CN101688224A - 乳酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乳酸的制造方法，是通过分离经微生物发酵培养而在培养液中产生的乳酸，从而制造乳酸的方法，包括下述工序A和工序B，工序A是将该培养液通过纳滤膜进行过滤的工序，工序B是将工序A所得的含乳酸的溶液在1Pa～大气压的压力下、在25℃～200℃进行蒸馏并回收乳酸的工序，根据本发明，可通过简单操作有效除去溶解在发酵培养液中、或者作为难溶性固体包含在发酵培养液中的无机盐，并且可抑制生产工序中乳酸的外消旋化、低聚化，因此可提供用于以高收率获得乳酸的制造方法。

Description

乳酸的制造方法
技术领域
本发明涉及乳酸的制造方法，是通过分离经微生物发酵培养而在培养液中产生的乳酸，从而制造乳酸的方法。具体地说，涉及通过将微生物培养液中残存的无机盐用纳滤膜除去，并将得到的含乳酸的溶液进行蒸馏，从而制造乳酸的方法。
背景技术
乳酸除了食品用、药用等用途之外，在工业用途中也作为生物降解性塑料的单体原料而被广泛应用，其需要日益增加。通过微生物发酵来生产2-羟基丙酸、即乳酸已经为人们所知，微生物将含有以葡萄糖为代表的碳水化合物的底物转化为乳酸。根据结合在羰基α位碳原子上的羟基的立体构型，将乳酸分为(L)-型和(D)-型的光学异构体。利用微生物发酵，可以通过选择适当的微生物而选择性地生产(L)-型或(D)-型的乳酸，或者生产(L)-型与(D)-型的混合体(外消旋体)的乳酸。
一般来说，利用微生物发酵来生产乳酸，是在通过在培养液中添加碱性物质来保持最适宜微生物发酵的pH的同时进行的。作为微生物发酵产生的酸性物质的乳酸，大部分由于添加碱性物质而在培养液中作为乳酸盐存在。这种情况下，通过发酵结束之后，在培养液中添加酸性物质来得到游离的乳酸。具体地说，作为一个添加在培养液中的碱性物质的例子，可使用氢氧化钙，这种情况下，微生物发酵所产生的乳酸作为乳酸钙而存在于培养液中。然后，通过在培养结束后的培养液中添加酸性物质(例如硫酸)，可以得到游离的乳酸溶液，但副生成钙盐(例如硫酸钙)。
作为除去这里所生成的钙盐并分离乳酸的方法，在生成了硫酸钙这样的因难溶性而沉淀的钙盐的情况下，可使用利用定性滤纸等滤除的方法。但是，该方法虽然可以除去作为固体沉淀的钙盐，但溶解在溶液中的微量钙盐无法被除去，因而残留在含乳酸的溶液中。此外在通过微生物发酵生产乳酸时，除了目的物乳酸之外还副生成各种无机盐，对于这些无机盐中溶解在培养液中的无机盐无法用定性滤纸等滤除。因此，如果将含有该乳酸的滤液通过例如之后的纯化工序进行浓缩操作，则存在含游离乳酸的溶液中再次析出(沉淀)钙盐、其他无机盐这样的问题。而且人们知道，如果在没有完全除去无机离子的状态下，直接通过蒸馏等操作加热含乳酸的溶液，则由于无机离子的影响，乳酸会进行外消旋化和低聚化。因此，希望寻求一种能够有效除去含乳酸的溶液中残留的微量无机离子成分的方法。
作为从含乳酸的溶液中除去微量无机离子成分的方法，已公开了使用离子交换树脂的方法(例如，参考专利文献1)。但是，为了保持离子交换树脂的离子交换性能，必须定期对离子交换树脂进行再生。此外，离子交换树脂的再生是使用大量的氯化钠水溶液进行的，伴随着再生，存在排出大量废液，废液处理花费巨额成本这样的问题。而且，如果反复进行离子交换树脂再生，则存在不仅离子交换树脂的再生率降低，而且离子交换性能降低、无机盐的去除率降低的这样的问题。
此外，利用使用电渗析装置的双极膜，从含乳酸的溶液中除去微量的钙成分等无机离子成分的方法也已为人们所知(例如，参考专利文献2)。但是，该方法所用的双极膜存在不仅昂贵，而且钙盐等无机盐的去除效率并不高这样的问题。
另外，使用分离膜分离、回收有机酸的方法已经为人们所知，有人公开了利用反渗透膜从丙酮酸溶液中分离拟丙酮酸(parapyruvic acid)的方法(参考专利文献3)，但是关于这时的无机盐去除率并未公开。此外，专利文献3涉及丙酮酸的分离、回收方法，但因为丙酮酸不是光学活性体，所以从含乳酸的溶液中分离、回收乳酸时的问题，即外消旋化、低聚化，并没有得到解决。
进而，有人公开了使用纳滤膜从含乳酸的溶液中除去无机盐的方法(例如，参考专利文献4～6)，但关于将微生物发酵培养液通过纳滤膜，并将得到的含乳酸的溶液蒸馏，从而回收乳酸的工序，以及蒸馏对乳酸收率的影响等并没有公开，没有解决通过蒸馏而以高收率回收乳酸这样的课题。
专利文献1：特表2001-506274号公报
专利文献2：特开2005-270025号公报
专利文献3：特开平6-306011号公报
专利文献4：US5503750
专利文献5：US5681728
专利文献6：US2004/0033573
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供解决上述问题的方法，即在通过微生物发酵生产乳酸时，在抑制乳酸外消旋化、低聚化的同时，有效分离、回收培养液中的乳酸的方法。
用于解决问题的方法
本发明者们为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，通过将含有乳酸的微生物发酵培养液使用纳滤膜进行过滤，并将得到的含乳酸的溶液进行蒸馏，可以在抑制乳酸外消旋化的同时有效地分离、回收乳酸，从而完成了本发明。
