CN101785818A - 一种治伤胶囊有效成分的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，具体公开了一种治伤胶囊有效成分的含量测定方法，包含以下步骤：取关附庚素对照品溶液与治伤胶囊供试品溶液20μl，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，含乙腈0.2％、三乙胺0.2％的辛烷磺酸钠溶液为流动相，检测波长为205nm，理论板数按关附庚素峰计算应不低于5000进行HPLC测定。本发明还提供关附庚素在制备抗炎药物中的应用。本发明采用高效液相色谱法测定有效成分关附庚素的含量，明确治伤胶囊每克含关附庚素不少于0.6mg，本发明所述方法样品处理过程简单，检测限低，精密度高，回收率高，稳定性好，具有良好的工业应用前景。

Description

一种治伤胶囊有效成分的含量测定方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种治伤胶囊有效成分的含量测定方法。

背景技术

跌打损伤是骨科常见病，在跌打损伤的过程中，炎性介质及细胞因子在炎症反应和组织修复中发挥着重要的作用。跌打损伤主要表现为局部组织的变性、炎性渗出及增生，在这个过程中有大量的细胞因子或炎性介质参加，如CCL5、IL-1β、TNF-α、IL-3等。CCL5在炎症反应中起最早的作用，它吸引白细胞的趋化移动并活化这些细胞，I L-3在体内由T淋巴细胞产生，IL-3的拮抗剂可能有助于对炎症性疾病的治疗，其临床应用仍在进行中。TNF-α普遍被认为是判断炎性关节炎病理进程的重要细胞因子，通常由单核细胞、巨噬细胞分泌。TNF-α在前炎性细胞因子的级联反应中起到重要作用，它能调节其他前炎性细胞因子的分泌。IL-1β被称为内源性致热原，除引起发烧外，亦在炎症反应中发挥重要作用，是炎症反应中较早出现的炎症介质。

对于跌打损伤临床常用药物为非甾体类药物如阿司匹林、吲哚美辛等，临床研究表明长期服用此类传统非甾体类抗炎药产生多种不良反应。中医药对跌打损伤治疗积累了丰富的经验，治伤胶囊系古方“治伤散”改剂型而成，具有祛风散结、消肿止痛的功效，用于跌打损伤所致之外伤红肿，内伤胁痛等，取以祛风止痛、化痰通络药物，以关白附、天南星、白芷、防风、羌活组方而成，其中关白附为君药，具有祛风化痰、燥湿止痛的功效；天南星燥湿化痰、解痉止痛、散结消肿；白芷祛风除湿、通窍止痛、消脓排肿，与天南星同为臣药；防风解表祛风、胜湿止痛、解痉；羌活散表寒、祛风湿、利关节，此两味同为佐使药。诸药合用，共奏祛风散结，消肿止痛之效。

现有技术中治伤胶囊的含量检测方法：

(1)外观：取治伤胶囊内容物，置显微镜下观察示油管含金黄色分泌物，直径约30μm。草酸钙针晶单个散在，或成束存在于椭圆形的粘液细胞中，针晶长27～63μm。

(2)羌活鉴定：取治伤胶囊5粒，倾出内容物，加70％乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取羌活对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液。照中国药典1990年版一部附录57页薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-甲酸-水(10∶2∶2∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)关白附总生物碱含量测定：取治伤胶囊装量差异项下的内容物，精密称定，取约6g，置具塞锥形瓶中，精密加入1％盐酸溶液50ml，超声处理30分钟，水温保持50℃以下，置离心管中以3000转/分的速度离心分离10分钟，精密量取上清液25ml，置分液漏斗中，用浓氨试液调节pH值至10～11。用氯仿提取5次，每次10ml，合并提取液，置水浴上蒸干。残渣加对甲基红指示剂显中性的乙醇5ml使溶解，蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，精密加0.01mol/L盐酸滴定液10ml，摇匀，加新沸过的冷水15ml与甲基红指示液2滴，用0.01mol/L氢氧化钠滴定液滴至黄色，即得。0.01mol/L盐酸滴定液每1ml相当于4.295mg的C₂₄H₃₁NO₆。本品每粒含总生物碱以关附甲素(C₂₄H₃₁NO₆)计，应为1.20～2.00mg。

