CN101688194A - 去毒的肺炎球菌神经氨酸酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了设计用于减轻或预防肺炎球菌感染、鼻部携带、鼻部建群和中枢神经系统侵入的组合物。本文提供了包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗－神经氨酸酶免疫应答的其变体。还提供了制备和使用本文公开的组合物的方法。具体地，提供了在受治疗者中产生抗体的方法，所述方法包括向受治疗者施用本文教导的药剂或组合物。也提供了减轻或预防受治疗者中的鼻部携带或肺炎球菌感染的方法，所述方法包括向受治疗者施用本文教导的组合物。

Description

去毒的肺炎球菌神经氨酸酶及其用途

关于联邦资助研究的声明

本发明是以来自美国国立卫生研究院的拨款DC 04976、AI 21548和P30 DK 54781和以来自美国国立变态反应和传染病研究所的合同NO1 AI65299在美国政府支持下进行的。美国政府可享有本发明的某些权利。

背景

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种相当普遍的人类病原体，其可感染包括肺、中枢神经系统(CNS)、中耳和鼻道在内的多个器官。这些组织的感染产生各种症状，诸如支气管炎、肺炎、脑膜炎和窦感染。肺炎链球菌是人类中细菌性脑膜炎的主要致因，并且尽管有抗生素治疗，仍与显著的死亡率和发病率相关。Quagliarello等人，(1992)N.Eng.J.Med.327：869-872。肺炎链球菌脑膜炎可引起永久性神经后遗症。发达国家与发展中国家的肺炎链球菌脑膜炎的发生率分别为每100,000人口1-2例和20例。Anon，(2000)CDSC European Bacterial Meningitis Surveillance Project(CDSC欧洲细菌性脑膜炎监视计划)。美国的肺炎球菌脑膜炎致死率为大约18％。Fedson等人，(1994)Arch.Intern.Med.154：2531-2535。肺炎球菌脑膜炎的最高发生率发生在1-4岁的儿童(所有细菌性脑膜炎的30％)、然后是15-19岁(14％)和1-11个月大的婴儿(13％)。Anon，(2000)CDSCEuropean Bacterial Meningitis Surveillance Project(CDSC欧洲细菌性脑膜炎监视计划)。在发达国家和发展中国家中，老年人也均受链球菌脑膜炎的严重影响。Butler等人，(1999)Drugs Aging 15(Suppl.1)：11-19；Fedson等人，(1999)Vaccine 17 Suppl.1：S11-18。

世界范围内的肺炎链球菌的主要储存宿主存在于人类鼻部携带。感染的获得通常是来自带菌者，并且感染总是在鼻部携带之后。认为鼻咽建群是肺炎链球菌向下呼吸道、鼻窦和中耳传播的先决条件。因此，阻止携带的任何医学干预将不仅能消除受治个体的疾病风险，而且还将产生群体免疫并极大地降低甚至群落中未治疗成员的感染风险。虽然肺炎链球菌是重要的人病原体，但是对肺炎链球菌引起鼻部携带或脑膜炎的机制仍知之甚少。

发明概述

本文提供了设计用于减轻或预防细菌感染(例如肺炎球菌感染)、鼻部携带、鼻部建群和CNS侵入的组合物。任选地，所述组合物可设计为用于粘膜施用。本文提供了包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。所述组合物，包括，例如SEQ ID NO：19和其变体，可以是去毒的。所述组合物还可包含可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的SEQ IDNO：19的变体。

还提供了在受治疗者中产生针对肺炎球菌神经氨酸酶的免疫应答和/或抗体的方法，所述方法包括向受治疗者施用包含所述的药剂的组合物。例如，可通过向受治疗者施用多肽而在受治疗者中产生抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体。所述组合物，包括，例如SEQ ID NO：19和其变体，可以是去毒的。任选地，所述组合物可适合施用于粘膜表面或用于全身施用。

还提供了包含针对肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分的抗体与药学可接受载运体(carrier)的组合物。任选地，所述组合物可适合施用于粘膜表面或用于全身施用。

还提供了减轻或预防受治疗者中的鼻部携带、鼻部建群或细菌感染(例如肺炎球菌感染)的方法，所述方法包括用本文教导的组合物接触受治疗者的鼻粘膜。

附图简述

附图包括于本说明书并构成本说明书的一部分，其说明了下述几个方面。

图1显示3X10⁶ CFU的肺炎链球菌无荚膜R36A株系或烈性EF3030株系向xid小鼠的鼻部递送。鼻部攻击后1和4天，收集神经元组织、鼻嗅神经和上皮细胞(ON/E)、嗅球(OB)和脑和淋巴组织(NW、NALT、CLN和肺)，切碎，并分析活体肺炎链球菌的存在。所示为log₁₀菌落形成单位(CFU)的平均值+一个标准误差(SE)。Y-轴上的0值代表不存在可检测的CFU。所示为每组5只小鼠的平均CFU+SE，每个平均值代表三次不同的实验。

图2显示鼻部攻击后肺炎链球菌株系EF3030 CFU的器官分布动力学。在第4、11、18、25和39天收集ON/E、OB、脑、血液、NW、NALT、CLN和肺组织，并分析肺炎链球菌的存在。3X10⁶CFU等份的肺炎链球菌造成鼻道建群和随后的OB感染。Y-轴上的0值代表不存在可检测的CFU。所示为三次单独实验的平均CFU+SE。每个时间点代表10只小鼠，第39天为例外，其代表5只小鼠。

图3显示与神经节苷脂(GLS)预孵育后肺炎链球菌株系EF3030的分别。在鼻部应用之前，等份(3X10⁷CFU)肺炎链球菌与20μg脱唾液酸-GM1(a-GM1)或125μg混合的GLS(MG)孵育30分钟。四天后收集ON/E、OB、脑和NW、NALT和肺，并分析肺炎链球菌的数量。Y-轴上的0值代表不存在可检测的CFU。所示为5只小鼠的平均值+1SE，并且按照对所检查的数据的适用性，根据Student t-检验或Mann-Whitney双样品秩检验(Mann-Whitney two sample rank test)统计分析获得P-值。数据代表两次单独的实验。

