发明内容:
本发明的目的是提供了一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法。
本发明是根据蛹虫草的正常菌种和退化菌种两者对合成染料脱色能力的差异,将指示剂溴麝香草酚蓝添加到培养基,利用颜色变化或/和脱色率区分退化菌种与正常菌种,从而实现了本发明的目的。
本发明的蛹虫草退化菌种快速鉴定方法,包括以下步骤:
a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养,然后将获得的一级菌种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养,得到蛹虫草二级液体菌种,经过滤获得蛹虫草的孢子液;
b)将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中,使每毫升色度培养基中含有孢子1×103~1×106个,然后在常规培养条件下振荡培养;
c)8-15天后,取出孢子培养液,观察孢子培养液的颜色,当孢子培养液的颜色为蓝色或者绿色时,判断该蛹虫草菌种为退化菌种。
所述的色度培养基的组分如下:按质量分数100%计,酵母粉0.45%、细菌蛋白胨0.75%、乳糖0.5%、溴麝香草酚蓝(BTB)0.025‰、余量为水。
本发明还提供了另一种蛹虫草退化菌种快速鉴定方法,包括以下步骤:
a)将蛹虫草菌种接种至固体PDA培养基进行一级菌种活化培养,然后将获得的一级菌种转接至液体PDA培养基中进行二级液体培养,得到蛹虫草二级液体菌种,经过滤获得蛹虫草的孢子液;
b)将a)步骤获得孢子液转接到色度培养基中,使每毫升色度培养基中含有孢子1×103~1×106个,然后在常规培养条件下振荡培养,按上述孢子液与其接入的色度培养基的体积比将液体PDA培养基接入到色度培养基内,同等条件下进行培养作为对照液;
c)8-15天后,取出孢子培养液和对照液,然后将孢子培养液和对照液离心去除菌丝和孢子,取上清液,测定两种上清液的OD615,用公式计算菌种的脱色率D=[1-(孢子培养液的上清液OD615/对照液的上清液OD615)]×100%,当脱色率D<20时,判断该蛹虫草菌种为退化菌种;
所述的色度培养基的组分如下:按质量分数100%计,酵母粉0.45%、细菌蛋白胨0.75%、乳糖0.5%、溴麝香草酚蓝(BTB)0.025‰、余量为水。
上述两种方法都是应用蛹虫草的正常菌种和退化菌种两者对溴麝香草酚蓝脱色能力的差异,将指示剂溴麝香草酚蓝添加到培养基,培养菌种,菌株对溴麝香草酚蓝进行脱色,8-15天后,表观为颜色的直接变化或者与同等条件下的培养基相对照的脱色率变化,颜色的变化和脱色率的变化,这两个指标都是对菌种脱色能力的外在表观,因此其构思是相同。如果经过上述方法测定后,当其颜色为黄色或者脱色率大于20时,则判断该菌种为正常菌种。
上述两种方法中,所述的b)步骤优选是先用液体PDA培养基将a)步骤获得孢子液稀释至浓度为1×105~1×108个/mL,然后再接入到色度培养基中。
上述两种方法中,所述的一级菌种活化培养可以采用一般的公知方法,优选方法是将分离纯化的蛹虫草菌种接种至经灭菌的固体斜面PDA培养基,20~25℃,避光培养7~10天,至白色绒毛状菌丝长满斜面,获得一级菌种。
上述两种方法中,所述的二级液体培养可以采用一般的公知方法,优选方法是将一级菌种从平板上接种至经灭菌的液体PDA培养基中,常规条件下振荡培养5~7天,至菌球充满液体培养基,获得二级液体菌种。
本发明的PDA液体和固体培养基是本领域公知技术中的培养基。
所述的酵母粉、细菌蛋白胨、溴麝香草酚蓝(BTB)和乳糖都属于现有技术的产品。
所述的色度培养基的配置方法如下:称量酵母粉4.5g,细菌蛋白胨7.5g,乳糖5g,溴麝香草酚蓝(BTB)0.025g,加水至1000mL,经高压蒸汽灭菌,冷却至室温待用。
本发明根据正常菌种和退化菌种对溴麝香草酚蓝脱色能力的差异,利用颜色变化或者脱色率区分退化菌株与正常菌株。该方法具有快速、简单、成本低的优点,能够准确的鉴别出退化菌株和正常菌株,从而可以在蛹虫草人工栽培前进行快速鉴定,筛选出正常菌株进行栽培,达到节约成本的目的。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1
按质量分数100%计,含有马铃薯20%,葡萄糖2%,蛋白胨1%,琼脂1.8%,余量为水,按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。
按质量分数100%计,含有马铃署20%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.1%,维生素B120mg/L,余量为水,按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g,细菌蛋白胨7.5g,溴麝香草酚蓝(BTB)0.025g,乳糖5g,余量为水,按照上述配方制得色度培养基。
将分离纯化的蛹虫草菌株M11接种至灭菌的固体斜面PDA培养基,20℃,避光培养10天,至白色绒毛状菌丝长满斜面,然后将该一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中,25℃、120r/min条件下振荡培养7天,至菌球充满液体培养基。
