CN101724610A - 等电等电荷法提取动物血(猪血)中的sod酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从猪血中提取SOD酶的方法，该方法根据猪血中主要蛋白质间等电点电荷存在较大差异特点，而进行分离的一种方法。本法将除去黄色血浆和血红蛋白球渗出的血红蛋白等处理液，用缓冲剂调正pH值为6±，用单宁使其沉淀析出、弃除。继续用保持其该电荷的处理液，用1/2体积的724弱酸性阳离子树脂进行吸附除去残留血红蛋白，残余杂质再用丁醇一磷酸二氢钾混合液处理，并用68℃热处理20min，然后将SOD沉淀物用去离子水稀释，丁醇沉淀反复数次，以除去试剂残留量，再用8％的氯化铜液在处理液每100ml容积中加入1-2毫升，以弥补丢失的铜离子，最后用真空冷冻干燥，得白色微蓝色SOD酶制剂。

Description

等电等电荷法提取动物血(猪血)中的SOD酶

技术领域

本发明涉及从猪血中提取SOD酶的处理方法。该方法根据血中主要蛋白质间等电点电荷存在较大差异特点而进行分离的一种方法。

背景技术

从动物血中制取SOD酶的技术早于1969后由Mccord和Fridovich第一次从动物血中所提取。这一技术是目前国内外从动物血中制取SOD酶的普遍做法。但这一技术所用试剂氯仿、丙酮具有刺激性强，不宜在较高温度下操作。本发明试剂可以在较高温度下进行，所用试剂或价格低廉，或用量少，或可以回收循环利用特点。完全可以取代Mccord法得到相应效果。

此一技术，原则上也适用于对各种生物具有已知等电点蛋白的分离。包括各种酶、蛋白类激素、各种细胞蛋白包括免疫球蛋白、以及各种特异性蛋白的分离等等。

对于SOD酶的分离，业界人士一般均认为较难提取，原因是分离时外界因素对其有一定影响：首先是温度，它在气候较高时则损害其活性；但却耐受较短时间的高温；其次是酸碱度，它的活力适合范围是PH：6-9。6以下越呈酸性，对活力影响越大。因而本发明充分考虑到这一特点相结合的一种分离方法。

发明内容

1、分离除去血浆

取新鲜猪血加入3.8％柠檬酸三钠抗凝剂，新鲜血液与抗凝剂之比为3∶1，搅拌均匀，以4000r/min离心10-15min，初步除去黄色血浆，收集红细胞。

红细胞中加放3倍体积的生理盐水，分三次，每次离心15min，继续除去黄色血浆及其悬浮物液。

2、红血球的破裂和血红细胞的渗出

加入同体积的去离子水，剧烈搅拌15min，在室温下迅速放入冰箱30min(≥-15℃)取出，在室温下剧烈搅拌15min，再放置冰箱30min(3℃-5℃)取出。

3、分离除去血红蛋白类杂质

(1)等电点电荷单宁沉淀法

a、NaH₂PO₄·2H₂O缓冲液(PH：5.5)的制备：将NaH₂SO₄·2H₂O-Na₂HPO₄·2H₂O配成0.2M浓度的溶液各1000ml，配成PH：5.5缓冲液备用。

b、血红蛋白的分离：将处理液用PH计测试(这时测得的数值大致为PH：6.5-6.9)，按处理液体积缓慢加入缓冲液(PH：5.5)，边加边拌，直到为PH：6±。搅拌30min，这时血红蛋白带正电荷，将单宁以每100毫升加入0.8-2g，血红蛋白被沉淀，以6000r/min离心弃除。

c、离子吸附法：测处理液的PH值继续保持PH：6，然后加入1/2体积的724弱酸性阳离子交换树脂，混合均匀，低温搅拌2-4小时，使其达到平衡。停止搅拌，取未被吸附的清液。

4、分离、弃去剩余杂质：

a、丁醇-K₂HPO₄·3H₂O的制备：将以上滤液按体积加入重量为38％的磷酸氢二钾(磷酸氢二钾先调成糊状)，充分搅拌15min，再加入体积15％的丁醇，搅拌均匀，置于3℃-5℃冰箱内，静置15min到1小时。

b、取出静置后，可以观察到溶液分4层：最上层为丁醇液，次上层为悬浮杂质层，次下层为磷酸氢二钾层，最下层为沉淀杂质层。

将此容器内容物用人造沸石过滤，滤除杂质以后6000r/min离心分离15min除沉淀物，再将上清液倒入分液漏斗内。这时可以见到内容物分上下层，上层为丁醇液(不含SOD)，下层为清液，取下层液于烧杯中。

(2)除去各种杂质——热沉淀

将以上溶液放入加热到68℃的水浴锅20min，取出在室温下迅速冷却，以滤纸过滤，除去沉淀物。

5、除去所用试剂残余量及弥补铜离子丢失：

a、将以上过滤后的溶液加入1.5倍体积的丁醇，搅拌后置于3℃-5℃冰箱内很快沉淀，经抽滤得白色沉淀物，b、沉淀物再用10倍体积的去离子水溶化，在每100ml中加入8％的氯化铜液1-2毫升。拌匀；c、再在此一溶液中重复用1.5倍丁醇沉淀抽滤，得白色稍带蓝色沉淀物，(丁醇可回收利用)。