图4A-F显示鼻部攻击后OB中肺炎链球菌TIGR4株系的检测。鼻部给予5X10⁵CFU的等份，并在攻击后一周分析血液、NW、ON/E、OB和脑组织中的建群(图4A和4B)。还通过PCR分析了这些组织(10μg DNA)中肺炎球菌溶血素基因的存在(图4C)。此外，还通过PspA-特异性Ab的免疫荧光显现了对照(D)或肺炎链球菌攻击的小鼠的OB中的肺炎链球菌(图E和F)。所示为平均值+1SE。数据代表三次单独的实验。

图5显示分泌型NanA TIGR4的基序和NanAR6(2型，其具有用于连接至细胞壁的LPXTG(SEQ ID NO：14)基序)的基序之间的比较。TIGR4基因包括在编码LPETG(SEQ ID NO：13)基序的序列之前的终止密码子。没有此基序，NanA被TIGR4分泌到环境中。

图6A显示以肺炎链球菌亲代株系TIGR4(■)或NanA等基因突变体TIGR4/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的鼻部洗液中能存活的肺炎链球菌的动力学。每个点代表来自每只小鼠的每毫升鼻部洗液的细菌总数。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005代表与接种TIGR4的小鼠相比的统计显著性。

图6B显示以肺炎链球菌亲代株系TIGR4(■)或NanA等基因突变体TIGR4/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠中的鼻部建群动力学。每个点代表来自每只小鼠的每克组织的细菌总数。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005代表与接种TIGR4的小鼠相比的统计显著性。

图6C显示以肺炎链球菌亲代株系TIGR4(■)或TIGR4/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠的嗅球中的CFU动力学。每个点代表来自每只小鼠的每克组织的细菌总数。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005表明与接种TIGR4的小鼠相比的统计显著性。

图7A显示以肺炎链球菌亲代株系EF3030(■)或EF3030/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠中的鼻部建群动力学。每个点代表来自每只小鼠的每毫升鼻部洗液的细菌总数。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005表明与接种EF3030的小鼠相比的统计显著性。

图7B显示以肺炎链球菌亲代株系EF3030(■)或EF3030/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠中的鼻部建群动力学。每个点代表来自每只小鼠的每克组织的细菌总数。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005代表与接种EF3030的小鼠相比的统计显著性。

图7C显示以肺炎链球菌亲代株系EF3030(■)或NanA等基因突变体EF3030/nanA-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠中的鼻部建群动力学。每个点代表来自每只小鼠的每克组织的细菌总数。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005代表与接种EF3030的小鼠相比的统计显著性。当将所有时间点的野生型和突变体数据汇集在一起时，EF3030和EF3030NanB-之间的比较在P＝0.001下是统计学显著的。

图8显示接种后4天，以肺炎链球菌亲代株系TIGR4(■)或TIGR4/nanB-(○)鼻内感染的CBA/N小鼠中的鼻部建群动力学。每个点代表来自每只小鼠的每毫升鼻部洗液或每克组织的细菌总数。没有一种情形中TIGR4和TIGR4/nanB-之间的差异是统计学显著的。

图9显示接种后4天，以肺炎链球菌亲代株系TIGR4(■)TIGR4/nanA-(○)或TIGR4/AB-鼻内感染的CBA/N小鼠中的鼻部建群动力学。每个点代表来自每只小鼠的每毫升鼻部洗液或每克组织的细菌总数。没有一种情形中TIGR4/nanA-和双突变体TIGR4/nanAB-之间的差异是统计学显著的。

图10显示鼻部攻击后通过抗-磷酸胆碱-特异性单克隆抗体的肺炎链球菌鼻部建群的抑制。鼻部攻击后通过抗-PC-特异性mAb的肺炎链球菌鼻部建群的抑制。总计1X10⁶CFU的TIGR4株系与5μg IgG3亚类或IgM同种型的抗-PC mAb孵育。每个鼻孔(nare)施用总计5μl。所示分别为应用9小时和12小时后500μl鼻部洗液中的CFU。所示为每组5只小鼠的平均值+SD。

图11显示R6NanA和TIGR4NanA的比对以及TIGR4NanA的片段的比对。rNanA571引发针对肺炎链球菌攻击的体内(in vivo)保护。

图12是显示以rNanA571和对照进行的示例性免疫接种方案的示意图。

图13显示用rNanA571免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的血液中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。黑色方块代表菌血症动物。模拟动物接受不相关的克隆蛋白，调节所述克隆蛋白的浓度，以使小鼠接受的LPS的量与rNanA571中存在的相同，所述量通过鲎裂解物测定检测。对照动物接受明矾佐剂而不是rNanA571。

图14显示用rNanA571免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的鼻部洗液中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。黑色方块代表菌血症动物。三角形代表给予模拟免疫接种方案并在其鼻部洗液中具有CFU的动物。菱形代表给予对照免疫接种方案并在其鼻部洗液中具有CFU的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。

图15显示用rNanA571免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的鼻部组织中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。黑色方块代表菌血症动物。三角形代表给予模拟免疫接种方案并在其鼻部组织中具有CFU的动物。菱形代表给予对照免疫接种方案并在其鼻部组织中具有CFU的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。

图16显示用rNanA571免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的肺组织中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。黑色方块代表菌血症动物。三角形代表给予模拟免疫接种方案的动物。菱形代表给予对照免疫接种方案的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。

图17显示用rNanA571免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的嗅球中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。黑色方块代表菌血症动物。三角形代表给予模拟免疫接种方案的动物。菱形代表给予对照免疫接种方案的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。

图18显示用rNanA571免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的脑中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。黑色方块代表菌血症动物。三角形代表给予模拟免疫接种方案的动物。菱形代表给予对照免疫接种方案的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。

图19显示用rNanA571、rNanA215、rNanA186免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的血液中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。三角形代表用rNanA215免疫接种的动物。菱形代表用rNanA186免疫接种的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。实心黑方块代表给予模拟免疫接种方案的动物。空心方块代表给予对照免疫接种方案的动物。X代表死亡的动物。

