CN101762667A - 一种用于检测香豆素系化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测香豆素系化合物的方法，该方法包括对样品进行超高效液相色谱和串联质谱检测，从而确定样品含有的香豆素系化合物的种类和含量。所述香豆素系化合物为醋硝香豆素、双香豆素、6-甲氧基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素、8-羟基补骨脂素、4-甲基-7-羟基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、7-甲基香豆素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、2′，4，8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和环香豆素中的一种或多种。本发明的方法可以在4分钟内完成22种香豆素系化合物的分析检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测香豆素系化合物的方法，特别涉及一种同时对多种香豆素系化合物进行检测的方法。
背景技术
香豆素系化合物是一类具有芳香气味，母核为苯并α-吡喃酮结构的天然产物，广泛分布于植物界，根据结构可分为简单香豆素系化合物、呋喃香豆素系化合物、吡喃香豆素系化合物和其他香豆素系化合物等。日常生活使用的化妆品通常添加有一定量的香料和香精，以赋予化妆品温馨和优雅的香气，但与此同时，添加的香料和香精的安全性将直接影响化妆品的安全性。香豆素系化合物被广泛用于添加在香水、沐浴啫喱和除臭剂等化妆品中。德国联邦风险评估研究所的研究结果显示，部分香豆素系化合物可引发肝损伤；并且，在具有高含量香豆素系化合物的化妆品使用过程中，香豆素系化合物可通过皮肤接触方式进入人体内，可能导致使用者每日摄入的香豆素系化合物的量超出人体的每日耐受摄入量(即，0.1mg/kg体重)。为此，我国《化妆品卫生标准》、《化妆品卫生规范》和欧盟化妆品规程(Council Directive76/768/EEC)均明确规定醋硝香豆素、双香豆素和6-甲氧基-7-羟基香豆素等香豆素系化合物为化妆品组分中的禁用物质。国际日化香料协会也不推荐具有致敏作用的二氢香豆素、7-甲基香豆素和7-甲氧基香豆素等香豆素系化合物作为日化香料成分使用。
目前，化妆品中香豆素系化合物的检测方法主要有高效液相色谱法和气相色谱法等。上述检测方法存在的不足是检测灵敏度和分析通量还有待于进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的检测灵敏度和分析通量低的不足，提供一种高通量的用于检测香豆素系化合物的方法，该方法不仅分析速度快，而且检测灵敏度高。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法，该方法包括以下步骤：
获取液相色谱中香豆素系化合物标准品的保留时间和质谱中香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰、以及香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程；
制备样品溶液，进行液相色谱检测，得到样品中各个组分的保留时间，对各个组分进行质谱检测，得到各个组分的特征碎片离子峰及特征碎片离子峰的面积；以及
将各个组分的保留时间和特征碎片离子峰与所述香豆素系化合物标准品的保留时间和特征碎片离子峰进行比对，从而确定所述样品中含有的香豆素系化合物的种类，并根据所述特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程进行计算，从而确定所述样品中含有的香豆素系化合物的含量；
其特征在于，所述香豆素系化合物为醋硝香豆素、双香豆素、6-甲氧基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素、8-羟基补骨脂素、4-甲基-7-羟基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、7-甲基香豆素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、2’，4，8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和环香豆素中的一种或多种；
所述液相色谱为超高效液相色谱，所述质谱检测是通过串联质谱法进行的。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法不仅具有分析通量高的特点，还具有精密度和检测灵敏度高的特点。具体地，根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法可以在4分钟内完成22种香豆素系化合物的分析检测，并且检出限为2.5-18.0μg/kg，在20-100μg/kg的3个添加水平范围内的平均回收率为80.2-93.1％，精密度均小于10％。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测香豆素系化合物的方法，该方法包括以下步骤：