即，本发明由以下(1)～(9)构成。
(1)一种乳酸的制造方法，是通过分离经微生物发酵培养而在培养液中产生的乳酸，从而制造乳酸的方法，包括下述工序A和工序B，工序A是将该培养液通过纳滤膜进行过滤的工序，工序B是将工序A所得的含乳酸的溶液在1Pa～大气压的压力下、在25℃～200℃进行蒸馏并回收乳酸的工序。
(2)如上述(1)所述的乳酸的制造方法，所述工序A中通过纳滤膜的培养液的pH值为2～4.5。
(3)如上述(1)或(2)所述的乳酸的制造方法，所述培养液是在钙盐存在下进行微生物发酵培养的培养液，并将经过工序C之后得到的含乳酸的培养液供给上述工序A，所述工序C是将该培养液中的钙成分作为难溶性硫酸盐除去的工序。
(4)如上述(1)～(3)的任一项所述的乳酸的制造方法，在操作压力0.5MPa、原液温度25℃、原液浓度1000ppm的条件下，所述纳滤膜的硫酸镁渗透率相对于柠檬酸渗透率的比为3以上。
(5)如上述(1)～(4)的任一项所述的乳酸的制造方法，在操作压力0.5MPa、原液温度25℃、原液浓度1000ppm的条件下，所述纳滤膜的硫酸镁渗透率为1.5％以下。
(6)如上述(1)～(5)的任一项所述的乳酸的制造方法，所述纳滤膜的膜原料包含聚酰胺。
(7)如上述(6)所述的乳酸的制造方法，其特征在于，所述聚酰胺以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有化学式(1)所示构成成分，
Figure G2008800222245D00041
化学式(1)
上式中，R表示-H或-CH3，n表示0～3的整数。
(8)如上述(1)～(7)的任一项所述的乳酸的制造方法，所述工序A中培养液的过滤压为0.1MPa～8MPa。
(9)如上述(1)～(8)的任一项所述的乳酸的制造方法，包括工序D，即将上述工序A所得的含乳酸的溶液用反渗透膜过滤从而提高乳酸浓度的工序。
发明效果
根据本发明，可通过简单操作有效除去溶解在发酵培养液中、或者作为难溶性固体包含在发酵培养液中的无机盐，并且可抑制生产工序中乳酸的外消旋化、低聚化，因此能够以高纯度、高收率制造乳酸。
附图说明
图1是显示本发明中使用的纳滤膜分离装置的一种实施方式的概要图。
图2是显示本发明中使用的纳滤膜分离装置的安装了纳滤膜的腔室剖面图的一种实施方式的概要图。
附图标号说明
1原液槽
2安装了纳滤膜或反渗透膜的腔室
3高压泵
4膜渗透液流
5膜浓缩液流
6通过高压泵送液的培养液流
7纳滤膜
8支持板
具体实施方式
以下对本发明进行更详细的说明。
本发明的乳酸的制造方法，是通过分离经微生物发酵培养而在培养液中产生的乳酸，从而制造乳酸的方法，包括下述工序A和工序B，工序A是将该培养液通过纳滤膜进行过滤，除去发酵培养液中的无机盐并得到乳酸溶液的工序，工序B是将工序A所得的含乳酸的溶液在1Pa～大气压的压力下、在25℃～200℃进行蒸馏并回收乳酸的工序。
作为工序A中使用的纳滤膜，也称为纳米过滤器(纳米过滤膜、NF膜)，是一般被定义为“透过一价离子、阻挡二价离子的膜”的膜。是被认为具有数纳米左右的微小孔隙的膜，主要用于阻挡水中的微小粒子、分子、离子、盐类等。
此外，所谓“通过纳滤膜进行过滤”，意味着将含有微生物发酵培养所产生的乳酸的培养液通过纳滤膜进行过滤，除去、阻挡或滤除溶解的或作为固体析出的无机盐，使乳酸溶液作为滤液透过。这里，无机盐包括培养液中所含的任一形态的无机盐，还包括溶解在培养液中的无机盐、在培养液中析出或者作为沉淀包含的无机盐的任一种
工序A中提供给纳滤膜的培养液的pH优选为2.0～4.5。因为已知在溶液中离子化的物质比与未离子化的物质更容易被纳滤膜除去或阻挡，所以通过使培养液的pH值为4.5以下，可以减少乳酸在培养液中解离从而作为乳酸离子存在的比例，使乳酸容易透过。此外，pH值小于2.0时可能造成损伤纳滤膜的影响。进而，由于乳酸的pKa为3.86，因而pH值为3.86以下时，培养溶液中含有大量未解离成乳酸离子和氢离子的乳酸，所以可以使乳酸有效地透过纳滤膜，因此更优选。另外，培养液的pH值调整可以在微生物发酵时进行，也可以在微生物发酵之后进行。
作为工序A中提供给纳滤膜的培养液，优选使用通过在培养液中添加碱性物质而保持最适合微生物发酵的pH值从而得到的培养液。作为添加的碱性物质不特别限制，优选添加碱性钙盐。由于在培养液中添加碱性钙盐，因而可以在工序A的前段导入工序C，即将培养液中的钙成分作为难溶性硫酸盐除去的工序。具体地说，例如，通过进行在培养液中添加硫酸、将培养液中的钙成分作为难溶性硫酸盐硫酸钙而沉淀、滤除的工序C，并将该滤液(含乳酸的分离液)通过工序A的纳滤膜，可以更有效地除去或阻挡钙成分。作为碱性钙盐，可列举氢氧化钙、碳酸钙、磷酸钙、氧化钙、乙酸钙等，优选为氢氧化钙。在将培养液中的钙成分作为难溶性硫酸盐沉淀、滤除时，如果添加在培养液中的硫酸的当量超过钙的当量(硫酸当量＞钙当量)，则过量的硫酸部分透过纳滤膜，然后，如果将渗透液暴露在浓缩、蒸馏等加热条件下，则可能透过的硫酸作为促进乳酸低聚化的催化剂而发挥作用，降低蒸馏收率。由此，在将培养液中的钙成分作为难溶性硫酸盐沉淀、滤除时，优选添加培养液中的钙成分的当量以下的硫酸，在通过pH值来调整添加当量的情况下，如果pH值为2.0以上，则硫酸当量为钙成分的当量以下，因此优选。