图20显示用rNanA571、rNanA215、rNanA186免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的鼻部洗液中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。三角形代表用rNanA215免疫接种的动物。菱形代表用rNanA186免疫接种的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。实心黑方块代表给予模拟免疫接种方案的动物。空心方块代表给予对照免疫接种方案的动物。X代表死亡的动物。

图21显示用rNanA571、rNanA215、rNanA186免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的鼻部组织中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。三角形代表用rNanA215免疫接种的动物。菱形代表用rNanA186免疫接种的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。实心黑方块代表给予模拟免疫接种方案的动物。空心方块代表给予对照免疫接种方案的动物。X代表死亡的动物。

图22显示用rNanA571、rNanA215、rNanA186免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的肺中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。三角形代表用rNanA215免疫接种的动物。菱形代表用rNanA186免疫接种的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。实心黑方块代表给予模拟免疫接种方案的动物。空心方块代表给予对照免疫接种方案的动物。X代表死亡的动物。

图23显示用rNanA571、rNanA215、rNanA186免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的嗅球中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。三角形代表用rNanA215免疫接种的动物。菱形代表用rNanA186免疫接种的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。实心黑方块代表给予模拟免疫接种方案的动物。空心方块代表给予对照免疫接种方案的动物。X代表死亡的动物。

图24显示用rNanA571、rNanA215、rNanA186免疫接种的动物与模拟动物和对照动物的脑中的肺炎链球菌菌落形成单位(CFU)。三角形代表用rNanA215免疫接种的动物。菱形代表用rNanA186免疫接种的动物。圆圈代表用rNanA571免疫接种的动物。实心黑方块代表给予模拟免疫接种方案的动物。空心方块代表给予对照免疫接种方案的动物。X代表死亡的动物。

图25A和B显示SEQ ID NO：41(即SEQ ID NO：19减去第一个氨基酸)、与2个2，7-脱水-Neu5AC复合的水蛭(北美水蛭，Macrobdella decora)分子内转唾液酸酶(2sli)(SEQ ID NO：37)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)神经氨酸酶(1kit)(SEQ ID NO：40)、绿色小单胞菌(Micromonospora viridifaciens)唾液酸酶(1eur)(SEQ ID NO：38)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)唾液酸酶(3sil)(SEQ ID NO：39)之间的示例性Fugue比对。

详述

一些现有的数据表明，神经氨酸酶是鼻道的独特致病因子。一个此类观察来自NanA-缺陷型肺炎链球菌株系D39的研究，该株系比其亲代株系更快地从鼻咽清除。Tong等人，(2002)Infect.Immun.68：921-924。神经氨酸酶切割宿主细胞表面上和体液中的多种多样的糖脂、糖蛋白和寡糖的末端唾液酸残基。肺炎球菌脑膜炎患者的脑脊髓液(CSF)中升高水平的游离唾液酸与不良的预后相关。O’Toole等人，(1971)J.Clin.Invest.50：979-985。此酶对肺炎链球菌在人类中的毒力的重要性还得到了两项独立研究的结果的例证，在所述研究中，肺炎链球菌的每种新的临床分离株都具有神经氨酸酶活性。O’Toole等人，(1971)J.Clin.Invest.50：979-985；Kelly等人，J.Bacteriol.94：272-273。此外，肺炎链球菌分离株的小鼠传代常常增加其毒力，已报道这还造成神经氨酸酶活性增加2-5倍。Vishniakova等人，(1992)Zhurnal Mikrobiologii，Epidemiologii i Immunobiologii 9-10：26-9。肺炎球菌C-多糖(也称为磷壁酸)与肺炎球菌F-抗原的多糖部分(也称为脂磷壁质)在结构上相同。Fischer等人，(1993)Eur.J.Biochem 215：851-857。这些分子是革兰氏阳性细菌中肺炎链球菌的独特特征。这些分子上的免疫显性决定簇是磷酸胆碱(PC)残基，并且针对PC的Ab保护免受腹膜内、静脉内或鼻部的肺炎球菌攻击。Briles等人，(1984)Eur.J.Immunol.14：1027-1030；Briles等人，(1981)Nature 294：88-90；Yother等人，(1982)Infect.Immun.36：184-188；Briles等人，(1984)J.Mol.Cell.Immunol.1：305-309。不过，由于所有这些研究评估的是针对由血清介导的全身感染的保护，因此并没有得到关于这些Ab抵抗鼻部建群的能力的信息。但是，表面磷酸胆碱残基是呼吸道细菌表面常见的。Lysenko等人，(2000)Infect.Immun.68：1664-71。

对肺炎链球菌引起鼻部携带和随后的疾病的机制的了解相当地少。截至目前尚没有研究确定减轻或阻止鼻部携带的机制。因为鼻咽建群被认为是肺炎链球菌向下呼吸道、向鼻窦、向循环和向脑扩散的先决条件，所以本领域需要在初始的肺炎球菌建群部位提供粘膜免疫性的手段。阻止在鼻咽的初始肺炎球菌建群阻止了鼻部携带，并降低了个体之间的肺炎链球菌传播。此外，提供鼻咽粘膜表面的免疫性预防或减轻由肺炎链球菌引起的后续疾病。

本文提供了设计用于减轻或预防细菌感染(例如肺炎球菌感染)、鼻部携带、鼻部建群和CNS侵入的组合物和方法。肺炎链球菌在鼻道建群，部分是通过经由C-多糖-神经节苷脂的相互作用穿过上皮屏障以及随后内吞进入上皮细胞。C-多糖通过与神经节苷脂的末端或内部GalNAcβ1-4Gal序列结合而结合脱唾液酸-GM1、脱唾液酸-GM2和岩藻糖基-脱唾液酸-GM1。

