CN101756912A - 一种蛇毒凝血酶冻干粉针剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蛇毒凝血酶冻干粉针剂及其制备方法，属于生物制品制剂领域。该冻干粉针剂以蛇毒凝血酶做为有效成分，冻干保护剂由明胶、右旋糖苷-20、山梨醇组成。用作止血剂等用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛇毒凝血酶冻干粉针剂及其制备方法，属于生物制品制剂领域。
背景技术
凝血酶以纤维蛋白I为作用底物，迅速转入血管受伤部位成为纤维蛋白凝块，阻止血液自受伤部位流出。凝血过程大致分为三个阶段，即凝血因子X的激活；凝血酶原的激活；纤维蛋白原变成纤维蛋白。能使纤维蛋白原变成纤维蛋白的作用称为类凝血酶样作用；能通过激活凝血因子X及凝血酶原而发挥作用的，称为类凝血激酶样作用。蛇毒中含有丰富的蛋白酶，其中一类丝氨酸蛋白酶与蛇伤造成的血液凝固失调等毒理作用密切相关，属于凝血酶类。很多凝血酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)己经从各种蛇毒中提纯，并已先后用于制备临床用药。
自1936年首次从矛头蝮蛇毒中获得部分纯化的凝血酶以来，迄今已发现30余种蛇毒中含有凝血酶组分，并有20余种已得到分离和纯化。Holleman等用亲和层析法自巴西矛头蝮(Bothrope jararaca)蛇毒中分离纯化得到了蛇毒凝血酶，经Itoh.N.等测定，Batroxobin为单链，由230个氨基酸组成，分子量为3100。V.klobusitzky(1936)首先发现并将该酶制剂研制成止血剂Reptilase。我国进口的药物“立芷雪”即是由瑞士巴塞尔素高大药厂生产。
蛇毒凝血酶活性成分在药物制剂中的含量非常少，每支注射剂约含0.1KU-10KU(相当于0.1-10微克)，在极稀的溶液中该生物活性成分的活性空间结构很容易被破坏解聚，活性降低甚至失去活性。
制做高纯度的蛇毒凝血酶的研究多有报道，但制得的原料在制备成方便临床有效应用的制剂方面文献则相对较少。由于蛇毒凝血酶在制剂的制备及贮存过程中效价会明显下降，实际操作中，制备含蛇毒凝血酶制剂时都按照标示量的130-200％投料。结果由于高纯度蛇毒高昂的价格，一方面带来实际生产成本的增加，另一方面因效价损失的幅度不确定而使实际效价难以确定，影响产品的合格率，给生产带来很大的麻烦，更重要的是大量异源蛋白的引进使制剂免疫源性及过敏性反应发生的几率大大增加，从而影响临床用药的安全性。
发明内容
本发明人通过大量的研究，提供了一种稳定的蛇毒凝血酶冻干粉针剂，其中用作冻干保护剂的是右旋糖苷、明胶和山梨醇的组合物。
本发明冻干粉针剂能最大程度地保留蛇毒凝血酶的活性，制备及贮存过程中效价稳定，而且能够满足长期贮存的需要。
本发明冻干粉针剂解决了以下现有技术的问题：1、解决了目前蛇毒凝血酶制剂制备及贮存过程中效价明显下降的问题，这样，在制剂投料时就可以正常投料或稍微高于正常投料(110-130％)，不用像现有工艺那样按150-200％投料；2、因为高纯度蛇毒价格非常昂贵，本发明冻干粉针剂解决了现有制剂因为初始投料过高引起的成本过高的问题；3、解决了现有制剂因效价损失的幅度不确定而使实际效价难以确定，影响产品的合格率，给生产带来很大的麻烦的问题；4、解决了现有制剂中冻干保护剂配方所含白蛋白带来的成本高、并且存在潜在的被病原体，如人免疫缺陷病毒(HIV)和乙肝病毒(HBV)感染的可能、诱发某些人的免疫反应的可能等问题。
本发明冻干粉针剂采用的右旋糖苷、明胶、山梨醇组成的溶媒系统对蛇毒凝血酶等蛋白、多肽类生物活性物质结构起稳定作用、保护作用，以减少蛇毒凝血酶在制剂制备过程中发生构型、构象的改变，维持其较高活性，从而减少冻干前活性成分的投料量，在节省昂贵的高纯度蛇毒生物活性成分的同时，由于蛇毒用量的减少，也降低了临床使用中引进较多异种毒素蛋白或制剂过程产生的多肽类碎片所造成的过敏反应或其他毒副反应。
本发明中的冻干保护剂为非活性成分，含右旋糖酐、明胶、山梨醇，均为药用级辅料。
其中，明胶是胶原蛋白质的水解产物，肽分子聚合物质，为一种吸水性强、粘度高，可溶于热水，形成热可逆性凝胶。它具有极其优良的物理性质，如胶冻力、亲和性、高度分散性、低粘度特性、分散稳定性、持水性、被覆性、韧性及可逆性等。在本发明冻干粉针剂中起到冻干保护剂、稀释剂、赋型剂、冻干支撑剂的作用。在本发明冻干粉针剂中起到主要和重要的作用。
右旋糖酐、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、甘露醇都是低分子糖类，常用做生物制品冻干保护剂。