将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(10×15cm,杭州新华纸业有限公司)过滤得到孢子液,用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1×108个/mL。将300μL孢子液接到30mL色度培养基,25℃、120r/min条件下振荡培养,以加入300μL液体PDA培养基到30mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。8天后,取出孢子培养液和对照液,经12000r/m离心15min,去除菌丝和孢子,吸取两者的上清液,以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零,测定两种上清液的OD615。
用公式计算菌株M11的脱色率D=[1-(孢子培养液的上清液OD615/对照液的上清液OD615)]×100。
通过上述检测,菌株M11的孢子培养液颜色为黄色,脱色率为104。
因此,可判断蛹虫草菌株M11为正常菌株。
菌株M11的栽培试验
将上述的M11二级菌种转接到大米培养基,在18~23℃、湿度为65~90%、温度为85%、光照强度为200-600lux、适当通气和光照下(12h/d)常规人工培养,55天后形成正常的子实体。
实施例2:
按质量分数100%计,含有马铃薯20%,葡萄糖2%,蛋白胨1%,琼脂1.8%,余量为水,按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。
按质量分数100%计,含有马铃署20%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.1%,维生素B120mg/L,余量为水,按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g,细菌蛋白胨7.5g,溴麝香草酚蓝(BTB)0.025g,乳糖5g,余量为水,按照上述配方制得色度培养基。
将分离纯化的蛹虫草菌株M4接种至灭菌的固体斜面PDA培养基,22℃,避光培养9天,至白色绒毛状菌丝长满斜面,然后将一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中,25℃、120r/min条件下振荡培养6天,至菌球充满液体培养基。
将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤,得到孢子液,用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1×107个/mL。将250μL孢子液接到25mL色度培养基,25℃、120r/min条件下振荡培养,以加入250μL液体PDA培养基到25mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。10天后,取出孢子培养液和对照液,经12000r/m离心15min,去除菌丝和孢子,吸取两者的上清液,以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零,测定两种上清液的OD615。
用公式计算菌株M4的脱色率D=[1-(孢子培养液的上清液OD615/对照液的上清液OD615)]×100。
通过上述检测,菌株M4的孢子培养液颜色为黄色,脱色率为32。
因此,可判断蛹虫草菌株M4为正常菌株。
菌株M4的栽培试验
将上述的M4二级菌种转接到大米培养基,在18~23℃、湿度为65~90%、温度为85%、光照强度为200-600lux、适当通气和光照下(12h/d)常规人工培养,60天后形成正常的子实体。
实施例3:
按质量分数100%计,含有马铃薯20%,葡萄糖2%,蛋白胨1%,琼脂1.8%,余量为水,按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。
按质量分数100%计,含有马铃署20%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.1%,维生素B120mg/L,余量为水,按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g,细菌蛋白胨7.5g,溴麝香草酚蓝(BTB)0.025g,乳糖5g,余量为水,按照上述配方制得色度培养基。
将分离纯化的蛹虫草菌株M6接种至灭菌的固体斜面PDA培养基,23℃,避光培养8天,至白色绒毛状菌丝长满斜面,然后将一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中,25℃、120r/min条件下振荡培养6天,至菌球充满液体培养基。