这些脱唾液酸神经节苷脂在细胞质膜中的丰度通常是低的，但是人类的肺例外，其可被肺炎链球菌建群。另外，肺炎链球菌自身具有两种神经氨酸酶NanA和NanB(Berry等人，(1996)J.Bacteriol.178：4854-4860)，它们可各自切割N-乙酰神经氨酸与半乳糖的α2，3-和α2，6-连接和切割与N-乙酰-半乳糖胺的α2，6-连接，以从完整的神经节苷脂上除去唾液酸。Scanlon等人，(1989)Enzyme 41：143-150。神经节苷脂上的唾液酸残基与半乳糖是α2，3连接。肺炎链球菌的神经氨酸酶除去存在于所有单唾液酸神经节苷脂中的末端唾液酸残基，和二唾液酸神经节苷脂和三唾液酸神经节苷脂中所见的半乳糖连接的多个唾液酸残基。因此，它们应该能够暴露最常见的哺乳动物细胞表面神经节苷脂中发现的GalNAcβ1-4Gal序列。这些残基是细胞表面的假定C-多糖结合位点。

使用其通常更多地与细胞壁相关联的NanA和被认为是分泌型的NanB，肺炎链球菌在呼吸道的上皮细胞产生了其自身的附着位点。因此，肺炎球菌C-多糖结合脱唾液酸神经节苷脂，特别是脱唾液酸-GM1，并且神经氨酸酶可在ON/E上为C-多糖创建丰富的结合位点，其中所述神经氨酸酶可将相对丰富的GM1转变为脱唾液酸-GM1。这一机制促进了鼻部携带并提供肺炎链球菌通过覆盖鼻甲(ON/E)、嗅球(OB)的鼻嗅神经和上皮细胞进入CNS的机会。相似地，中耳炎和牵涉肺炎链球菌的其他感染可相似地通过分布于中耳的神经获得进入CNS的机会。肺炎链球菌之外的其他细菌具有与之相当的神经氨酸酶，因此其他细菌中也存在相同机制。因此，本文公开了靶向各种细菌中的此机制的组合物和方法。本文教导的药剂、组合物和方法被导向于干扰这种机制，以减轻携带和阻止CNS侵入。

本文提供了包括肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分的组合物，所述肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体。还提供了包含多肽和药学可接受载运体的组合物，所述多肽具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体。SEQ ID NO：19的合适的变体包括但不限于E647T(SEQ ID NO：35)、R663H、E647Q和Y752F(SEQ ID NO：36)。所述组合物和多肽可以是去毒的，所述多肽包括例如SEQID NO：19和其变体。因此，例如，提供了包含去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分的组合物，所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体。在一些形式下，肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分或去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分不是由SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16组成的。

任选地，所述组合物可设计为用于粘膜施用。例如，本文提供了包含肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分和药学可接受载运体的组合物，其中所述组合物适合施用于粘膜表面。任选地，所述组合物可包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体。

任选地，所述组合物可以是气溶胶、鼻喷剂(nasal mist)、鼻喷雾剂(nasalspray)、鼻滴剂(nasal drop)、雾化溶液(nebulizer solution)、气溶胶吸入剂、栓剂形式或适合粘膜施用的任何形式(包括口服施用)。任选地，所述组合物可以以微球或脂质体递送。

施用于粘膜表面意指施用于包括呼吸系统、胃肠系统或泌尿生殖器系统的任何粘膜表面。粘膜表面的实例包括但不限于鼻腔(包括至嗅神经上皮细胞)、鼻咽、直肠、阴道、喉、口、欧氏管、气管、支气管和其他气道以及肠粘膜。

为了施用于粘膜表面，可使用粘膜佐剂。佐剂可与本发明的组合物伴随施用，或在所述组合物施用之前或之后立即施用。任选地，所述组合物还包含佐剂。粘膜佐剂制剂包括例如靶向粘膜诱导部位的药剂。佐剂可任选地选自包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、血管生成因子、凋亡抑制剂和其组合的组。当选择细胞因子作为佐剂时，所述细胞因子可选自包括但不限于以下的组：白介素，包括IL-1、IL-1γ、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15和IL-18；转化生长因子-β(TGF-β)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素-γ(IFN-γ)；或具有佐剂活性的其他细胞因子。具有佐剂活性或其他生物活性的细胞因子的部分或细胞因子的突变体或模拟物(或其组合)也可用于本发明的组合物和方法。

当选择趋化因子作为佐剂时，所述趋化因子可任选地选自包括但不限于淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)、RANTES、LARC、PARC、MDC、TARC、SLC和FKN的组。当选择凋亡抑制剂作为佐剂时，所述凋亡抑制剂可任选地选自包括但不限于胱天蛋白酶-8抑制剂和其组合的组。当选择血管生成因子作为佐剂时，所述血管生成因子可任选地选自包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、乙酰透明质酸(HA)片段和其组合的组。事实上，可选择加上(plus，+)和去掉(minus，-)血管生成因子作为佐剂。

本发明的基本无毒、具有生物活性的粘膜佐剂的其他实例包括激素、酶、生长因子或其生物活性部分。此类激素、酶、生长因子或其生物活性部分可以是例如人、牛、猪、绵羊、犬、猫、马或禽来源的，并可以是肿瘤坏死因子(TNF)、促乳素、表皮生长因子(EGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、促生长素(生长激素)或胰岛素或免疫系统的细胞上表达其受体的任何其他激素或生长因子。

粘膜施用的佐剂还包括细菌毒素，如霍乱毒素(CT)、大肠杆菌(E.coli)热不稳定毒素(LT)、艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素A和百日咳毒素(PT)或其组合、亚基、类毒素、嵌合体或突变体。例如，可使用天然霍乱毒素亚基B(CTB)的纯化制品。这些毒素的任一种的片段、同系物、衍生物和融合物也是合适的，只要它们保留了佐剂活性。优选地，可使用具有降低的毒性的突变体。合适的突变体描述于，例如WO 95/17211(Arg-7-Lys CT突变体)、WO 96/6627(Arg-192-Gly LT突变体)和WO 95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突变体)。可用于本发明方法和组合物的其他LT突变体包括，例如Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。其他佐剂，诸如RH3-配体；CpG-基序寡核苷酸；细菌单磷酰脂A(MPLA)，如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌或福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的单磷酰脂A；皂苷(如，QS21)或聚丙交酯乙交酯(PLGA)微球，也可用于粘膜施用。其他可能的粘膜佐剂是防卫素和含有CpG基序的寡核苷酸。

