CN101723805A - 一种生物转化法制备天然2-苯乙醇的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物转化法制备天然2-苯乙醇的分离方法，所述方法包括：(1)取含有2-苯乙醇的发酵液，除去酵母细胞得到含有2-苯乙醇的发酵清液；(2)发酵清液通过苯乙烯系大孔吸附树脂填充柱；(3)以蒸馏水淋洗树脂柱除杂，再以75～100％的丙酮溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，去除洗脱剂和水分，得到2-苯乙醇。本发明的有益效果主要体现在：操作步骤少，设备要求简单，材料消耗少，生产成本低等优点，而且整个过程不需要使用有毒溶剂，无有机污染物排放，有较高的工业化应用可行性。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种生物转化法制备天然2-苯乙醇的分离方法，具体地说，涉及一种用大孔树脂从酵母细胞转化L-苯丙氨酸的发酵液中吸附分离天然2-苯乙醇的方法。
(二)背景技术
2-苯乙醇(2-phenylethanol)是一种具玫瑰气味的芳香醇，天然存在于玫瑰、茉莉、百合和丁香等多种植物的精油中。2-苯乙醇的玫瑰香气非常受人欢迎，使其成为多种香精常用的组分。自1876年在玫瑰及其他精油中发现2-苯乙醇以来，人们已开发出多种化学方法合成2-苯乙醇。目前市场上出售的2-苯乙醇基本上都是化学合成品，纯度已能达到了较高水平，价格也较便宜，广泛用于调配日化用品和食品的香精。随着生活水平的提高和健康意识的增强，人们越来越青睐无污染的天然产品。从玫瑰等植物精油中提取天然2-苯乙醇，由于原料来源不足难以满足市场需求。近年来，采用生物转化法生产天然2-苯乙醇成为了研究热点并取得可喜的研究成果。生物转化法生产天然2-苯乙醇，就是以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为前体，由酵母细胞将其转化为2-苯乙醇。由此生产的2-苯乙醇，按欧洲立法规定，可以归属为天然产品，是取代从玫瑰或其它植物精油中提取的天然的2-苯乙醇最佳选择，而且生产过程避免了化学合成中的高温高压、易燃易爆和环境污染大等缺点，顺应现代绿色化工发展的趋势，具有广阔的开发前景和工业化应用价值。
生物转化制备2-苯乙醇的发酵过程结束后，需要采用某种生化分离方法从发酵液中分离2-苯乙醇产品。设计一个生化产品分离与纯化过程时，不能一味追求高收率或高纯度，应综合考虑产品规格、生产规模、物料组成和产品的形式等因素，统筹兼顾地确定适用于特定产品的分离纯化方法。采用生物转化法制备天然2-苯乙醇，其主要应用领域是用作食品或日化用品的调香添加剂；从产品的质量来看，只要没有不良气味物质存在，不必过高追求其纯度水平，况且发酵液中存在由酵母细胞产生的杂醇油，如提取到产品中，具有与2-苯乙醇的香气协和增效的作用；从生产规模来看，天然2-苯乙醇的市场需求很大，如工业化生产，料液处理量大，转化发酵液体中的菌体可采用离心或板框过滤除去，后续的分离方法必须能够适用于大规模工业化应用。
应用大孔树脂进行分离的技术是20世纪60年代末发展起来的继离子交换树脂后的分离新技术之一。大孔树脂的孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，由于具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、节省费用等诸多优点，特别适合于水溶液中化合物的分离。结合2-苯乙醇产品目标及其的理化性质，可以看出，采用大孔树脂吸附法是分离2-苯乙醇的一种理想方法。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种生物转化法制备天然2-苯乙醇的分离方法。
本发明采用技术方案如下：
一种生物转化法制备2-苯乙醇的分离方法，所述方法包括：(1)取含有2-苯乙醇的发酵液，除去酵母细胞得到含有2-苯乙醇的发酵清液；清液可以经过浓缩，也可以不经过浓缩，待分离的清液中2-苯乙的浓度范围为1g/L～5g/L。清液的pH可以采用HCl或NaOH调节至5.5，也可以不经过调节。(2)发酵清液通过苯乙烯系大孔吸附树脂填充柱；(3)以蒸馏水淋洗树脂柱除杂，再以75～100％的丙酮溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，去除洗脱剂和水分，得到2-苯乙醇。
所述苯乙烯系大孔吸附树脂为常规市售的各种聚苯乙烯系的非极性大孔树脂，它们的比表面积一般要在500m2/g以上，优选为下列之一：Amberlite XAD-4、HP-20、HP-21、HP-30、HP-40、D101、H1020、NKA、D4020、H103或X-5。大孔树脂初次使用时通常需要经过预处理，重复使用时需要经过再生。
优选的，步骤(3)洗脱溶剂为85～100％的丙酮，体积用量为3～10BV(树脂柱体积)，洗脱流速为2～10BV/h(树脂柱体积/小时)。