现行质量标准单独采用酸碱滴定法测定总生物碱含量来控制治伤胶囊有效成分的含量，酸碱滴定法滴定终点判定较主观，误差较大，从而影响含量测定的重复性及精确度。

此外，目前对中药作用机制的研究较少，特别是药效物质的基础研究更加薄弱，不利于保证中药制剂质量稳定，限制了其临床应用的可靠性。因此，急需寻找中药特别是组方中君药的有效成分并测定其含量来保证药效。

发明内容

本发明针对现有技术中采用酸碱滴定法测定关白附总生物碱含量控制治伤胶囊中有效成分含量存在终点判定较主观，误差大，影响含量测定的重复性及精确度的缺陷，提供一种更全面、更精确的治伤胶囊有效成分含量测定方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案：

一种治伤胶囊有效成分的含量测定方法，包含以下步骤：

精密称取关附庚素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液作为对照品溶液；称取治伤胶囊内容物约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1％盐酸溶液50ml，密塞，称定重量，浸泡20min，超声处理30分钟，冷却后再称重，用1％盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即为供试品溶液；

分别取对照品溶液与供试品溶液20μl，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈、0.2％三乙胺0.2％pH为3辛烷磺酸钠溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为205nm，理论板数按关附庚素峰计算应不低于5000进行HPLC测定。

本发明所述含量测定方法测定结果为治伤胶囊每克含关附庚素不少于0.6mg。

本申请发明人在对治伤胶囊抗软组织损伤有效成分的筛选研究中发现，关白附所含总生物碱及其有效成分关附庚素具有良好的抗炎、镇痛作用，作用机制涉及影响损伤部位Rantes，IL-1β，TNF-α，IL-3等因子的生成。据此，明确治伤胶囊中的有效成分主要为关白附总生物碱和关附庚素，因此检测关白附总生物碱和关附庚素含量可保证治伤胶囊药效稳定。

用本发明所述方法测定关附庚素所需的制剂用量小，样品处理过程简单，检测限低，定量限为0.127μg，检测限为0.0432μg，精密度高，回收率高，回收率平均值＝95.82％，RSD＝2.50，稳定性好。

作为优选，本发明所述含量测定方法还包含以下步骤：

称取治伤胶囊内容物约6g，精密称定，精密加入1％盐酸溶液50ml，超声处理30分钟，水温保持50℃以下，置离心管中以3000转/分的速度离心分离10分钟，精密量取上清液25ml，用浓氨试液调节pH值至10～11；用氯仿提取5次，每次10ml，合并提取液，水浴蒸干，残渣加对甲基红指示剂显中性的乙醇5ml使溶解，蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，精密加0.01mol/L盐酸滴定液10ml，摇匀，加冷开水15ml与甲基红指示液2滴，用0.01mol/L氢氧化钠滴定液滴至黄色。每1ml盐酸滴定液(0.01mol/L)相当于4.295mg的C₂₄H₃₁NO₆。测定治伤胶囊每粒含总生物碱以关附甲素(C₂₄H₃₁NO₆)计，应为1.20～2.00mg。

本发明优选的技术方案在原有滴定法测关白附总生物碱的基础上增加了高效液相液相色谱法测定关附庚素的含量，更明确的控制制剂中有效成分的含量，更有利于保证药效。

本发明还提供关附庚素在制备抗炎药物中的应用。关附庚素为关附甲素的单乙酰化物，植化研究表明关白附所含生物碱关附庚素含量高于关附甲素，比关附甲素更稳定，同时药效结果显示关附庚素具有很好的抗炎镇痛作用，对多种炎症因子Rantes，IL-1β，TNF-α，IL-3具有较强的拮抗作用，因此开发关附庚素制备抗炎药物具备良好的应用前景。

具体实施方式：

本发明公开了一种治伤胶囊有效成分的含量测定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步详细阐述本发明：

实施例1：关附庚素的制备

取关白附粗粉5kg，40kg95％乙醇浸泡3次，每次5天，滤液50℃减压浓缩得总浸膏约450g，将浸膏分散于1.5L水中，1％盐酸调pH至3-4，用500ml氯仿萃取3-5次，萃取液浓缩得组分约100g。该组分以100g的250-350目硅胶拌样，上硅胶柱层析(Ф10cmX50cm，H型薄层层析硅胶)，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺＝12∶1∶0.05、10∶1∶0.05、8∶1∶0.05、6∶1∶0.05、4∶1∶0.05梯度洗脱，收集关附庚素富集流分。依此反复硅胶柱层析至最终得关附庚素单体约2.5g。

