai、葡萄)显示具有高抗氧化剂水平和健康促进特性。
通常，植物和植物产品比动物食品具有高得多的抗氧化剂含量。某些含香料、浆果、果实、坚果、巧克力的产品、植物和谷物是饮食抗氧化剂的优良来源。而且，咖啡、绿茶和红茶、红酒及各种浆果和水果果汁饮品也是抗氧化剂的优良来源。
现在，许多上述来源的抗氧化剂糖浆和粉末以食品成分和添加剂形式提供，用于许多食品体系。高多酚抗氧化剂糖浆和粉末(例如，来自澳大利亚南部塔瑞克技术公司(Tarac Technologies，South Australia)和美国加利福尼亚州多酚公司(Polyphenolics from California，USA)的源自葡萄的Vinlife)能够形成诸如巧克力(澳大利亚墨尔本的可可农场(Cocoa Farm，MelbourneAustralia)、可可饮料、茶和冰淇淋(澳大利亚的温迪维莱冰淇淋公司(Wendy’s Vinlife Ice Cream，Australia)等产品。然而，这些食品成分通常用于提高食品的抗氧化剂含量以提供有益的健康效果而不是作为食品防腐剂。
已知甘蔗含有多酚和其他具有有益性质的植物化学物质。涉及这些性质的出版物的例子包括国际专利申请WO 2005/117608、PCT/AU2006/000769和PCT/AU2007/001382。然而，这些文献并未公开低色度(colour)甘蔗提取物作为食品防腐剂。
根据Payet等，“具有抗氧化剂活性的甘蔗制造产品中酚类组分浓度的比较”(Comparison of the Concentrations of Phenolic Constituents in CaneSugar Manufacturing Products with their Antioxidant Activities)，J Agric FoodChem，2006，54，7270-7276所述测定许多甘蔗制造产品的抗氧化剂活性。文献报道抗氧化剂活性可能是因为麦拉德反应产物的作用和着色剂大量增加的结果。具有高色度的防腐剂作为食品添加剂的应用受到限制。并未公开使用低色度甘蔗提取物作为食品防腐剂。
日本专利公开2001-112439揭示，包含蛋白黑素的红糖提取物具有抗氧化作用，可用于降低体脂和改善皮肤状况。然而，蛋白黑素是在高温和低水活度条件下当糖和氨基酸组合时形成(通过麦拉德反应)的褐色、高分子量的异源性聚合物。因此，该提取物具有高色度，限制其作为食品添加剂的应用。该提取物还具有强烈的气味，进一步限制了其作为食品添加剂的应用。并未公开使用低色度的甘蔗提取物作为食品防腐剂。
日本专利公开2002-161046揭示，可从甘蔗提取具有抗氧化特性的多酚。并未公开使用低色度甘蔗提取物作为食品防腐剂。
日本专利公开2001-200250揭示，具有抗氧化性质的甘蔗提取物可用作食品添加剂。然而，并未公开使用低色度甘蔗提取物作为食品防腐剂。
同时，目前使用天然抗氧化剂如迷迭香、茶提取物、生育酚和抗坏血酸盐进行食品防腐。这些天然抗氧化剂较昂贵。由于生育酚的疏水性质，还存在实践的问题。由于抗坏血酸增加食品酸味也存在实践问题。
抗菌剂
杀死或抑制微生物的试剂可分为消毒剂、抗菌防腐剂或抗生素。抗生素是由一种能够杀死(杀菌)或抑制(抑菌)其他微生物的微生物产生的分子。抗菌防腐剂和消毒剂是市售化学品，它们的区别在于，抗菌防腐剂可以至少短时间地接触粘膜表面，而消毒剂不应接触粘膜表面，因为消毒剂可能有害。
科学事务的ADA委员会(The ADA’s Council on Scientific Affairs)强调了其他ADA接受的产品的口腔健康益处，例如有助于防止和减少菌斑和龈炎的抗微生物漱口水和牙膏，以及相对于单独使用含氟牙膏能提供针对蛀齿的额外保护作用的含氟漱口水。
通常，美国食品药品管理局(FDA)将漱口水分为：美容、治疗、或两者的组合。美容用漱口水是市售非处方(OTC)产品，有助于在刷牙前或者刷牙后去除口腔碎屑，暂时抑制口臭、减少口腔细菌和使口气清新而具有令人愉快的味道。治疗性漱口水不仅具有其美容相应产品的效果，而且包含添加的活性成分，有助于针对一些口腔疾病提供保护。治疗性漱口水由FDA规定，得到美国牙科协会(ADA)自愿批准。
在最低程度上，大多数漱口水是有效的口腔抗菌剂，能够清新口腔和抑制口臭最长达3小时。然而，它们在预防蛀齿、牙龈炎(牙龈组织炎症)和牙周病方面的疗效有限。然而，临床证明治疗性预防蛀齿的含氟漱口水能够对抗最多达50％及以上的导致蛀齿的细菌。大多数预防蛀齿的漱口水包含氟化钠，长时间过量摄取氟化钠可能导致氟中毒。
大多数非处方漱口水包含5种标准组分：
●对抗细菌的活性成分，例如季铵化合物、硼酸和苯甲酸、酚类化合物；
●调味剂如糖精或甘油；
●收敛剂如氯化锌以提供令人愉快的味觉和收缩组织；
●乙醇，18-26％；和
●水。
漱口水还可包含缓冲剂以降低酸度，溶解粘膜和缓解软组织疼痛。预防蛀齿的漱口水通常包含0.05％的氟化钠、或0.1％的氟化亚锡，得到FDA的批准。
抗菌斑漱口水中的活性成分各种各样。某些漱口水包含氯己定(所测试的最有效的菌斑对抗药物，仅处方提供)、重金属盐或草药提取物如源自血根植物的血根(sanguinaria)。
抗菌性漱口水和牙膏能降低牙菌斑中可能导致龈炎的细菌计数并抑制细菌活性，龈炎是一种早期可逆形式的牙周(牙龈)疾病。ADA-接受的抗菌性漱口水和牙膏通过显示在菌斑和牙龈炎中的显著减轻作用而证实了这些要求。抗菌性漱口水中活性物质的浓度常常大大超过提供快速细菌致死作用所确定的最低抑制浓度，使其可用于感染性病症中。
然而，许多人因为关心毒性和对牙齿的损伤而在市售漱口产品的使用方面较为谨慎。天然替代品包括盐水清洗剂和碳酸氢钠溶液清洗剂。
因此，需要一种天然防腐剂和抗菌剂的替代性来源。
发明概述
糖蜜和其他甘蔗加工产物是复杂的植物化学物质的混合物，通常包含多酚、多糖、肽和蛋白质、矿物质、有机酸、单糖和二糖。本发明提供了具有优良的防腐和抗菌剂特性的低色度的甘蔗提取物。具体说，意外地发现，低色度甘蔗提取物具有高抗氧化剂活性，使其适用于抑制脂肪和油或其氧化产物的分解并可用作抗菌剂。
根据本发明的第一方面，提供了一种防腐剂，其包含具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物。
根据本发明的第二方面，提供了一种食品、化妆品或药品的防腐方法，该方法包括在食品、化妆品或药品中加入有效防腐量的具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物的步骤。
本发明该方面使用的低色度提取物具有抗氧化和抗菌特性。过去，使用不同的防腐剂来获得这两种作用。
本文所用术语“低色度”用于指源自甘蔗的提取物时表示750nm测量时的吸收值小于或等于约0.010。
本文所用术语“高抗氧化性”指源自甘蔗的提取物时表示根据实施例4所述进行测试，抗氧化剂水平至少约为50微克/毫升儿茶素当量。优选地，源自甘蔗的提取物的抗氧化剂水平为0.99-6克/升儿茶素当量；更优选4-5克/升儿茶素当量。
根据本发明的第三方面，提供了具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物作为抗氧化剂在食品、化妆品或药品中的应用。
本发明的该方面采用富含抗氧化剂的成本有效的提取物，可用于替代目前食品工业中采用的昂贵的合成抗氧化剂。
根据本发明的第四方面，提供了具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物作为抗微生物剂在食品、化妆品或药品中的应用。
本发明的该方面采用富含多酚的提取物，可用于满足全球食品工业对天然抗微生物剂日益增长的需求。此外，本发明的提取物相对于目前使用的抗微生物剂很可能具有价格优势。
术语“有效防腐量”表示能使脂肪和油的酸败最小或显著降低(抗氧化性质)和/或使微生物生长最小或显著降低(抗微生物性质)的量。具体用量取决于具体的组合物和所需的储存期。通常，用量占全部组合物重量0.0001-5％，更常见0.01-2.5％。