各种不同种蛇毒凝血酶均属蛋白酶类物质，其活性立体空间结构在配制溶液中很容易被破坏，降低甚至失去活性。本发明利用明胶在溶液中一定的粘度及支架作用，再配合其他小分子糖类形成冻干保护溶液，经过大量处方筛选和试验研究发明了含明胶、右旋糖苷等的蛇毒凝血酶药物组合物以降低蛇毒中生物活性酶类在制剂过程中活性的损失，并在长期存放中保持其活性稳定。
用此保护剂冻干的蛇毒凝血酶/凝血激酶等生物活性物质在制剂配制及冻干过程中效价损失低于10％，在2℃-8℃条件下，保存24个月以后，蛇毒凝血酶的生物活性不变，效价无明显下降。
本发明所提供的注射用蛇毒凝血酶药物组合物，其中蛇毒凝血酶的含量为0.5-100KU/支，优选1-10KU/支。
本发明所述的“蛇毒凝血酶”是指广义上的蛇毒凝血酶，包括但不限于以下情况：矛头蝮蛇蛇毒凝血酶、蕲蛇蛇毒凝血酶、尖吻蝮蛇蛇毒凝血酶、白眉蛇蛇毒凝血酶，也包括，通常所说的蛇毒凝血酶、蛇毒类凝血酶、蛇毒血凝酶、蛇凝血素酶、降纤酶、去纤酶、抗栓酶、蛇毒凝血酶样酶、巴曲酶、蛇毒凝血酶原、蛇毒凝血酶原激酶等从蛇毒中提取出的蛋白酶，或者以基因工程等方式人工制备的蛋白酶。
本发明所提供的注射用蛇毒凝血酶组合物为冻干粉针剂，配制成的溶液中活性成分百分含量极低属于微量成分，根据每次制剂的需要核加一定的剂量，控制其含量为标示量的110％即可。
本发明的技术方案为提供一种蛇毒凝血酶冻干粉针剂，由蛇毒凝血酶做为有效成分，冻干保护剂由右旋糖苷、山梨醇、明胶组成。
所述的冻干粉针剂各组分的配比为：
蛇毒凝血酶 1-10000KU
明胶 1-12g
右旋糖苷-20 10-40g
山梨醇 15-50g
所述的冻干粉针剂各组分的配比优选为：
蛇毒凝血酶 100-10000KU
明胶 3-9g
右旋糖苷-20 15-30g
山梨醇 30-45g
所述的冻干粉针剂各组分的配比进一步优选为：
蛇毒凝血酶 100-10000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g
所述的冻干粉针剂各组分的配比进一步优选为：
蛇毒凝血酶 1000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g
本发明所述蛇毒凝血酶冻干粉针剂的制备方法为：
制法：
1、称取处方量的明胶加水400ml加热搅拌使完全溶解；
2、称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8；
3、加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟，脱碳后再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至600ml；
4、无菌滤过加入处方量的蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.6ml/支溶液，共1000支，半压胶塞装箱放入冷冻干燥机箱进行冷冻干燥；
5、冷冻干燥参数：预冻温度-50--10℃，最优选-45℃，升温1-10℃/小时，最优选5℃/2小时，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥温度不超过15-37℃，最优选30℃；
6、干燥结束后压塞、出箱，轧盖即得制成品。
本发明中使用的蛇毒凝血酶购自市场，或可按照已有文献的方法制备，蛇毒凝血酶提取方法举例如下：
取长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)毒液的冷冻干燥品用水配成5％的溶液，离心(10000rpm，15min)取上清液，加固体硫酸铵到45％饱和度，用2mol/L氢氧化钠溶液调pH到7.0，4℃静置过夜，离心(10000rpm，15min)，收集沉淀，用pH7.5的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，用截留分子量10000的超滤器脱盐，浓缩。用DEAE-Sepharose FF层析(用PH7.5的0.01mol/LTriS-HCl缓冲液平衡)，洗脱时用含0-0.5mol/L氯化钠的pH7.5的0.01mol/LTris-HCl缓冲液直线剃度洗脱，流速0.6ml/min，208nm波长检测，部分收集，取有活性部分，适当浓缩，继续用Sephadex G-25层析，用pH7.5的0.01mol/L Tris-HCI缓冲液平衡，洗脱，取有活性部分，用截留分子量10000的超滤器脱盐、浓缩、冻干。用国家药品标准WS-XG-031-2000中所述比活力测定法检测活性组分，取比活力大于1200单位的组分。
