CN101759674B - 高纯度z-蒿本内酯和蛇床内酯a的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，包括如下步骤：制备川芎或当归粗提物作为进样物；配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相；然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，或是固定相和流动相同时泵入柱内，再转主机；由进样阀进样；根据检测器图谱接收目标成份，经分离后可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A，所述的溶剂体系是四个组分(A，B，C，D)，A组分为正构烷烃，B组分为脂肪醚或脂肪脂，C组分为脂肪醇或脂肪酮，D组分为水。本方法可获得纯度高达95％以上的z-蒿本内酯和蛇床内酯A。该方法简便易行，回收率高，易于推广使用。

Description

高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法

技术领域

本发明涉及一种单体内酯成分的制备方法，尤其涉及一种高纯度z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法。 

背景技术

中药川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根茎，始载于《神农本草经》。主要产于四川，早在南北朝就有栽种，现其他省份也有栽种。其性温，味辛，微苦，具有活血行气祛风止痛之功效。主治血淤气滞所致月经不调，痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛，头痛，风寒湿痹，跌打肿痛等疾病。临床主要用于治疗心脑血管、呼吸、泌尿系统及妇科方面的疾病。 

川芎中的成分比较复杂，有苯酞内酯类，如藁本内酯、新川芎内酯、洋川芎内酯、3-丁基苯酞、3-亚丁基苯酞等；酚类及有机酸类，如阿魏酸，瑟丹酸，大黄酚，4-羟基-3-甲氧基-苯乙烯，1-羟基-1-(3-甲氧基-4-羟苯基)-乙醇，4-羟基苯甲酸，香荚兰酸，咖啡酸，原儿茶酸，亚油酸等；生物碱类，如川芎嗪、黑麦草碱，L-异亮氨酸-L-缬氨酸酐，1-β-丙烯酸乙酯，7-醛基-β-咔啉，1-乙酰基-β-咔啉，L-缬氨酰-L-缬氨酸酐，三甲胺，胆碱等。

当归为伞形科植物当归的根，当归入肝、心、脾经，药性甘、辛、温，具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效，为临床使用频率最高的中药之一， 素有“十方九归”之称。国内外许多学者对当归的化学成份、药理作用以及临床应用均进行了较为详细的研究。从该植物中分离出苯酞类、萜类、芳香族化合物等多种成份，获得了许多当归的有效成份以及对其功能主治的认识。 

当归的化学成份主要分为精油和水溶性成份两大部分。当归精油的中性成份主要为蒿本内酯、正丁烯基内酯、α-蒎烯、月桂烯、β-罗勒烯、别罗勒烯、6-正丁基环庚二烯-1，4，2-甲基十二烷酮、苯乙烯、β-甜没药烯、菖蒲二烯、异菖蒲二烯、正丁基四氢化内酯、5-二环揽烯等；当归精油的酸性成份主要包括樟脑酸、茴香酸、壬二酸、邻苯二甲酸、肉豆蔻酸、癸二酸等；当归油酸性成份主要有：苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、愈创木酚、2，3-二甲苯酚、对乙苯酚、间乙苯酚、4-乙基间苯二酚、2，4-二羟基苯乙酮、香荆芥酚、异丁香酚、香草醛等。另有报道，精油中尚含正十二烷醉和佛手柑内酯。 

其中两种药物中共同的含量较高的有以下几个化合物：阿魏酸，蛇床内酯I，蛇床内酯H，Coniferyl ferulate，蛇床内酯A，丁基苯内酯，E-蒿本内酯，E-丁基萘内酯，Z-蒿本内酯，Z-丁基萘内酯和Levistolide A，结构如下： 

阿魏酸 

蛇床内酯I 

蛇床内酯H 

蛇床内酯A 

Coniferyl ferulate 

丁基苯内酯 

E-蒿本内酯 

Z-蒿本内酯 

其中蒿本内酯具有药理学和临床性活性，可以抑制血小板凝聚；抑制动脉增生；放松子宫，气管肌和平滑肌；防止妇科疾病；治疗月经不调，早产和高血压，等等。但是由于蒿本内酯其苯酞内酯的结构，蒿本内酯极不稳定，如果使用常规的分离方法，例如硅胶或者C-18填料：使用硅胶，硅胶对此类结构的吸附力很大，在分离过程中会有很大的阻力；使用C-18填料虽然没有很大的吸附力，可以较易的分离出此物质，但是填料的使用耗费较高，而且会难免在分离中有所损失。 

高速逆流色谱技术(High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题：样品容易被吸附、损耗和变性，HSCCC保证较高峰型分辨率、分离量大、样品无损耗、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂。高速逆流色谱仪能直接分离大量粗提物样品或合成混合物，分离结果能够达到相当高的纯度。因此，HSCCC具有操作简便，理论回收率为100％，重现性好和分离效率高、分离量较大的特点，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。 