6、真空冷冻干燥

取沉淀物进行真空冷冻干燥，此即为SOD粉剂。

具体实施方式

一、在1000毫升普通清洁水中，加入38克柠檬酸三钠，配成3.8％的浓度待用。采新鲜猪血1800毫升，加入600毫升上述溶液，搅拌均匀，以4000r/min离心10分钟，弃去沉淀，收集上层液，在此溶液中加入5000毫升三倍左右的生理盐水。同样4000r/min离心10分钟，收集上清液，继续二次，每次以同一方法，分离除去黄色沉淀的血液。得1500毫升血红溶液。

二、为了使此1500毫升血红细胞中含有大部分的血红蛋白沉淀弃去。已知血红蛋白的等电点为PH：7.2，因此用NaH₂PO₄·2H₂O-Na₂HSO₄·2H₂O缓冲液配成PH：5.5的酸性液1000毫升，逐次少量加入到1500毫升血红球溶液中，待溶液加入0.8％的单宁，搅拌30min，血红蛋白与单宁结合成单宁-血红蛋白沉淀，用6000r/min离心除去沉淀，取上层液。

三、由于猪血SOD酶的等电点是PH：4.8有必要将PH：6以上的蛋白进一步除去，因此将以上接近2000毫升的PH：6的溶液加入1000毫升724弱酸性阳离子交换树脂，混合均匀后，搅拌4小时，这时PH：6以上血红蛋白等杂质已被树脂吸附，而SOD在溶液中呈碱性，故未被吸附倒出。

四、丁醇-磷酸氢二钾混合液去杂：SOD酶极易溶化于磷酸氢二钾液中，而不溶于15％较低浓度中，但丁醇可以除去脂类物质。将以上所得1800毫升处理液加入680克K₂HPO₄·3H₂O及15％270毫升丁醇，充分搅拌40分钟，(K₂HPO₄·3H₂O事先粉细)，放入冰箱30分钟后，取出用人造沸石过滤，滤液用6000r/min离心除沉淀物，倒入分液漏斗，取下层清液而弃除丁醇液。(所得本醇待后用蒸法回馏收回)

五、为了进一步除去其他蛋白残余杂质，将上述下层清液加热到68℃水浴锅20分钟，这时，有微量杂质用滤纸过滤除去。

六、将过滤所得1900毫升清液按体积1.5倍加入3000毫升丁醇，搅拌后放置3℃-5℃冰箱半小时，可见白色的SOD酶约10克沉淀，将此酶液抽滤，用10倍去离子水稀释后得约10毫升处理液，为了弥补失去的铜离子，以每100毫升中加入8％氯化铜1-2毫升，拌匀溶化后，再加入1/2体积的丁醇，立即见有白色微带蓝色的沉淀物——Cu-SOD酶，将此酶用真空冷冻干燥，得3.8克白色微带蓝色的SOD酶粉剂制品。

Claims (5)

1.一种从猪血中提取SOD酶的方法，其特征在于：

a、它是用非刺激性有机物进行沉淀分离的的一种方法，它所用试剂如单宁丁醇等都是一种对SOD酶无损害的、温和的溶剂。

b、试剂价格低廉，虽丁醇较昂贵，但可回收循环使用。

2.一种从猪血中提取SOD酶的方法，其特征在于：以该酶蛋白的等电点PH：4.6-4.8为中心，将其他非该蛋白等电点电荷的蛋白进行弃除的方法。

a、由于血中的主要成份是血红蛋白，其除去方法是：用缓冲剂调正处理剂的PH值为6±，这时血红蛋白呈正离子，将单宁以一定量比例投入拌匀，红血蛋白以结合物的形式沉淀，离心弃去之。

b、为了进一步除去≥PH：6的杂蛋白及其未被除尽的血红蛋白，继续采用1/2体积的724弱酸性阳离子交换树脂进行吸附，二者拌合后继续搅拌2-4小时，使之达到平衡，吸附结束，将未被吸附的含有SOD酶的溶液倒出，进行下一步分离。

3.分离弃去其他剩余物质

a、为了除去猪血中含非蛋白的脂类物质，用丁醇-磷酸氢二钾混合液继续清除。方法是：在溶液中加入处理量15％的丁醇和38％的磷酸氢二钾，二者混合，充分搅拌15min，在冰箱中静置15分钟-1小时，将杂质用人造沸石滤除，得过滤液。

b、热沉淀：由于SOD酶的耐热性在短时间内较强，将上述滤液放入68℃水浴锅中加热20min，并在室温下迅速冷却，将其他杂蛋白除去。

4.除去所用试剂残余量及弥补铜离子丢失。

由于经过权利2中要求的处理，尚存留试剂残余量，须除去，同时，为弥补SOD酶中的铜离子丢失，须补足。故最后按每100ml处理量用1.5倍的丁醇沉淀抽提得白色SOD酶后，将酶液再用10倍的去离子水溶化，每100ml加入该体积8％的氯化铜液1.2毫升，搅拌，使溶液微呈蓝色，然后现加入该体积1.5倍的丁醇再沉淀抽取一次，得到略呈微蓝白色的带铜离子的SOD酶(残留试剂杂质扩散于处理液中弃除)。用真空冷干燥之，即为含铜离子的微蓝白色SOD酶粉剂。

5.此技术原则上适用于对各种生物具有已知等电点蛋白的分离，包括各种酶、蛋白类激素、各种细胞蛋白包括免疫球蛋白、以及各种特异性蛋白的分离等等。