CN105707203A - 一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种本发明的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法及其应用方法，所述制备方法包括以下步骤：1）按常规方法制备多个固定化酵母反应柱；2）将固定化酵母反应柱与HZ816大孔吸附树脂滤柱通过一台循环泵构成一个循环回路；3）将含有L?苯丙氨酸的反应液流经固定化酵母反应柱进行β?苯乙醇转化反应，转化液直接流经树脂滤柱，实时吸附产物而不吸附底物，有利于底物重回固定化酵母反应柱实施二次转化；4）待转化反应完成后，将HZ816大孔吸附树脂滤柱用纯水进行洗涤，然后用乙醇对HZ816大孔吸附树脂滤柱进行产物洗脱，调整洗脱液中β?苯乙醇的浓度为3.0?5.0g/L，即为畜禽鱼肉类保鲜剂产品。本发明的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法简单，转化率高，应用前景广泛。

Description

一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法及其应用方法。

背景技术

随着人民生活水平不断提高和市场肉品供应的丰富，人们对消费肉品的要求是新鲜、安全、卫生。目前市场上加工和销售的生鲜肉主要有热鲜肉、冷冻肉和冷鲜肉，其中冷鲜肉由于安全性、营养性均优于热鲜肉、冷冻肉，因此已经成为生鲜肉发展的必然趋势。冷鲜肉虽然在生产、销售中要求始终处于在0-4℃条件下，此时大多数微生物的生长繁殖被抑制，可以确保肉的安全卫生，但并不能完全抑制微生物的生长繁殖，一些适应于低温生长的微生物仍然可以繁殖生长。另外在贮存和销售过程中由于冷鲜肉自身的生理生化活性，特别是一些酶类受外界各种环境因素的影响常会造成冷鲜肉表面褪色现象，严重影响其外观及可接受性。冷鲜肉的货架期成为限制冷鲜肉快速发展的主要瓶颈。

β-苯乙醇（β-Phenylethanol）亦称2-苯乙醇（简称2-PE）广泛存在于自然界中，安全无毒，具有广泛的抗菌活性，不仅能抑制大肠杆菌等G-细菌的生长，还对枯草芽胞、金黄色酿脓葡萄球面镜菌等G+菌具有抑制作用。2-PE对真菌如酵母菌、青霉菌等亦有一定的抑制作用。2-PE作为抗菌防腐剂在医学等领域已得到应用，近几年作为生物防腐剂在果蔬、柑橘采后病害防治的应用已引起研究人员的关注，而作为一种冷鲜肉保鲜剂也应该具有应用前景。

2-PE是一种具有玫瑰气味的芳香醇，天然存在于新鲜水果（苹果等）、花卉（如玫瑰）和酵母中。由于从玫瑰等植物或其它精油中提取得到的天然β-苯乙醇非常稀少且价格昂贵，目前2-PE基本采用化学合成法生产，主要化学合成方法是环氧乙烷法和氧化苯乙烯加氢法，使用的原料苯或苯乙烯多属于致癌物质，对人体健康和环境都有巨大的危害，产品大都含有一些难以去除的不良副产物。生物法合成的2-PE被欧洲和美国食品管理局标记为“天然”产品，在美国2-PE允许用于食品，在欧洲可用于香精。从生物法生产2-PE产品是获得天然2-PE的重要途径，由于生长细胞培养基中含大量糖、蛋白粉、酵母粉等有机物，在糖酵解过程中会产生大量乙醇、杂醇（丁醇）和杂酸（丁酸和异丁酸等）等副产物，有机物、杂酸、杂醇的存在会影响保鲜效果。而固定化细胞转化液组分简单、副产物少， 除2-PE外，仅含少量的乙醇、底物L-苯丙氨酸和代谢中间产物苯乙醛，而乙醇和苯乙醛本身亦有抑菌效果，使该混合液的保鲜效果更佳。因此急需一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法及其应用方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法及其应用方法。

本发明的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）按常规方法制备多个固定化酵母反应柱，制成后可反复使用8次以上；

