CN101773530A

CN101773530A - 一种达玛烷型配糖体的制备方法

Info

Publication number: CN101773530A
Application number: CN201010114808.4A
Authority: CN
Inventors: 黎福南; 丁艳芬; 杨崇仁
Original assignee: YUXI WINHEY BIO Tech CO Ltd
Current assignee: Weihe Pharma{grave Over C }euticals Co ltd
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: CN101773530B

Abstract

本发明是一种达玛烷型配糖体的制备方法。经超声波提取、高分子絮凝澄清、大孔吸附树脂柱层析、离子交换树脂柱层析、浓缩、干燥后得到达玛烷型配糖体。该方法应用超声波提取技术进行高效率与低能耗提取，应用高分子絮凝沉淀技术对大分子杂质进行处理，应用膜分离和膜浓缩技术进行分离与浓缩，通过提取单元优化，系统集成，以及在线质量检测和自动控制，实现达玛烷型配糖体的高效率、高质量、低成本、规模化生产。

Description

一种达玛烷型配糖体的制备方法

技术领域

本发明涉及中药有效成分的提取、纯化技术领域，具体地说是一种以人参、三七、西洋参等为原料制备达玛烷型配糖体的方法。

背景技术

以达玛烷型四环三萜(damarrane tetracyclic triterpenoid)为基本骨架的植物配糖体(plantglycosides)具有多方面的生理活性，在医药卫生、保健食品和功能化妆品行业具有广阔的开发应用前景。达玛烷型配糖体的工业化生产是新兴医药健康产业形成与发展的基础。植物配糖体具有分子量大、极性大、对热和酸不稳定等特性，提取分离困难。已有多种提取植物配糖体的方法，特别是从三七中提取总皂苷已进行工业生产。由于提取单元技术落后，单元之间缺乏系统整合与集成，自动化程度低，不能进行在线质量控制，导致提取率和产品质量不稳定。应用现代制药工程的提取技术，进行提取单元关键技术的改造与提升，通过优化整合和系统集成，开发达玛烷型配糖体现代化提取工程技术，对于形成优势产业，培育龙头企业，促进达玛烷型配糖体医药健康产业的发展和中药现代化具有重要的意义。

达玛烷型配糖体主要存在于五加科(Araliaceae)人参属(Panax Linn)植物中，通常称为人参皂苷(ginsenosides)。三七[P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen]、人参(P.ginseng C.A.Meyer)和西洋参(P.quenquefolius)是工业化生产达玛烷型配糖体的重要天然原料。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从植物原料中提取达玛烷型配糖体的工业化制备方法，该方法设计科学合理、生产周期短、自动化程度高、质量可控、易于规模化生产；且收率高、产品纯度高、环境友好、节约能源、生产成本低。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

(1)超声波提取：富含达玛烷型配糖体的植物原料粉碎，过20～40目筛，投入超声波提取装置，用质量浓度为30～85％的乙醇超声提取0.5～2小时，提取液减压浓缩，回收乙醇，得浓缩液；

(2)高分子絮凝澄清：浓缩液加水至浓缩液体积的1.5～3倍，加如浓缩液量1～5％的高分子絮凝剂液，混合，60～90℃加热10～40min，放置，冷却至室温，离心，清液存入储罐，不溶物用水搅拌，过滤，滤液存入储罐；

(3)大孔吸附树脂柱层析：在层析柱中均匀装入大孔吸附树脂，自顶部将上述澄清液加入层析柱中，用水洗脱至洗脱液无色无味，用浓度为60～95％乙醇洗脱，每小时洗脱流量为柱体积的2～8倍；用薄层层析法控制洗脱量，至洗脱液无达玛烷型配糖体特征斑点，即停止洗脱，将乙醇洗脱液存入储罐；

(4)离子交换树脂柱层析：在层析柱中均匀装入离子交换树脂，将上述乙醇洗脱液自顶部泵入，用质量浓度为65％～90％乙醇洗脱，每小时洗脱流量为柱体积的2～8倍；用薄层层析法控制沈脱量，至沈脱液无达玛烷型配糖体特征斑点，即停止洗脱，收集洗脱液；