如全文所用，药学可接受载运体意指不是生物学或其他方面不需要的物质，即所述物质可与所选的化合物一起施用于个体，而不引起任何不期望的生物效应或以有害的方式与含有其的药物组合物的其他组分的任一种相互作用。

本文描述的任何组合物可与药学可接受载运体一起在治疗上使用。本文描述的化合物可方便地配制成包含所述化合物的一种或多种以及药学可接受载运体的药物组合物。参见，如Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿氏药物科学)，最新版本，E.W.Martin Mack Pub.Co.，Easton，PA，其公开了可与本文描述的化合物制剂的制备联合使用的制备药物组合物的典型载运体和常规方法，其通过引用并入本文。这些最通常地将是用于向人类施用组合物的标准载运体。一方面，人类和非人类，包括溶液，诸如无菌水、盐水和生理pH下的缓冲溶液。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

除了所选的分子之外，本文描述的药物组合物可包括但不限于，载运体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和类似物。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，诸如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂和类似药剂。

肺炎球菌神经氨酸酶意指在肺炎球菌细菌中发现的任何神经氨酸酶分子。肺炎球菌神经氨酸酶片段意指在肺炎球菌细菌中发现的任何神经氨酸酶分子的片段。其变体包括保留与这些天然存在的神经氨酸酶或它们的片段的序列相似性和一种或多种功能相似性的非天然存在的多肽。

表1显示来自几个物种的神经氨酸酶包括TIGR4和R6的比对。神经氨酸酶分子还包括例如SP1326。SP1326氨基酸序列可经由GenBank登录号AAK75424访问。Tettelin，H.等人，(2001)Science 293：498-506。在GenBank登录号AAK75424下提供的SP1326的所有信息(包括任何氨基酸和核酸序列)通过此引用整体并入本文。如全文所标明的，除非另外指明，所有氨基酸序列的氨基酸残基均根据肺炎球菌株系R6的氨基酸序列进行编号，如表1所示。根据给定的R6编号，可从表1容易地确定株系TIGR4的对应编号，表1显示TIGR4与R6的比对。例如，TIGR4 NanA的残基35对应于R6NanA的残基50。相似地，TIGR4 NanA的残基186对应于R6NanA的残基200。

表1.ClustalW(v1.4)多重序列比对

比对了3个序列          比对得分＝6332

插入的缺口＝32         保守同一性＝105

逐对比对模式：慢

逐对比对参数：

开放缺口罚分＝10.0     延伸缺口罚分＝0.1

相似性矩阵：blosum

多重比对参数：

开放缺口罚分＝10.0     延伸缺口罚分＝0.1

延迟分歧＝40％         缺口距离＝8

相似性矩阵：blosum

处理时间：3.5秒

R6 NanA           1 MSYFRNRDIDIERNSMNRSVQERKCRYSIRKLSVGAVSMIVGAVVFGTSP    50

TIGR4 NanA        1                MNRSVQERKCRYSIRKLSVGAVSMIVGAVVNGTSP    35

鼠伤寒沙门氏菌    1                                                        0

R6 NanA           51 VLAQEGASEQPLANETQLSGESSTLTDTEKSQPSSETELSGNKQEQERKD  100

TIGR4 NanA        36 VLAQEGASEQPLANETQLSGESSTLTDTEKSQPSSETELSGNKQEQERKD   85

鼠伤寒沙门氏菌    1                                                        0

R6 NanA           101 KQEEKIPRDYYARDLENVETVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLE 150

TIGR4 NanA         86 KQEEKIPRDYYARDLENVETVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLE 135

鼠伤寒沙门氏菌      1                                                      0

R6 NanA        151 NATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSD   200

TIGR4 NanA     136 NATVHMENKPDAKAPAFYNLNSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSD   185

鼠伤寒沙门氏菌 1                                                          0

R6 NanA        201 GKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRT   250

TIGR4 NanA     186 GKQNYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRT   235

鼠伤寒沙门氏菌 1                           MTVEKSVVFKAEG----------EHF    16

                                             ＊＊＊＊  ＊           .

R6 NanA        251 SLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEE   300

TIGR4 NanA     236 SLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEE   285

鼠伤寒沙门氏菌  17 TDQKG-----------------------NTIVGS--------------------27

                     . . ＊                     ＊＊. ＊＊

R6 NanA        301 VQKRSQLFKRSDLEKKLPEGAALTEKTDIFESGRNGKPNKDGIKSYRIPA   350

TIGR4 NanA     286 VQKRSQLNKRSDLEKKLPEGAALTEKTDIFESGRNGNPNKDGIKSYRIPA   335

鼠伤寒沙门氏菌  28 --------------------------------GSGG-----TTKYFRIPA    40

                                                     ＊ .＊ ＊ .＊＊＊＊

R6 NanA        351 LLKTDKGTLIAGADERRLHSSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITNLR   400

TIGR4 NanA     336 LLKTDKGTLIAGADERRLHSSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITNLR   385

鼠伤寒沙门氏菌 41  MCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDR    90

                  .  ＊＊＊＊..  ＊＊ ＊. .＊＊ ＊ ＊＊ ＊.＊＊＊＊....＊＊＊

R6 NanA        401 DNPKASDPSIGSPVNIDMVLVQDPETKRIFSIYDMFPEGKGIFGMSSQKE   450

TIGR4 NanA     386 DNPKASDPSIGSPVNIDMVLVQDPETKRINSIYDMFPEGKGINGMSSQKE   435

鼠伤寒沙门氏菌  91 VNSKLSR-------------VMDP--------------------------   101

                     ＊  ＊＊            ＊ ＊＊

R6 NanA        451 EAYKKIDGKTYQILYREGEKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVDPVKP   500