获取液相色谱中香豆素系化合物标准品的保留时间和质谱中香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰、以及香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程；
制备样品溶液，进行液相色谱检测，得到样品中各个组分的保留时间，对各个组分进行质谱检测，得到各个组分的特征碎片离子峰及特征碎片离子峰的面积；以及
将各个组分的保留时间和特征碎片离子峰与所述香豆素系化合物标准品的保留时间和特征碎片离子峰进行比对，从而确定所述样品中含有的香豆素系化合物的种类，并根据所述特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程进行计算，从而确定所述样品中含有的香豆素系化合物的含量；
其特征在于，所述香豆素系化合物为醋硝香豆素、双香豆素、6-甲氧基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素、8-羟基补骨脂素、4-甲基-7-羟基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、7-甲基香豆素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、2’，4，8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和环香豆素中的一种或多种；
所述液相色谱为超高效液相色谱，所述质谱检测是通过串联质谱法进行的。
根据本发明的检测方法可以同时对多种香豆素系化合物进行检测，所述香豆素系化合物可以为本领域技术人员熟知的各种香豆素系化合物。优选地，所述香豆素系化合物为醋硝香豆素、双香豆素、6-甲氧基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素、8-羟基补骨脂素、4-甲基-7-羟基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、7-甲基香豆素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、2’，4，8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和环香豆素中的一种或多种。
本发明的用于检测香豆素系化合物的方法中，所述液相色谱为超高效液相色谱。与常规的液相色谱和高效液相色谱相比，超高效液相色谱大幅度改善了液相色谱的分析速度、分离效率、样品通量和灵敏度。本发明的用于检测香豆素系化合物的方法中，所述质谱检测是通过串联质谱法进行的。串联质谱法具有高选择性和高灵敏度的优点。将超高效液相色谱与串联质谱结合起来，则可以充分发挥二者各自的优点，为本发明的检测方法提供一个可靠、灵敏且快速的分析平台。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法包括获取液相色谱中香豆素系化合物标准品的保留时间和质谱中香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰、以及香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程的步骤。
对香豆素系化合物标准品的溶液进行超高效液相色谱检测可以确定香豆素系化合物标准品在超高效液相色谱中的保留时间；对香豆素系化合物标准品进行串联质谱检测可以确定香豆素系化合物标准品的特征碎片离子；对具有不同浓度的香豆素系化合物标准品的溶液进行超高效液相色谱和串联质谱检测则可以建立该香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程。
确定香豆素系化合物标准品在超高效液相色谱中的保留时间、在串联质谱分析中的特征碎片离子以及建立特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程的方法可以为本领域技术人员公知的方法。一般地，可以配制一系列具有不同浓度的香豆素系化合物标准品的溶液，分别对这些溶液进行超高效液相色谱检测和串联质谱检测，从而确定该香豆素系化合物标准品在超高效液相色谱中的保留时间以及在串联质谱中的特征碎片离子峰；将串联质谱检测得到的特征碎片离子峰面积相对于该香豆素系化合物标准品溶液的浓度作图，并进行线性拟和，从而建立该香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程。
本发明对于配制一系列具有不同浓度的香豆素系化合物标准品溶液所采用的溶剂并没有特别的限定，可以为本领域技术人员熟知的各种溶剂，只要所述溶剂可以溶解所述香豆素系化合物标准品即可。优选地，所述溶剂为乙腈和水，其中，乙腈与水的体积比可以为1∶1.5-4，优选为3∶7。同时，本发明对于所述香豆素系化合物标准品溶液的浓度也没有特别的限定，可以根据所采用的仪器的检测范围和待测样品中的香豆素系化合物的含量来确定。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法包括制备样品溶液，进行液相色谱检测，得到样品中各个组分的保留时间，对各个组分进行质谱检测，得到各个组分的特征碎片离子峰及特征碎片离子峰的面积。