本发明防腐剂可通过以下技术无需进一步的改进即可直接掺入食品、化妆品或药品(肠内或胃肠外产品)中，这些技术包括混合、输注、注射、掺混、分散、精炼(conching)、乳化、浸渍、喷射、团聚和捏合。
根据本发明的第五方面，提供了一种改善口腔卫生和/或抑制、治疗和/或预防龋齿形成的方法，该方法包括将具有高抗氧化剂活性的治疗有效量的低色度甘蔗提取物加入口腔卫生产品的步骤。
本文所用术语“治疗有效量”表示能使微生物生长最小或显著抑制和/或杀死口腔中的微生物的量。通常，用量占全部组合物重量的0.0001-5％，更常见0.01-2.5％。
本文所用术语“口腔卫生产品”包括但不限于牙齿清洁产品，例如牙膏、漱口水和口香糖。
根据本发明的第六方面，提供了治疗有效量的具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物在口腔卫生产品中的应用，以改善口腔卫生和/或抑制、治疗和/或预防龋齿形成。
本发明所用提取物可源自任何甘蔗加工产物，包括甘蔗研磨工艺、甘蔗制糖的精制工艺以及使用甘蔗产物的其他工艺，例如由糖蜜制造乙醇作为甜酒生产的一部分。提取物可源自原料、工艺期间的产物、副产物、最终产物和废物料。例如，甘蔗提取物可源自甘蔗原汁进料、澄清甘蔗汁和浓缩甘蔗汁糖浆、废蜜、糖蜜(由主要的糖厂或精炼厂获得)、金色糖浆、红糖、甘蔗渣、生物酵母泡沫(biodunder)、田间废弃物、生长头、果肉、甘蔗汽提物、髓、再生提取物(中和或非中和的)和研磨滤泥(mill mud)。优选地，提取物源自糖蜜。
本发明中使用的提取物的物理特性取决于其总的化学组成。根据所应用的加工方法，提取物可以通过蒸发浓缩产生糖浆，或者可选地提取物可以完全干燥得到粉末。制备具有不同物理性质的提取物的能力提高了提取物的商业用途。根据其物理特性和化学组成，提取物适用于各种应用。例如，食品工业的要求可能与美容工业的要求存在显著不同。
本文所用术语“食品”包括任何可食用的产品，例如但不限于糖果，补充剂，小吃(甜食和开胃菜)，含可可和咖啡的食品，调味料，饮料(包括速食饮料、预混物)，营养物质，动物健康和营养中使用的饮食补充剂和包含补充剂和制剂，乳制品，例如牛奶、酸奶酪、冰淇淋、烘焙产物和食品调味品，以及动物饲料。
本发明防腐剂可掺入食品中，所述食品包括但不限于：
●乳制品—例如乳酪、黄油、牛奶和其他乳酸饮料、涂抹料(spreads)和乳酪混合物、冰淇淋和酸乳酪；
●基于脂肪的产品—例如人造奶油、涂抹料、蛋黄酱、起酥油、烹饪和煎炸油以及装饰料；
●基于谷物的产品—包括谷物(例如，面包和面制食品(pastas))，不论这些物质是烹饪、烘焙或是以其他方式加工；
●糖果—例如巧克力、蜜饯、口香糖、甜点、非乳酪面饰、果汁冻(sorbets)、冰霜和其他填料；
●运动营养产品，包括粉末、预混物、汁液、能量棒、等张饮料和明胶、淀粉基或果胶凝胶冻。
●饮品—不论是热饮还是冷饮(咖啡、茶、可可、谷类、菊苣和其他基于植物提取物的饮品)、酒精或非酒精饮品，包括可乐和其他软饮料、果汁饮料、饮食补充剂、速食预混物和膳食替代饮品；和
●混合产品—包括蛋和蛋产品、加工食品如汤、预先制备的面食制品。
●
本发明使用的提取物的制备方法
本发明使用的提取物源自甘蔗产物，优选甘蔗精制工艺得到的糖蜜。提取物可通过各种方法或者方法的组合从甘蔗产物获得，这些方法包括：
采用非水或水性溶剂进行溶剂和反溶剂提取；
通过尺寸排阻方法，例如凝胶渗透色谱或超滤方法分离在特定分子量范围内的组分；和
采用色谱技术或技术的组合，例如离子交换色谱、疏水色谱和通过逐步提高pH或用诸如乙醇等溶剂利用分级洗脱的离子交换色谱，分离低分子量组分和高分子量组分。
提取物可通过标准技术进一步加工，例如微孔过滤、反渗透、真空蒸发和冷冻干燥、喷雾干燥和隧道干燥(tunnel drying)。
提取物制备方法的例子在国际专利申请WO 2005/117608和PCT/AU2007/001382中描述。
附图简要说明
图1示出糖蜜在Bio-Gel P-2上凝胶过滤，显示实施例1中3次运行的A420和抗氧化剂活性。
图2示出糖蜜在Bio-Gel P-2上凝胶过滤，显示实施例1中3次运行的A420和总的酚类化合物。
图3示出糖蜜在Bio-Gel P-2上凝胶过滤，显示实施例1中3次运行的A420和蔗糖。
图4示出糖蜜在Bio-Gel P-2上凝胶过滤，显示实施例1中3次运行的A420和葡萄糖+果糖。
图5是在Bio-Gel P-2上获得的糖蜜分馏物的照片(实施例1的收集池1-5)。
图6示出糖蜜在Bio-Gel P-2上凝胶过滤，显示实施例1采用pH5.0的甲酸盐/乙腈缓冲液和pH7.5的Tris HCl缓冲液的A420分布曲线。
图7示出实施例4的96-孔板图样。
图8示出实施例4中A750的原始吸光度数值。
图9示出实施例4中校正的吸光度数值。
图10显示实施例4中糖蜜原料稀释品和馏分3-23的96孔板图样。
图11显示图10所示图样在750nm的吸光度数值。
图12示出实施例4的色谱图。
图13示出实施例4的儿茶素标准曲线。
图14示出实施例4中馏分3-26的各馏分按儿茶素当量表示的总的多酚，误差为±2SD。
图15示出实施例4中各馏分3-26按儿茶素当量表示的总的多酚，误差为±2SD。
图16示出由实施例4收集的有色馏分。
实施例
现在将参考以下非限制性实施例阐述本发明的各种实施方式/方面。
缩写列表
BDL            低于检测限
CE             儿茶素当量
DW             干重
GAE            没食子酸当量
GI             血糖指数
IC或ICUMSA     通用糖分析方法的国际委员会
MF             微孔过滤
N/D            未检测
N/T            未测试
实施例1
本实施例研究采用凝胶渗透来制备可用于本发明的提取物。
方法
在Bio-Gel P-2柱上进行制备型凝胶渗透来分馏分子量在100-1800道尔顿(Da)范围的稀释的糖蜜(50％w/v)。收集六次色谱运行得到的5个分子量馏分并冻干。分析各馏分的抗氧化剂活性、总的酚类化合物、HPLC分布曲线和糖。
用凝胶过滤缓冲液(含10％乙腈的20mM甲酸铵，pH 5.0)将糖蜜稀释至50％(w/v)，并于10℃在6000g离心约1小时。上清液通过1.6μm GF/A滤膜(Whatman)过滤并在-80℃以30毫升等分试样冻存用于凝胶过滤色谱。
凝胶过滤
以60毫升/小时流速，在玻璃柱(26毫米x1000毫米)中填装Bio-Gel P-2(BioRad，USA)至床高度为910毫米。室温下在含10％乙腈的20mM甲酸铵缓冲液(pH 5.0)中以30毫升/小时的速率使床层平衡。将稀释的糖蜜(20毫升，50％w/v)加载到柱上，收集5毫升的馏分。对总共120毫升的稀释糖蜜进行六次凝胶过滤。对前三次过滤得到的馏分进行颜色(A420)、总酚类化合物和抗氧化剂活性分析。对后三次过滤则省去抗氧化剂活性分析。每次过滤称量约20个管子，并用1克/毫升的密度确定平均馏分的体积，从而由重量分析法确定各馏分体积。
凝胶过滤柱用以下三种标准品进行校准：蔗糖(360kDa)、NADH(663kDa)和维生素B12(1355kDa)。按照KDa＝Ve-Vo/Vt-Vo，计算每种标准品的分配系数(KDa)。用牛血清白蛋白确定空体积。Bio-Gel P-2的分馏范围是100-1800Da(BioRad)。
冻干的本体馏分：对于每次凝胶过滤分析，根据颜色(A420)、总的酚类化合物和抗氧化剂收集各馏分为5个主要馏分。每次过滤收集的馏分如表1所示。
表1：每次过滤收集的馏分列表
  运行编号   馏分体积(ml)   收集池1   收集池2   收集池3   收集池4   收集池5
  1   4.88   34-50   51-66   67-82   83-100   101-120
  2   4.74   35-54   55-72   73-83   84-104   105-120
  3   4.95   35-52   53-68   69-79   80-100   101-120