所述步骤(2)中，发酵清液通过苯乙烯系大孔吸附树脂填充柱的体积≤10BV，流速≤10BV/h。
所述步骤(3)中，所用蒸馏水体积≤15BV，淋洗流速为5～10BV/h。
所述步骤(3)中，去除溶剂和水分的方法如下：先40℃、0.1MPa蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出。
所述发酵清液的pH可以采用HCl或NaOH调节至5.5，也可以不经过调节。
所述含有2-苯乙醇的发酵液由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生物催化L-苯丙氨酸得到，具体参见中国专利CN 101157940A。
具体的，所述方法如下：
(1)以L-苯丙氨酸为底物、酿酒酵母为催化剂，于25～30℃转化18～24h，得到含有2-苯乙醇的发酵液；
(2)发酵液经过离心、过滤或自然沉淀除去酵母细胞，得到发酵清液；发酵清液可以经过浓缩，也可以不经过浓缩，其中的2-苯乙醇浓度范围为1～5g/L。发酵清液的pH可以采用HCl或NaOH调节至5.5，也可以不经过调节。
(3)苯乙烯系大孔吸附树脂预处理后装柱，填充的高度一般为层析柱高度的70％～80％；预处理方法如下：先用蒸馏水洗去树脂的漂浮杂质，然后用体积分数为95％的乙醇浸泡过夜，再用蒸馏水洗净树脂中的乙醇，然后用1mol/L的HCl溶液浸泡过夜，而后用蒸馏水洗至pH为中性，接着1mol/L的NaOH溶液浸泡过夜，而后用蒸馏水洗至pH为中性；层析柱的大小以及树脂填充的体积大小可以根据分离规模而选择。市场上的10mm×300mm、16mm×300mm、26mm×400mm、35mm×500mm等型号的层析柱均可用。
(4)将≤10BV体积的转化发酵清液以≤10BV/h的流速通过大孔树脂填充柱；
(5)用蒸馏水淋洗树脂填充柱，洗去转化发酵清液中残余的培养基组分以及酵母细胞的代谢产物等各种未被树脂吸附的极性成分；蒸馏水的体积≤15BV，淋洗的流速为5～10BV/h；
(6)以3～10BV体积的浓度为75％～100％的丙酮为洗脱剂进行洗脱，收集全部洗脱液，洗脱剂上柱的流速为2～10BV/h；
(7)将含2-苯乙醇的洗脱液，先在40℃、0.1Mpa条件下蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，得2-苯乙醇。
采用本发明分离生物转化法制备天然2-苯乙醇，产品的纯度一般为80％～90％，收率一般为50％～87％。一般情况下，兼顾2-苯乙醇的纯度和收率，选择合适的条件，两者均可达到85％以上。
本发明的有益效果主要体现在：操作步骤少，设备要求简单，材料消耗少，生产成本低等优点，而且整个过程不需要使用有毒溶剂，无有机污染物排放，有较高的工业化应用可行性。
(四)附图说明
图1为本发明的方法工艺流程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明中大孔树脂的预处理或再生的方法为：先用蒸馏水洗去树脂的漂浮杂质，然后用体积分数为95％的乙醇充分浸泡过夜，再用蒸馏水洗净树脂中的乙醇，然后用酸碱处理，即用1mol/L的HCl溶液浸泡过夜，而后用蒸馏水洗至pH为中性，接着1mol/L的NaOH溶液浸泡过夜，而后用蒸馏水洗至pH为中性。
本发明中-苯乙醇浓度分析采用高效液相色谱法，具体方法为：高效液相色谱为岛津LC-20AD型，SPD-20A紫外检测器，色谱柱为VP-ODS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶水＝50∶50，流速1mL/min，检测波长260nm。样品经适当倍数稀释和0.45μm微孔滤膜过滤后进行液相色谱分析，进样量10μL。
本发明中使用过的大孔树脂按预处理方法进行再生重复使用；减压蒸馏时流出的丙酮可以回收重复使用。
实施例1：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)所用培养基组成如下：
平板培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉3g/L，2-苯乙醇3g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。
斜面培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。
种子培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。
转化培养基：蔗糖100g/L，酵母浸出粉5g/L，KH2PO47.5g/L，K2HPO4·3H2O 12.6g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。