制备所述样品溶液时所采用的溶剂可以为本领域常用的各种溶剂，只要所述溶剂可以溶解所述样品，并与确定香豆素系化合物标准品在液相色谱中的保留时间时所采用的溶剂相同即可。优选地，所述溶剂为乙腈和水，其中乙腈与水的体积比可以为1∶1.5-4，优选为3∶7。
本发明对所述样品溶液的浓度没有特别的限定，只要该浓度使得样品中的香豆素系化合物的浓度落入所述特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程的线性范围内即可。当样品中含有多种香豆素系化合物时，所述样品溶液的浓度使每种香豆素系化合物的浓度分别落入各自的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程的线性范围内即可。当所述样品中的香豆素系化合物的浓度不在所述线性方程的线性范围内时，可以对所述样品溶液进行稀释或浓缩。一般地，所述样品溶液中样品的浓度可以使得样品溶液中每种香豆素系化合物的浓度处于1-500ng/mL的范围内，优选处于1-250ng/mL的范围内。
本发明对于所述样品的来源并无特别的限定，可以为任意来源的样品，优选来自化妆品。所述化妆品可以为各种类型的化妆品，一般地，所述化妆品可以为膏霜、散粉、水剂、唇膏和香波中的一种或多种。
优选地，当所述样品来自化妆品时，本发明的用于检测香豆素系化合物的方法还可以包括从化妆品中提取样品的步骤：将所述化妆品与溶剂混合，进行超声提取，然后获取上清液，相对于1g的化妆品，所述溶剂的用量可以为10-30mL，所述超声提取的时间可以为5-30分钟；脱除所述上清液中的溶剂，得到样品基质；以及通过固相萃取从所述样品基质中获取样品。
本发明对于所述溶剂的种类没有特别限定，可以为本领域常用的各种溶剂。但是，为了进一步提高检测的准确性，优选根据化妆品的种类来选择所述溶剂。当所述化妆品为膏霜、水剂、散粉和香波中的一种或多种时，所述溶剂优选为乙腈；当所述化妆品为唇膏时，所述溶剂优选为四氢呋喃和甲醇，且四氢呋喃与甲醇的体积比可以为1∶3-5，优选为1∶4。
所述固相萃取可以根据本领域技术人员熟知的方法进行。从进一步提高检测结果的可靠性的角度出发。优选地，所述固相萃取包括：依次用第一淋洗剂和第二淋洗剂对处于固相萃取柱内的所述样品基质进行淋洗。
本发明对于所述固相萃取柱的种类没有特别限定，可以为本领域常用的各种固相萃取柱。从进一步提高萃取效率和萃取速度的角度出发，所述萃取柱优选为Oasis HLB萃取柱。
所述第一淋洗剂用于洗脱所述样品基质含有的极性弱于所述香豆素系化合物的杂质，即应当先淋洗出极性弱于香豆素系化合物的杂质，避免所述杂质进入香豆素系化合物，从而进一步提高检测结果的可靠性；所述第二淋洗剂用于洗脱所述样品基质含有的香豆素系化合物。本发明对于第一淋洗剂和第二淋洗剂的用量并无特别限定，只要所述第一淋洗剂可以确保除去或基本除去极性弱于所述香豆素系化合物的杂质，而所述第二淋洗剂的用量可以确保完全或基本完全将所述香豆素系化合物淋洗下来即可。
本发明对于所述第一淋洗剂和第二淋洗剂的种类也没有特别的限定，只要所述第一淋洗剂的极性不足以将香豆素系化合物淋洗出来，而所述第二淋洗剂的极性足以将所述样品基质含有的各种香豆素系化合物淋洗出来即可。
本发明的发明人经过研究发现，不同浓度的甲醇水溶液对香豆素系化合物表现出不同的淋洗能力，随甲醇水溶液中甲醇含量的提高，淋洗能力逐渐增强。基于此，所述第一淋洗剂可以为5-15体积％的甲醇水溶液，所述第二淋洗剂可以为85-95体积％的甲醇水溶液；优选地，所述第一淋洗剂为浓度为10体积％的甲醇水溶液，所述第二淋洗剂为浓度为90体积％的甲醇水溶液。本发明对于所述甲醇水溶液的pH没有特别的限定，可以为碱性、中性或酸性的甲醇水溶液，例如：中性甲醇水溶液与酸化甲醇水溶液(含有2重量％的乙酸)和氨化甲醇水溶液(含有2重量％的NH4OH)的淋洗效果并无显著差异。
除去用第二淋洗剂进行淋洗而得到的淋洗液中的淋洗剂，即可得到所述样品。除去所述淋洗液中的淋洗剂的方法可以为本领域技术人员熟知的方法，不再赘述。
在使所述样品基质进入所述固相萃取柱之前，优选将所述固相萃取柱活化，所述活化的方法是本领域技术人员公知的，在此不再详述。本发明对于使所述样品基质进入所述固相萃取柱的方法也没有特别限定，可以为本领域常用的方法，一般包括：使用第一淋洗剂溶解所述样品基质，从而得到样品基质的溶液；然后，将所述样品基质的溶液添加到所述固相萃取柱中，并使所述样品基质的溶液进入所述固相萃取柱的固定相。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法，对所述样品溶液进行超高效液相色谱检测可以将所述样品溶液分离成为多个具有不同的保留时间的组分，对得到的各个组分进行串联质谱检测可以确定各个组分的特征碎片离子峰以及该特征碎片离子峰的面积。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法，同时涵盖了定性分析和定量分析两个方面。所述定性分析包括：将通过超高效液相色谱分析得到的样品中的各个组分的保留时间与香豆素系化合物标准品的保留时间进行比对，以及通过串联质谱法而得到的样品中的各个组分的特征碎片离子峰与香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰进行比对，从而确定所述样品是否含有香豆素系化合物，并确定所述样品含有的香豆素系化合物的种类。所述定量分析包括：根据通过串联质谱分析而确定的特征碎片离子峰的面积，以及所述香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程来确定所述样品溶液中含有的香豆素系化合物的浓度，进而确定所述样品中含有的香豆素系化合物的量。