  4   4.69   35-53   54-71   72-81   82-100   101-120
  5   4.52   37-56   57-76   77-87   88-103   104-120
  6   4.71   35-51   52-71   72-81   82-99   100-120
  总体积(ml)   447   435   270   452   470
六次凝胶过滤之后，合并每个收集池内(收集池1-5)的六个样品。从每个最终收集池取10毫升样品，其余冻干。
颜色(A420)：用超纯水(Arium Model 611，Sartorius)稀释凝胶过滤馏分，并在Heliosλ(Unicam)分光光度计上在420nm读取吸光度。
总酚类化合物：根据Folin-Ciocalteu比色法(Kim等，2003)测定总的酚类化合物。在75毫米的试管中向50微升稀释的样品中加入650微升去离子水。将未稀释的Folin-Ciocalteu试剂(50微升)加入各试管。混合溶液并在室温下静置5分钟。最后加入500微升7％Na2CO3与反应液混合，90分钟后室温下读取750nm处的吸光度。酚类化合物总含量以每毫升未稀释样品中儿茶素当量微克数表示。制备0-250微克/毫升范围的儿茶素标准品。
抗氧化剂活性：首先，制备包含等体积的14mM ABTS(2，2’-连氮基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)和4.9mM过硫酸钾的底物，并在室温下暗室中储存过夜。分析之前，用超纯水将该溶液稀释约60倍并调节至734nm处的吸光度为0.99-1.01。在75毫米试管中ABTS底物(1毫升)于水浴中26℃预孵育5分钟，加入50微升样品或标准品。混合溶液并在26℃保持45分钟，测定734nm的吸光度。抗氧化剂活性以每毫升未稀释样品中没食子酸当量的微克数表示。制备0-25微克/毫升范围的没食子酸标准品。
RP-HPLC分布曲线：在配备有系统控制器(型号SCL-10AVP)、二元泵(型号LC10-AD)、光电二极管阵列(PDA)检测器(型号SPD-M10AVP)以及用于数据采集和分析的经典Vp 6.14版软件的Shimadzu系统获取糖蜜提取物的定性指纹图谱。样品(10微升)在30x4.6毫米的Luna 3微米C18(2)柱(Phenomenex)上于30℃洗脱。流速为1.5毫升/分钟。流动性为：A相，含0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的水溶液，B相，60％乙腈在0.085％TFA中。梯度曲线为5-35％B保持12分钟；35-100％B保持1分钟，100％B保持3分钟，100-5％B保持0.3分钟，5％B重新平衡4.7分钟。从200到400nm以4nm的波长步阶以及在214、254、280、340和400nm的单独通道测定吸光度图谱，由PDA检测器检测洗脱峰，常规报道214nm色谱图。由5个冻干收集池制备凝胶过滤样品，包含等浓度总的酚类化合物(每毫升1毫克儿茶素当量)。用于凝胶过滤的糖蜜样品包含2毫克CE/毫升。
糖分析：采用配备系统控制器(型号SCL-10AVP)、泵(型号LC-10ADVP)、折射率检测器(型号RID-10A)和经典Vp 6.12软件的Shimadzu系统，通过反相HPLC分析单糖和二糖。将样品(10微升)注入5-微升LC-NH2 Supelcosil柱(250毫米×4.6毫米，Phenomenex)，40℃下运行。流动相是85％乙腈，流速为1毫升/分钟。样品等度洗脱20分钟，每个样品进行两次。采用包含相同重量浓度的各糖的四种标准溶液，制备0.3-1.2毫克/毫升范围的葡萄糖、果糖和蔗糖的标准曲线。各标准溶液一式三份注入。
SDS-PAGE：采用微型Protean II平板凝胶系统(BioRad)，在12％丙稀酰胺凝胶上，进行SDS-PAGE电泳。凝胶过滤得到的冻干样品溶解在水中(200毫克/毫升)，取30微升在等体积的加载缓冲液中消化。将15微升(含1.5毫克固体)加载到凝胶上。当溴苯酚蓝染料前缘到达凝胶底部时停止电泳。在0.25％考马斯蓝中对凝胶染色，在台式扫描仪(Scanjet 5400C，惠普(Hewlett Packard))上扫描。
结果
Bio-Gel P-2的校准：
在Bio-Gel P-2柱上制备用于确定分子量的校准曲线。
凝胶过滤分布曲线
图1和2显示了糖蜜(3次运行)的颜色(A420)、抗氧化剂和总的酚类化合物的凝胶过滤分布曲线。A420颜色分布曲线显示，在柱空体积附近的峰和馏分62(MW 832Da)的尖峰。然后吸光度逐渐降至基线。抗氧化剂和总的酚类化合物的分布曲线相互间非常接近。前两个抗氧化剂/酚类化合物的峰与A420峰共洗脱。然而，馏分80(MW 352)处的抗氧化剂/酚类化合物宽峰并不对应于颜色峰。该峰包含分子量135-599Da范围的馏分69-100，可能是低色度类黄酮和多酚酸的混合物。
图3和4分别显示了蔗糖和单糖(葡萄糖+果糖)的分布曲线。柱能够部分分辨蔗糖和单糖。在抗氧化剂峰的前缘(馏分80前)洗脱蔗糖，尾缘(馏分80后)洗脱单糖。因此，低色度抗氧化剂峰包含所有糖蜜单糖。
对于需要低色度抗氧化剂产品的膜过滤应用，要求低于600Da的分子量作为目标。可以通过离子排斥色谱由糖分离抗氧化剂。
本体凝胶过滤收集池
将六次凝胶过滤分析的每次5个收集池融化，合并后冻干。图5显示冻干之前合并的收集池(收集池1-5)的颜色。收集池1和2颜色非常深；收集池1稍混浊而收集池2半透明。收集池3-5颜色变浅，从淡褐色到淡黄色。
表2显示了冻干之前合并的收集池的组成以及各个收集池的平均分子量范围。通过质量计算，低色度抗氧化剂/酚类化合物的峰(图1和2)分别包含49％的抗氧化剂活性和50％的酚类化合物。空体积(收集池1)洗脱的深色峰包含14％抗氧化剂活性，深色尖峰(收集池2)包含28％。柱抗氧化剂活性的回收率为70％。
表2冻干之前在Bio-Gel P-2上凝胶过滤得到合并的收集池的组成
  组分   收集池1   收集池2   收集池3   收集池4   收集池5
  体积(ml)   437   425   260   442   460
  总固体(g/100ml)   0.56   1.36   7.3   3.24   0.15
  总的酚类化合物(μg CE/ml)   324   555   761   550   141
  抗氧化剂活性(μg GAE/ml)   92   183   229   173   49
  果糖(mg/ml)   BDL   BDL   4.0   5.1   BDL
  葡萄糖(mg/ml)   BDL   BDL   5.1   4.2   BDL
  蔗糖(mg/ml)   BDL   0.70   50   12   BDL
  总固体(g)   2.45   5.78   18.98   14.32   0.69
  总的酚类化合物(mg CE)   142   236   198   243   65
  抗氧化剂(mg GAE)   40   78   60   76   23
  平均分子量范围   ＞1800-1444   1377-636   604-373   356-156   150-65
加载糖蜜的组成：总固体＝35.6g/100ml；A420＝43.7；
总酚类化合物＝10340μg/ml；抗氧化剂活性＝3390μg/ml。
6次过滤操作的糖蜜总体积＝120ml。
表3显示了冻干之后合并的收集池的组成。相对于物理性质，收集池1是显著不同于收集池2的松散产品，收集池2具有硬质易碎质地。收集池3和4易碎(crunchy)且吸湿，分别包含71％和64％的糖。收集池5颜色深且粘性，难以从干燥托盘中取出而导致大量产品损失。以固体为基准计(mgGAE/g固体)，收集池2和收集池5在冻干后发生显著的抗氧化剂活性损失，分别为26％和34％。
表3：冻干后在Bio-Gel P-2上凝胶过滤的合并的收集池的组成
  组分   收集池1   收集池2   收集池3   收集池4   收集池5