作为本发明中使用的纳滤膜除去、阻挡或滤除溶解或作为固体析出的无机盐的程度的评价方法，可列举通过计算无机离子去除率(阻挡率)来评价的方法，但不限于该方法。可以利用以离子色谱法为代表的分析方法，通过测定原液(培养液)中所含的无机盐浓度(原液无机盐浓度)和渗透液(乳酸溶液)中所含的无机盐浓度(渗透液无机盐浓度)，根据式1计算出无机盐阻挡率(去除率)。
无机盐去除率(％)＝(1-(渗透液无机盐浓度/原液无机盐浓度))×100...(式1)。
作为工序A中所用的纳滤膜的膜分离性能，不特别限制，优选在操作压力0.5MPa、原液温度25℃、原液浓度1000ppm的条件下纳滤膜的硫酸镁渗透率相对于柠檬酸渗透率的比为3以上的纳滤膜。如果在上述条件下纳滤膜的硫酸镁渗透率相对于柠檬酸渗透率的比为3以上，则能够除去培养液中所含的无机盐，有效地使乳酸透过，因此优选。这里，可以利用以离子色谱法为代表的分析方法，测定原液中所含的硫酸镁浓度(原液硫酸镁浓度)和渗透液中所含的硫酸镁浓度(渗透液硫酸镁浓度)，根据式(2)计算出硫酸镁渗透率。同样地对于柠檬酸渗透率，也可以利用以高效液相色谱法为代表的分析方法，测定原液中所含的柠檬酸浓度(原液柠檬酸浓度)和渗透液中所含的柠檬酸浓度(渗透液柠檬酸浓度)，通过将式2的硫酸镁浓度替换成柠檬酸浓度而计算出。
硫酸镁渗透率(％)＝(渗透液硫酸镁浓度)/(原液硫酸镁浓度)×100...(式2)。
此外，优选使用在操作压力0.5MPa、原液温度25℃、原液浓度1000ppm的条件下，硫酸镁渗透率为1.5％以下的纳滤膜。在上述条件下纳滤膜的硫酸镁渗透率超过1.5％的情况下，如果对透过纳滤膜的乳酸溶液进行浓缩，则可能析出无机盐，进而，如果进行蒸馏操作，则由于透过的无机盐影响而乳酸容易发生外消旋化和低聚化，并且蒸馏收率可能降低。更优选使用硫酸镁渗透率为1.0％以下的纳滤膜。
另外，优选使用氯化钠(500mg/L)去除率为45％以上的纳滤膜。此外，作为纳滤膜的渗透性能，优选使用在0.3MPa的过滤压下、每单位膜面积的氯化钠(500mg/L)渗透流量(m3/m2/天)为0.5～0.8的纳滤膜。作为每单位膜面积的渗透流量(膜渗透通量)的评价方法，可以通过测定渗透液量、渗透液的采液时间和膜面积，根据式(3)进行计算。
膜渗透通量(m3/m2/天)＝渗透液量/膜面积/采液时间...(式3)。
本发明所用的纳滤膜的原料可以使用乙酸纤维素系聚合物、聚酰胺、聚酯、聚酰亚胺、乙烯基聚合物等高分子原料，但不限于由上述1种原料构成的膜，也可以是含有多种膜原料的膜。此外，其膜结构可以是下述非对称膜、复合膜的任一种，所述非对称膜是在膜的至少一面具有致密层，且从致密层开始向膜内部或另一面具有孔径渐渐变大的微孔的膜，所述复合膜是在非对称膜的致密层上具有由其他原料形成的非常薄的功能层的膜。作为复合膜，可使用例如，特开昭62-201606号公报所记载的、其构成为在以聚砜为膜原料的支持膜上具有由聚酰胺功能层形成的纳米过滤器的复合膜。
其中，优选兼备高耐压性、高透水性和高溶质去除性能、具有优异的潜能、以聚酰胺为功能层的复合膜。为了能够维持对操作压力的耐久性、高透水性和阻挡性能，优选具有下述结构的膜，所述结构以聚酰胺为功能层，并用由多孔质膜、无纺布形成的支持体保持该功能层。此外，作为聚酰胺半透膜，优选在支持体上具有交联聚酰胺功能层的复合半透膜，所述交联聚酰胺功能层是多官能团胺与多官能团酰卤进行缩聚反应而得的。
在以聚酰胺为功能层的纳滤膜中，作为构成聚酰胺的单体的优选羧酸成分，可列举例如，1，3，5-苯三酸、二苯甲酮四甲酸、1，2，4-苯三酸、1，2，4，5-苯四酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、萘二甲酸、联苯基甲酸、吡啶甲酸等芳香族羧酸，如果考虑到对制膜溶剂的溶解性，则更优选为1，3，5-苯三酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸以及它们的混合物。
作为构成所述聚酰胺的单体的优选胺成分，可列举间苯二胺、对苯二胺、联苯胺、亚甲基双二苯胺、4，4’-二氨基二苯醚、联茴香胺、3，3’，4-三氨基二苯醚、3，3’，4，4’-四氨基二苯醚、3，3’-二羟基联苯胺、1，8-萘二胺、单甲基间苯二胺、单甲基对苯二胺、3，3’-单甲基氨基-4，4’-二氨基二苯醚、4，N，N’-(4-氨基苯甲酰)-对苯二胺-2，2’-二(4-氨基苯基苯并咪唑)、4，N，N’-(4-氨基苯甲酰)-间苯二胺-2，2’-二(4-氨基苯基苯并咪唑)、2，2’-二(4-氨基苯基苯并噁唑)、2，2’-二(4-氨基苯基苯并噻唑)等具有芳香环的伯二胺，哌嗪、哌啶或它们的衍生物等仲二胺，其中，以含有哌嗪或哌啶作为单体的交联聚酰胺为功能层的纳滤膜，除了具有耐压性、耐久性以外，还具有耐热性、耐化学性，因此优选使用。更优选为以所述交联哌嗪聚酰胺或交联哌啶聚酰胺为主成分、且含有上述化学式(1)所示构成成分的聚酰胺，进而优选为以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有上述化学式(1)所示构成成分的聚酰胺。此外，优选使用上述化学式(1)中n＝3的聚酰胺。作为其功能层为以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有上述化学式(1)所示构成成分的聚酰胺的纳滤膜，可列举例如，特开昭62-201606号公报所记载的纳滤膜，作为具体例，可列举東レ株式会社制造的交联哌嗪聚酰胺系半透膜UTC60，其功能层是以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有上述化学式(1)中n＝3的基团作为构成成分的聚酰胺。