本发明蛇毒凝血酶冻干粉针剂，1KU/支，临床主要用于止血。用于需减少流血或止血的各种医疗情况，如：外科、内科、妇产科、眼科、耳鼻喉科、口腔科等临床科室的出血及出血性疾病；也可用来预防出血，如手术前用药，可避免或减少手术部位及手术后出血。
本发明蛇毒凝血酶冻干粉针剂，大剂量，如10KU/支，可用于治疗血栓性疾病，脑栓塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血栓性疾病以及预防术后血栓再发等。
本发明蛇毒凝血酶冻干粉针剂还对肾病、红斑狼疮、病毒性肝炎及雷诺氏病等有治疗效果。
本发明冻干粉针剂(1KU/支)的用法用量为：静注、肌注：成人1.0-2.0KU，儿童0.3-1.0KU。紧急出血，立即静注1KU，同时肌注1KU。手术前后，术前1hr肌注1KU或术前15min静注1KU，术后肌注1KU/日，连用3日。
以下是本发明冻干粉针剂配方的的筛选过程：
处方筛选情况：同样的主药效价，不同的赋型剂、冻干保护剂配方，相同的生物制品冻干条件下，不同处方的冻干保护效果。各处方均配制100ml溶液，凝血酶500KU，分装100瓶，冻干前理论效价均为5KU/支。
本发明中使用的蛇毒凝血酶其测定方法参照国家药品标准WS1-XG-031-2000。使用的右旋糖苷-20、山梨醇及明胶为市售药用注射级辅料；本发明所提到的水是指注射用水。本发明凝血单位参考立芷雪单位定义。
评价该组合物冻干前后活性成分的效价变化，参照中国药典2005年版三部附录VIB方法；其他制剂水分及pH值测定按照中国药典内的相关办法；溶解性测定方法：取10支该组合物制品，每支用1ml生理盐水溶解，记录各支完全溶解成澄清透明的溶液的时间，取这10支制品溶解时间的平均值做为该批次制剂的溶解时间。
KU(克氏单位)：一个克氏单位指在体外37℃下，使1ml标准人血浆在60±20秒内凝固的血凝酶活性量。
表1：第一次处方筛选
| 处方编号 | 右旋糖酐 | 山梨醇 | 葡萄糖 | 蔗糖 | 5％Na2HPO4 | 海藻糖 | 明胶 | 乳糖 |
| 处方1 | 4 | _ | - | 6 | - | 1 | - | |
| 处方2 | 4 | 6 | - | - | - | 1 | - | |
| 处方3 | 5 | - | - | - | 5 | 1 | - |
| 处方编号 | 右旋糖酐 | 山梨醇 | 葡萄糖 | 蔗糖 | 5％Na2HPO4 | 海藻糖 | 明胶 | 乳糖 |
| 处方4 | _ | - | - | - | 100ml | - | 1 | - |
| 处方5 | 4 | - | 6 | - | - | - | 1 | - |
| 处方6 | 4 | - | - | 6 | - | - | 1 | - |
| 处方7 | 6 | - | 4 | 4 | - | - | 1 | - |
| 处方8 | 4.5 | - | 5 | 5.5 | - | - | 1 | - |
| 处方9 | 5 | - | - | - | - | - | 1 | 5 |
将以上9批样品分装1ml/支，半压胶塞置冻干机中进行冻干。
表2：第一次处方筛选结果(冻干时间38h)
| 处方 | 处方1 | 处方2 | 处方3 | 处方4 | 处方5 | 处方6 | 处方7 | 处方8 | 处方9 |
| 名称 | |||||||||
| 冻干前效价 | 5KU | 5KU | 5KU | 5KU | 5KU | 5KU | 5KU | 5KU | 5KU |
| 冻干后效价 | 4.2KU | 4.8KU | 4.0KU | 1.2KU | 1.9KU | 4.0KU | 2.4KU | 3.6KU | 3.0KU |
| 水分 | 0.3％ | 0.4％ | 0.3％ | 0.4％ | 0.4％ | 0.5％ | 0.3％ | 0.4％ | 0.2％ |
| 外观 | 块状物 | 块状物 | 块状物 | 块状物 | 块状物 | 块状物 | 块状物 | 块状物 | 块状物 |
| 溶解性 | ＞5min | ＞5min | ＞5min | 2min | ＞5min | ＞5min | ＞5min | ＞5min | ＞5min |
| 溶解后pH值 | 6.7 | 6.6 | 6.9 | 6.7 | 6.8 | 6.6 | 6.7 | 6.8 | 6.6 |
在第一次处方筛选中，1号、2号、3号及5号处方，同时含有明胶和右旋糖苷的情况下(另外分别含有蔗糖、山梨醇、海藻糖等小分子糖)，冻干保护效果较好，效价保留较高。但制品外观块状不蓬松，不太理想；另外，成品溶解时间较长，不够理想。
为确定最佳处方，继续进行第二次处方及工艺优化。