  干燥产品重量(g)   2.62   5.23   18.17   13.74   0.5
  总的酚类化合物(g/100g)   5.60   4.1   0.99   1.70   5.42
  抗氧化剂活性(g/100g)   1.6   0.99   0.29   0.55   2.1
  果糖(g/100g)   BDL   BDL   5.0   16   BDL
  葡萄糖(g/100g)   BDL   BDL   7.1   14   BDL
  蔗糖(g/100g)   BDL   6.7   59   34   BDL
  总的酚类化合物(mg CE)   147   214   180   234   27
  抗氧化剂(mg GAE)   42   52   53   76   11
  质地   松散   易碎   易碎   易碎   粘性
  颜色   黑色   黑色   浅褐色   浅褐色   黑色
加载糖蜜的组成：总固体＝35.6g/100ml；A420＝43.7；
总的酚类化合物＝10340μg/ml；抗氧化剂活性＝3390μg/ml。
6次运行的糖蜜总体积＝120ml。
RP-HPLC分布曲线：检测冻干的凝胶过滤收集池的反相HPLC分布曲线(分布曲线b-f)。可用于表征收集池的所有分布曲线之间存在显著差异。收集池1显示逐渐升高的曲线，只有一个小峰。推测该样品包含不均匀的聚合物材料，该材料不能通过HPLC柱解析成各峰。收集池2代表分子量范围636-1377Da，包含深褐色材料的尖峰。该收集池显示能在不到1分钟即洗脱的亲水性最强材料以及许多在梯度上分辨率良好的峰。收集池3和4代表低色度抗氧化剂峰，其各自的分布曲线之间存在显著差异。收集池5显示的一系列峰可代表低分子量酚酸以及弱结合于柱、根据其分子量未被洗脱的较高分子量的化合物。该收集池中亲水性材料的比例较低，导致在分布曲线的疏水区域存在较大的峰高。糖蜜加载样品使得一些峰能够匹配收集池中的某些分子量范围，以及显示收集池5中那些弱结合于凝胶和被洗脱的糖蜜峰。所有样品在14.5分钟显示与色谱无关的显著峰，代表分析结束时用乙腈冲洗以去除柱上所有结合的材料。有趣的是，代表糖蜜中疏水性较高的化合物的峰随着收集池分子量而降低。
SDS-PAGE：使用冻干收集池的变性电泳来检测提取物中的蛋白质材料。提取物中没有明显超过14kDa的蛋白质条带。在收集池1(道2)中，在接近染料前缘观察到较浅的染色，但不确定其是否是染色的蛋白质或是不均匀染料前缘的残留考马斯蓝。低分子量多肽(＜10kDa)的检测可能要求16％凝胶的Tris-Tricine缓冲液。
结论
凝胶过滤分布曲线表明，在420nm处测定的深色糖蜜在柱的空体积中(＞1800Da)和832Da处洗脱。抗氧化剂活性和总的酚类化合物与这两个颜色峰共洗脱。在135和599kDa之间洗脱抗氧化剂/酚类化合物宽峰，但不存在颜色峰。该抗氧化剂峰包含所有蔗糖和单糖。其包含49％洗脱的抗氧化剂活性和50％总的酚类化合物。因此，去除深色糖蜜可能将产物的抗氧化剂活性降低约一半。在空体积附近洗脱的深色聚合物材料包含14％洗脱的抗氧化剂活性。
冻干的凝胶过滤收集池的量从0.5g到18g，两个含糖的收集池获得高质量。三个冻干的收集池中抗氧化剂活性回收率大于92％，但收集池2和5中抗氧化剂活性存在显著损失。
冻干收集池的HPLC指纹图谱显示一些可用于表征这些样品的独特差异。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质分析显示，在所有冻干样品中缺乏超过14kDa的蛋白质材料。收集池1显示在染料前缘附近的痕量蛋白质染色。这可能是与可水解鞣质缔合的结合的蛋白质。
然后分析冻干样品中的多糖和多酚特征，分析其抑制肠酶的能力。
该实施例显示，糖蜜凝胶过滤所得颜色分布曲线依赖于缓冲液的pH和/或组成并且可制备本发明色度较低的高抗氧化剂提取物。在pH 7.5，大多数深色在空体积洗脱，而在pH 5.0，在较低分子量观察到第二深色峰。pH 5.0缓冲液包含10％乙腈，可能有助于凝胶渗透性质的改变。
这种较低色度的高抗氧化剂提取物可用作食品添加剂以降低GI、降低致癌性、改变机体组成，可用作抗氧化剂或抗微生物剂而不干扰食品颜色或感官特性。并且，本发明较低色度的提取物可用于药品应用，尤其是颜色和苦味是重要问题的情况下。
实施例2
本实施例进一步研究实施例1中收集池1-4的多酚组合物。本实施例还证实了酵母泡沫(dunder)提取物中的多酚含量。
方法
溶剂萃取：将各样品的等分试样(约200毫克)溶解在酸化(pH 1.6)的水中(10毫升)。然后用乙酸乙酯萃取混合物(3×15毫升)，真空蒸发溶剂(40℃)，混合物在甲醇水溶液中重建(1∶1，2毫升)然后进行HPLC分析。
HPLC分析：采用Shimadzu系统(澳大利亚新南威尔士雷达米尔的新马度有限公司(Shimadzu Inc.，Rydalmere，NSW，Australia))进行HPLC，该系统配备两个LC-10ADVP高压泵、SIL-10ADVP自动进样器(250微升进样环路)、CTO-1-ADVP柱加热器和SPD-M10ADVP光二极管阵列检测器。用于分离多酚的柱是Luna C18(直径4.6mm×长度250mm，粒度5μm，澳大利亚新南威尔士雷恩可弗的飞诺麦克斯公司(Phenomenex，Lane Cove，NSW，Australia))。用于分离的流动相是2％乙酸的水溶液(A)和0.5％乙酸的乙腈∶水(1∶1)的溶液(B)，流速1毫升/分钟。用线性梯度洗脱分析物：59分钟内10-100％B，再在100％B保持5分钟。在280、320和370nm进行检测。与可靠的标准品(澳大利亚新南威尔士卡斯特-希尔的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Castle-Hill，NSW，Australia))比较洗脱时间来鉴定分析物。
结果和讨论
基于以下三个特定波长之一(280nm、320nm和370nm)的最大UV吸收定量分析各化合物。分别由丁香酸、p-香豆酸和槲皮素的校正曲线得到基于这些波长的定量数据。HPLC-DAD鉴定的样品中八种化合物的水平如下所示(表4)。
表4：HPLC-DAD检测5种糖蜜样品中存在的多酚化合物的浓度
所有样品包含不同水平的丁香酸，大多数样品中主要的化合物。发现大多数样品中存在表儿茶素。
表5：HPLC-DAD检测4种样品在每个波长处酚类化合物的浓度
Figure GPA00001084283600192
由表5可知，所有样品中在280nm处显示最大吸收的组分浓度较高，然后是主要在320nm处存在吸收的组分，再是370nm。这表明样品主要包含酚酸。
结论
通过HPLC-DAD分析检测样品中的八种酚类化合物。这些样品的高酚含量表明，它们适合用作食品或药品的防腐剂。
实施例3
本实施例比较了糖蜜提取物与绿茶提取物(目前用作食品抗氧化剂)的抗氧化能力。
材料和方法
样品制备：研磨样品并将约50毫克样品溶解在5毫升甲醇中。样品涡流、超声30分钟，离心5分钟(1900RCF)。收集上清液，进行干燥。样品以10毫克/毫升的浓度重新溶解在甲醇中。绿茶提取物和糖蜜提取物是水溶性的。
氧自由基吸收容量(ORAC)试验：本研究中采用的ORAC试验测定37℃测试样品对抗2，2′-氮杂二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)诱导的过氧化自由基的抗氧化清除活性。使用荧光素作为荧光探针。测定各样品的亲水ORAC值。
根据初步筛选所得大致抗氧化剂容量，从样品相关浓度开始，一式四份，用AWA(丙酮∶水∶乙酸；70∶29.5∶0.5)制备系列稀释品，采用ORAC方法分析提取物/样品。包括绿茶提取物作为阳性对照，该提取物根据样品制备方法制备。
包括甲醇绿茶提取物作为阳性对照，也溶解在磷酸盐缓冲液中(pH7.4)。
妥罗(Trolox)，一种水溶性维生素E类似物，用作参比标准品。在100、50、25和12.5μM的AWA溶液中制备妥罗标准品的标准曲线。