2）将固定化酵母反应柱与HZ816大孔吸附树脂滤柱通过一台循环泵构成一个循环回路，并在固定化酵母反应柱入口处接入一个补液接口，将以下重量百分比的反应液由注液接口注入固定化酵母反应柱：葡萄糖1%，L-苯丙氨酸0.8-1.2%，乙醇2.0-3.0%，氯化镁0.06-0.1%，固定化酵母反应柱的柱温维持在28-30℃，流经时间控制在30min；利用固定化酵母反应柱将L-苯丙氨酸快速高效转化成β-苯乙醇；

3）反应液经过固定化酵母反应柱流出后直接流经HZ816大孔吸附树脂滤柱，HZ816大孔吸附树脂滤柱实时吸附β-苯乙醇，但不吸附L-苯丙氨酸，排除了后续进行的二次转化中β-苯乙醇对细胞的影响和对转化率的抑制，为二次转化奠定了基础；

4）待HZ816大孔吸附树脂滤柱吸附工作24小时后，将HZ816大孔吸附树脂滤柱用纯水进行洗涤，然后用乙醇对HZ816大孔吸附树脂滤柱进行产物洗脱，调整洗脱液中β-苯乙醇的浓度为3.0-5.0g/L，即为畜禽鱼肉类保鲜剂产品。

本发明的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，在步骤3）中：当HZ816大孔吸附树脂滤柱流出液中L-苯丙氨酸质量分数大于0.1%时，将HZ816大孔吸附树脂滤柱流出液泵回固定化酵母反应柱进行二次转化，同时由补液接口补加不含L-苯丙氨酸的反应液。

本发明的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，在步骤4）中：为便于储运，将洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得高浓度畜禽鱼肉类保鲜剂浓缩液。

本发明的畜禽鱼类保鲜制剂的应用方法，包括以下步骤：

1）在畜禽鱼类冷鲜肉生产过程中，将浓度为3.0-5.0g/L的β-苯乙醇水溶液喷洒在畜禽鱼类冷鲜肉上，或者将畜禽鱼类冷鲜肉浸泡在浓度为2.0-3.0g/L的β-苯乙醇水溶液中，浸泡5-10分钟；

2）将保鲜处理后的畜禽鱼类冷鲜肉采用无菌塑料袋进行封装，之后置于冷藏柜中保存，冷藏柜温度调整为5-7℃，能够延长畜禽鱼类冷鲜肉2-3天的货架期。

与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法简单，转化率高，所制备的畜禽鱼类保鲜制剂能够用于畜禽鱼类冷鲜肉的保鲜处理，成分单一，操作简单易行，应用前景广泛。

附图说明

图1是本发明实施例所述的一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备装置的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

如图1所示，一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）按常规方法制备多个固定化酵母反应柱，制成后可反复使用8次以上；所述制备固定化酵母反应柱包括以下步骤：

（1）第1天；将1000g干麦芽粉碎倒入糖化罐，加入4300ml的水，恒温65℃糖化3h，搅拌煮沸后再过滤，将滤液稀释到5波美度，即为麦芽汁培养液，按2ml/支选择10支玻璃试管，选择10个容量为1000ml的三角烧瓶（每瓶装400ml麦芽汁培养液），另选用一个容量为500ml的三角烧瓶，装200ml麦芽汁培养液并加入4g琼脂粉即为麦芽汁培养基；

（2）将上述培养液和培养基连同3个茄子瓶、10块培养皿一起封口或包裹，置于高压灭菌柜，在121℃下灭菌30min；

（3）灭菌后，待自然冷却至45℃时取出，按无菌操作规程，将麦芽汁培养基按约30ml/瓶，分装3个茄子瓶，按约12ml/皿，分装3块培养皿，平放静置凝固；连同上述培养液一起置37℃下培养18h，以确认培养基或培养液灭菌彻底；