将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤,得到孢子液,用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1×106个/mL。将300μL孢子液接到30mL色度培养基,25℃、120r/min条件下振荡培养,以加入300μL液体PDA培养基到30mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。12天后,取出孢子培养液和对照液,经12000r/m离心15min,去除菌丝和孢子,吸取两者的上清液,以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零,测定两种上清液的OD615。
用公式计算菌株M6的脱色率D=[1-(孢子培养液的上清液OD615/对照液的上清液OD615)]×100。
通过上述检测,菌株M6的孢子培养液颜色为绿色,脱色率为15。因此,可判断蛹虫草菌株M6为退化菌株。
菌株M6的栽培试验
将上述的M6二级菌种转接到大米培养基,在18~23℃、湿度为65~90%、温度为85%、光照强度为200-600lux、适当通气和光照下(12h/d)人工培养,72天后没有形成正常的子实体。
实施例4:
按质量分数100%计,含有马铃薯20%,葡萄糖2%,蛋白胨1%,琼脂1.8%,余量为水,按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。
按质量分数100%计,含有马铃署20%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.1%,维生素B120mg/L,余量为水,按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g,细菌蛋白胨7.5g,溴麝香草酚蓝(BTB)0.025g,乳糖5g,余量为水,按照上述配方制得色度培养基。
将分离纯化的蛹虫草菌株M5接种至灭菌的固体斜面PDA培养基,24℃,避光培养7天,至白色绒毛状菌丝长满斜面,然后将该一级菌种从平板接至经灭菌的液体PDA培养基中,25℃、120r/min条件下振荡培养5天,至菌球充满液体培养基。
将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤,得到孢子液,用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为5×105个/mL。将400μL孢子液接到40mL色度培养基,25℃、120r/min条件下振荡培养,以加入400μL液体PDA培养基到40mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。14天后,取出孢子培养液和对照液,经12000r/m离心15min,吸取两者的上清液,以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零,测定两种上清液的OD615。
用公式计算菌株M5的脱色率D=[1-(孢子培养液的上清液OD615/对照液的上清液OD615)]×100。
通过上述检测,菌株M5的孢子培养液颜色为蓝色,脱色率为-46。因此,可判断蛹虫草菌株M5为退化菌株。
菌株M5的栽培试验
将上述的M5二级菌种转接到大米培养基,在18~23℃、湿度为65~90%、温度为85%、光照强度为200-600lux、适当通气和光照下(12h/d)常规人工培养,70天后没有形成正常的子实体。
实施例5:
按质量分数100%计,含有马铃薯20%,葡萄糖2%,蛋白胨1%,琼脂1.8%,余量为水,按照上述配方制得固体斜面PDA培养基。
按质量分数100%计,含有马铃署20%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.1%,维生素B1 20mg/L,余量为水,按照上述配方制得液体PDA培养基。
每升色度培养基中含有酵母粉4.5g,细菌蛋白胨7.5g,溴麝香草酚蓝(BTB)0.025g,乳糖5g,余量为水,按照上述配方制得色度培养基。
将分离纯化的蛹虫草菌株M8接种至灭菌的固体斜面PDA培养基,25℃,避光培养7天,至白色绒毛状菌丝长满斜面,然后将一级菌种从平板接至经灭菌的二级菌种的液体PDA培养基中,25℃、120r/min条件下振荡培养5天,至菌球充满液体培养基。
将上述培养液用经灭菌的三层擦镜纸(同实施例1)过滤,得到孢子液,用液体PDA培养基将孢子液浓度稀释为1×105个/mL。将500μL孢子液接到50mL色度培养基,25℃、120r/min条件下振荡培养,以加入500μL液体PDA培养基到50mL色度培养基进行同等条件培养作为对照液。15天后,取出孢子培养液和对照液,经12000r/m离心15min,吸取两者的上清液,以无菌水作为分光光度计的校准液进行调零,测定两种上清液的OD615。
用公式计算菌株M8的脱色率D=[1-(孢子培养液的上清液OD615/对照液的上清液OD615)]×100。
通过上述检测,菌株M8的孢子培养液颜色为蓝色,脱色率为-123。因此,可判断蛹虫草菌株M8为退化菌株。
菌株M8的栽培试验
将上述的M8二级菌种转接到大米培养基,在18~23℃、湿度为65~90%、温度为85%、光照强度为200-600lux、适当通气和光照下(12h/d)人工培养,65天后没有形成正常的子实体。