简言之，将20μL样品/标准品/对照/空白(AWA)、10μL荧光素(6.0×10-7M)和170μL AAPH(20mM)加入各孔中。加载后立即将板转移到预先设定为37℃的平板读数仪，以1分钟的时间间隔测定荧光35次。荧光读数参比溶剂空白孔。用妥罗浓度和荧光素衰减曲线下净面积之间的回归方程计算最终的ORAC值，以每克样品的微摩尔妥罗当量(TE)表示。
结果和讨论
各产物的产率在表4中示出。
表4：各样品提取物的产率
样品编号 样品质量(mg) 提取物质量(mg) 产率(％)
  糖蜜提取物   49.8   34.3   69
  绿茶   48.5   16.3   34
抗氧化剂容量：通过制备甲醇提取物获得的样品的抗氧化剂容量在表5中示出。糖蜜提取物显示最大的抗氧化剂容量，产生提取物时的ORAC值为4395微摩尔TE/克样品，或者在缓冲液中直接溶解时样品的ORAC值为5020微摩尔TE/克样品(表6)。这两个值都显著高于对应的绿茶提取物。
表5：与绿茶甲醇提取物相比，用甲醇萃取的糖蜜提取物样品的抗氧化剂容量
样品   ORAC值微摩尔TE/克样品
  糖蜜提取物   4395±229
  绿茶   1793±93.5
数值是均值±均值的标准误。
表6：与绿茶甲醇提取物相比，直接溶解在磷酸盐缓冲液中(pH 7.4)的糖蜜提取物的抗氧化剂容量
样品   ORAC值微摩尔TE/克样品
  糖蜜提取物   5020±375
  绿茶   1467±90
数值是均值±均值的标准误。
本实施例清楚说明，源自糖蜜的提取物是强效抗氧化剂，相对于目前市售的天然食品抗氧化剂如绿茶具有更高的ORAC活性。这表明，本发明产生的提取物可用作食品和药品中的抗氧化剂和抗微生物剂。
实施例4
本实施例研究各糖蜜馏分中的多酚化合物相对于色度的分布以制备低色度的食品抗氧化剂。
方法：
试剂：
Folin-Ciocalteu反应试剂(未稀释)
7％碳酸钠(无水)
儿茶素标准品(1mg/ml)
制备以下用于96孔板的标准品和样品。
将14微升稀释样品或标准品加入分析管中。
加入182微升超纯水并混合。
加入14微升Folin-Ciocalteu反应试剂。
混合并静置5分钟。
加入140微升7％的碳酸钠。
混合并室温静置90分钟。
λ750nm读数。目的是读取加入碳酸钠后90±5分钟的试管。
酚类分析的标准曲线：1mg/ml儿茶素的冷冻标准品。制备以下标准稀释品：
表7：儿茶素标准曲线样品稀释
  儿茶素(μL，1mg/ml)   水(μl) 儿茶素浓度(μg/ml)
  0   1000 0
  50   950 50
  儿茶素(μL，1mg/ml)   水(μl) 儿茶素浓度(μg/ml)
  100   900 100
  150   850 150
  200   800 200
  250   750 250
样品：选择用于试验的样品是以下凝胶渗滤所得馏分3-26。
糖蜜以1∶4的比例用0.1M氯化钠溶液稀释。
注入0.35毫升样品，以0.35毫升/分钟的速率通过P2凝胶，收集3毫升馏分。
馏分在4℃储存36小时后进行分析。
馏分升高至室温，涡流混合后取样。
在包括儿茶素标准品的96孔板上测试样品。
用微板读数仪中存在的混合机制实现各个混合步骤。
采用750nm滤光片的单一读数模式中的终点函数，用BioRad Model680XR微板读数仪读取板。
结果和讨论
比较两份“原始数据”报告以确认由于第二次读取前的额外时间，样品是否存在显著改变。吸光度读数非常接近，所以认为结果是准确的。
结果在图7-16和表8-12中示出。
图7-9中96-孔板图样和吸光度读数。在图7中，空白(Blk)、儿茶素标准品(CS…)和馏分样品(F)都是一式三份，空孔标以“Emp”。图9显示了校正的吸光度数值，即从标准品和样品中减去空白。
所得儿茶素标准曲线线性程度非常高，R2值为0.999(参见表8和图13)。
表8：儿茶素标准曲线的数据
浓度(μg/ml)   吸光度        吸光度         吸光度1             2              3   平均吸光度 SD ％CV
  050100150200250   -0.003        0.004          -0.0010.149         0.161          0.1390.321         0.322          0.2980.451         0.469          0.4650.630         0.631          0.6670.829         0.808          0.801   0.00000.14970.31370.46170.64270.8127   0.00360.01100.01360.00950.02110.0146   #DIV/0！15％9％4％7％4％
表9：分馏样品的原始数据，右栏列示出其儿茶素当量。(见图8)
  馏分   吸光度  吸光度  吸光度1       2       3   吸光度均值 SD 2SD ％CV   儿茶素当量
  34567891011121314151617181920212223242526   -0.005  0.006   -0.0020.117   0.143   0.1650.242   0.252   0.2570.148   0.144   0.1550.151   0.161   0.1610.195   0.192   0.1600.181   0.180   0.1980.188   0.183   0.1800.249   0.270   0.2740.211   0.226   0.2190.113   0.117   0.1190.057   0.088   0.0960.062   0.064   0.0590.043   0.034   0.0470.048   0.049   0.0480.041   0.080   0.0430.037   0.034   0.0330.022   0.043   0.0360.026   0.032   0.0240.023   0.027   0.0300.015   0.015   0.0140.010   0.013   0.0140.004   0.006   0.0010.001   0.003   0.017   -0.00030.14170.25030.14900.15770.18230.18630.18370.26430.21870.11630.09200.06170.04130.04830.04200.03470.03370.02730.02670.01470.01230.00370.0070   0.00570.02400.00760.00560.00580.01940.01010.00400.01340.00750.00310.00570.00250.00670.00060.00140.00210.01070.00420.00350.00060.00210.00250.0087   0.01140.04810.01530.01110.01150.03880.02020.00810.02690.01500.00610.01130.00500.01330.00120.00280.00420.02140.00830.00700.00120.00420.00500.0174   -3412％34％6％7％7％21％11％4％10％7％5％12％8％32％2％7％12％64％30％26％8％34％137％249％   2.838445.868778.798048.090950.717258.191959.404058.596083.040469.202038.191930.818221.626315.464617.585915.666713.444413.141411.222211.02027.38386.67684.05055.0606
将各馏分具有±2SD误差的儿茶素当量绘图要求将各一式三份的吸光度变换为儿茶素当量，这些数字的SD用于代表误差。