(5)膜浓缩：将上述洗脱液通过膜浓缩设备，得浓缩液；

(6)喷雾干燥：将上述浓缩液进行喷雾干燥，得到达玛烷型配糖体产品；

在线检测：在生产全过程的各个环节设置控制点，应用薄层层析(TLC)和高压液相色谱(HPLC)分析检测方法，分析达玛烷型配糖体的组成与含量，建立指纹图谱分析方法，对植物原料和上述提取步骤进行在线质量检测；

自动控制：在生产全过程连接各个提取单元，各个环节设置控制点，应用pH计、质量流量计、压力计、液位计、温度传感器，在线监测温度、压力、密度、黏度、pH值等，采集工艺参数，应用计算机管理软件，设定控制值，通过系统分析和网络集成，进行信息管理，实现生产全过程的自动控制。

所述富含达玛烷型配糖体的植物原料，包括人参、三七、西洋参等植物的地下部分和地上部分。

所述的高分子絮凝剂液的配制方法为：取高分子絮凝剂，加入浓度0.5～2.5％醋酸，搅拌溶解，放置，过滤，即得。

本发明与现有技术相比较具有如下优势：

1.本发明首次将超声波提取技术应用于达玛烷型配糖体的生产中，不仅提取率高、杂质少，而且缩短提取时间、节约能源、对环境友好。特别有利于极性大、对热和酸不稳定的配糖体物质的提取。

2.本发明首次选用适宜提取达玛烷型配糖体的高分子絮凝剂，将其作为提取单元整合于植物提取工程中。该技术能有效地去除提取液中的多糖、蛋白质、树胶等大分子杂质和重金属，回收率高，与传统醇沉法相比较，除杂效果明显，操作简单、低成本。

3.本发明首次在达玛烷型配糖体的提取中应用膜分离和膜浓缩技术，将其作为提取单元整合于植物提取工程中。该技术与高分子絮凝剂配合使用，在室温下进行，能有效去除大分子杂质和重金属，提高浓缩效率，防止达玛烷型配糖体受热降解，保证产品质量。较传统工艺速度快、效率高，节约能源。

4.本发明在提取单元优化整合与系统集成的基础上，通过管道连接和自动控制，实现达玛烷型配糖体的自动化生产。同时，采集各控制点的工艺参数，应用计算机管理软件进行系统分析和网络集成，进行信息管理，实现生产过程的智能控制。应用薄层层析和高压液相色谱技术，建立指纹图谱分析方法，进行生产全过程的在线质量控制。为植物提取工程规范化、现代化提供示范。

5.中国专利CN1334267A提供了一种三七总皂苷的制备工艺。与本发明的技术相比较，如表1和表2。

表1提取单元技术的比较

单元技术	传统工艺	CN1334267A	本发明工艺
单元技术	传统工艺	CN1334267A	本发明工艺	提取技术	热回流提取	连续热回流提取	超声波提取
澄清技术	无	静止沉淀	高分子絮凝沉淀	提取技术	热回流提取	连续热回流提取	超声波提取
澄清技术	无	静止沉淀	高分子絮凝沉淀	脱糖技术	正丁醇萃取	大孔吸附树脂柱层析	大孔吸附树脂柱层析
脱色技术	氧化铝或活性碳	离子交换树脂柱层析	离子交换树脂柱层析	脱糖技术	正丁醇萃取	大孔吸附树脂柱层析	大孔吸附树脂柱层析
脱色技术	氧化铝或活性碳	离子交换树脂柱层析	离子交换树脂柱层析	浓缩技术	敞口浓缩	加温减压浓缩	膜分离浓缩
干燥技术	真空干燥	喷雾干燥	喷雾干燥	浓缩技术	敞口浓缩	加温减压浓缩	膜分离浓缩
干燥技术	真空干燥	喷雾干燥	喷雾干燥	系统集成	无	管道化	管道集成，自动化生产
在线控制	无	无	自动控制	系统集成	无	管道化	管道集成，自动化生产

表2提取率及成本比较

项目	传统工艺	CN1334267A	本发明工艺
项目	传统工艺	CN1334267A	本发明工艺	提取率	7～8％	11％	13％
酒精消耗量(原料比)	1∶1.6	1∶1.1	1∶0.8	提取率	7～8％	11％	13％
酒精消耗量(原料比)	1∶1.6	1∶1.1	1∶0.8	耗水(m³)	2292	1763	240
耗蒸汽(kg)	305890	235300	4275	耗水(m³)	2292	1763	240
耗蒸汽(kg)	305890	235300	4275	耗电(kw.h)	12883	9910	6750