纳滤膜一般制成螺旋型的膜元件使用，本发明中所用的纳滤膜也优选制成螺旋型的膜元件使用。作为优选的纳滤膜元件的具体例，可列举例如，作为乙酸纤维素系纳滤膜的GE Osmonics社制纳滤膜GEsepa，以聚酰胺为功能层的アルフアラバル社制纳滤膜NF99或NF99HF，以交联哌嗪聚酰胺为功能层的フイルムテツク社制纳滤膜NF-45、NF-90、NF-200或NF-400，或者包含其功能层为以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有上述化学式(1)所示构成成分的聚酰胺的東レ株式会社制UTC60的同社制纳滤膜模块SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，更优选是以聚酰胺为功能层的アルフアラバル社制纳滤膜NF99或NF99HF，以交联哌嗪聚酰胺为功能层的フイルムテツク社制纳滤膜NF-45、NF-90、NF-200或NF-400，或者包含其功能层为以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有上述化学式(1)所示构成成分的聚酰胺的東レ株式会社制UTC60的同社制纳滤膜模块SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，更优选是包含功能层为以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有上述化学式(1)所示构成成分的聚酰胺的東レ株式会社制UTC60的同社制纳滤膜模块SU-210、SU-220、SU-600或SU-610。
工序A中将微生物发酵培养液通过纳滤膜进行的过滤，也可以施加压力，其过滤压优选使用0.1MPa～8MPa的范围。如果过滤压低于0.1MPa，则膜渗透速度低下，如果高于8MPa，则可能造成膜损伤的影响。此外，如果过滤压使用0.5MPa～7MPa，则由于膜渗透通量高，因而可以有效地透过乳酸溶液，造成膜损伤的影响的可能性小，因此更优选，特别优选使用1MPa～6MPa。
对通过工序A的纳滤膜进行过滤的微生物发酵培养液中的乳酸浓度，不特别限制，如果为高浓度，则由于渗透液中所含的乳酸浓度也高，故而能够缩短浓缩时间，因此对削减成本是理想的。
对工序A中培养液内所含的无机盐浓度不特别限制，可以为饱和溶解度以上。即，如果无机盐为饱和溶解度以下，则溶解在培养溶液中，如果为饱和溶解度以上，则部分析出，因为本发明的乳酸制造方法，对于溶解在培养液中的无机盐、析出或沉淀而包含在培养液中的无机盐的任一种，都可以除去或阻挡，所以可以在不限制无机盐浓度的情况下过滤乳酸。
通过上述方法从培养液中分离乳酸时，作为对乳酸的纳滤膜渗透性的评价方法，可以通过计算乳酸渗透率来进行评价。可以利用以高效液相色谱法为代表的分析方法，通过测定原液(培养液)中所含的乳酸浓度(原液乳酸浓度)和渗透液(含乳酸的溶液)中所含的乳酸浓度(渗透液乳酸浓度)，根据式4计算出乳酸渗透率。
乳酸渗透率(％)＝(渗透液乳酸浓度/原液乳酸浓度)×100...(式4)。
本发明的乳酸制造方法的特征在于，通过将用纳滤膜过滤工序A的培养液而得的含乳酸的溶液，进一步供给蒸馏工序B，从而获得高纯度的乳酸。蒸馏工序在1Pa～大气压(常压，约101kPa)的减压条件下进行。如果在10Pa～30kPa的减压条件下进行，则可以降低蒸馏温度，因此更优选。在减压下进行时的蒸馏温度为20℃～200℃，但因为在180℃以上进行蒸馏时，可以由于杂质影响而导致乳酸外消旋化，所以如果为50℃～180℃、更优选为60℃～150℃，则能够理想地进行乳酸蒸馏。
在进行上述工序B之前，对透过纳滤膜的含乳酸的溶液，既可以使用以蒸发器为代表的浓缩装置一次浓缩含乳酸的溶液，又可以将工序A所得的含乳酸的溶液进一步供给工序D，即利用反渗透膜进行过滤从而提高乳酸浓度的工序，从减少用于浓缩的能量的观点出发，优选采用利用反渗透膜进行过滤从而提高乳酸浓度的工序D。这里所谓反渗透膜，是以大于等于被处理液渗透压的压力差为动力，除去离子、低分子量分子的过滤膜，可以采用例如，乙酸纤维素等纤维素系、通过多官能团胺化合物与多官能团酰卤缩聚而在多微孔性支持膜上设置聚酰胺分离功能层而得的膜等。为了抑制反渗透膜表面污染、即结垢，还优选采用主要为下水处理用的低结垢反渗透膜等，该反渗透膜等是通过在聚酰胺分离功能层的表面被覆具有至少1个与酰卤基反应的反应性基团的化合物的水溶液，使分离功能层表面残存的酰卤基与该反应性基团之间形成共价键，从而得到的。因为本发明的工序B能够除去大部分2价钙离子，所以反渗透膜表面不生成结垢，可以稳定地进行膜浓缩。
接下来，对于用于供给本发明的乳酸制造方法的利用微生物发酵培养的乳酸生产进行说明。