结构确证：1H-NMR、13C-NMR、质谱。

HPLC试验：Agilent 1200、色谱柱：；流动相：55％乙睛-水；检测波长：205nm；流速：1ml/min；柱温：不控制。

实施例2：本发明所述治伤胶囊的制备

处方药材五味，按照关白附176g，制天南星29g，白芷15g，防风15g，羌活15g的比例，除生关白附外，其余防风等四味粉碎成细粉，将生关白附粉碎成细粉与上述细粉用等量递增法配研，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，辐照灭菌，即得。

实施例3：治伤胶囊中不同成分对软组织损伤小鼠模型的影响

本实验采用足趾夹挤法制作的小鼠软组织损伤模型，观察治伤胶囊、治伤胶囊中总生物碱、关附庚素、治伤胶囊非生物碱成分对软组织损伤小鼠的足组织IL-1β、TNF-α和Rantes的影响，以此作为筛选治伤胶囊治疗软组织损伤作用有效成分的评价指标，为开展质量研究提供依据。

受试药物样品制备：

取治伤胶囊内容物适量，加入1％盐酸溶液，超声处理30分钟，离心，取上清液，置分液漏斗中，加浓氨试液，用三氯甲烷提取2次，合并提取液，置水浴上蒸干，称重，以1％CMC-Na制成混悬液，得生物碱样品。

上述方法中离心后取沉淀与三氯甲烷提取后的残液合并，置水浴上蒸干，称重，以1％CMC-Na制成混悬液，即得非生物碱样品(即治伤胶囊总生物碱以外成分)。

实施例1制得关附庚素称重，以1％CMC-Na制成混悬液，得关附庚素样品。

分组给药：将动物随机分为7组，即空白对照组，软组织损伤组，阳性药(氢化可的松)对照组、治伤胶囊组、总生物碱组，非生物碱组、关附庚素组。将不同药物样品用1％CMC-Na(羧甲基纤维素钠)制成不同浓度同等容量的溶液，灌胃容量为0.1ml/10g体重，各组给药容量相同。于夹挤后给药1次，第二日早晚各一次，第三日给药一次。空白对照组，软组织损伤组按同样方法灌服等量1％CMC-Na。

小鼠软组织损伤采用止血钳夹挤法制作的软组织损伤的模型。小鼠实验前禁食不禁水12h，采用JZ01Cr止血钳夹住小鼠后右腿接近足趾部，夹至中间第二档位，持续30S，然后松开，正常喂养。模型成功的标志是外皮未破裂，腿骨未断，能明显看到伤肢肿胀、疼痛(舔足，行走提足)。各组动物给药结束后，迅速脱颈椎处死，取小腿自足部，称重并剪碎，用冷的生理盐水匀浆，离心并取上清液，分装后-20℃冷冻保存备用。

观察指标：白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和Rantes的表达量。试剂盒购武汉博士德生物工程有限公司，批号EK0394、EK0527和EK0495。检测方法：上述指标测定均按其测定试剂盒说明书进行。治伤胶囊中不同成分对软组织损伤小鼠足趾重量的影响，结果如表1所示。对软组织损伤小鼠组织中炎症因子的影响，结果如表2所示。

表1治伤胶囊中不同成分对软组织损伤小鼠足趾重量的影响

组别	剂量(g/kg/d)	n	足趾重量(mg)
				空白对照组	-	10	167.32±11.07
软组织损伤组	-	10	215.67±17.08**
				氢化可的松组	0.03	10	199.76±15.41*
非生物碱组	2	10	208.27±13.22
				治伤胶囊组	2	10	204.68±19.77
生物碱组	0.2	10	197.51±18.96*
				关附庚素	0.05	10	198.28±16.74*

注：**P＜0.01vs空白，*P＜0.05vs模型

表2治伤胶囊中不同成分对软组织损伤小鼠组织中炎症因子的影响

组别	剂量	n	IL-1β(pg/ml)	TNFα(pg/ml)	Rantes(pg/ml)
						空白对照组	-	10	59.00±20.54	232.66±62.60	205.66±83.86