注：提取率按三七根提取总皂苷得率计算。

附图说明

图1.1为三七根茎达玛烷型配糖体的硅胶薄层层析图(1.Rb1，2.Rd，3.Re，4.R1，5.Rg1，6.三七总皂苷)；

图1.2为三七根茎达玛烷型配糖体的Rp-8反相硅胶薄层层析图(1.Rd，2.Rb1，3.Rg1，4.Re，5.R1，6.三七总皂苷)；

图2为三七根茎达玛烷型配糖体的薄层层析和高压液相色谱指纹图谱。

图3.1为人参根达玛烷型配糖体的硅胶H薄层层析图(1.Rb1，2.Rd，3.Re，4.Rg1，5.人参总皂苷)；

图3.2为人参根达玛烷型配糖体的反相硅胶Rp-8薄层层析图(1.Rd，2.Rb1，3.Rg1，4.Re，5.人参总皂苷)；

图4为人参根达玛烷型配糖体的高压液相色谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，以下以结合实施例作进一步的说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

以三七根茎为原料提取达玛烷型配糖体的方法：

(1)超声波提取：干燥的三七根茎30kg粉碎，过20～40目筛，投入封闭式超声波强化提取装置，用质量浓度为40％乙醇200kg超声提取1小时，提取液减压浓缩，回收乙醇，得到约50L浓缩液；

(2)高分子絮凝澄清：浓缩液加水至总液量150L，加高分子絮凝剂液2L，混合，60℃加热30min，放置，冷却至室温，离心，清液存入储罐，不溶物用5kg水搅拌，过滤，滤液存入储罐；

(3)大孔吸附树脂柱层析：在不锈钢层析柱中均匀装入大孔吸附树脂，树脂经预处理活化后，将上述澄清液自柱的上面均匀加入层析柱中，用水洗脱至洗脱液无色无味，即用浓度为65％乙醇洗脱，洗脱液每小时流量为柱体积的3倍；用薄层层析法控制沈脱量，至薄层层析检测无达玛烷型皂苷特色斑点，即停止洗脱，将乙醇洗脱液存入储罐；

(4)离子交换树脂柱脱色：在不锈钢层析柱中均匀装入离子交换树脂，树脂经预处理活化后，将上述乙醇沈脱液泵入，用浓度为65％乙醇洗脱，洗脱液每小时流量为柱体积的3倍；用薄层层析法控制洗脱量，至薄层层析检测无达玛烷型皂苷特色斑点，即停止洗脱，收集洗脱液；

(5)膜浓缩：将上述洗脱液通入膜浓缩设备，得浓缩液；

(6)喷雾干燥：将上述浓缩液进行喷雾干燥，得到三七根茎达玛烷型配糖体产品，得率按原料计算，为13.8％。

上述制备过程中在线质量控制：应用薄层层析(TLC)和高压液相色谱(HPLC)分析检测技术，分析达玛烷型配糖体的组成与含量，建立指纹图谱分析方法，对植物原料和上述提取步骤进行在线质量检测。图1和图2为三七根茎达玛烷型配糖体的薄层层析和高压液相色谱指纹图谱。

三七根茎达玛烷型配糖体的硅胶薄层层析方法：取三七根茎达玛烷型配糖体样品，加甲醇分别制成1mg/ml的溶液，吸取供试品溶液10μl，点于硅胶H薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，以含10％硫酸(质量百分比)的乙醇溶液喷雾显色。结果见图1.1。

三七根茎达玛烷型配糖体的Rp-8反相硅胶薄层层析方法：取三七根茎达玛烷型配糖体样品，加甲醇分别制成1mg/ml的溶液，吸取供试品溶液10μl，点于反相硅胶Rp-8薄层板上，以甲醇-水(68∶32)为展开剂，展开，取出，晾干，以含10％硫酸的乙醇溶液喷雾显色。结果见图1.2。

三七根茎达玛烷型配糖体的高压液相色谱指纹图谱的分析条件：色谱条件及系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱；流速为0.8ml/min；检测波长为203nm；柱温25℃；人参皂甙Rg1和人参皂甙Re的分离度应该大于1.5，理论板数按人参皂甙Rg1计应不低于6000。