如前所述，根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法中，所述液相色谱为超高效液相色谱。
所述超高效液相色谱在超高效液相色谱仪上进行。所述超高效液相色谱仪可以为可商购得到的各种型号的超高效液相色谱仪。所述超高效液相色谱仪的配置可以为本领域的常规配置。但是，从进一步提高分离效果、样品通量和检测的灵敏度的角度出发，所述超高效液相色谱仪所配备的色谱柱优选为填料的粒径为亚微米的色谱柱。所述亚微米为低于2微米。满足上述要求的色谱柱可以为各种来源的色谱柱，优选地，所述色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱。为了获得更为优异的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应，所述超高效液相色谱仪运行时的流动相优选为乙腈和水。
所述超高效液相色谱仪的运行条件可以为本领域技术人员熟知的条件，没有特别限定。优选地，所述超高效液相色谱仪的运行条件包括：所述流动相的流速为0.2-0.4毫升/分钟，所述色谱柱的温度为20-40℃；梯度洗脱程序为：0-2分钟时，流动相中乙腈的浓度从30体积％线性升高至45体积％；2-4.5分钟时，流动相中乙腈的浓度从45体积％线性升高至95体积％；4.5-6分钟时，流动相中乙腈的浓度为95体积％；6-7分钟时，流动相中乙腈的浓度从95体积％线性降低至30体积％。更优选地，所述流动相的流速为0.3毫升/分钟；所述色谱柱的温度为40℃。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法，所述质谱检测是通过串联质谱法而进行的。所述串联质谱法中的第一级质谱用于获取准分子离子；第二级质谱用于获取特征碎片离子，由此提高质谱检测的选择性。特征碎片离子是由准分子离子进一步裂解而得的。所述串联质谱法采用的质谱仪可以为本领域常用的各种质谱仪，优选地，所述串联质谱法在串联的四极杆质谱仪上进行。所述四极杆质谱仪优选采用电喷雾离子源。
本发明对于质谱检测中的离子化模式并没有特别的限制。为了进一步提高检测的可靠性，优选地，醋硝香豆素、双香豆素和8-羟基补骨脂素的电离方式为电喷雾电离源负离子方式(ESI-)；6-甲氧基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素、4-甲基-7-羟基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、7-甲基香豆素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、2’，4，8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和环香豆素的电离方式为电喷雾电离源正离子方式(ESI+)。
一般地，所述四极杆质谱仪的运行条件包括：毛细管电压为2.5-4kV；离子源温度为120-180℃；去溶剂气温度为400-600℃；去溶剂气流量为900-1100升/小时；锥孔气流量为10-50升/小时；光电倍增器电压为550-750V；碰撞气体为氩气，碰撞气压为0.3-0.35Pa，碰撞气流量为0.1-0.2毫升/分钟；采用多反应监测模式进行检测。
优选地，所述毛细管电压为3kV；所述离子源温度为150℃；所述去溶剂气温度为500℃；所述去溶剂气流量为1000升/小时；所述锥孔气流量为50升/小时；所述光电倍增器电压为650V；所述碰撞气压为0.35Pa，所述碰撞气流量为0.15毫升/分钟。
根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法，所述超高效液相色谱和串联质谱优选为联用。
以下结合实施例对本发明的检测香豆素系化合物方法进行详细描述。
实施例1
本实施例用来说明根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法。
(1)香豆素系化合物标准品溶液的制备
分别准确称取适量的各香豆素系化合物标准品，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成1000mg/L标准储备液，于-20℃下保存。准确量取各香豆素系化合物标准储备液4mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，配制成40mg/L混合标准储备液。使用时，用甲醇逐级稀释成浓度为1、2、5、10、20、50、100、200和250ng/mL的混合标准工作液。