作为利用微生物发酵培养的乳酸生产中所使用的发酵原料，只要能促进培养的微生物生长、良好地生产作为目的发酵产物的乳酸即可，可以是适当含有碳源、氮源、无机盐类和必要的氨基酸、维生素等有机微量营养素的普通液体培养基。作为碳源，可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类，含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜，以及乙酸等有机酸、乙醇等醇类、甘油等。作为氮源，可以使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类，其他辅助性使用的有机氮源、例如油粕类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浆(corn steepliquor)、酵母或酵母提取物、肉提取物、蛋白胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。作为无机盐类，可以适当添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。在本发明中所用的微生物生长需要特定营养素(例如，氨基酸等)的情况下，可以添加该营养物质本身或者含有该营养物质的天然物。此外，还可以根据需要使用消泡剂。本发明中，所谓培养液，是指微生物或培养细胞在发酵原料中生长而得的液体。补加到培养液中的发酵原料的组成也可以在培养开始时的发酵原料组成基础上进行适当变化，以提高作为目标的乳酸的生产性。
本发明中，微生物培养优选在pH值4-8、温度20-40℃的范围内进行。此外，在微生物的培养中，如果必须提高氧气的供给速度，则可以在空气中加入氧气并将氧气浓度保持在21％以上，或者使用加压培养、提高搅拌速度、提高通气量等方法。
在微生物培养初期，进行分批培养或补料分批培养来提高微生物浓度，然后既可以开始连续培养(提取)，也可以接种高浓度菌体、在开始培养的同时进行连续培养。可以在适当时期供给原料培养液和提取培养物。供给原料培养液与提取培养物的开始时期可以不同。此外，供给原料培养液和提取培养物既可以是连续的，也可以是分批的。可以在原料培养液中添加如上所述的菌体生长所需的营养素，从而使菌体生长连续地进行。对于培养液中微生物或培养细胞的浓度，为了得到效率良好的生产性，优选在不造成培养液的环境不适应微生物或培养细胞生长、死亡率升高的范围内，维持高浓度状态，作为一例，通过维持干重为5g/L以上可获得良好的生产效率。
在使具有发酵生产能力的新鲜菌体生长的同时进行的连续培养操作，通常从培养管理上考虑，优选在单一发酵槽中进行。但是，如果是在菌体生长的同时生成产物的连续培养法，则不限制发酵槽的数量。由于发酵槽容量小等原因，也可使用多个发酵槽。在这种情况下，将多个发酵槽用配管并联或者串联起来进行连续培养，也能获得发酵产物的高生产性。
对于本发明中使用的微生物不特别限制，可列举例如，在发酵工业中经常使用的面包酵母等酵母，大肠杆菌、棒状杆菌等细菌，丝状真菌、放线菌等。本发明中使用的微生物也包括动物细胞、昆虫细胞等的培养细胞。使用的微生物可以是从自然环境中分离出来的微生物，也可以是通过突变、基因重组而改变了部分性质的微生物。
实施例
以下，使用实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
参考例1具有乳酸生产能力的酵母菌株的制作
如下所述制成具有乳酸生产能力的酵母菌株。具体地说，通过将人源L-LDH基因连接在酵母基因组上PDC1启动子的下游，来制成具有L-乳酸生产能力的酵母菌株。聚合酶链反应(PCR)使用La-Taq(宝酒造株式会社制)、或者KOD-Plus-polymerase(东洋纺株式会社制)，按照所附操作说明来进行。
培养回收人乳腺癌细胞株(MCF-7)，然后使用TRIZOL Reagent(Invitrogen社制)提取总RNA，以得到的总RNA为模板，使用SuperScriptChoice System(Invitrogen社制)通过逆转录反应来合成cDNA。这些操作的详细内容分别按照各自所附的方案(Protocol)进行。将得到的cDNA作为后续PCR的扩增模板。
以上述操作所得的cDNA为扩增模板，以序列号1和序列号2所示寡核苷酸为引物对，利用KOD-Plus-polymerase通过PCR来克隆L-LDH基因。纯化各个PCR扩增片段，用T4多核苷酸激酶(宝酒造株式会社制)将末端磷酸化，然后连接在pUC118载体(用限制性酶HincII切割，并将切割面进行了去磷酸化处理的载体)上。使用DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造株式会社制)进行连接反应。用连接质粒产物转化大肠杆菌DH5α，回收质粒DNA，从而获得亚克隆了人源L-LDH基因(登录号：AY009108、序列号3)的质粒。将得到的插入了L-LDH基因的pUC118质粒用限制性酶XhoI和NotI消化，将得到的各DNA片段插入到酵母表达用载体pTRS11的XhoI/NotI切割位点。这样得到了人源L-LDH基因表达质粒pL-LDH5。