在上述达玛烷型配糖体生产过程中，连接各个提取单元，在关键环节设置控制点，应用pH计、质量流量计、压力计、液位计、温度传感器，采集样品，在线监测温度、压力、密度、黏度、pH值等，应用计算机管理软件，采集工艺参数，通过系统分析和网络集成，设定控制值，进行信息管理，实现生产全过程的自动控制。

实施例2：

以人参根为原料提取达玛烷型配糖体的方法：

(1)超声波提取：干燥的人参根30kg粉碎，过20～40目筛，投入封闭式超声波强化提取装置，用浓度为80％乙醇200kg超声提取1.5小时，提取液减压浓缩，回收乙醇，得到约50L浓缩液；

(2)高分子絮凝澄清：浓缩液加水至总液量75L，加高分子絮凝剂液1L，混合，90℃加热15min，放置，冷却至室温，离心，清液存入储罐，不溶物用5kg水搅拌，过滤，滤液存入储罐；

(3)大孔吸附树脂柱层析：在不锈钢层析柱中均匀装入大孔吸附树脂，树脂经预处理活化后，将上述澄清液自柱的上面均匀加入层析柱中，用水洗脱至洗脱液无色无味，即用浓度为95％乙醇洗脱，洗脱液每小时流量为柱体积的7倍；用薄层层析法控制洗脱量，至薄层层析检测无达玛烷型皂苷特色斑点，即停止洗脱，将乙醇沈脱液存入储罐；

(4)离子交换树脂柱脱色：在不锈钢层析柱中均匀装入离子交换树脂，树脂经预处理活化后，将上述乙醇洗脱液泵入，用浓度为90％乙醇洗脱，洗脱液每小时流量为柱体积的7倍；用薄层层析法控制洗脱量，至薄层层析检测无达玛烷型皂苷特色斑点，即停止洗脱，收集洗脱液；

(5)膜浓缩：将上述洗脱液通入膜浓缩设备，得浓缩液；

(6)喷雾干燥：将上述浓缩液进行喷雾干燥，得到人参根达玛烷型配糖体产品，得率按原料计算，为6.6％。

上述制备过程中进行在线质量控制：应用薄层层析和高压液相色谱方法，建立指纹图谱分析方法，进行生产全过程的在线质量控制。图3和图4为人参根达玛烷型配糖体的薄层层析和高压液相色谱指纹图谱。

人参根达玛烷型配糖体的硅胶薄层层析方法：取人参根达玛烷型配糖体样品，加甲醇分别制成1mg/ml的溶液，吸取供试品溶液10μl，点于硅胶H薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，以含10％硫酸的乙醇溶液喷雾显色。结果见图3.1。

人参根达玛烷型配糖体的Rp-8反相硅胶薄层层析方法：取人参根达玛烷型配糖体样品，加甲醇分别制成1mg/ml的溶液，吸取供试品溶液10μl，点于反相硅胶Rp-8薄层板上，以甲醇-水(68∶32)为展开剂，展开，取出，晾干，以含10％硫酸的乙醇溶液喷雾显色。结果见图3.2。

人参根达玛烷型配糖体的高压液相色谱图分析方法与三七根茎达玛烷型配糖体的高压液相色谱图分析方法相同。

自动控制系统与实施例1相同。

上述实施例中：

1.高分子絮凝剂液的配制方法为：取高分子絮凝剂，加入浓度为0.5～2.5％醋酸，搅拌溶解，放置，过滤，即得。

2.大孔吸附树脂的处理方法为：将大孔吸附树脂置于沉淀缸内，用水漂洗，过滤，加75～98％乙醇，装入不锈钢层析柱上，放置15～36h，用乙醇冲洗层析柱，至乙醇液稀释后不混浊；继续用水洗涤，除去乙醇，加入0.5～5倍于树脂体积的10～50％盐酸洗涤，用水洗至中性，再以0.5～5倍于树脂体积的1～8％氢氧化钠洗涤，用水洗至中性，HPLC检测无有机物质残留。

3.离子交换树脂的处理方法为：将离子交换树脂置于沉淀缸内，用75～98％乙醇浸泡15～36h，放出乙醇，加去离子水浸泡，装入不锈钢层析柱上，放出水，加入浓度为75～98％乙醇，浸泡15～36h，用去离子水洗去乙醇；以1～6倍于层析柱体积的质量浓度为2～8％盐酸洗涤，用水洗至中性，再以0.5～5倍于树脂体积的质量浓度为1～8％氢氧化钠洗涤，用水洗至中性，保持柱面溶剂，待用。