目前，还没有利用HSCCC来同时制备高纯度的z-蒿本内酯和蛇床内酯A的报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度z-蒿本内酯和蛇床内酯A的一次性制备方法，其克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使分离回收率提高，且节约溶剂、操作简便。 

为解决上述技术问题，本发明一种高纯度z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其采用高速逆流色谱仪，包括以下步骤： 

(1)制备川芎或当归粗提物作为进样物； 

(2)配制构成固定相、流动相的溶剂体系，该溶剂体系由四个组分A，B，C，D组成，A组分为正构烷烃，B组分为脂肪醚或脂肪酯，C组分为脂肪醇或脂肪酮，D组分为水，将该溶剂体系混匀静置分层后，以上相为固定 相，下相为流动相； 

(3)使逆流色谱仪柱子中充满固定相； 

(4)使其主机转动，再将流动相泵入柱内，或是固定相和流动相同时泵入柱内，再转主机； 

(5)由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份，经分离后可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A。 

步骤(2)中，所述的正构烷烃可优选正庚烷、正辛烷或正己烷；所述的脂肪醚可优选乙醚，所述的脂肪酯可优选乙酸乙酯；所述的脂肪醇可优选甲醇、正丁醇或乙醇，所述的脂肪酮可优选丙酮。 

由于苯酞内酯类物质的极性较小，水溶性较差，同样不易溶于酸、碱性水溶液，故将上述四个组分中的水量适度减少，可使纯度增加。故根据UV检测器检测的出峰时间(从开始进样到紫外检测到所需物质达到最大值的时间为出峰时间)和分离度，加入适量水。 

溶剂体系中A，B，C，D四个组分的体积比依次为(2.5-6)∶(3-6)∶(4-7)∶(3-6)，例如5∶5∶4∶6；3∶4∶4∶3；6∶4∶7∶3等。溶剂体系优选正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水体系。上述体系以上相为固定相，下相为流动相，均可用于经过一次分离从川芎及当归粗提物中分离z-蒿本内酯和蛇床内酯A。 

本发明步骤(2)至(5)中适合温度15-30℃，在上述温度范围内，温度较低时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对峰形无多大影响。 

按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，采用TBE-300型高速逆 流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml， 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。流动相进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为700-999r/min，以1.0-2.5ml/min的流速将流动相泵入柱内；或者固定相和流动同时泵入柱内，待溶剂充满整个柱子后，调整主机转速为700-999r/min。 

主机转速越高，固定相保留率越高，但转速越高，越易产生乳化现象。当转速在800-999r/min范围内，分离效果较好，在此范围内改变转速，对结果无太大影响，故优选900r/min。 

流动相流速越小，固定相保留值越高，分离效果好，当流速在1-1.5ml/min范围内，分离效果较好，当流速为1.2ml/min，分离度最佳，故优选流速为1.2ml/min。 

本发明制备步骤包括有一个体系。因为z-蒿本内酯的不稳定性，没有自然析晶的过程，经过体系的一次分离后收集到的z-蒿本内酯和蛇床内酯A的馏分蒸干后，得到白色颗粒状物质，经过有机试剂多次的洗涤及包含多种有机试剂的溶液结晶，可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶。经过高效液相检测，纯度在95％以上。所述的有机试剂优选氯仿或甲醇。 

本发明具有以下有益效果：本发明方法采用了高速逆流色谱分离技术，是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使被分离物回收率高。又因为采用优选的溶剂体系，控制温度、调整主机转速和流动相流速等工艺条件，可以高效率地分离、获得高纯度的z-蒿本内酯(达到90％以上)，并且适合从各种工艺途径制备的川芎或当归提取物。保证较高峰形分 辨度，分离量大、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂、操作简便。 

附图说明

图1是本发明实施例1的HSCCC-UV检测图谱； 

图2是本发明实施例2的HSCCC-UV检测图谱； 

图3是本发明实施例3的HSCCC-UV检测图谱； 

图4是本发明实施例4的HSCCC-UV检测图谱； 

图5是本发明实施例5的HSCCC-UV检测图谱； 

图6是本发明实施例6的HSCCC-UV检测图谱； 

图7是本发明实施例7的HSCCC-UV检测图谱； 

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述： 

以下实施例中的川芎、当归是市售产品。 

实施例1 

将川芎粉碎为粗粉，取100g粗粉加入600ml90％(V/V)乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏作为进样物备用。 

从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备z-蒿本内酯和蛇床内酯A。按5∶6∶4∶6体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度15℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取70mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为840r/min，以1.2ml/min的流速将流动 相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图1所示，其中，峰1为蛇床内酯A，峰2为z-蒿本内酯。目标馏分蒸干后用甲醇挥发结晶可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％。 