以含有人源L-LDH基因的质粒pL-LDH5为扩增模板，以序列号4和序列号5所示的寡核苷酸为引物对，通过PCR扩增含有1.3kb的人源L-LDH基因和来自酿酒酵母的TDH3基因的终止子序列的DNA片段。此外，以质粒pRS424为扩增模板，以序列号6和序列号7所示的寡核苷酸为引物对，通过PCR扩增含有1.2kb的来自酿酒酵母的TRP1基因的DNA片段。将各个DNA片段分别用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离，按照常规方法纯化。将这里所得的1.3kb片段、1.2kb片段混合作为扩增模板，以序列号4和序列号7所示的寡核苷酸为引物对，通过PCR法获得产物，将获得的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法制备人源LDH基因和TRP1基因连接而成的2.5kb的DNA片段。按照常规方法，用该2.5kb的DNA片段转化非色氨酸营养缺陷型的芽殖酵母NBRC10505株。
如下所述来确认得到的转化细胞是将人源L-LDH基因连接在酵母基因组上的PDC1启动子下游的细胞。首先，通过按照常规方法制备转化细胞的基因组DNA，以该基因组DNA为扩增模板，以序列号8和序列号9所示的寡核苷酸为引物组，通过PCR得到0.7kb的扩增DNA片段来确认。此外，对于转化细胞是否具有乳酸生产能力，通过在下述条件下利用HPLC法测定乳酸量，来确定在SC培养基(METHODS IN YEAST GENETICS2000 EDITION，CSHL PRESS)中培养转化细胞的培养上清液中含有乳酸。
柱：Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)，流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)，反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris[二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷]、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)，检测方法：电导率，温度：45℃。
此外，在以下条件下用HPLC法测定L-乳酸的光学纯度。
色谱柱：TSK-gel Enantio L1(東ソ一株式会社制)，流动相：1mM硫酸铜水溶液，流速：1.0ml/分钟，检测方法：UV254nm，温度：30℃。
另外，用式4计算L-乳酸的光学纯度。这里，L表示L-乳酸的浓度，D表示D-乳酸的浓度。
光学纯度(％)＝100×(L-D)/(L+D)……(式4)。
HPLC分析的结果是，检测到4g/L的L-乳酸，D-乳酸为检测限以下。通过以上研究，确认了该转化体具有L-乳酸生产能力。将所得转化细胞制成酵母SW-1株，用于接下来的实施例。
参考例2通过分批发酵制造L-乳酸
作为使用微生物的发酵形态，进行最典型的分批发酵，评价其乳酸生产性。使用表1所示的乳酸发酵培养基进行分批发酵试验。该培养基在高压蒸汽灭菌(121℃、15分钟)后使用。作为微生物使用参考例1所制成的酵母SW-1株，使用参考例1所示的HPLC评价产物乳酸的浓度，使用グルコ一ステストワコ一C(和光纯药工业株式会社制)测定葡萄糖浓度。以下显示参考例2的操作条件。
反应槽容量(乳酸发酵培养基量)：2(L)，温度调整：30(℃)，反应槽通气量：0.2(L/分钟)，反应槽搅拌速度：400(rpm)，pH值调整：用1N氢氧化钙调整至pH值5。
首先，在盛有5ml乳酸发酵培养基的试验管中将SW-1株振荡培养过夜(预培养)。将预培养液接种到100ml新鲜的乳酸发酵培养基中，并在500ml振荡烧瓶中振荡培养24小时(前培养)。调整温度、调整pH值，进行发酵培养。此时的菌体生长量是600nm的吸光度为15。分批发酵的结果示于表2。
[表1]
葡萄糖 100g/L
酵母含氮碱性培养基(无氨基酸)(Difco社) 6.7g/L
除亮氨酸之外的19种标准氨基酸 152mg/L
亮氨酸 760mg/L
肌醇 152mg/L
对氨基苯甲酸 16mg/L
腺嘌呤 40mg/L
尿嘧啶 152mg/L
[表2]
  发酵时间   72小时
  葡萄糖总投入量   100g
  乳酸总产量   26g
  未被利用的葡萄糖   0g
  乳酸相对于糖的收率   26％
  乳酸产生速度   0.36g/L/小时
参考例3纳滤膜的硫酸镁渗透性评价
在10L超纯水中添加10g硫酸镁(和光纯药工业株式会社制)，在25℃搅拌1小时，调制成1000ppm的硫酸镁水溶液。接下来，在膜过滤装置的原液层1中注入10L上述所调制的硫酸镁水溶液。作为图2的符号7所示的90ф纳滤膜，将交联哌嗪聚酰胺半透膜“UTC60”(纳滤膜1，東レ制)、交联哌嗪聚酰胺半透膜“NF-400”(纳滤膜2，フイルムテツク制)、聚酰胺半透膜“NF99”(纳滤膜3，アルフアラバル制)、乙酸纤维素半透膜“GEsepa”(纳滤膜4，GE Osmonics制)分别安装在不锈钢(SUS316制)制的腔室中，将原液温度调整为25℃，将高压泵3的压力调整为0.5MPa，回收渗透液4。在以下条件下通过离子色谱法(DIONEX制)分析原液槽1、渗透液4中所含的硫酸镁浓度，计算硫酸镁的渗透率。