4.超声波装置包括但不限于各种类型的封闭式和开放式的超声波强化提取装置。所述膜浓缩设备包括但不限于各种类型的膜分离和膜浓缩装置。

Claims

1.一种达玛烷型配糖体的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(2)高分子絮凝澄清：上述浓缩液加水至浓缩液的1.5～3倍，加入浓缩液量1～5％的高分子絮凝剂液，混合，60～90℃加热10～40min，放置，冷却至室温，离心，清液存入储罐，不溶物用水搅拌，过滤，滤液存入储罐；

(3)大孔吸附树脂柱层析：在层析柱中均匀装入大孔吸附树脂，树脂经预处理活化后，自顶部将上述澄清液加入层析柱中，用水洗脱至洗脱液无色无味，用质量浓度为60～95％乙醇洗脱，每小时洗脱流量为柱体积的2～8倍，用薄层层析检测，至洗脱液无达玛烷型配糖体特征斑点，即停止洗脱，将乙醇洗脱液存入储罐；

(4)离子交换树脂柱层析：在层析柱中均匀装入离子交换树脂，树脂经预处理活化后，将上述乙醇洗脱液自顶部泵入，用质量浓度为65～90％乙醇洗脱，每小时洗脱流量为柱体积的2～8倍，用薄层层析检测，至洗脱液无达玛烷型配糖体特征斑点，即停止洗脱，收集洗脱液；

(5)浓缩：将上述洗脱液通入膜浓缩设备，得浓缩液；

(6)干燥：将上述浓缩液进行喷雾干燥，得到达玛烷型配糖体产品。

2.根据权利要求1所述的达玛烷型配糖体的制备方法，其特征在于：在生产过程中应用薄层层析和高压液相色谱方法，对植物原料和上述提取步骤进行在线质量检测。

3.根据权利要求1所述的达玛烷型配糖体的制备方法，其特征在于：在生产过程中应用管道连接，并在各个环节设置控制点，应用pH计、质量流量计、压力计、液位计、温度传感器在线监测温度、压力、密度、黏度、pH值，应用计算机辅助对工艺参数进行系统分析，实现生产全过程的自动控制。

4.根据权利要求1所述的达玛烷型配糖体的制备方法，其特征在于：所述富含达玛烷型配糖体的植物原料，包括但不限于人参、三七、西洋参等富含达玛烷型配糖体的植物地下部分和地上部分。

5.根据权利要求1所述的达玛烷型配糖体的制备方法，其特征在于：所述的高分子絮凝剂液的配制方法为：取高分子絮凝剂，用质量浓度0.5～2.5％醋酸搅拌溶解，放置，过滤，即得。

6.根据权利要求1所述的达玛烷型配糖体的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的大孔吸附树脂，包括各种类型的聚苯乙烯型大孔吸附树脂，树脂的预处理方法为：将大孔吸附树脂置于沉淀缸内，用水浸泡，过滤，加75～98％乙醇，装入层析柱，放置15～36h，用乙醇冲洗，至乙醇液稀释后不混浊，用水洗净乙醇后，用0.5～5倍于树脂体积的质量浓度为10～50％盐酸洗涤，用水洗至中性，以0.5～5倍于树脂体积的质量浓度为1～8％氢氧化钠洗涤，再用水洗至中性，至HPLC检测无有机物质残留。

7.根据权利要求1所述的达玛烷型配糖体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述离子交换树脂柱层析所用的离子交换树脂包括各种类型的强酸型和弱酸型离子交换树脂；树脂的处理方法为：将离子交换树脂置于沉淀缸内，用质量浓度为75～98％乙醇浸泡15～36h，过滤，加入去离子水浸泡，装入层析柱，放出水，加入质量浓度为75～98％乙醇，浸泡15～36h，用去离子水洗净乙醇后，以1～6倍于层析柱体积的质量浓度为2％～8％盐酸洗涤，用水洗至中性，以0.5～5倍于树脂体积的质量浓度为1％～8％氢氧化钠洗涤，再用水洗至中性，保持柱面溶剂，待用。