（4）第2-6天；按无菌操作规程，将酿酒酵母菌保藏菌种，划线接种在麦芽汁培养基上，置28℃培养36h，挑选生长旺盛、形态正常的单菌落，接种在麦芽汁培养液试管中，置28℃，160rpm震荡培养18h，得到该菌的纯培养菌液，取0.1ml加至茄子瓶内的培养基上，用涂布棒涂布均匀菌液，共涂布茄子瓶3瓶，置28℃培养18h即为菌种斜面，置4℃冰箱保存备用，制作一次茄子瓶菌种可供多批次生产使用，一般2个月之内使用有效；

（5）第7天；按无菌操作规程，从步骤（4）制备的酿酒酵母菌菌种斜面用接种铲铲下一铲菌苔，接入400ml麦芽汁培养液（容量为1000ml的三角烧瓶）中，共接种10瓶，置28℃，160rpm震荡培养24h，得到4000ml一级菌种液；

（6）第7天；将17.5kg干麦芽粉碎倒入糖化罐，加入70升的水， 65℃恒温糖化3h，搅拌煮沸后再过滤，将滤液稀释到5波美度，总体积为75升，即为麦芽汁培养液，注入100升容积的发酵罐，通入蒸汽升温至121℃，维持30min，冷却至室温；

（7）第8天；按无菌操作规程，用上述步骤（5）生产的一级菌种液3750ml，按5% （w/w）接种量接入上述步骤（6）准备好的发酵罐中，发酵罐装液量为75%，于300r/min、通气量0.2vvm、温度28℃、压力0.01Mpa条件下进行培养24小时，菌体终浓度达OD600=3，即为制备固定化细胞的生产菌种；

（8）第9天；将上述步骤（7）生产菌种液用连续离心机，于5000r/min，离心9min，弃上清，收集菌体。菌体用pH值为6.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次；

（9）再将菌体重悬于pH值为5.5、浓度为0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液中，调整其浓度至OD600=10，制得20升菌悬液，可于4℃冰箱中保存备用；

（10）将3.2%的聚乙烯醇20升与0.28%的活性炭20升等体积混合于热融罐中，充分热融，冷却后与上述步骤（9）中的酵母菌悬液20升均匀混合，总体积为60升，随后用自动多点点滴器将其滴入600升的饱和硼酸溶液（pH 6.7），边滴边搅拌，形成直径为1.5mm 的颗粒并在硼酸溶液中持续交联24h，制成固定化酵母菌胶粒；

（11）第11天；滤出上述步骤（10）胶粒约60kg，用PBS洗涤重悬后均匀分装至两根直径22cm、长120cm有机玻璃柱中，将两根玻璃柱的进出水口头尾相连通，串联制成固定化酵母反应柱；

2）将固定化酵母反应柱与HZ816大孔吸附树脂滤柱通过一台循环泵构成一个循环回路，并在固定化酵母反应柱入口处接入一个补液接口，将以下重量百分比的反应液100升由注液接口注入固定化酵母反应柱：葡萄糖1%，L-苯丙氨酸0.8%，乙醇2.0%，氯化镁0.06%，固定化酵母反应柱的柱温维持在30℃，流经时间控制在30min；利用固定化酵母反应柱将L-苯丙氨酸快速高效转化成β-苯乙醇；

3）反应液经过固定化酵母反应柱流出后直接流经HZ816大孔吸附树脂滤柱，HZ816大孔吸附树脂滤柱实时吸附β-苯乙醇，但不吸附L-苯丙氨酸，排除了后续进行的二次转化中β-苯乙醇对细胞的影响和对转化率的抑制，为二次转化奠定了基础；

4）待测得HZ816大孔吸附树脂滤柱流出液中L-苯丙氨酸质量分数为0.05%，说明转化反应已经完成，将HZ816大孔吸附树脂滤柱用纯水进行洗涤一次，然后用45升乙醇对HZ816大孔吸附树脂滤柱进行产物洗脱，得到β-苯乙醇浓度为15.8g/L的乙醇混合液44升，取其633ml用水稀释至2000ml，使β-苯乙醇终浓度为5.0g/L，即为畜禽鱼肉类保鲜剂产品。