组别	剂量	n	IL-1β(pg/ml)	TNFα(pg/ml)	Rantes(pg/ml)
						软组织损伤组	-	10	166.98±47.31**	845.32±309.72**	562.47±281.54**
氢化可的松组	0.03	10	123.28±41.56**	555.08±119.69**	454.27±111.23
						非生物碱组	2	10	141.61±26.67	647.31±184.36*	421.67±120.13
治伤胶囊组	2	10	132.92±35.63*	554.77±151.19**	377.50±105.97
						生物碱组	0.2	10	118.50±37.99**	498.60±102.56**	332.43±89.94**
关附庚素	0.05	10	118.32±33.75**	474.46±161.08**	353.35±98.28*

注：**P＜0.01vs空白，*P＜0.05、**P＜0.01v s模型

结论：结果表明，治伤胶囊中有效成分主要是总生物碱、关附庚素，其中关附庚素的作用强于总生物碱。

实施例4：治伤胶囊中不同成分对急性软组织损伤大鼠模型的影响

本实验采用重物打击法制作的大鼠软组织损伤模型，观察治伤胶囊、治伤胶囊中总生物碱、关附庚素、即非生物碱部分对软组织损伤大鼠的肿胀程度、病理变化的影响，以此作为筛选治伤胶囊治疗软组织损伤作用有效成分的评价指标，为开展质量研究提供依据。

方法：

1、受试药物制备：同实施例3

2、分组与给药：将动物随机分为6组，即软组织损伤组，治伤胶囊组、阳性药对照组、生物碱组，非生物碱组、关附庚素组。将不同药物用1％CMC-Na制成不同浓度同等容量的溶液，灌胃容量为1ml/100g体重，各组给药容量相同。

3、动物模型：雄性SD大鼠60只，体重180-220g，实验前1天以10％硫化钠CMC溶液在右后肢外侧脱毛约2×2cm²面积，实验当天，用自制测量尺测定拟损伤部位后肢周长，然后固定大鼠，将1根内径1.5cm、高150cm的空心管置于大鼠右后肢脱毛部位软组织上，然后将1根50g重的钝头铁杵自上而下自由落体击中大鼠右后肢软组织，共3次，造成面积约3cm²大小有明显皮下出血及肿胀的非开放性软组织损伤。次日测定拟损伤部位后肢周长后随机分组，除氢化可的松皮下注射给药外，其他组灌胃给药，每天1次，连续6天，给药后2、4、6天各测量周长1次，计算肿胀度。

4、观察指标与检测方法：肿胀度：造模或给药后损伤部位周长与造模前周长之差值，单位：mm；

损伤程度分级：

“-”无明显肿大和瘀斑；

“+”无肿大，隐约可见瘀斑；

“++”肿胀厚度在左侧肢体同部位厚度1倍以下，可见瘀斑；

“+++”肿胀厚度在左侧同部位厚度1倍以上和/或有明显的紫瘀斑。

结果：治伤胶囊中不同成分对软组织损伤大鼠肿胀度的影响，见表3-表7。

表3治伤胶囊中不同成分对急性软组织损伤大鼠肿胀度的影响

注：*p＜0.05(与模型对照组比较)。

表4治伤胶囊用药前急性软组织损伤大鼠的损伤程度评级

表5治伤胶囊成分对急性软组织损伤大鼠损伤程度影响(用药2天)

表6治伤胶囊中成分对急性软组织损伤大鼠损伤程度影响(用药4天)

结论：从表3-表6结果可见，用药2天时治伤胶囊组、生物碱组、关附庚素组对急性软组织损伤大鼠具有一定的消肿作用，以关附庚素组R值最小，用药4天时各组损伤程度评级均明显低于模型对照组(p＜0.05)，提示治伤胶囊对急性软组织损伤大鼠具有消肿作用；此外，各组比较，均以关附庚素给药剂量最低，R值最小。