其中，所述香豆素系化合物标准品为：醋硝香豆素(纯度98重量％)购自加拿大TRC公司；双香豆素(纯度99重量％)和8-甲氧基补骨脂素(纯度99重量％)购自比利时Acros公司；6-甲氧基-7-羟基香豆素(纯度95重量％)、7-羟基香豆素(纯度95重量％)、4-甲基-7-羟基香豆素(纯度95重量％)、6，7-二甲氧基香豆素(纯度95重量％)、异欧前胡素(纯度95重量％)和二氢欧山芹醇当归酸酯(纯度95重量％)购自中国药品生物制品检定所；8-羟基补骨脂素(纯度98重量％)购自美国ChromaDex公司；香豆素(纯度97重量％)购自美国Fluka公司；7-甲氧基香豆素(纯度99重量％)和7-甲基香豆素(纯度99重量％)购自美国AccuStandard公司；二氢香豆素(纯度99重量％)和4-甲基-7-乙氧基香豆素(纯度98重量％)购自美国Alfa Aesar公司；补骨脂素(纯度99重量％)、异补骨脂素(纯度98重量％)、5-甲氧基补骨脂素(纯度99重量％)、4-甲基-7-二乙氨基香豆素(纯度99重量％)、2’，4，8-三甲基补骨脂素(纯度98重量％)和欧前胡素(纯度98重量％)购自美国Sigma公司；以及环香豆素(纯度99重量％)购自德国
公司。
(2)香豆素系化合物标准品溶液的超高效液相色谱和串联质谱检测
检测仪器为ACQUITY超高效液相色谱仪和Xevo TQ MS三重四级杆质谱仪，采用MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)。
超高效液相色谱分析的条件包括：色谱柱为Waters公司的ACQUITYUPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm，填料粒径为1.7μm)；保护柱为Waters公司的VanGuard BEH C18柱(5mm×2.1mm，填料粒径为1.7μm)；流动相为乙腈和水，梯度洗脱程序为：0-2分钟时，乙腈的浓度从30体积％线性升高至45体积％；2-4.5分钟时，乙腈的浓度从45体积％线性升高至95体积％；4.5-6分钟时，乙腈的浓度为95体积％；6-7分钟时，乙腈的浓度从95体积％线性降低至30体积％；流动相的流速为0.3毫升/分钟；柱温为40℃；样品室温度为20℃；进样量为5μL。
质谱检测条件为：采用电喷雾离子源；毛细管电压为3.0kV；离子源温度为150℃；去溶剂气温度为500℃；去溶剂气流量为1000升/小时；锥孔气流量为50升/小时；碰撞气流量为0.15毫升/分钟；光电倍增器电压为650V；碰撞气体为氩气，碰撞气压为0.35Pa；多反应监测(MRM)模式检测。
香豆素系化合物标准品在超高效液相色谱中的保留时间，在串联质谱中的准分子离子峰以及特征碎片离子峰如下表1所示。
表1
*：强度相对较大的特征碎片离子
表1中，每种香豆素系化合物标准品均给出了两个特征碎片离子，其中：强度相对较大的特征碎片离子的离子峰面积用于与浓度作图，从而得出特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程；强度相对较小的特征碎片离子用于辅助强度相对较大的特征碎片离子来确定香豆素系化合物的种类。
在上述超高效液相色谱条件和串联质谱条件下，对具有不同浓度的香豆素系化合物标准品溶液进行检测，确定特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程。得到的线性方程、以及线性方程的线性范围和相关系数如表2所示。以信噪比为10估算检出限为2.5-18.0μg/kg。
表2
| 名称 | 线性方程* | 线性范围(ng/mL) | 相关系数 |
| 醋硝香豆素 | y＝557.19x+8718.80 | 1-50 | 0.9977 |
| 双香豆素 | y＝0.75x-0.38 | 5-250 | 0.9995 |
| 6-甲氧基-7-羟基香豆素 | y＝828.18x+5206.70 | 1-50 | 0.9931 |
| 7-羟基香豆素 | y＝308.86x+442.92 | 5-250 | 0.9975 |
| 8-羟基补骨脂素 | y＝3.99x+45.29 | 1-50 | 0.9982 |
| 4-甲基-7-羟基香豆素 | y＝262.53x+194.23 | 1-50 | 0.9985 |
| 6，7-二甲氧基香豆素 | y＝841.42x+510.08 | 1-50 | 0.9981 |
| 香豆素 | y＝39.38x-6.41 | 5-250 | 0.9998 |
| 7-甲氧基香豆素 | y＝411.49x-447.96 | 5-250 | 0.9986 |
| 二氢香豆素 | y＝2.40x-1.34 | 5-250 | 0.9982 |
| 补骨脂素 | y＝153.15x-116.29 | 5-250 | 0.9999 |
| 异补骨脂素 | y＝70.19x-157.77 | 1-50 | 0.9985 |
| 8-甲氧基补骨脂素 | y＝254.72x-62.15 | 1-50 | 0.9999 |
| 7-甲基香豆素 | y＝0.10x+0.02 | 1-50 | 0.9991 |
| 名称 | 线性方程* | 线性范围(ng/mL) | 相关系数 |