表3：第二次处方筛选和筛选结果(冻干时间27h)
注：效价损失率＝(冻干前效价-冻干后效价)/冻干前效价×100％
在第二次处方筛选中，所得样品溶解时间较理想，低于3分钟。冻干保护液配方中，在同时含有明胶和右旋糖苷的情况下，另外的组分中以分别含有蔗糖、山梨醇、甘露醇的配方冻干保护效果较好，效价保留较高。
为确定最佳处方，继续进行第三次处方筛选：
经过第三次处方筛选试验，处方16最理想，即明胶1％，右旋糖酐4％，山梨醇6％，该配方是将生物活性的蛇毒凝血酶制备成稳定的冻干粉针剂的理想保护组合物溶液配方，此配方冻干过程中效价损失最小。
进一步筛选有效成分与冻干保护剂之间的最佳比例：
配方A：
处方组成 每1000支用量
蛇毒凝血酶 1000KU
明胶 6g
右旋糖酐-20 24g
山梨醇 36g
称取处方量的明胶加水400ml加热搅拌使完全溶解；称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8。加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟脱碳，再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至600ml，无菌滤过加入蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.6ml/支溶液于西林瓶中，半压胶塞置入冻干机中进行冷冻干燥操作。
配方B：
处方组成每 1000支用量
蛇毒凝血酶 1000KU
明胶 9g
右旋糖酐-20 36g
山梨醇 54g
称取处方量的明胶加水700ml加热搅拌使完全溶解；称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8。加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟脱碳，再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至900ml，无菌滤过加入蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.9ml/支溶液于西林瓶中，半压胶塞置入冻干机中进行冷冻干燥操作。
冷冻干燥：
两种制备方法理论灌装量均为1000支，冻干前理论效价5KU/支。
预冻温度-45℃，升温5℃/2小时，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥温度不超过30℃，干燥结束后压塞、出箱，轧盖。
表5：两种配方的比较
| 配方 | 冻干时间 | 外观 | 水分(％) | 溶解时间(min) | 冻干前效价(KU) | 冻干后效价(KU) | 效价损失(％) |
| A | 24h | 类白色疏松体 | 0.6 | 1.5 | 5 | 4.6 | 9 |
| B | 28h | 类白色疏松体 | 0.9 | 2.8 | 5 | 4.5 | 10 |
根据以上筛选结果，配方A的每支有效成分冻干效价损失在10％之内的基础上，减少辅料用量，每支分装0.6ml进行冻干，冻干效果明显较好，冷冻干燥时间缩短，且获得了整齐的类白色疏松体，溶解时间在2分钟以内，效果最为理想。所以：
蛇毒凝血酶 1000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g
是筛选获得的最优配方。在此配方的基础上制备方法中优选加水至600ml，共1000支，0.6ml/支。
评价本发明冻干粉针剂的长期稳定性：
评价该组合物的长期稳定性的方法为：取3批样品，分别于2-8℃条件下放置，在放置前和放置期间的第3个月、6个月、9个月、12个月、18个月和24个月末取样，检查3批样品的外观、pH值、水份、溶液的澄清度与颜色、无菌、热原和效价等各项参数。外观、pH值、水份、溶液的澄清度与颜色、无菌、热原和效价等的检测方法均按照中国药典规定的方法进行。
用本发明的方法制备的蛇毒凝血酶冻干粉针制剂，按照蛋白质的冻干曲线冻干，于4℃贮藏长达并包括36个月。从开始贮藏起的0、1、3、6、9、12、18、24和36个月，随即选取等分试样，并做效价及无菌、热原、水分测定。
下表列出不同时间点取出的等分试样的测试结果。这些结果显示，根据本发明制备的制剂是稳定的，表1说明，当在4℃贮藏至少36个月时，效力在贮藏时间为零时所记录的效价范围内(1KU士20％/支)。
表6：14℃时制剂的稳定性
| 贮藏时间(月) | 效价(KU/支) | 无菌 | 热原 | 水分 |
