CN101766642A - 人参皂甙Rd在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人参皂甙Rd在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途。实验证实，立体定向注射β淀粉样蛋白到双侧海马CA1区可模拟阿尔茨海默病中神经细胞的损伤，发现事先给予人参皂甙Rd可显著减轻Aβ对神经元的毒性作用，使增殖活化的星形胶质细胞数目及形态恢复正常、改善CA1区异常的细胞超微结构，并可使细胞凋亡因子caspase-3的表达明显降低，提示人参皂甙Rd对阿尔茨海默病中神经细胞损伤有明显的保护作用。

Description

人参皂甙Rd在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用

技术领域

本发明涉及人参皂甙Rd的新用途，具体涉及人参皂甙Rd在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

随着社会的发展，人口老龄化现象日益明显，年龄相关疾病的患病率显著升高。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人常见的一种神经退行性疾病，近年来发病率不断上升，以进行认知功能障碍和记忆损害为特征，成为仅次于心血管疾病、恶性肿瘤和中风的第四位死亡原因，给社会、家庭以及个人带来巨大的影响。因此，AD已成为世界各国关注的焦点，积极寻找防治AD的方法及有效药物成为当今亟待解决的问题。虽然目前有关AD的发病机制、基因定位以及诊断和治疗方面已经取得了很多成就，但仍有许多未知领域有待于进一步探索。

AD病人脑内的特征性的病理改变为：老年斑沉积、神经原纤维缠结和基底前脑胆碱能神经元丢失。目前多数学者认为，老年斑的主要成分β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)在脑组织中的异常积聚是AD形成和发生的关键因素。异常积聚的Aβ可诱导神经毒性，损伤神经系统，导致患者出现认知功能障碍。因此，针对Aβ来治疗AD将成为一种很有潜力的治疗方法，从中药宝库中发掘具有预防和治疗Aβ神经损伤的药物，已日益受到全球的重视。

人参是传统的名贵中药材，在中国已有上千年的应用历史。主要活性成分人参皂甙一直倍受研究者的关注。GS属三萜皂甙，结构上与类固醇相似，基本结构均含有17个碳原子的甾核。迄今为止，人们已从人参中提取出30余种GS单体，按其在硅胶薄层色谱Rf值的大小顺序将各个组分命名为R0、Ra、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3等，这些组分按化学结构又分为两类：①达玛烷型，包括二醇型如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2等，及三醇型，如Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1等；②齐墩果烷型，如R0。其中达玛烷型占绝大多数，是GS最主要活性组分。人参皂甙Rd化学结构式如图1所示。发明人前期I、II、III期临床试验中发现，人参皂甙Rd可明显改善脑梗死病人的预后，而无明显毒副作用，提示其具有神经保护的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供人参皂甙Rd在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，并期望将其推广应用至帕金森病、亨丁顿舞蹈症、多发性硬化症等其他神经系统变性病的预防和治疗中。

有效成分含有人参皂甙的药物可采用片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、乳剂或透皮贴剂。上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、抗坏血酸、甘露醇等。

上述的制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。

说明书附图

图1为人参皂甙Rd的结构式；

图2为海马尼氏染色，A：假手术组；B：AD模型+生理盐水组；C：AD模型+人参皂甙Rd组；

图3为海马星形胶质细胞免疫组化染色(GFAP)，A：AD模型+生理盐水组；B：AD模型+人参皂甙Rd组；

图4为海马透射电镜，A：假手术组；B：AD模型+生理盐水组；C：AD模型+人参皂甙Rd组；

图5为海马Western blot，A：正常对照；B：假手术组；C、D、E：AD模型+生理盐水组；F：AD模型+人参皂甙Rd组。

具体实施方式

动物实验：

人参皂甙Rd由广州泰禾生物药业有限公司提供，利用中国专利ZL01803432.2的方法制备。

1材料与方法

1.1实验动物及分组

雄性SD大鼠，由第四军医大学实验动物中心提供，6～7周龄，体重190～210克，实验前3天领回，分笼饲养于安静环境中。动物室温度控制在20～24℃，湿度控制在50％左右，动物自由进食、饮水，正常日光周期。随机分组：正常对照组、假手术组、AD模型组，AD模型组动物腹腔注射生理盐水或人参皂甙Rd(10mg/kg)。每组各有4只动物。