| 5-甲氧基补骨脂素 | y＝469.23x+195.12 | 1-50 | 0.9995 |
| 4-甲基-7-乙氧基香豆素 | y＝824.94x+76.71 | 1-50 | 0.9978 |
| 4-甲基-7-二乙氨基香豆素 | y＝649.43x+1422.70 | 1-50 | 0.9972 |
| 2’，4，8-三甲基补骨脂素 | y＝265.79x-83.59 | 1-50 | 0.9998 |
| 欧前胡素 | y＝219.05x-207.36 | 1-50 | 0.9997 |
| 异欧前胡素 | y＝489.85x-361.48 | 1-50 | 0.9997 |
| 二氢欧山芹醇当归酸酯 | y＝0.74x+3.52 | 5-250 | 0.9996 |
| 环香豆素 | y＝1363.00x+1248.50 | 1-50 | 0.9995 |
*：上述线性方程中的x对应于浓度，y对应于特征碎片离子峰面积。
(3)方法的回收率和精密度
分别称取经测定不含有香豆素系化合物的香波类化妆品各0.500g，分别添加不同浓度的标准品，每个添加浓度设置6个平行样，用本发明的用于检测香豆素系化合物的方法进行测定，确定方法的回收率和精密度。香豆素系化合物的添加量、回收率和精密度结果见表3。
回收率的计算公式为：
回收率＝香豆素系化合物的检测量/香豆素系化合物的添加量×100％。
精密度(RSD)的计算公式为：
其中，Ai为第i次的检测值；
A为各次检测的检测值的平均值；
n为检测次数，等于6。
表3
*：RSD为精密度
表3中的数据表明，在低、中、高3个添加水平范围内的平均回收率为80.2-93.1％，精密度均小于10％。
实施例2
本实施例用来说明根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法。
准确称取化妆品试样(为膏霜)0.500g于25mL具塞比色管中，加入10mL乙腈，涡旋混匀，超声提取20分钟后，以15000转/分钟转速离心15分钟，收集上清液于50mL鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于40℃的水浴中浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入2mL 10重量％的甲醇水溶液溶解残渣，得到的溶液用于固相萃取。Oasis HLB固相萃取柱用5mL甲醇活化、5mL水平衡后，将试样溶液过柱，弃去直接流出液，先用1mL 10重量％的甲醇水溶液淋洗，再用3mL 90重量％的甲醇水溶液洗脱，收集90重量％的甲醇水溶液的洗脱液，用氮气缓慢吹干后，准确加入1mL 30体积％的乙腈水溶液溶解残渣，过0.20μm微孔滤膜后，按照与实施例1相同的超高效液相色谱条件和串联质谱条件进行检测，并根据检测结果确定该化妆品含有香豆素，且香豆素的含量为37.37mg/kg。
实施例3
本实施例用来说明根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法。
准确称取化妆品试样(为唇膏)0.500g于25mL具塞比色管中，加入2mL四氢呋喃，超声提取5分钟，再加8mL甲醇，涡旋混匀，超声提取20分钟后，以15000转/分钟的转速离心15分钟，收集上清液于50mL鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于40℃的水浴中浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入2mL 10体积％的甲醇水溶液溶解残渣，得到的溶液用于固相萃取。OasisHLB固相萃取柱用5mL甲醇活化、5mL水平衡后，将试样溶液过柱，弃去直接流出液，先用1mL 10体积％甲醇水溶液淋洗，再用3mL 90体积％的甲醇水溶液洗脱，收集90体积％的甲醇水溶液的洗脱液，用氮气缓慢吹干后，准确加入1mL 30体积％的乙腈水溶液溶解残渣，过0.20μm微孔滤膜后，按照与实施例1相同的超高效液相色谱条件和串联质谱条件进行检测，并根据检测结果确定该化妆品含有香豆素，且香豆素的含量为20.07mg/kg。
实施例4
本实施例用来说明根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法。
准确称取化妆品试样(为散粉)0.500g于25mL具塞比色管中，加入15mL乙腈，涡旋混匀，超声提取30分钟后，以15000转/分钟转速离心15分钟，收集上清液于50mL鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于40℃的水浴中浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入2mL 5重量％的甲醇水溶液溶解残渣，得到的溶液用于固相萃取。Oasis HLB固相萃取柱用5mL甲醇活化、5mL水平衡后，将试样溶液过柱，弃去直接流出液，先用3mL 5重量％的甲醇水溶液淋洗，再用2mL 95重量％的甲醇水溶液洗脱，收集95重量％的甲醇水溶液的洗脱液，用氮气缓慢吹干后，准确加入1mL 30体积％的乙腈水溶液溶解残渣，过0.20μm微孔滤膜后，按照与实施例1相同的超高效液相色谱条件和串联质谱条件进行检测，并根据检测结果确定该化妆品含有香豆素，且香豆素的含量为27.60mg/kg。