一种畜禽鱼类保鲜制剂的应用方法，包括以下步骤：取18只新鲜鸡酮体，用浓度为5.0g/L的β-苯乙醇水溶液喷洒9只，将保鲜处理后的鸡酮体采用无菌塑料袋进行独立封装作为试验样，剩下的9只直接用无菌塑料袋独立包装作为对照样，3只一组分成3组试验样和3组对照样，全部置于5℃冷藏柜中保存。保鲜效果；鸡肉酮体表面微生物总数和挥发性盐基氮指标检测结果见下表；

试验样品的指标显示其9天后还保持着鲜鸡肉一级水平，而对照样品在6至9天内降为了二级水平鲜鸡肉。可见经上述保鲜处理的鸡肉货架期比不处理的对照样可延长3天。

实施例2

如图1所示，一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）按常规方法制备多个固定化酵母反应柱，制成后可反复使用8次以上；所述制备固定化酵母反应柱的方法同实施例1；

2）将固定化酵母反应柱与HZ816大孔吸附树脂滤柱通过一台循环泵构成一个循环回路，并在固定化酵母反应柱入口处接入一个补液接口，将以下重量百分比的反应液100升由注液接口注入固定化酵母反应柱：葡萄糖1%，L-苯丙氨酸1.2%，乙醇3.0%，氯化镁0.1%，固定化酵母反应柱的柱温维持在28℃，流经时间控制在30min；利用固定化酵母反应柱将L-苯丙氨酸快速高效转化成β-苯乙醇；

3）反应液经过固定化酵母反应柱流出后直接流经HZ816大孔吸附树脂滤柱，HZ816大孔吸附树脂滤柱实时吸附β-苯乙醇，但不吸附L-苯丙氨酸，排除了后续进行的二次转化中β-苯乙醇对细胞的影响和对转化率的抑制，为二次转化奠定了基础；

4）待测得HZ816大孔吸附树脂滤柱流出液中L-苯丙氨酸质量分数为0.07%，说明转化反应已经完成；将HZ816大孔吸附树脂滤柱用纯水进行洗涤一次，然后用75升乙醇对HZ816大孔吸附树脂滤柱进行产物洗脱，得到β-苯乙醇浓度为14.4g/L的乙醇混合液73.5升，取其263ml用水稀释至1262ml，使β-苯乙醇终浓度为3.0g/L，即为畜禽鱼肉类保鲜剂产品。

一种畜禽鱼类保鲜制剂的应用方法，包括以下步骤：取新鲜猪肉，去掉筋膜及多余的脂肪，切成约 200 g 的肉块，共18块，将9块肉块浸泡在浓度为3.0g/L的β-苯乙醇水溶液中，侵泡5分钟，将保鲜处理后的肉块采用无菌塑料袋进行独立封装作为试验样，剩下的9块肉块直接用无菌塑料袋独立包装作为对照样，3只一组分成3组试验样和3组对照样，全部置于6℃冷藏柜中保存。保鲜效果；肉块表面微生物总数和挥发性盐基氮指标检测结果见下表；

试验样品的指标显示其9天后还保持着鲜猪肉水平，而对照样品在6至9天内降为了次鲜肉等级。可见经上述保鲜处理的猪肉货架期比不处理的对照样可延长3天。

实施例3

如图1所示，一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）按常规方法制备多个固定化酵母反应柱，制成后可反复使用8次以上；所述制备固定化酵母反应柱的方法同实施例1；

2）将固定化酵母反应柱与HZ816大孔吸附树脂滤柱通过一台循环泵构成一个循环回路，并在固定化酵母反应柱入口处接入一个补液接口，将以下重量百分比的反应液100升由注液接口注入固定化酵母反应柱：葡萄糖1%，L-苯丙氨酸1.2%，乙醇3.0%，氯化镁0.1%，固定化酵母反应柱的柱温维持在28℃，流经时间控制在30min；利用固定化酵母反应柱将L-苯丙氨酸快速高效转化成β-苯乙醇；

3）反应液经过固定化酵母反应柱流出后直接流经HZ816大孔吸附树脂滤柱，HZ816大孔吸附树脂滤柱实时吸附β-苯乙醇，但不吸附L-苯丙氨酸，排除了后续进行的二次转化中β-苯乙醇对细胞的影响和对转化率的抑制，为二次转化奠定了基础；