阴离子：柱(AS4A-SC(DIONEX制))，洗脱液(1.8mM碳酸钠/1.7mM碳酸氢钠)，温度(35℃)。
阳离子：柱(CS12A(DIONEX制))，洗脱液(20mM甲磺酸)，温度(35℃)。
结果示于表3。
[表3]
品名(制造商名) 膜原料   过滤压(MPa)  原液硫酸镁浓度(ppm)   渗透液硫酸镁浓度(ppm)   硫酸镁渗透率(％)
  纳滤膜1   UTC60(東レ)   交联哌嗪聚酰胺   0.5  1000   2   0.2
  纳滤膜2   NF-400(フイルムテツク)   交联哌嗪聚酰胺   0.5  1000   20   2
  纳滤膜3   NF99(アルフアラバル)   聚酰胺   0.5  1000   20   2
  纳滤膜4   Gesepa(GEosmonics)   乙酸纤维素   0.5  1000   30   3
参考例4纳滤膜的柠檬酸渗透性评价
在10L超纯水中添加10g柠檬酸(和光纯药工业株式会社制)，在25℃搅拌1小时，调制成1000ppm的柠檬酸水溶液。接着，在与参考例3相同的条件下回收纳滤膜1～4的渗透液。在以下条件下通过高效液相色谱法(株式会社岛津制作所制)分析原液槽1、渗透液4中所含的柠檬酸浓度，计算出柠檬酸的渗透率和柠檬酸渗透率/硫酸镁渗透率。
柱：Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)，流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)，反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)，检测方法：电导率，温度：45℃。
结果示于表4。
Figure G2008800222245D00181
参考例5～25
(用纳滤膜过滤的培养液的准备)
对参考例1、2中进行了乳酸发酵的培养液(2L)滴加浓硫酸(和光纯药工业株式会社制)，至pH值为1.9(参考例5)、2.0(参考例6～9)、2.2(参考例10～13)、2.6(参考例14～20)、4.0(参考例21～24)，然后在25℃搅拌1小时，将培养液中的乳酸钙转换成乳酸和硫酸钙。接下来，通过使用定性滤纸No2(アドバンテツク株式会社制)将沉淀的硫酸钙进行吸附过滤，从而滤除沉淀物，回收滤液2L。此外，对于未添加浓硫酸的pH值5的培养液(2L)也进行分离实验(参考例25)。
(利用纳滤膜的分离实验)
接着，在图1所示的膜过滤装置的原液槽1中注入上述实施例所得的2L滤液。作为图2的符号7的90ф纳滤膜，将所述纳滤膜1～4分别安装在不锈钢(SUS316制)制的腔室中，将高压泵3的压力分别调整为1MPa、3MPa、4MPa、5MPa，分别回收各个压力下的渗透液4。在与参考例3相同的条件下通过离子色谱法(DIONEX制)分析原液槽1、渗透液4中所含的硫酸离子、钙离子的浓度，在与参考例1相同的条件下通过高效液相色谱法(株式会社岛津制作所制)分析原液槽1、渗透液4中所含的乳酸的浓度。结果示于表5。
Figure G2008800222245D00201
如表5所示，可知在所有的pH值、过滤压力下，都能高效除去硫酸钙。此外，在上述参考例5～25中，可以在不将纳滤膜更换成新膜的状态下，在上述过滤压下高效除去硫酸钙。
实施例1～4
(使用蒸发器浓缩含乳酸的溶液并蒸馏浓缩液)
对参考例7、参考例11、参考例15、参考例22的渗透液各1L，使用旋转蒸发器(东京理化器械株式会社制)在减压条件下(50hPa)蒸发水而进行浓缩。这时，未发现硫酸钙析出。
接着，在133Pa、130℃的条件下进行减压蒸馏。为了确认经蒸馏的乳酸的外消旋化，采用高效液相色谱法测定蒸馏前后的光学纯度，结果未发现光学纯度降低。结果示于表6。
[表6]
纳滤膜 pH   纳滤膜渗透液乳酸浓度(g/L)   蒸发器浓缩后乳酸浓度(g/L) 浓缩后析出物   蒸馏前光学纯度(％e.e.)   蒸馏后光学纯度(％e.e.)   蒸馏收率(％)
 实施例1   纳滤膜1   2   24.1   810   无   99.9   99.9   81
 实施例2   纳滤膜1   2.2   24.9   798   无   99.9   99.9   84
 实施例3   纳滤膜1   2.6   26.8   821   无   99.9   99.9   88
 实施例4   纳滤膜1   4   21   788   无   99.9   99.9   92
实施例5～13
(使用反渗透膜浓缩含乳酸的溶液)
将参考例5(纳滤膜1、pH1.9)的渗透液、参考例7(纳滤膜1、pH2.0)的渗透液、参考例11(纳滤膜1、pH2.2)的渗透液、参考例15(纳滤膜1、pH2.6)的渗透液、参考例18(纳滤膜2、pH2.6)的渗透液、参考例19(纳滤膜3、pH2.6)的渗透液、参考例20(纳滤膜4、pH2.6)的渗透液、参考例22(纳滤膜1、pH4.0)的渗透液、参考例25(纳滤膜1、pH5.0)的渗透液各1.9L，注入图1所示的膜过滤装置的原液槽1中。作为图2的符号7的90ф反渗透膜，将聚酰胺制反渗透膜(UTC-70、東レ株式会社制)分别安装在不锈钢(SUS316制)制的腔室中，将高压泵3的压力分别调整至3MPa，回收反渗透膜浓缩液5。在与参考例1相同的条件下，通过高效液相色谱法(株式会社岛津制作所制)分析膜浓缩液中所含的乳酸浓度。结果示于表7。