实施例2 

将当归粉碎为粗粉，取100g粗粉加入600ml90％(V/V)乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏作为进样物备用。 

从体系中选取正庚烷-乙酸乙酯-乙醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备z-蒿本内酯和蛇床内酯A。按6∶3∶5.5∶4.5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取70mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为990r/min，以2.5ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图2所示，其中，峰1为蛇床内酯A，峰2为z-蒿本内酯。目标馏分蒸干后用氯仿挥发结晶可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％。 

实施例3 

将川芎粉碎为粗粉，取100g粗粉加入600ml90％(V/V)乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏作为进样物备用。 

从体系中选取正己烷-乙醚-乙醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上 来分离制备z-蒿本内酯和蛇床内酯A。按6∶4∶7∶3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度30℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为900r/min，以1ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图3所示，其中，峰1为蛇床内酯A，峰2为z-蒿本内酯。目标馏分蒸干后用甲醇挥发结晶可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％。 

实施例4 

将川芎粉碎为粗粉，取100g粗粉加入600ml90％(V/V)乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏作为进样物备用。 

从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备z-蒿本内酯和蛇床内酯A。按5∶5∶5∶5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为900r/min，以1.2mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图4所示，其中，峰1为蛇床内 酯A，峰2为z-蒿本内酯。目标馏分蒸干后用氯仿挥发结晶可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％。 

实施例5 

将川芎粉碎为粗粉，取100g粗粉加入600ml90％(V/V)乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏作为进样物备用。 

从体系中选取正辛烷-乙酸乙酯-乙醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备z-蒿本内酯和蛇床内酯A。按3∶4∶4∶3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度30℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为900r/min，以1.2ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图4所示，其中，峰1为蛇床内酯A，峰2为z-蒿本内酯。目标馏分蒸干后用甲醇挥发结晶可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％。 

实施例6 

将当归粉碎为粗粉，取100g粗粉加入600ml90％(V/V)乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏作为进样物备用。 

从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备z-蒿本内酯和蛇床内酯A。按2.5∶3∶7∶3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将 上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为850r/min，以1ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图4所示，其中，峰1为蛇床内酯A，峰2为z-蒿本内酯。目标馏分蒸干后用氯仿挥发结晶可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％。 

实施例7 

将当归粉碎为粗粉，取100g粗粉加入600ml90％(V/V)乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏作为进样物备用。 

从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备z-蒿本内酯和蛇床内酯A。按3∶3∶4∶3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有 

KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为900r/min，以1.6ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图4所示，其中，峰1为蛇床内酯A，峰2为z-蒿本内酯。目标馏分蒸干后用甲醇挥发结晶可得到z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％。 

Claims (7)

1.一种高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备川芎或当归粗提物作为进样物；

(2)配制构成固定相、流动相的溶剂体系，该溶剂体系由四个组分A，B，C，D组成，A组分为正构烷烃，B组分为脂肪醚或脂肪酯，C组分为脂肪醇或脂肪酮，D组分为水，将该溶剂体系混匀静置分层后，以上相为固定相，下相为流动相；所述的正构烷烃为正庚烷、正辛烷或正己烷；所述的脂肪醚为乙醚，所述的脂肪酯为乙酸乙酯；所述的脂肪醇为甲醇、正丁醇或乙醇，所述的脂肪酮为丙酮；所述的溶剂体系中A，B，C，D四个组分的体积比依次为(2.5-6)∶(3-6)∶(4-7)∶(3-6)；

(3)使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相；

(4)使其主机转动，再将流动相泵入柱内，或是固定相和流动相同时泵入柱内，再转主机；

(5)由进样阀进样，根据检测器图谱接收目标成份，经分离后可得到Z-蒿本内酯和蛇床内酯A。

2.根据权利要求1所述的高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其特征在于：所述的A组分为正己烷，所述的B组分为乙酸乙酯，所述的C组分为乙醇，所述的D组分为水。

3.根据权利要求1所述的高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其特征在于：步骤(2)至步骤(5)中，温度是15-30℃，主机转速是700-999r/min，流动相泵入柱内的流速为1.0-2.5ml/min，进样量 为1-100mg/ml。

4.根据权利要求3所述的高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其特征在于：所述的主机转速是800-999r/min，所述的流动相流速为1.0-1.5ml/min。

5.根据权利要求4所述的高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其特征在于：所述的主机转速是900r/min，所述的流动相流速为1.2ml/min。

6.根据权利要求1所述的高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其特征在于：步骤(5)完成后，经过分离后得到的Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的流分蒸干后，可以得到白色颗粒状物质，经过有机试剂多次的洗涤及包含多种有机试剂的溶液结晶，得到Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的白色片状结晶。

7.根据权利要求6所述的高纯度Z-蒿本内酯和蛇床内酯A的制备方法，其特征在于：所述的有机试剂为氯仿或甲醇。 

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