为此重新计算表9中的数值，剔除F14 rep1和F18 rep2，因为它们超出所示误差。
表10：馏分样品的数据，以儿茶素当量表示(板1)。
  馏分   CE1     CE2      CE3   CE均值   SD   2SD   ％CV
  34567891011121314151617181920212223242526   1.424   4.758    2.33338.394  46.273   52.93976.273  79.303   80.81847.788  46.576   49.90948.697  51.727   51.72762.030  61.121   51.42457.788  57.485   62.93959.909  58.394   57.48578.394  84.758   85.97066.879  71.424   69.30337.182  38.394   39.00020.212  29.606   32.03021.727  22.333   20.81815.970  13.242   17.18217.485  17.788   17.48515.364  27.182   15.97014.152  13.242   12.9399.606   15.970   13.84810.818  12.636   10.2129.909   11.121   12.0307.485   7.485    7.1825.970   6.879    7.1824.152   4.758    3.2423.242   3.848    8.091   2.838445.868778.798048.090950.717258.191959.404058.596083.040469.202038.191930.818221.626315.464617.585915.666713.444413.141411.222211.02027.38386.67684.05055.0606   1.72317.28112.31441.68721.74955.87863.06551.22474.06932.27440.92581.71420.76262.01770.17500.42850.63083.24021.26161.06420.17500.63080.76262.6418   3.446214.56234.62893.37443.499111.75726.13092.44948.13874.54881.85153.42841.52524.03540.34990.85711.26166.48042.52322.12840.34991.26161.52525.2835   121％32％6％7％7％20％10％4％10％7％5％11％7％26％2％5％9％49％22％19％5％19％38％104％
各板再重复两次以确保是一次公正的结果。
表11：按儿茶素当量表示的各馏分样品的数据(板2)
  馏分   CE1      CE2      CE3   CE均值   SD   2SD   ％CV
  34567891011121314151617181920212223242526   -0.118   2.235    0.17636.647   44.000   44.29476.941   79.000   75.76544.882   50.765   50.76543.706   47.235   50.76551.059   52.529   55.76555.765   59.000   57.52953.412   57.235   61.35376.059   68.706   74.29464.882   40.471   67.52935.765   35.176   36.64726.059   29.882   28.41220.765   21.059   21.94114.000   15.471   15.47115.471   17.529   19.00014.588   14.588   15.76511.353   10.471   10.4717.529    11.941   13.41211.059   10.176   11.0598.118    7.529    9.2946.353    6.647    6.9414.588    4.294    4.5883.412    2.824    2.5291.353    1.353    5.765   0.764741.647177.235348.803947.235353.117657.431457.333373.019666.205935.862728.117621.254914.980417.333314.980410.764710.960810.76478.31376.64714.49022.92162.8235   1.28204.33261.63763.39623.52942.40751.61993.97153.83861.87180.74021.92870.61230.84901.77290.67920.50943.06130.50940.89850.29410.16980.44932.5471   2.56418.66523.27526.79247.05884.81493.23977.94307.67723.74351.48043.85731.22451.69813.54571.35851.01896.12251.01891.79710.58820.33960.89855.0943   335％21％4％14％15％9％6％14％11％6％4％14％6％11％20％9％9％56％9％22％9％8％31％180％
表12：按儿茶素当量表示的各馏分样品的数据(板3)
  馏分   CE1      CE2      CE3   CE均值   SD   2SD   ％CV
  34567891011121314151617181920212223242526   -3.800   4.200    -0.37136.771   44.486   42.77173.343   65.057   75.05746.200   50.771   48.20049.343   51.057   49.34352.486   55.629   54.48654.486   57.057   51.34358.200   54.200   65.34381.057   78.200   78.48663.057   62.200   65.05735.914   36.486   37.05725.057   27.914   27.34319.629   20.200   20.48613.914   13.629   14.20015.914   16.771   15.34315.629   15.057   14.20011.343   11.057   12.7718.200    11.343   11.34310.486   8.771    10.7718.486    9.914    9.6295.914    5.629    6.4863.629    3.914    3.9142.200    2.771    1.9140.771    3.343    4.771   1.914341.342971.152448.390549.914354.200054.295259.247679.247663.438136.485726.771420.104813.914316.009514.961911.723810.295210.00959.34296.00953.81902.29522.9619   3.23254.05075.34782.29170.98971.59082.86195.64481.57361.46620.57141.51190.43640.28570.71900.71900.91841.81451.08170.75590.43640.16500.43642.0270   6.46508.101410.69554.58331.97953.18165.723811.28963.14722.93231.14293.02370.87290.57141.43811.43811.83693.62912.16341.51190.87290.32990.87294.0541   338％20％15％9％4％6％11％19％4％5％3％11％4％4％9％10％16％35％22％16％15％9％38％137％