实施例5：治伤胶囊中总生物碱、关附庚素、关附甲素对小鼠软组织损伤炎症因子IL-3的影响

本实验采用足趾夹挤法制作的小鼠软组织损伤模型，观察治伤胶囊中总生物碱、关附庚素、关附甲素对软组织损伤小鼠组织中IL-3的影响，以进一步比较有效成分的活性强弱。

方法：

1、受试药物制备

关附甲素由中国药科大学提供，其余同实施例3。

2、分组与给药：将动物随机分为5组，即空白对照组，软组织损伤组，总生物碱组，关附庚素组，关附甲素组。给药方法同实施例2。

3、动物模型：同实施例2。

4、观察指标与检测方法：白介素-3试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，测定均按其测定试剂盒说明书进行，结果见表7。

表7治伤胶囊中总生物碱、关附庚素、关附甲素对小鼠软组织损伤炎症因子IL-3的影响

组别	剂量(g/kg/d)	n	IL-3(pg/ml)
				空白对照组	-	15	48.93±14.5¨
软组织损伤组	-	15	90.88±33.7
				总生物碱组	0.1	15	65.01±27.3*
关附甲素组	0.05	15	61.61±14.2**
				关附庚素组	0.05	15	59.69±11.4**

注：**P＜0.01vs模型，*P＜0.05vs模型

结论：治伤胶囊总生物碱，关附庚素，关附甲素均对IL-3有作用，关附庚素、关附甲素均是有效成分。

实施例6：治伤胶囊中关白附鉴定及关附庚素含量检测方法

对照品溶液制备：取实施例1制备的关附庚素样品加三氯甲烷制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液制备：取本品粉末约1g，精密称定，置20ml离心管中，加1％盐酸溶液1ml，三氯甲烷约15ml，超声处理20分钟，离心，取上清液，同法提取3次，合并3次提取液置50ml容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

照薄层色谱法(中国药典一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(0.8∶16∶1∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾溶液，晾干，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

含量测定按照高效液相色谱法(中国药典附录VI D测定)

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；含乙腈0.2％、三乙胺0.2％的辛烷磺酸钠溶液为流动相；检测波长为205nm。理论板数按关附庚素峰计应不低于2000。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪测定，即得。结果显示，本品含关附庚素不得少于0.01％。

实施例7：治伤胶囊有效成分的测定

药材鉴定：

(1)取本品内容物，置显微镜下观察：油管含金黄色分泌物，直径约30μm。草酸钙针晶单个散在，或成束存在于椭圆形的粘液细胞中，针晶长27～63μm。

(2)取本品5粒，倾出内容物，加70％乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取羌活对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典1990年版一部附录57页)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-甲酸-水(10∶2∶2∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取本品10粒，研细，加石油醚15ml，超声处理20分钟，过滤，取残渣，再加丙酮40ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。取防风对照药材1g，加石油醚5ml，超声处理20分钟，过滤，取残渣，再加丙酮10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加乙醚制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(5∶1.4)为展开剂，展开，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(控制湿度在20％--60％)

(4)取本品10粒，研细，加乙酸乙酯30ml，超声处理1小时，时时震摇，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取欧前胡素对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30-60℃)∶乙醚∶甲醇(3∶2∶1.4)为展开剂，在25℃以下展开，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点。

含量测定：

(1)取本品装量差异项下的内容物，精密称定，取约6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1％盐酸溶液50ml，超声处理30分钟(水温保持50℃以下)，置离心管中以3000转/分的速度离心分离10分钟，精密量取上清液25ml，置分液漏斗中，用浓氨试液调节pH值至10～11。用氯仿提取5次，每次10ml，合并提取液，置水浴上蒸干。残渣加中性乙醇(对甲基红指示剂显中性)5ml使溶解，蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，精密加盐酸滴定液(0.01mol/L)10ml，摇匀，加新沸过的冷水15ml与甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液(0.01mo l/L)滴至黄色，即得。每1ml盐酸滴定液(0.01mol/L)相当于4.295mg的C₂₄H₃₁NO₆。

本品每粒含总生物碱以关附甲素(C₂₄H₃₁NO₆)计，应为1.20～2.00mg。

(2)高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定制剂中关附庚素含量。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈0.2％三乙胺0.2％辛烷磺酸钠溶液为流动相；检测波长为205nm。理论板数按关附庚素峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备：精密称取关附庚素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品装量差异限下的内容物，精密称定，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1％盐酸溶液50ml，密塞，称定重量，浸泡20min，超声处理30分钟，放冷，再称重，用1％盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：分别取对照品溶液与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每克含关附庚素(C₁₅H₁₀O₅)不得少于0.6mg。实施例8：高效液相色谱法测定关附庚素含量的方法学考察