TIGR4 NanA     436 EAYKKIDGKTYQILYREGEKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVDPVKP   485

鼠伤寒沙门氏菌 102 ---------TCIVANIQG-------RE--TILVMVGKWNNN----DKTWG   129

                              ＊ .  .＊     ＊＊  ＊.    ＊＊ . ＊

R6 NanA        501 AYSDKGDLYKGNQLLGNIYFTTNKTSPFRIAKDSYLWMSYSDDDGKTWSA   550

TIGR4 NanA     486 AYSDKGDLYKGDQLLGNIYFTTNKTSPNRIAKDSYLWMSYSDDDGKTWSA   535

鼠伤寒沙门氏菌 130 AYRDK--------------------AP---DTDWDLVLYKSTDDGVTFSK   156

                   ＊＊ ＊＊                .＊     ＊  ＊ . ＊ ＊＊＊ ＊ ＊

R6 NanA        551 PQDITPMVKADWMKFLGVGPGTGIVLRNGPHKGRILIPVYTTNNVSHLNG   600

TIGR4 NanA     536 PQDITPMVKADWMKFLGVGPGTGIVLRNGPHKGRILIPVYTTNNVSHLDG   585

鼠伤寒沙门氏菌 157 VETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLN--DGKLVFPVQMVR-TKNITT   203

                    .     ..        .  ＊ ＊  ＊.  .   ＊... ＊＊  ..

R6 NanA        601 SQSSRIIYSDDHGKTWHAGEAVNDNRQVDGQKIHSSTMNNRRAQNTESTV  650

TIGR4 NanA     586 SQSSRVIYSDDHGKTWHAGEAVNDNRQVDGQKIHSSTMNNRRAQNTESTV  635

鼠伤寒沙门氏菌 204 VLNTSFIYSTD-GITWSLPSGYCEGFGSE---------NN---------I  234

                      .  ＊＊＊  ＊  ＊  ＊＊  ...    ＊＊    .

R6 NanA        651 VQLNNGDVKLFMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKDIKRYPQVKDVYVQMSA  700

TIGR4 NanA     636 VQLNNGDVKLNMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKDIKRYPQVKDVYVQMSA  685

鼠伤寒沙门氏菌 235 IEFN-ASLVNNIR-NSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNR------  276

                   .. ＊  .    .＊  .＊  .    .＊＊ ＊ ＊＊  .＊

R6 NanA        701 IHTMHEGKEYIILSNAGGPKRENGMVHLARVEENGELTWLKHNPIQKGEF  750

TIGR4 NanA     686 IHTMHEGKEYIILSNAGGPKRENGMVHLARVEENGELTWLKHNPIQKGEN  735

鼠伤寒沙门氏菌 277 ----NHGVQGSTITIPSG----NKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHN  318

                       . ＊ .   ..  ＊   ＊  .＊        .＊       .

R6 NanA        751 AYNSLQELGNGEYGILYEHTEKGQNAYTLSFRKFNWDFLSKDLISPTEAK  800

TIGR4 NanA     736 AYNSLQELGNGEYGILYEHTEKGQNAYTLSNRKNNWENLSKNLISPTEAN  785

鼠伤寒沙门氏菌 319 LYSGEVKLIDDFYPKVGNAS--GAGYSCLSYRKN---VDKETLYVVYEAN  363

                    ＊     ＊    ＊  .  .  ＊ .   .＊＊ ＊＊   ＊  ＊＊

R6 NanA        801 VKRTREMGKGVIGLEFDSEVLVNKAPTLQLANGKTARFMTQYDTKTLLFT  850

TIGR4 NanA     786 NRDGQRR-----------------DGQRSYWLGVRLRSIGQQGSNPSIGK  818

鼠伤寒沙门氏菌 364 ------------------------------------------------GS  365

R6 NanA        851 VDSEDMGQKVTGLAEGAIESMHNLPVSVAGTKLSNGMNGSEAAVHEVPEY  900

TIGR4 NanA     819 WNNSDNPNPVN---------NQDLVVCSRNGRYRTGNYWYSNRKHRKYAN  859

鼠伤寒沙门氏菌 366 IEFQDLSRHLP-------------VIKSYN    (SEQ ID NO：17)   382

                      ＊    .               .   .

R6 NanA        901 TGPLGTSGEEPAPTVEKPEYTGPLGTSGEEPAPTVEKPEYTGPLGTAGEE  950

TIGR4 NanA     860 SSCKSSR----CQSSWRSKWNQSSGANSSR----IYR-------GSNWYR  894

鼠伤寒沙门氏菌 383                                                     382

R6 NanA        951 AAPTVEKPEFTGGVNGTEPAVHEIAEYKGSDSLVTLTTKEDYTYKAPLAQ 1000

TIGR4 NanA     895 ASCSNNR--RVNGINFACNSYYKKRLYLQSSSCSAGTSNNRK-------Q  935

鼠伤寒沙门氏菌 383                                                     382

R6 NanA        1001 QALPETGNKESDLLASLGLTAFFLGLFTLGKKREQ(SEQ ID NO：15)1035

TIGR4 NanA     936 GENPPSFTRTN--------SNLPWSVYAREKERTI (SEQID NO：16)  962

鼠伤寒沙门氏菌 383                                                     382

神经氨酸酶的任何抗原变体或神经氨酸酶片段的任何抗原变体也可用于本文教导的组合物或方法。因此，天然存在的神经氨酸酶或其片段可通过根据本文教导的方法进行氨基酸残基取代、缺失和/或改变而修饰。任选地，此类修饰将设计为使神经氨酸酶或神经氨酸酶片段去毒。例如，SEQID NO：19可以是去毒的。所述神经氨酸酶或神经氨酸酶片段也可包含可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的SEQ ID NO：19的变体。

去毒意指酶活性的降低或消除，优选地同时保持抗原性或免疫原性。这可通过使用位点特异性诱变取代、缺失或改变神经氨酸酶活性位点的氨基酸实现。每种氨基酸取代、缺失或改变可在一个或多个氨基酸残基位置进行。除非另外指明，氨基酸位置编号对应于表1中显示的R6株系。不过，基于R6株系位置，技术人员可容易地确定其他株系包括同样显示于表1的TIGR4株系的对应残基位置。