各样品一式三份进行测试，各板具有其自身的儿茶素标准参比曲线。图9描绘了各板中各馏分的多酚结果，证实分析准确性。
相对于各馏分的±2SD误差，不存在明显偏离结果。这就表明，该分析相对准确，即使一式三份各馏分的吸光度读数并不完全精确，如％CV数值所示。
在0.35毫升样品上，用微板读数仪在750nm分析各馏分的吸光度。图10显示糖蜜原料稀释品和馏分3-23的96孔板图样。(在图10中：ND-没有稀释，D1∶2-1∶2稀释，F-馏分编号，Emp-空孔。)图11显示图10所示图样在750nm的吸光度数值。
图12显示上述分析的色谱结果。橙色、紫色、绿色和蓝色痕迹分别显示λ405、350、280和214nm。顶部坐标轴示出收集的馏分。
图12中的图例
Figure GPA00001084283600281
在该波长(750nm)，馏分8向前的吸光度数值低于0.010，认为具有“低色度”。
由图15可见，相对于儿茶素当量，馏分12具有相当高的多酚含量，该馏分也与图12中λ280痕迹上的肩峰一致。图12中馏分12的λ405nm痕迹非常低，表明低色度。各馏分的色度差异可参见图16。
结论
认为具有“高抗氧化剂”的馏分在这些试验条件下包含的多酚含量为50微克/毫升儿茶素当量或者更高。
认为“低色度”的馏分在这些试验条件下的吸光度读数为0.010或更低。
750nm波长用于多酚反应。在415nm可更好地分析各馏分实际色度的吸光度，因为该颜色在该波长吸收更多能量，使其对馏分间的差异更加敏感。然而，750nm检测提供了色度测量的有用指标。
该实验表明，可从糖蜜分离许多低色度的高抗氧化剂馏分。图16示出相对于对照(糖蜜)，一些低色度馏分。所有低色度样品均没有明显的气味。由于低色度高抗氧化剂馏分的色度低，可用于许多应用而不干扰最终食品的感官性质。
实施例5
基于以下成分制备牙膏，根据本发明该牙膏可用于治疗或预防龋齿或口腔卫生的方法中。
提供为浅褐色水溶性可自由流动的粉末的低色度高抗氧化剂糖蜜提取物。将A的组分合并到一起，然后加入所有B的组分，70℃混合直至均匀。然后加入C，混合直至均匀。最后，混合的同时缓慢加入D，直至均匀。用柠檬酸适量调节至pH 5.9-6.3。
实施例6
适用于儿童的包含0.3％一氟磷酸钠的上述实施例5的牙膏。
实施例7
包含牙齿增白化合物的上述实施例5的牙膏。
实施例8
该组合物提供漱口水。
  组分   ％w/w
  磷酸钙低色度高抗氧化剂糖蜜提取物泊洛沙姆调味剂水/乙醇   2.00.51.0适量定量至100％
实施例9
该组合物提供口香糖。
  组分   ％w/w
  WO 2005/117608中引用的甘蔗或低GI糖低色度高抗氧化剂糖蜜提取物树胶基质小麦葡萄糖糖浆食物酸(296)湿润剂(422)调味剂乳化剂(322，来自大豆)着色剂(100，133)抗氧化剂(BHT)   2.01.5适量0.51.02.0适量0.50.00020.1
实施例10
该组合物提供软明胶糖果。
  组分   ％w/w
  小麦葡萄糖糖浆WO 2005/117608中引用的甘蔗或低GI糖小麦或玉米淀粉明胶柠檬酸浓缩果汁天然调味剂天然着色剂低色度高抗氧化剂糖蜜提取物   36％32％23％6％0.95％适量适量适量2.0％
实施例11
该组合物提供经调味的水基饮料。
  组分   重量(g)
  糖   8.50
  低色度高抗氧化剂糖蜜提取物   2.00
  柠檬酸50％w/w   2.00
  调味剂   0.30
  苯甲酸钠   0.10
  水   至1000ml
制备：
搅拌的同时将苯甲酸钠溶解到50毫升水中
加入柠檬酸溶液和低色度高抗氧化剂糖蜜提取物
搅拌直至低色度高抗氧化剂糖蜜提取物溶解
加入糖并搅拌直至溶解，然后加入调味剂并搅拌直至掺合
加水配至1升
实施例12
该组合物提供果泥小吃。
  组分   ％w/w
  苹果泥   79.00
  组分   ％w/w
  覆盆子泥   12.00
  浓缩苹果汁   7.6
  低色度高抗氧化剂糖蜜提取物   1.2
  覆盆子调味剂   0.2
  总计   100
制备：
将各果泥和浓缩果汁混合到一起
加入糖蜜提取物和调味剂充分混合直至掺合
实施例13
该组合物提供了具有加入的糖蜜抗氧化剂的油。
  组分   ％w/w
  葵花子油   98.8
  低色度高抗氧化剂糖蜜提取物   1.2
  总计   100
实施例14
该组合物提供谷物棒。
  组分   ％w/w
  脱脂奶粉   2.00
  低色度高抗氧化剂糖蜜提取物   0.50
  稻米脆皮(Rice crisps)   20.00
  小麦脆皮   10.00
  苹果，干燥并切片   6.00
  组分   ％w/w
  无子葡萄(Sultanas)   3.00
  杏仁，烘烤并切片   4.00
葡萄糖糖浆DE38，43°Be   11.00
转化糖糖浆(74-76％)   5.25
山梨糖醇糖浆   20.0
棕榈仁脂肪   2.00
卵磷脂   0.15
糖   12.00
水   4.00
盐   0.10
总计   100
制备：
将低色度高抗氧化剂糖蜜提取物与脱脂奶粉混合并置于Hobart混合机中
加入稻米和小麦脆皮，与粉末成分轻柔混合。然后加入水果成分并混合
混合葡萄糖糖浆、转化糖浆和山梨糖醇糖浆并加热至113℃。然后在冷水浴中冷却以终止蒸煮过程。
在75℃的水浴中熔化棕榈仁脂肪和卵磷脂
将脂肪混合物加入糖浆组合中
混合糖、水和盐并加热至110℃
将脂肪加入糖溶液中
将液体物质加入干成分，在Kenwood型混合机中混合均匀
将物料置于大理石板上，轧至所需厚度。使物料在室温下冷却
切割成同一筛分大小的片并包装
实施例15
为测定糖蜜提取物多酚粉末对食品腐败和口腔卫生微生物的抗微生物活性。
方法
糖蜜提取物多酚粉末：来自糖蜜的多酚粉末(5g)由地平线科技控股有限公司(Horizon Science Pty Ltd)按国际专利申请WO 2005/117608所述提供。
菌株和生长条件：：本试验所用试验菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株6571(NCTC-国家标准菌库(NationalCollection of Type Cultures)，英国伦敦针对感染的健康防护管理中心(Health Protection Agency Centre for Infection，London，UK))，变形链球菌(Streptococcus mutans)ACM 969和普通变形杆菌(Proteus vulgaris)ACM4730，由澳大利亚昆士兰大学的微生物保藏中心(ACM)提供(AustralianCollection of Microorganisms(ACM)，University of Queensland)。试验菌在胰蛋白大豆酵母提取物肉汤(TSYEB)(Oxoid CM 129B，Basingstoke，UK)，30g/L；酵母提取物(Oxoid CM19)，6g/L上培养24小时。在540nm测定光密度(吸光度)并用TSYEB调节至吸光度0.5，定量接种。
菌株的制备与稀释：连续稀释(1∶1)试验菌在TSYEB肉汤中的过夜培养物22次，制备接种物。11-22次稀释用于96孔微量滴定板。进行稀释之后，将最低稀释物接种到所有试验菌的板计数琼脂上(Oxoid CM0463)以验证细菌计数。
由糖蜜制备多酚粉末：将来自糖蜜的多酚粉末(0.1克)溶解在10毫升TSYEB中。该溶液在TSYEB中稀释，从浓度1％(w/v)开始，稀释至0.0005％(w/v)。