| 0 | 1.1 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 1 | 1.0 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 3 | 1.1 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 6 | 1.0 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 9 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 12 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 18 | 1.0 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 24 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 36 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
表7显示蛇毒凝血酶冻干粉针制剂在25℃贮藏的稳定性。结果显示，在该制剂下25℃稳定至少1年，其证据是，在25℃贮藏6个月后，平均效价仍在规定之内(1KU士20％/支)。
表7：25℃时制剂的稳定性
| 贮藏时间(月) | 效价(KU/支) | 无菌 | 热原 | 水分 |
| 0 | 1.0 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 1 | 1.1 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 3 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 6 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 9 | 1.0 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 12 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 18 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 贮藏时间(月) | 效价(KU/支) | 无菌 | 热原 | 水分 |
| 24 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 36 | 0.9 | 合格 | 合格 | 合格 |
本发明的蛇毒凝血酶冻干粉针的冻干保护剂能提供介于pH5和pH6.8之间的缓冲范围及由液体溶液冻干制成可贮藏的粉针剂时使蛇毒凝血酶效价损失低于20％。本发明的蛇毒凝血酶冻干粉针能以固体形式，在介于-20℃～7℃的温度下保持稳定至少1年。
通过以下实验检验本发明不同蛇种凝血酶冻干粉针剂的制剂效果：
用本发明方法制备巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)凝血酶冻干粉针剂和长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)凝血酶冻干粉针剂。
表8：不同蛇种凝血酶与本冻干保护液组合物冻干效果比较
| 不同蛇种凝血酶 | 外观 | 水分(％) | 溶解时间(min) | 冻干前效价(KU) | 冻干后效价(KU) | 效价损失(％) |
| 巴西矛头蝮蛇(Bothropsatrox)蛇毒凝血酶 | 类白色疏松体 | 0.9 | 1.4 | 5 | 4.7 | 9 |
| 长白山白眉蝮 | 类白色疏松体 | 0.8 | 1.4 | 5 | 4.5 | 10 |
| 蛇(Agkistrodonhalys)蛇毒凝血酶 |
试验结果表明，不同来源、分子量不同的蛇毒凝血酶使用本发明的冻干保护剂配方和制备方法制备，冻干过程效价损失均很低，说明了，本发明的配方适合于目前常用的任何种类的蛇毒凝血酶。
在药品生产和临床应用中，本发明具有重要的实际意义和可操作性。
具体实施方式
下面以具体实施例来详细说明本发明所提供的一种供注射用的蛇毒凝血酶冻干粉针剂及其制备方法，以下非限制性实施例的目的是为了更好地说明本发明的内容，并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1：
配方：
巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒凝血酶1000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g
制法：
1、称取处方量的明胶加水400ml加热搅拌使完全溶解；
2、称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8；
3、加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟，脱碳后再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至600ml；
4、无菌滤过加入处方量的蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.6ml/支溶液，共1000支，半压胶塞装箱放入冷冻干燥机箱进行冷冻干燥；
5、冷冻干燥参数：预冻温度-45℃，升温5℃/2小时，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥温度30℃；
6、干燥结束后压塞、出箱，轧盖即得制成品。
实施例2：
配方：
长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒凝血酶1000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g
制法：
1、称取处方量的明胶加水400ml加热搅拌使完全溶解；
2、称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8；
3、加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟，脱碳后再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至600ml；
4、无菌滤过加入处方量的蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.6ml/支溶液，共1000支，半压胶塞装箱放入冷冻干燥机箱进行冷冻干燥；
5、冷冻干燥参数：预冻温度-45℃，升温5℃/2小时，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥温度30℃；
6、干燥结束后压塞、出箱，轧盖即得制成品。
实施例3：
配方：
巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒凝血酶10000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g
制法：
1、称取处方量的明胶加水400ml加热搅拌使完全溶解；
2、称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8；
3、加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟，脱碳后再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至600ml；
4、无菌滤过加入处方量的蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.6ml/支溶液，共1000支，半压胶塞装箱放入冷冻干燥机箱进行冷冻干燥；
5、冷冻干燥参数：预冻温度-45℃，升温5℃/2小时，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥温度30℃；
6、干燥结束后压塞、出箱，轧盖即得制成品。
实施例4：
配方：
长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒凝血酶10000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g
制法：
1、称取处方量的明胶加水400ml加热搅拌使完全溶解；
2、称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8；
3、加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟，脱碳后再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至600ml；