实施例5
本实施例用来说明根据本发明的用于检测香豆素系化合物的方法。
准确称取化妆品试样(为水剂)0.500g于25mL具塞比色管中，加入5mL乙腈，涡旋混匀，超声提取5分钟后，以15000转/分钟的转速离心15分钟，收集上清液于50mL鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于40℃的水浴中浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入2mL 15重量％的甲醇水溶液溶解残渣，得到的溶液用于固相萃取。Oasis HLB固相萃取柱用5mL甲醇活化、5mL水平衡后，将试样溶液过柱，弃去直接流出液，先用1mL 15重量％的甲醇水溶液淋洗，再用3mL 85重量％的甲醇水溶液洗脱，收集85重量％的甲醇水溶液的洗脱液，用氮气缓慢吹干后，准确加入1mL 30体积％的乙腈水溶液溶解残渣，过0.20μm微孔滤膜后，按照与实施例1相同的超高效液相色谱条件和串联质谱条件进行检测，并根据检测结果确定该化妆品含有7-甲基香豆素，且7-甲基香豆素的含量为2.10mg/kg。
Claims (18)
1.一种用于检测香豆素系化合物的方法，该方法包括以下步骤：
获取液相色谱中香豆素系化合物标准品的保留时间和质谱中香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰、以及香豆素系化合物标准品的特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程；
制备样品溶液，进行液相色谱检测，得到样品中各个组分的保留时间，对各个组分进行质谱检测，得到各个组分的特征碎片离子峰及特征碎片离子峰的面积；以及
将各个组分的保留时间和特征碎片离子峰与所述香豆素系化合物标准品的保留时间和特征碎片离子峰进行比对，从而确定所述样品中含有的香豆素系化合物的种类，并根据所述特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程进行计算，从而确定所述样品中含有的香豆素系化合物的含量；
其特征在于，所述香豆素系化合物为醋硝香豆素、双香豆素、6-甲氧基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素、8-羟基补骨脂素、4-甲基-7-羟基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、7-甲基香豆素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、2’，4，8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和环香豆素中的一种或多种；
所述液相色谱为超高效液相色谱，所述质谱检测是通过串联质谱法进行的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品溶液的溶剂为乙腈和水，且乙腈与水的体积比为1∶1.5-4。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述样品溶液的浓度使得所述样品中含有的香豆素系化合物的浓度落入所述特征碎片离子峰面积与浓度之间的线性方程的线性范围之内。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品来自化妆品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述化妆品为膏霜、散粉、水剂、唇膏和香波中的一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，该方法还包括从所述化妆品中提取样品的步骤：
将所述化妆品与溶剂混合，进行超声提取，然后获取上清液，相对于1g化妆品，所述溶剂的用量为10-30mL，所述超声提取的时间为5-30分钟；
脱除所述上清液中的溶剂，得到样品基质；以及
通过固相萃取从所述样品基质中获取样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，当所述化妆品为膏霜、水剂、散粉和香波中的一种或多种时，所述溶剂为乙腈；当所述化妆品为唇膏时，所述溶剂为四氢呋喃和甲醇，且四氢呋喃与甲醇的体积比为1∶3-5。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述固相萃取包括：依次用第一淋洗剂和第二淋洗剂对处于固相萃取柱内的所述样品基质进行淋洗，所述第一淋洗剂为5-15体积％的甲醇水溶液；所述第二淋洗剂为85-95体积％的甲醇水溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超高效液相色谱在超高效液相色谱仪上进行，所述超高效液相色谱仪的色谱柱中的填料粒径为小于2微米，流动相为乙腈和水。