抗生素溶液的制备：本研究中使用抗生素青霉素G和盐酸土霉素(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich(St.Louis，MO))。将各0.01克的青霉素G和盐酸土霉素分别溶解在20毫升TSYEB中。
青霉素G和盐酸土霉素的抗生素溶液在TSYEB(1∶1)稀释，从浓度0.05％(w/v)开始，稀释至2.44x10-5％(w/v)。
微板分析方法：本研究使用带盖的平底96孔无菌微量滴定板以防止交叉污染(德国奴姆布莱特的斯卡特德公司(Sarstedt，
Figure GPA00001084283600331
Germany))。各96孔微量滴定板中的一排孔只包含培养基(无菌阴性对照)。从第一排孔起的三排孔包含1∶1稀释的试验菌(最左侧孔中相当于105cfu/ml的细菌对照，最右侧孔中102cfu/ml)以及来自糖蜜的多酚溶液从最高到最低浓度(1％到0.0005％w/v)。一式三份测定多酚溶液与细菌细胞的各组合。接下来三排孔包含相同数量的细菌稀释品，但多酚溶液从最低到最高浓度(0.0005％到1％w/v)。一式三份测定多酚溶液与细菌细胞的各组合。其余一排孔包含相同数量的细菌稀释品和生长培养基以及多酚溶液，称为阳性对照。在用于试验菌的另一块板中进行不含多酚溶液的阳性对照的复孔(n＝6)。每个300微升孔包含50微升接种物、150微升多酚溶液。每个阴性或无菌对照孔包含200微升TSYEB肉汤。各阳性对照孔包含50微升接种物、150微升TSYEB肉汤。
青霉素G和盐酸土霉素用作参比标准品，用于测定试验菌的敏感性，并将多酚溶液的抗微生物活性与抗生素的抗微生物活性进行比较。
在分光光度计SBT(Sunrise-Basic Tecan)(奥地利)中540nm测定光密度(OD)。测定培育之前的OD，代表零时间(To)的分光光度计读数。将板置于培养箱中37℃培养22小时。变形链球菌在37℃培养22小时和44小时。板中溶液用多通道移液器混合以防止在22小时(T22)后分光光度计中读取OD之前发生团聚。
结果分析：抑制百分比的计算是基于Casey等，2004；Patton等，2006的研究。抑制百分比＝1-(OD测试孔/相应阳性对照孔的OD)x100
MIC0是不导致生长抑制的多酚溶液或抗生素的最高浓度；
MIC50是导致50％生长抑制的多酚溶液或抗生素的浓度；和
MIC100是导致100％生长抑制的多酚溶液或抗生素的最低浓度。
结果
表13：来自糖蜜的多酚粉末中抗菌活性的分析结果
Figure GPA00001084283600342
表14.青霉素G中抗菌活性的分析结果
Figure GPA00001084283600351
表15.土霉素中抗菌活性的分析结果
Figure GPA00001084283600352
讨论
初步筛选多酚溶液对抗金黄色葡萄球菌的抗菌活性。通过筛选，检测可使用的多酚溶液的最高浓度。多酚粉末浓度大于1％(w/v)时的光密度读数大于1，超出分光光度计分析所推荐的范围。多酚溶液能够抑制金黄色葡萄球菌，MIC0＜0.001％，MIC50为0.28％和MIC100＞1％(w/v)，参见表13。
普通变形杆菌是食物腐败微生物，多酚溶液能够抑制普通变形杆菌，MIC0＜0.02％，MIC50为1％和MIC100＞1％(w/v)，参见表13。22小时内变形链球菌不生长，生长周期延长至44小时。变形链球菌完全抑制浓度为1％，MIC50为0.5％和MIC0为0.06％(w/v)，参见表13。
用作参比标准品的抗生素显示完全抑制的浓度低得多，然而不同的试验菌要求不同浓度。最低浓度的土霉素(2.44x10-5％w/v)即可完全抑制金黄色葡萄球菌和变形链球菌，参见表15。这两种革兰氏阳性菌也能够被糖蜜提取物多酚粉末所抑制。
结论
糖蜜提取物多酚粉末能够抑制食物腐败菌普通变形杆菌。
变形链球菌和金黄色葡萄球菌都是病原体，其生长能够被糖蜜提取物多酚粉末所抑制。
糖蜜提取物多酚粉末抑制作用所要求的1％浓度相对于其他植物提取物来说非常低，在防止微生物生长方面具有优良效果。本研究中试验的批次并非最近制备的，新鲜批次的糖蜜提取物多酚粉末的效果更佳，因为如储存不当多酚易发生快速氧化。
虽然实施例采用高色度糖蜜提取物，但预期本发明方法中使用的低色度高抗氧化剂提取物中也存在相关多酚。由这些结果可以推断，源自甘蔗的低色度高抗氧化剂提取物可用于抑制龋齿形成和改善口腔卫生。
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本说明书和权利要求书中使用的术语“包含”和“包括”并不限制本发明而排斥任何任何变体或添加。
本领域技术人员可以容易理解本发明的修饰和改进。这些修饰和改进也包括在本发明的范围内。

Claims (16)

1.一种包含具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物的防腐剂。
2.如权利要求1所述的防腐剂，其特征在于，所述具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物在750nm测量时的吸光度值小于或等于0.010，抗氧化剂水平至少约为50微克/毫升儿茶素当量。
3.一种食品、化妆品或药品的防腐方法，该方法包括在食品、化妆品或药品中加入有效防腐量的具有高抗氧化活性的低色度蔗糖提取物的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有效防腐量为组合物总重量的0.0001-5.0％。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有效防腐量为组合物总重量的0.01-2.5％。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物在750nm测量时的吸光度值小于或等于0.010。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物的抗氧化剂水平至少约为50微克/毫升儿茶素当量。
8.一种改善口腔卫生和/或抑制、治疗和/或预防龋齿形成的方法，该方法包括将具有高抗氧化活性的治疗有效量的低色度蔗糖提取物加入口腔卫生产品的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述治疗有效量为组合物总重量的0.0001-5.0％。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述治疗有效量为组合物总重量的0.01-2.5％。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物在750nm测量时的吸光度值小于或等于0.010。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物的抗氧化剂水平至少约为50微克/毫升儿茶素当量。
13.一种包含具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物的口腔卫生产品。
14.如权利要求13所述的口腔卫生产品，其特征在于，所述具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物在750nm测量时的吸光度值小于或等于0.010，抗氧化剂水平至少约为50微克/毫升儿茶素当量。
15.具有高抗氧化剂活性的低色度甘蔗提取物在食品、化妆品或药品中作为抗氧化剂和/或抗微生物剂的应用。
16.治疗有效量的具有高抗氧化活性的低色度蔗糖提取物在口腔卫生产品中的应用，以改善口腔卫生和/或抑制、治疗和/或预防龋齿的形成。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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