4、无菌滤过加入处方量的蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.6ml/支溶液，共1000支，半压胶塞装箱放入冷冻干燥机箱进行冷冻干燥；
5、冷冻干燥参数：预冻温度-45℃，升温5℃/2小时，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥温度30℃；
6、干燥结束后压塞、出箱，轧盖即得制成品。
通过以下试验例进一步验证本发明蛇毒凝血酶冻干粉针剂的作用
试验例：本发明蛇毒凝血酶冻干粉针剂对家兔全血的促凝作用与立芷雪比较
实验动物：日本大耳白家兔，体重2-3公斤，雌雄各半。
家兔72只，分成4组，每组18只，第1组为本发明实施例1组，第2组为本发明实施例2组，第3组为立芷雪(英文名：Reptilase；通用名：注射用血凝酶；生产公司：瑞士素高药厂；购自市场)组，1、2、3组剂量均为2KU/kg.BW，第4组为空白对照，2ml/kg.BW生理盐水.各组静脉注射15分钟后，测定家兔出血时间和凝血时间(出血时间测定采用DuKe氏法-实用医学检验学P116；凝血时间测定采用玻片法-实用医学检验学P129)。结果如表结果如表9所示：
表9家兔出血时间及凝血时间测定结果
与空白对照组相比较：*p＜0.01；**p＜0.01；**p＜0.01；****p＜0.01；与立芷雪组相比较：***p＜0.05；
从表9的数据可以看出，实施例1组和实施例2组家兔出血时间及凝血时间明显短于空白对照组，并且作用优于立芷雪。
Claims (8)
1.一种蛇毒凝血酶冻干粉针剂，其特征在于，由蛇毒凝血酶做为有效成分，冻干保护剂由明胶、右旋糖苷-20、山梨醇组成。
2.根据权利要求1所述的冻干粉针剂，其特征在于，各组分的配比为：
蛇毒凝血酶 1-10000KU
明胶 1-12g
右旋糖苷-20 10-40g
山梨醇 15-50g。
3.根据权利要求1所述的冻干粉针剂，其特征在于，各组分的配比为：
蛇毒凝血酶 100-10000KU
明胶 3-9g
右旋糖苷-20 15-30g
山梨醇 30-45g。
4.根据权利要求1所述的冻干粉针剂，其特征在于，各组分的配比为：
蛇毒凝血酶 100-10000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g。
5.根据权利要求1所述的冻干粉针剂，其特征在于，各组分的配比为：
蛇毒凝血酶 1000KU
明胶 6g
右旋糖苷-20 24g
山梨醇 36g。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的冻干粉针剂，其特征在于，所述蛇毒凝血酶为巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒凝血酶或长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys)蛇毒凝血酶。
7.权利要求1-5中任意一项所述的冻干粉针剂的制备方法为：
1)称取处方量的明胶加水加热搅拌使完全溶解；
2)称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8；
3)加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附，脱碳后再用0.22μM滤膜过除菌过滤，放至室温加注射用水定容；
4)无菌滤过加入处方量的蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装溶液，半压胶塞装箱放入冷冻干燥机箱进行冷冻干燥；
5)干燥结束后压胶塞、出箱，轧盖即得制成品。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
1)称取处方量的明胶加水400ml加热搅拌使完全溶解；
2)称取处方量的右旋糖酐和山梨醇，加入到上述溶液中，搅拌使完全溶解，并用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值为6.8；
3)加热煮沸后加入适量活性炭保温吸附30分钟，脱碳后再用0.22μM的滤膜过滤，放至室温加注射用水定容至600ml；
4)无菌滤过加入处方量的蛇毒凝血酶，混合均匀后，定量灌装0.6ml/支溶液，共1000支，半压胶塞装箱放入冷冻干燥机箱进行冷冻干燥；
5)冷冻干燥参数：预冻温度-45℃，升温5℃/2小时，真空度控制0.025-0.05Torr，1mV＝0.5Torr，再干燥温度30℃；
6)干燥结束后压胶塞、出箱，轧盖即得制成品。
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