4）待测得HZ816大孔吸附树脂滤柱流出液中L-苯丙氨酸质量分数为0.06%，说明转化反应已经完成；将HZ816大孔吸附树脂滤柱用纯水进行洗涤一次，然后用60升乙醇对HZ816大孔吸附树脂滤柱进行产物洗脱，经减压蒸馏去除乙醇，得到β-苯乙醇浓度为95%的畜禽鱼肉类保鲜剂浓缩液1130ml，取其31.6ml用水稀释至10升，使β-苯乙醇终浓度为3.0g/L，即为畜禽鱼肉类保鲜剂产品。

一种畜禽鱼类保鲜制剂的应用方法，包括以下步骤：取18条大小相近约500g的新鲜鱼酮体，将9条浸泡在浓度为3.0g/L的β-苯乙醇水溶液中，侵泡5分钟，将保鲜处理后的鱼采用无菌塑料袋独立包装作为试验样，剩下的9条鱼直接用无菌塑料袋独立包装作为对照样，3只一组分成3组试验样和3组对照样，全部置于7℃冷藏柜中保存。保鲜效果；鱼表面微生物总数和挥发性盐基氮指标检测结果见下表；

试验样品的指标显示其8天后还保持着鲜鱼水平，而对照样品在6至8天内降为了次鲜鱼等级，可见经上述保鲜处理的鱼货架期比不处理的对照样可延长2天。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按常规方法制备多个固定化酵母反应柱，制成后可反复使用8次以上；

2）将固定化酵母反应柱与HZ816大孔吸附树脂滤柱通过一台循环泵构成一个循环回路，并在固定化酵母反应柱入口处接入一个补液接口，将以下重量百分比的反应液由注液接口注入固定化酵母反应柱：葡萄糖1%，L-苯丙氨酸0.8-1.2%，乙醇2.0-3.0%，氯化镁0.06-0.1%，固定化酵母反应柱的柱温维持在28-30℃，流经时间控制在30min；利用固定化酵母反应柱将L-苯丙氨酸快速高效转化成β-苯乙醇；

3）反应液经过固定化酵母反应柱流出后直接流经HZ816大孔吸附树脂滤柱，HZ816大孔吸附树脂滤柱实时吸附β-苯乙醇，但不吸附L-苯丙氨酸，排除了后续进行的二次转化中β-苯乙醇对细胞的影响和对转化率的抑制，为二次转化奠定了基础；

4）待转化反应完成后，将HZ816大孔吸附树脂滤柱用纯水进行洗涤，然后用乙醇对HZ816大孔吸附树脂滤柱进行产物洗脱，调整洗脱液中β-苯乙醇的浓度为3.0-5.0g/L，即为畜禽鱼肉类保鲜剂产品。

2.根据权利要求1所述的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，其特征在于，在步骤3）中：当HZ816大孔吸附树脂滤柱流出液中L-苯丙氨酸质量分数大于0.1%时，将HZ816大孔吸附树脂滤柱流出液泵回固定化酵母反应柱进行二次转化，同时由补液接口补加不含L-苯丙氨酸的反应液。

3.根据权利要求1所述的畜禽鱼类保鲜制剂的制备方法，其特征在于，在步骤4）中：为便于储运，将洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得高浓度畜禽鱼肉类保鲜剂浓缩液。

4.一种畜禽鱼类保鲜制剂的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）在畜禽鱼类冷鲜肉生产过程中，将浓度为3.0-5.0g/L的β-苯乙醇水溶液喷洒在畜禽鱼类冷鲜肉上，或者将畜禽鱼类冷鲜肉浸泡在浓度为2.0-3.0g/L的β-苯乙醇水溶液中，浸泡5-10分钟；

2）将保鲜处理后的畜禽鱼类冷鲜肉采用无菌塑料袋进行封装，之后置于冷藏柜中保存，冷藏柜温度调整为5-7℃，能够延长畜禽鱼类冷鲜肉2-3天的货架期。