(含乳酸的溶液的蒸馏)
对上述反渗透膜浓缩液各0.4L，使用旋转蒸发器(东京理化器械株式会社制)在减压条件下(50hPa)蒸发水而进行浓缩。这时，未发现硫酸钙析出。接着，在133Pa、130℃条件下进行减压蒸馏。为了确认蒸馏的乳酸的外消旋化，通过高效液相色谱法测定蒸馏前后的光学纯度，结果未发现光学纯度降低。结果示于表7。
[表7]
纳滤膜 pH   纳滤膜渗透液乳酸浓度(g/L)  操作压力(MPa)   反渗透膜浓缩液乳酸浓度(g/L) 浓缩后析出物   蒸馏前光学纯度(％e.e.)   蒸馏后光学纯度(％e.e.)   蒸馏收率(％)
  实施例5  纳滤膜1   1.9   22.9  3   114.5   无   99.9   99.9   76
  实施例6  纳滤膜1   2   24.1  3   120.5   无   99.9   99.9   81
  实施例7  纳滤膜1   2.2   24.9  3   124.5   无   99.9   99.9   84
  实施例8  纳滤膜1   2.6   26.8  3   134   无   99.9   99.9   88
  实施例9  纳滤膜2   2.6   21.2  3   106   无   99.9   99.9   80
  实施例10  纳滤膜3   2.6   21.9  3   109.5   无   99.9   99.9   80
  实施例11  纳滤膜4   2.6   21  3   105   无   99.9   99.9   84
  实施例12  纳滤膜1   4   21  3   105   无   99.9   99.9   92
  实施例13  纳滤膜1   5   8.3  3   41.5   无   99.9   99.9   90
比较例1
(利用定性滤纸的过滤实验)
与实施例1～4同样，对参考例1、2中进行了乳酸发酵的培养液(2L)滴加浓硫酸(和光纯药工业株式会社制)至pH值为2.0，然后在25℃搅拌1小时。将沉淀的硫酸钙使用定性滤纸No2(アドバンテツク制)通过吸附过滤而滤除。通过离子色谱法分析滤液中所含的硫酸钙的浓度，结果钙离子浓度为549mg/L。由此可知，硫酸钙未被完全除去。
比较例2
(乳酸的蒸馏)
对比较例1所得的滤液1L(乳酸浓度：24g/L)，使用旋转蒸发器(东京理化制)，在减压条件下(50hPa)蒸发水而进行浓缩，结果未被上述定性滤纸除去的硫酸钙析出。接着，在133Pa、130℃下进行减压蒸馏。为了确认经蒸馏的乳酸的外消旋化，在与参考例1同样的条件下通过高效液相色谱法测定蒸馏前后乳酸的光学纯度，结果发现光学纯度降低。此外，在蒸馏残渣中确认了部分低聚化的乳酸。结果示于表8。
[表8]
  蒸馏前光学纯度(％e.e.)   蒸馏后光学纯度(％e.e.)
  99   94
以上实施例和比较例的结果表明，利用纳滤膜，能够高效除去培养液中的硫酸钙。即，表明了根据本发明，可以用纳滤膜高效除去微生物培养液的乳酸溶液中的钙成分，且即使浓缩钙成分也不析出，并且即使进行蒸馏工序也不发生外消旋化、低聚化。
工业可利用性
通过本发明的乳酸制造方法得到的乳酸，除了适合作为食品、药品使用之外，还适合作为生物分解性塑料聚乳酸的单体原料使用。

Claims (9)

1.一种乳酸的制造方法，是通过分离经微生物发酵培养而在培养液中产生的乳酸，从而制造乳酸的方法，包括下述工序A和工序B，工序A是将该培养液通过纳滤膜进行过滤的工序，工序B是将工序A所得的含乳酸的溶液在1Pa～大气压的压力下、在25℃～200℃进行蒸馏并回收乳酸的工序。
2如权利要求1所述的乳酸的制造方法，所述工序A中通过纳滤膜的培养液的pH值为2～4.5。
3.如权利要求1或2所述的乳酸制造方法，所述培养液是在钙盐存在下进行微生物发酵培养的培养液，将经过工序C之后得到的含乳酸的培养液供给上述工序A，所述工序C是将该培养液中的钙成分作为难溶性硫酸盐除去的工序。
4.如权利要求1～3的任一项所述的乳酸的制造方法，在操作压力0.5MPa、原液温度25℃、原液浓度1000ppm的条件下，所述纳滤膜的硫酸镁渗透率相对于柠檬酸渗透率的比为3以上。
5.如权利要求1～4的任一项所述的乳酸的制造方法，在操作压力0.5MPa、原液温度25℃、原液浓度1000ppm的条件下，所述纳滤膜的硫酸镁渗透率为1.5％以下。
6.如权利要求1～5的任一项所述的乳酸的制造方法，所述纳滤膜的膜原料包含聚酰胺。
7.如权利要求6所述的乳酸的制造方法，其特征在于，所述聚酰胺以交联哌嗪聚酰胺为主成分、且含有化学式(1)所示构成成分，
Figure A2008800222240002C1
化学式(1)
上式中，R表示-H或-CH3，n表示0～3的整数。
8.如权利要求1～7的任一项所述的乳酸的制造方法，所述工序A中培养液的过滤压为0.1MPa～8MPa。
9.如权利要求1～8的任一项所述的乳酸的制造方法，包括工序D，即将上述工序A所得的含乳酸的溶液用反渗透膜过滤从而提高乳酸浓度的工序。
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