将冰箱保存的酿酒酵母斜面菌种(安琪酒精活性干酵母的培养物，湖北安琪酵母股份有限公司生产，批号051225)挑取一满环菌体，接种于新鲜斜面培养基，斜面于30℃生化培养箱中培养基24h，得活化的酿酒酵母菌株斜面。从活化的菌种斜面中挑取2～4环菌体到装有100mL种子培养基的500mL的三角瓶中，种子培养基于30℃恒温振荡摇床中，200r/min振荡培养24h，取样测种子液菌体浓度，稀释20倍后OD660＝0.417，得到符合要求的酿酒酵母种子液。5L机械搅拌通用型发酵罐装转化培养基3.5L，121℃离位灭菌30min。待发酵罐进入稳定运行状态后，接入350mL上述种子液，再加入35g的L-Phe固体粉末。设定培养温度30℃，搅拌转速为400～500r/min，通气量设定为0.6～1v/v，转化过程中搅拌转速和通气量随溶氧下降情况而逐步调高，保证溶氧饱和度大于70％。转化培养18～24h结束，获得含有2-苯乙醇的转化发酵液。
实施例2：
200mL按实施例1方法获得的转化发酵液经过4500r/min离心15min，收集离心杯中的上清液。上清液的pH测定值为5.5，不经调节。液相色谱测定2-苯乙醇的浓度为4.63g/L。
本例实施选用的大孔树脂为D101(南开大学化工厂生产，粒度0.32mm～1.25mm，比表面积500m2/g～580m2/g)，经过预处理的D101填充10mm×300mm的层析柱，填充高度为250mm，树脂床体积为20mL。装好后，填充柱用200mL蒸馏水淋洗好后备用。
取110mL上述2-苯乙醇发酵清液，以5BV/h流速通过大孔树脂填充柱后，直接用60mL的75％丙酮进行洗脱，流速为5BV/h，收集全部洗脱液，液相色谱测定洗脱液中2-苯乙醇浓度，计算得2-苯乙醇的收率为87.4％。洗脱液在40℃、0.1Mpa条件下蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，得天然2-苯乙醇产品，取0.1000g的2-苯乙醇样品用95％乙醇定容到25mL，液相色谱法测定2-苯乙醇浓度，样品纯度达到82.7％。
实施例3：
200mL按实施例1方法获得的转化发酵液经过4500r/min离心15min，收集离心杯中的上清液。上清液的pH测定值为5.5，不经调节。液相色谱测定其的2-苯乙醇浓度为4.73g/L。
本例实施选用的大孔树脂为D101(南开大学化工厂生产，粒度0.32mm～1.25mm，比表面积500m2/g～580m2/g)，经过预处理的D101填充10mm×300mm的层析柱，填充高度为250mm，树脂床体积为20mL。装好后，填充柱用200mL蒸馏水淋洗好后备用。
取100mL的2-苯乙醇转化发酵液以10BV/h流速上柱后，用100mL蒸馏水淋洗树脂，淋洗流速为7.5BV/h。淋洗结束后，用60mL的99.5％丙酮进行洗脱，流速为7.5BV/h，收集全部洗脱液，取样分析洗脱液中2-苯乙醇浓度，计算2-苯乙醇的收率为86.3％。洗脱液在40℃、0.1Mpa条件下蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，得天然2-苯乙醇样品，取0.1000g的2-苯乙醇样品用95％乙醇定容到25mL，液相色谱法测定2-苯乙醇浓度，样品纯度达到85.7％。
实施例4：
200mL按实施例1方法获得的转化发酵液经自然沉淀后收集部分上清液。上清液的pH为5.3，不经调节。液相色谱测定其中的2-苯乙醇浓度为4.57g/L。
本例实施选用的大孔树脂为H103(南开大学化工厂生产，粒度0.32mm～1.25mm，比表面积1000m2/g～1100m2/g)，经过预处理的H103填充10mm×300mm的层析柱，填充高度为250mm，树脂床体积为20mL。装好后，填充柱用200mL蒸馏水淋洗好后备用。
取120mL的2-苯乙醇转化发酵液以5BV/h流速上柱后，用300mL蒸馏水淋洗树脂，淋洗流速为10BV/h。淋洗结束后，用100mL的90％丙酮进行洗脱，流速为5BV/h，收集全部洗脱液，取样分析洗脱液中2-苯乙醇浓度，计算2-苯乙醇的收率为56.5％。洗脱液在40℃、0.1Mpa条件下蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，得天然2-苯乙醇产品，取0.1000g的2-苯乙醇样品用95％乙醇定容到25mL，液相色谱法测定2-苯乙醇浓度，样品纯度达到90.3％。
实施例5：
3000mL按实施例1方法获得的转化发酵液经4500r/min离心15min后得水相清液。清液的pH测定值为6.1，不经调节。液相色谱测定其中的2-苯乙醇浓度为4.42g/L。
本例实施选用的大孔树脂为D4020(南开大学化工厂生产，粒度0.32mm～1.25mm，比表面积540m2/g～580m2/g)，经过预处理的D4020填充16mm×400mm的层析柱，填充高度为300mm，树脂床体积为60mL。装好后，填充柱用300mL蒸馏水淋洗好后备用。
取250mL的2-苯乙醇转化发酵液以7.5BV/h流速上柱后，用300mL蒸馏水淋洗树脂，淋洗流速为7.5BV/h。淋洗结束后，用200mL的90％丙酮进行洗脱，流速为10BV/h，收集全部洗脱液，取样分析洗脱液中2-苯乙醇浓度，计算2-苯乙醇的收率为82.7％。洗脱液在40℃、0.1Mpa条件下蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，得天然2-苯乙醇样品，取0.1000g的2-苯乙醇样品用95％乙醇定容到25mL，液相色谱法测定2-苯乙醇浓度，样品纯度达到86.8％。