可任选地进行的一种取代包括用苯丙氨酸取代R6的酪氨酸残基752(TIGR4的737)，如表1所示。可进行的第二种任选的取代包括用苏氨酸取代R6的位置647(TIGR4的632)处的谷氨酸残基，如表1所示。诱变，包括这两种任选的取代，可使用例如Stratagene的

诱变方法(La Jolla，CA)进行。使用此方法，含有期望变化的寡核苷酸引物可用于对包含现有的rNanA571质粒的模板进行PCR。可使用DpnI消除PCR循环结束时剩余的任何未修饰的模板。PCR产物可用于转化大肠杆菌宿主株系的高效感受态细胞。可对转化体进行测序以校验所述突变。使用的引物可以是：

突变体E647T：

有义：5′-cgcaaaatacaacctcaacggtggtac-3′SEQ ID.NO：31

反义：5′-gtaccaccgttgaggttgtattttgcg-3′SEQ ID.NO：32

突变体Y752F：

有义：5′-aaggagagtttgcctttaattcgctccaag-3′SEQ ID.NO：33

反义：5′-cttggagcgaattaaaggcaaactctcctt-3′Seq ID.NO：34

Crennell等人(1993)证明鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶的酶活性位点含有关键的酪氨酸和谷氨酸、以及精氨酸三联体和疏水口袋。Crennell等人，PNAS 90：9852-9856，由于其中教导的神经氨酸酶结构而通过引用整体并入本文。这两个关键的活性位点酪氨酸和谷氨酸氨基酸对应于肺炎链球菌神经氨酸酶的Y752和E647(此处给出的编号是相对于NanA_R6或SEQ IDNO：15)。在Kleineidam等人中，改变产气荚膜梭菌(C.perfringens)A99的小唾液酸酶的等同关键氨基酸造成唾液酸酶的灭活。参见，Kleineidam等人，Biol Chem 382：313-319(2001)，其由于其中教导的结构而通过引用并入本文。

替代地，取代、缺失或改变可以在其他氨基酸内，所述其他氨基酸显示为保守氨基酸残基，并且当在用Fugue运行的比对中观察时，其相对结构位置也是保守的，Fugue是使用结构信息进行序列比对的程序。参见，Shi，J.等人，FUGUE：sequence-structure homology recognition usingenvironment-specific substitution tables and structure-dependent gap penalties(FUGUE：使用环境特异性取代表和结构依赖性缺口罚分的序列结构同源性识别)，J Mol Biol 310：243-257(2001)，其由于其中教导的方法而通过引用并入本文。SEQ ID NO：19、与2个2，7-脱水-Neu5AC复合的水蛭(北美水蛭)分子内转唾液酸酶(2sli)、霍乱弧菌神经氨酸酶(1kit)、绿色小单胞菌唾液酸酶(1eur)和鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶(3sil)之间的示例性Fugue比对显示于图25A和B。

这些位于两个关键活性位点酪氨酸和谷氨酸氨基酸之外的其他保守氨基酸的一些包括R347、I348、P349、D362、R364、Y608、R663、S714、R721、W739、Y767和E768(此处给出的数值是相对于NanA_R6或SEQ IDNO：15)。精氨酸R347、I348和P349在细菌、人类和病毒神经氨酸酶之间是保守的。R364、R663和R721与形成沙门氏菌(Salmonella)酶中的活性位点三联体的三个精氨酸是同源的。其他的一些则参与为活性位点的部分的疏水口袋。

取代、缺失或改变还可发生于氨基酸残基383-390、541-548、609-616或674-681内的Asp盒内。Asp盒内的芳香族残基结束于疏水核心(丝氨酸和色氨酸)，并可抑制或消除酶活性，而天冬氨酸残基自身向外指向溶剂，并因此也可用于去毒目的。Asp盒中的改变可包括例如用谷氨酸或苏氨酸取代天冬氨酸。其他保守的或非保守的氨基酸取代也可用于Asp盒中的天冬氨酸残基或任何其他残基，以便减少毒性。任选地靶向神经氨酸酶的其他区域进行位点特异性诱变。

还公开了神经氨酸酶或其片段，所述神经氨酸酶或其片段在对应于残基750-760的区域和更具体地位置752处的酪氨酸处具有修饰。酪氨酸残基的保守氨基酸取代包括，例如，丝氨酸或苏氨酸，而非保守取代可以是苯丙氨酸。还提供了神经氨酸酶，其在对应于氨基酸残基340-350、600-610或360-370的区域中具有修饰。更具体地，位置347、364、663或721处的精氨酸可用赖氨酸或谷氨酰胺或任何其他保守或非保守的氨基酸取代。本文教导的各种修饰可组合使用。因此，一种或多种保守或非保守的氨基酸取代可任选地存在于同一神经氨酸酶。

与未去毒的神经氨酸酶相比的去毒的神经氨酸酶或神经氨酸酶片段的降低的活性可通过Lock等人(Microb.Pathog.4：33-43，1988)的测定进行测量。使用Lock测定，裂解物、血清或血液中的NanA活性可使用2′-(4-甲基-伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸作为酶测定中的底物进行测量(Lock等人1988)。将10微升底物与10μL血清组合，并在37℃下孵育5分钟。反应使用0.5M碳酸钠停止。神经氨酸酶活性以每分钟释放的4-甲基伞形酮(MU)的量进行测量。MU具有366nm的激发波长和445nm的发射波长。优选所述去毒的神经氨酸酶保留与未去毒的神经氨酸酶相当的抗原性或免疫原性，以使它可与药学可接受载运体组合而形成免疫组合物。对于比较目的，未去毒的神经氨酸酶包括但不限于如表1所示的R6 NanA。在优选的实施方案中，去毒的神经氨酸酶或其片段展示低于1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的未去毒的神经氨酸酶的酶活性。因此，去毒的神经氨酸酶或其片段可展示低于1％的未去毒的神经氨酸酶的活性。因此，所述去毒的神经氨酸酶或其片段可具有与未去毒的神经氨酸酶的酶活性相比无法测量的酶活性。此外，去毒的神经氨酸酶可具有与未去毒的神经氨酸酶相似的保护抗体引发活性。