1.2AD模型制作及给药方法

用无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成5μg/μl，37℃孵育1周备用。造模前连续7天腹腔注射生理盐水或人参皂甙Rd，每天一次，第8天造模。10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，将头部固定于立体定向仪上，顶部消毒去毛，纵向切口2cm，暴露颅骨，选双侧海马CA1区为注射区，定位坐标：前囟后3.0mm，中线旁2.0mm，硬膜下3.0mm，用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，缓慢垂直进针，将2μl Aβ1-40缓慢注入，注射时间5min，留针5min，撤针5min。所有操作均在无菌条件下进行，皮肤切口处给予少许青霉素粉并缝合。造模后继续腹腔注射生理盐水或人参皂甙Rd 7天。假手术组动物，不注射生理盐水或人参皂甙Rd，立体定向手术时注射等量生理盐水。所有动物给药结束5天后将脑组织进行组织学、免疫组织化学染色，透射电子显微镜观察及Western blot检测。

1.3组织切片制备

将大鼠用1％戊巴比妥钠深度麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100ml，4％多聚甲醛液400ml，断头取脑，将脑组织入4％多聚甲醛后固定，20％蔗糖4℃沉底。之后于-21℃恒冷箱切片机行海马冠状位连续切片，片厚30μm。

1.4尼氏染色

切片入氯仿1分钟；无水酒精1分钟；95％酒精、70％酒精各1分钟，蒸馏水洗片刻；0.1％焦油紫染液37℃温箱中染色10分钟，蒸馏水洗涤；95％酒精分色；常规脱水、透明、封片。光镜下观察CA1区神经元数目。

1.5免疫组织化学染色

切片入0.01mol/L磷酸钾盐缓冲液(PBS，PH 7.4)漂洗，80％甲醇双氧水，含0.3％Triton X-100的0.01mol/L PBS浸泡，GFAP一抗室温孵育过夜，生物素标记二抗室温孵育2h，生物素-卵白素-HRP复合物室温孵育2h，DAB显色。阴性对照以0.01mol/L PBS代替一抗。光镜下观察CA1区星形胶质细胞数目。

1.6透射电镜样品制备

动物灌注固定后，CA1区组织修块后经30mg/L戊二醛后固定4℃过夜，10g/L锇酸后固定2h，0.1mol/L PBS漂洗两次，每次10分钟，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋、修块，超薄切片，透射电镜下观察并记录结果。

1.7Western blot检测

动物断头处死，立即在低温条件下分离出大脑海马组织，用预制冷的蛋白裂解液进行组织匀浆，整个过程在冰上操作。低温离心样品，取上清进行蛋白质定量(BSA法)。制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，转膜，脱脂牛奶封闭，加一抗、二抗，化学发光法显示条带。

2结果

2.1组织学染色

尼氏染色发现，假手术组大鼠海马CA1区细胞构筑明确，胞浆内可见团块状蓝紫色尼氏小体，核仁清晰；CA1区注射Aβ1-40后，神经元数目明显减少，残存的细胞内部结构紊乱，无法辨认尼氏小体及核仁；在AD造模前后持续给予人参皂甙Rd，可显著减轻Aβ1-40对神经元的毒性作用，神经元数目与正常对照组相比未见减少，细胞结构清晰(图2)。

2.2免疫组织化学染色

大鼠海马CA1区注射Aβ1-40后，可见注射区域星形胶质细胞明显增殖活化，表现为GFAP阳性细胞显著增多，胞体变大，突起增粗增长；给予人参皂甙Rd后，星形胶质细胞数目及形态恢复正常(图3)。

2.3透射电镜

假手术组大鼠海马CA1区显微结构清晰，突触结构正常，突触前膜、突触后膜、突触间隙及突触小泡明显可见；注射Aβ1-40后，CA1区显微结构模糊，正常突触破坏，突触小泡崩解消失；给予人参皂甙Rd后，混乱的CA1区显微结构恢复正常，可见明确的突触前后膜、突触间隙及突触小泡(图4)。

2.4Western blot

在正常及假手术组大鼠海马组织内，凋亡相关蛋白caspase-3表达非常低，而在AD模型动物海马组织内其表达量显著增高，给予人参皂甙Rd后，caspase-3表达明显降低(图5)。

动物实验发现：人参皂甙Rd可通过下调凋亡相关蛋白caspase-3显著减轻Aβ1-40对大鼠的神经毒性，从而具有脑保护作用。此外，人参皂甙的脑保护作用还可期望应用于帕金森病、亨丁顿舞蹈症、多发性硬化症等其他神经系统变性病的预防和治疗。

Claims (2)

1.人参皂甙Rd在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述用途，所述药物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、乳剂或透皮贴剂。

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