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述超高效液相色谱仪的运行条件包括：所述流动相的流速为0.2-0.4毫升/分钟，所述色谱柱的温度为20-40℃，梯度洗脱程序为：0-2分钟时，流动相中乙腈的浓度从30体积％线性升高至45体积％；2-4.5分钟时，流动相中乙腈的浓度从45体积％线性升高至95体积％；4.5-6分钟时，流动相中乙腈的浓度为95体积％；6-7分钟时，流动相中乙腈的浓度从95体积％线性降低至30体积％。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述串联质谱法在串联的四极杆质谱仪上进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述四极杆质谱仪采用电喷雾离子源。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，醋硝香豆素、双香豆素、8-羟基补骨脂素的电离方式为电喷雾电离源负离子方式；6-甲氧基-7-羟基香豆素、7-羟基香豆素、4-甲基-7-羟基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、香豆素、7-甲氧基香豆素、二氢香豆素、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、7-甲基香豆素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基-7-乙氧基香豆素、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、2’，4，8-三甲基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯和环香豆素的电离方式为电喷雾电离源正离子方式。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，以m/z表示，醋硝香豆素的特征碎片离子为265.2、双香豆素的特征碎片离子为117.3、6-甲氧基-7-羟基香豆素的特征碎片离子为133.1、7-羟基香豆素的特征碎片离子为107.2、8-羟基补骨脂素的特征碎片离子为157.1、4-甲基-7-羟基香豆素的特征碎片离子为105.2、6，7-二甲氧基香豆素的特征碎片离子为151.2、香豆素的特征碎片离子为91.4、7-甲氧基香豆素的特征碎片离子为121.4、二氢香豆素的特征碎片离子为107.4、补骨脂素的特征碎片离子为115.4、异补骨脂素的特征碎片离子为131.3、8-甲氧基补骨脂素的特征碎片离子为174.3、7-甲基香豆素的特征碎片离子为105.3、5-甲氧基补骨脂素的特征碎片离子为174.3、4-甲基-7-乙氧基香豆素的特征碎片离子为121.4、4-甲基-7-二乙氨基香豆素的特征碎片离子为188.4、2’，4，8-三甲基补骨脂素的特征碎片离子为142.3、欧前胡素的特征碎片离子为147.3、异欧前胡素的特征碎片离子为147.4、二氢欧山芹醇当归酸酯的特征碎片离子为187.4、以及环香豆素的特征碎片离子为173.3。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述特征碎片离子是由准分子离子进一步裂解而得的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，以m/z表示，醋硝香豆素的准分子离子为352.1、双香豆素的准分子离子为335.5、6-甲氧基-7-羟基香豆素的准分子离子为193.1、7-羟基香豆素的准分子离子为163.1、8-羟基补骨脂素的准分子离子为201.1、4-甲基-7-羟基香豆素的准分子离子为177.1、6，7-二甲氧基香豆素的准分子离子为207.1、香豆素的准分子离子为147.4、7-甲氧基香豆素的准分子离子为177.4、二氢香豆素的准分子离子为149.4、补骨脂素的准分子离子为187.4、异补骨脂素的准分子离子为187.3、8-甲氧基补骨脂素的准分子离子为217.5、7-甲基香豆素的准分子离子为161.4、5-甲氧基补骨脂素的准分子离子为217.5、4-甲基-7-乙氧基香豆素的准分子离子为205.5、4-甲基-7-二乙氨基香豆素的准分子离子为232.5、2’，4，8-三甲基补骨脂素的准分子离子为229.5、欧前胡素的准分子离子为271.6、异欧前胡素的准分子离子为271.5、二氢欧山芹醇当归酸酯的准分子离子为329.6、以及环香豆素的准分子离子为323.6。
18.根据权利要求13所述的方法，其中，所述四极杆质谱仪的运行条件包括：毛细管电压为2.5-4kV；离子源温度为120-180℃；去溶剂气温度为400-600℃；去溶剂气流量为900-1100升/小时；锥孔气流量为10-50升/小时；光电倍增器电压为550-750V；碰撞气体为氩气，碰撞气压为0.3-0.35Pa，碰撞气流量为0.1-0.2毫升/分钟；采用多反应监测模式进行检测。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121010 Termination date: 20141230 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |