CN101760484A

CN101760484A - 一种补料发酵生产辅酶q10的方法

Info

Publication number: CN101760484A
Application number: CN200810162759A
Authority: CN
Inventors: 吴菁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2010-06-30

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种补料发酵法生产辅酶Q₁₀。本发明采用红色酵母菌HY-05用于发酵生长辅酶Q₁₀，并用玉米浆补料分批发酵，在减少底物的反馈抑制同时，增大发酵过程中的溶氧，进一步提高辅酶Q₁₀的合成量，发酵成本低。

Description

一种补料发酵生产辅酶Q10的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种补料发酵生产辅酶Q₁₀的方法。

背景技术

辅酶Q₁₀别名癸烯醌、泛酮、万有醌，英文名Coenzyme Q₁₀，简称CoQ₁₀，为脂溶性酮类化合物，化学名称2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌。分子式：C₅₉H₉₀O₄；CAS号：303-98-0；化学结构式：性质：黄色或浅黄色结晶性粉末。易溶于氯仿、苯和四氯化碳，溶于丙酮、乙醚，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇。遇光易分解。

辅酶Q₁₀在动植物、微生物细胞内与线粒体内膜相结合，是呼吸链中重要递氢体，是一种有效的生化药物，具有重要的生理作用，近年来已被广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近，研究发现CoQ₁₀。具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。

CoQ₁₀的制备方法主要有五种：

1、半合成法：目前开发的半合成法工艺是以对甲基苯酚为原料通过溴代，醚化、氧化获得甲基二甲氧基苯醒，然后与从烟草或马铃薯叶子中提取茄呢醇缩合得到辅酶Q₁₀。该方法的关键是如何将侧链连接到母环上。

2、全合成法：1988年Eem和Kanan开发的全合成法生产辅酶Q₁₀工艺是目前唯一成功的全合成法技术，但是由于合成线性不饱和侧链存在一定难度，以及合成条件苛刻，与工业化还有一定的距离。

3、发酵法：1977年实现了微生物发酵法生产辅酶Q₁₀。这种生产工艺被认为是最有前途的合成工艺，近几年来微生物发酵法成为国内外开发的热点。红极毛杆菌、脱氮极毛杆菌，甲烷微环菌等是生产辅酶Q₁₀的主要菌种。

4、植物细胞培养法：植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理后，置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。植物的各个部位，如根、茎、叶、花、果、花药和花粉等都可以作为外植体来启动细胞培养，所形成的脱分化细胞团称为愈伤组织，将愈伤组织转移到液体培养基中进行培养称为悬浮培养。

5、生物提取法：(1)醇一碱皂化制造法：该工艺辅酶Q₁₀的收率为61.2mg/kg新鲜猪心，这是国内普遍采用工艺。在乙醇的存在下，长时间的皂化可能导致辅酶Q₁₀中的甲氧基和乙醇中乙氧基换位，生成单或双乙氧基衍生物，为了避免这些杂质的生成。可以用KOH代替NaOH和甲醇皂化，但也必须加入焦性没石子酸，否则辅酶Q₁₀在皂化过程中全部被破坏，加入量占起始原料的5％-7％，皂化过程中可以通入氮气。(2)醇一醚混合提取法该工艺醇一碱皂化制造法工艺相似，只是省去了皂化反应。

总的来说：化学合成法合成步骤繁多，条件苛刻，副产物含量多，提纯成本高；并且合成产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，要合成生物活性高的CoQ₁₀尚未达到工业化生产的程度。生物提取法中动植物CoQ₁₀含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。植物细胞培养法周期长，产率低，而且生产成本高，不利于工业化生产。相比之下利用微生物发酵法生产CoQ₁₀有几个基本优点：(1)发酵产物为天然品，生物活性好，易被人体吸收；(2)没有原材料的制约，可通过规模放大提高生产能力。如能选择合适菌株进行诱变选育，选育性能优良的菌种，同时优化发酵工艺，使菌种的CoQ₁₀。生产水平提高，生产成本就会大幅度下降。因此，微生物生产CoQ₁₀在工业化生产上更为看好。

发明内容

本发明的目的是提供一种补料发酵的方法来生产CoQ₁₀。

本发明技术人员经长期研究发现红色酵母菌HY-05能用于发酵生产CoQ₁₀，并能高密度发酵。研究表明，蔗糖是酵母菌HY-05发酵生产CoQ₁₀的较佳碳源，但浓度过高会抑制CoQ₁₀合成。玉米浆中含有多种氨基酸、生物素、蛋白质等成分，可提供细胞生长所需的氮，并可作为CoQ₁₀合成的促进剂，但研究表明，玉米浆起始浓度过高不利于CoQ₁₀发酵。本发明以补料分批培养的方式较好的解决了此问题。

具体发酵方法如下所示：

1、种子培养：

从活化斜面上挑取一环菌体接入种子培养基，28℃，240r/min培养24h。种子培养基(％)：蔗糖2.0，蛋白胨1.0，酵母粉1.0；自然pH。

2、摇瓶培养：

菌种在平板上28℃培养48h后，接入种子培养基(20mL/250mL锥形瓶)，28℃振荡培养24h后，以2％接种量接入发酵培养基(40mL/500mL锥形瓶)，26℃振荡培养72h。发酵培养基(％)：蔗糖4.0，蛋白胨2.8，KH₂PO₄0.13；pH＝5.0。

3、补料分批培养：

5L发酵罐装液量3L，接种量2％，发酵温度26℃，pH5.5～6.5为宜，搅拌速度300r/min。在发酵前期可通过转速和通气量控制溶解氧在50％左右，从发酵第24h开始，在减速流加20％蔗糖溶液的同时以7.5mL/(L·h)的速度流加玉米浆，保持溶解氧的浓度在35％左右，48h时终止发酵。

本发明用补料发酵的方法，生产出的CoQ₁₀明显优于分批发酵，并且补料方式、补加底物的量都影响着CoQ₁₀的合成量。当底物消耗速率较高，细胞生长较快时，CoQ₁₀的合成速率较低，在细胞生长的稳定期CoQ₁₀合成继续进行。细胞的生长与CoQ₁₀的合成属于半耦联型，底物的流加必须兼顾细胞生长和产物的合成。采用补料分批发酵方式不仅可减少底物的反馈抑制，而且可增大发酵过程中的溶氧，进一步提高CoQ₁₀的合成量。玉米浆中含有嘌呤类、硫氨素、苯丙氨酸、缬氨酸等多种成分，可作为CoQ₁₀合成的促进剂提高产物的合成。从发酵第24h开始，在减速流加蔗糖的同时以7.5mL/(L·h)的速度流加玉米浆，CoQ₁₀的积累可达到最大为156.2mg/L，与不补料相比产量提高了58.1％。

与现有CoQ₁₀生产方法相比，本发明具有如下有益效果：

1、所用发酵菌株红色酵母菌HY-05为安全性菌株；

2、所用发酵培养基及相关原料价廉易得，可降低发酵成本；

3、发酵温度适中，发酵条件要求低；

4、发酵所得单位产量高。

Claims

1.一种生产辅酶Q₁₀的方法，采用补料发酵法生产，其特征在于发酵所采用的菌种为红色酵母菌HY-05。

2.根据权利要求1所说补料发酵的方法，其特征在于，所述发酵方法具体包括如下步骤：

①种子培养：从活化斜面上挑取一环菌体接入种子培养基，28℃，240r/min培养24h。种子培养基(％)：蔗糖2.0，蛋白胨1.0，酵母粉1.0；自然pH。

②摇瓶培养：菌种在平板上28℃培养48h后，接入种子培养基(20mL/250mL锥形瓶)，28℃振荡培养24h后，以2％接种量接入发酵培养基(40mL/500mL锥形瓶)，26℃振荡培养72h。发酵培养基(％)：蔗糖4.0，蛋白胨2.8，KH₂PO₄0.13；pH＝5.0。

③补料分批培养：接种量为2％，发酵温度26℃，pH5.5～6.5为宜，搅拌速度300r/min。在发酵前期可通过转速和通气量控制溶解氧在50％左右，从发酵第24h开始，在减速流加20％蔗糖溶液的同时以7.5mL/(L·h)的速度流加玉米浆，保持溶解氧的浓度在35％左右，48h时终止发酵。