在原有滴定法测总生物碱的基础上增加了高效液相液相色谱法测定关附庚素的含量，更明确的控制制剂中有效成分的含量，保证药效。用本发明所述方法测定关附庚素所需的制剂用量小，样品处理过程简单，检测限低，精密度高，回收率高，重复性好，稳定性好。

1、日内精密度试验

分别精密吸取供试品溶液20μl，重复进样5次，按选定的色谱条件测定，结果如表8所示。

表8日内精密度试验结果

关附庚素峰面积值的RSD＜2％，结果表明，日内精密度良好。

2、回收率实验

取已知含量的样品(0.9231mg/g)约1g，精密称定，分别加入对照品溶液(0.570mg/ml)1ml，按上述样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入色谱仪，以下列公式计算回收率，结果见表9。

回收率(％)＝(测得量-样品中含量)/加入对照品量×100％

表9关附庚素加样回收实验结果

n	样品取量(g)	含关附庚素量(mg)	加入对照品量(mg)	测得量(mg)	回收率(％)
						1	1.0711	0.9887	0.57	1.5593	100.01
2	1.0543	0.9732	0.57	1.5058	93.44
						3	1.0562	0.9749	0.57	1.5254	96.57

n	样品取量(g)	含关附庚素量(mg)	加入对照品量(mg)	测得量(mg)	回收率(％)
						4	1.0534	0.9724	0.57	1.5134	94.91
5	1.0518	0.9709	0.57	1.5078	94.20
						6	1.0307	0.9514	0.57	1.4968	95.69

回收率平均值＝95.82％，RSD＝2.50，试验结果表明，加样回收良好。

3、重复性考察

取6份样品(约2g)，同含量测定方法，测定样品关附庚素含量，RSD＜3％，结果见表10。

表10关附庚素重复性考察结果

试验次数	样品含量mg/g	X
			1	0.9540
2	0.9423
			3	0.9116	0.9231
4	0.9143
			5	0.8967
6	0.9194
				RSD＝2.167

试验表明，重复性良好。

4、稳定性试验

样品溶液的稳定性试验，以新配制的样品溶液为标准，放置于室温，分别于0小时、4小时、8小时、12小时及24小时，分别进样20μl，测得样品中关附庚素峰面积值的RSD＜2％，结果见表11。

表11样品溶液稳定性考察结果

实验结果表明，关附庚素样品供试溶液在室温下24h内稳定性良好。

5、定量限试验

取关附庚素对照品0.0108mg/ml，稀释为0.00635mg/ml。注入液相色谱仪20μl，测的样品峰面积为35.54，信噪比为10.4。试验表明定量限为0.127μg。

6、检测限测定

取关附庚素对照品0.0108mg/ml，稀释5倍，进样20μl，测的样品峰面积为17.31，信噪比为3.0。试验表明检测限为0.0432μg。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种治伤胶囊有效成分的含量测定方法，包含以下步骤：

精密称取关附庚素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液作为对照品溶液；称取治伤胶囊内容物约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1％盐酸溶液50ml，密塞，称定重量，浸泡20min，超声处理30分钟，冷却后再称重，用1％盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即为供试品溶液；

分别取对照品溶液与供试品溶液20μl，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈、0.2％三乙胺、0.2％pH值为3辛烷磺酸钠溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为205nm，理论板数按关附庚素峰计算应不低于5000进行HPLC测定。

2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，还包含以下步骤：

称取治伤胶囊内容物约6g，精密称定，精密加入1％盐酸溶液50ml，超声处理30分钟，水温保持50℃以下，置离心管中以3000转/分的速度离心分离10分钟，精密量取上清液25ml，用浓氨试液调节pH值至10～11；用氯仿提取5次，每次10ml，合并提取液，水浴蒸干，残渣加对甲基红指示剂显中性的乙醇5ml使溶解，蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，精密加0.01mol/L盐酸滴定液10ml，摇匀，加冷开水15ml与甲基红指示液2滴，用0.01mol/L氢氧化钠滴定液滴至黄色。

3.关附庚素在制备抗炎药物中的应用。