实施例6：
3500mL按实施例1方法获得的转化发酵液经板框压滤后得发酵清液。清液的pH为4.8，用NaOH调节pH至5.5。液相色谱测定其中的2-苯乙醇浓度为4.83g/L。
本例实施选用的大孔树脂为HP-20(日本三菱化成公司生产，粒度0.32mm～1.25mm，比表面积500m2/g～600m2/g)，经过预处理的HP-20填充26mm×500mm的层析柱，填充高度为380cm，树脂床体积为200mL。装好后，填充柱用1000mL蒸馏水淋洗好后备用。
取1000mL的2-苯乙醇转化发酵液以10BV/h流速上柱后，用1000mL蒸馏水淋洗树脂，淋洗流速为10BV/h。淋洗结束后，用800mL的90％丙酮进行洗脱，流速为10BV/h，收集全部洗脱液，取样分析洗脱液中2-苯乙醇浓度，计算2-苯乙醇的收率为85.7％。洗脱液在40℃、0.1Mpa条件下蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，得天然2-苯乙醇产品，取0.1000g的2-苯乙醇样品用95％乙醇定容到25mL，液相色谱法测定2-苯乙醇浓度，样品纯度达到85.3％。
Claims (8)
1.一种生物转化法制备天然2-苯乙醇的分离方法，所述方法包括：(1)取含有2-苯乙醇的发酵液，除去酵母细胞得到含有2-苯乙醇的发酵清液；(2)发酵清液通过苯乙烯系大孔吸附树脂填充柱；(3)以蒸馏水淋洗树脂柱除杂，再以75～100％的丙酮溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，去除洗脱剂和水分，得到2-苯乙醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述苯乙烯系大孔吸附树脂为下列之一：Amberlite XAD-4、HP-20、HP-21、HP-30、HP-40、D101、H1020、NKA、D4020、H103或X-5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)洗脱溶剂为85～100％的丙酮，体积用量为3～10BV，洗脱流速为2～10BV/h。
4.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，发酵清液通过苯乙烯系大孔吸附树脂填充柱的体积≤10BV，流速≤10BV/h。
5.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所用蒸馏水体积≤15BV，淋洗流速为5～10BV/h。
6.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，去除洗脱剂和水分方法如下：先40℃、0.1MPa蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出。
7.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述含有2-苯乙醇的发酵液由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生物催化L-苯丙氨酸得到。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)以L-苯丙氨酸为底物、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为催化剂，于25～30℃转化18～24h，得到含有2-苯乙醇的发酵液；
(2)发酵液经过离心、过滤或自然沉淀除去酵母细胞，得到发酵清液；
(3)苯乙烯系大孔吸附树脂预处理后装柱，填充的高度一般为层析柱高度的70％～80％；预处理方法如下：先用蒸馏水洗去树脂的漂浮杂质，然后用体积分数为95％的乙醇浸泡过夜，再用蒸馏水洗净树脂中的乙醇，然后用1mol/L的HCl溶液浸泡过夜，而后用蒸馏水洗至pH为中性，接着1mol/L的NaOH溶液浸泡过夜，而后用蒸馏水洗至pH为中性；
(4)将≤10BV体积的转化发酵清液以≤10BV/h的流速通过大孔树脂填充柱；
(5)用蒸馏水淋洗树脂填充柱；蒸馏水的体积≤15BV，淋洗的流速为5～10BV/h；
(6)以3～10BV体积的浓度为75％～100％的丙酮为洗脱剂进行洗脱，收集全部洗脱液，洗脱剂上柱的流速为2～10BV/h；
(7)将含2-苯乙醇的洗脱液，先在40℃、0.1Mpa条件下蒸馏至无液体流出，然后80℃、0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，得2-苯乙醇。
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