与未去毒的神经氨酸酶或片段(fagments)相比，去毒的神经氨酸酶或去毒的神经氨酸酶片段可在其氨基酸序列中包括改变(即取代、修饰或缺失)。在优选的实施方案中，去毒的神经氨酸酶包括大约7％、10％、15％或20％的未去毒的神经氨酸酶内发现的氨基酸的改变。优选的氨基酸缺失包括未去毒的神经氨酸酶的N-末端的大约5、10、15或更多个氨基酸的缺失。其他优选的实施方案包括未去毒的神经氨酸酶的C-末端(对于本申请目的，C-末端开始于如表1所示的R6 NanA的氨基酸800)的大约60、50、40、30、20、10、5或更多个氨基酸的缺失。在又其他的优选实施方案中，去毒的神经氨酸酶包括未去毒的神经氨酸酶的C-末端的17、9、8、7、4或2个氨基酸的缺失。某些示例性的优选缺失说明于表1(即，TIGR4 NanA氨基酸序列)。这些改变中的任一种可与一种或多种其他改变组合。优选此类去毒的神经氨酸酶物类展示大约低于1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的未去毒的神经氨酸酶的酶活性。

可使用神经氨酸酶或其片段中的其他保守和非保守取代，其中所述神经氨酸酶或其片段诸如，例如SEQ ID NO：19或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的SEQ ID NO：19的变体。优选神经氨酸酶或其片段保持其抗原性(antigencity)或免疫原性。这些保守取代是天然存在的氨基酸被取代为具有相似性质的氨基酸的取代。此类保守和非保守取代任选地改变多肽的酶功能。例如，可根据表2进行保守取代。

应理解，当需要时，可对编码本发明多肽的核酸和/或本发明多肽的氨基酸序列进行修饰和变更，而仍获得具有相似或其他期望的特性(如，抗原性或免疫原性)的多肽。此类变更可发生于天然分离物或使用位点特异性诱变合成引入，所述程序，诸如错配聚合酶链式反应(PCR)是本领域公知的。例如，多肽中的某些氨基酸可取代为其他氨基酸而没有可察觉的功能活性丧失。因此预期可对本发明多肽的氨基酸序列(或基础的核酸序列)进行各种变更，以造成酶活性的丧失或降低并维持抗原性或免疫原性。

nanA基因或nanA基因的任何部分的缺失可使用Sung等人，(2001)Appl Environ Microbiol 67：5190-5196描述的方法进行，该文献由于其中教导的方法而通过引用整体并入本文。与蛋白质的Arg残基特异性反应的试剂2，3丁二酮用于评估Arg残基对NanA分子折叠的重要性。位点定向诱变可用于改变特定的氨基酸。

神经氨酸酶还可通过化学处理去毒，所述化学处理包括例如变性。化学处理也可与位点特异性诱变组合，以进一步减轻不良的副作用和改善抗原性或免疫原性。在用去毒的神经氨酸酶免疫接种受治疗者之前，所述去毒的神经氨酸酶可用试剂诸如福尔马林、戊二醛、热或用本领域技术人员已知的其他试剂处理。

本文提供了肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原或免疫原部分。例如，提供了包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽。任选地，神经氨酸酶或片段可以是去毒的，其中所述神经氨酸酶或片段包括包含SEQ ID NO：19的多肽。所述多肽还可包含可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的SEQ ID NO：19的变体，优选地去毒的变体。

还提供了组合物，所述组合物包含去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其片段和药学可接受载运体。例如，所述组合物可包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO：19可如本文所述是去毒的。任选地，所述组合物还包含佐剂(包括，例如粘膜佐剂)。所述多肽还可包含可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的SEQ ID NO：19的变体。

可向SEQ ID NO：19或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的其变体添加其他氨基酸残基，只要所述片段保持其抗原性或免疫原性。例如，SEQ IDNO：18包含SEQ ID NO：19和来自如实施例10所述的克隆载体的其他残基。

此外，其他部分可添加至神经氨酸酶或其片段，包括添加至SEQ IDNO：19或添加至可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的SEQ ID NO：19的变体。例如，可添加增加抗原性或免疫原性的部分。此类部分包括，例如细胞因子、趋化因子、生长因子、血管生成因子、凋亡抑制剂、激素、毒素或本文讨论的用作佐剂的其他部分。所述部分可任选地是修饰的或截短的，以用于所述改变的分子。因此，本文提供了肺炎球菌神经氨酸酶嵌合体，所述嵌合体包含神经氨酸酶或其抗原或免疫原片段和增强抗原性或免疫原性的部分，其中所述神经氨酸酶或其抗原或免疫原片段诸如，例如SEQ IDNO：19或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的其变体。还提供了组合物，所述组合物包含肺炎球菌神经氨酸酶衍生物和药学可接受载运体，其中所述肺炎球菌神经氨酸酶衍生物诸如，例如SEQ ID NO：19或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的其变体。任选地，所述组合物还包含佐剂(包括，例如粘膜佐剂)。

任选地，本发明的修饰的神经氨酸酶片段或其部分具有与天然存在的肺炎球菌神经氨酸酶或其片段有至少约70％同源性的氨基酸序列。例如，所述氨基酸序列可与SEQ ID NO：19具有至少约70％同源性。

还提供了核酸，其编码修饰的神经氨酸酶或其片段。应理解，定义本文公开的核酸和蛋白的任何已知变体和衍生物或可能产生的变体和衍生物的一种方式，是通过按照与特定已知序列的同源性来定义变体和衍生物。例如，由表1所示的R6肺炎球菌株系的nanA基因编码的氨基酸序列定义了肺炎球菌神经氨酸酶的具体序列并且定义了该蛋白的具体氨基酸序列。此外，R6或TIGR4肺炎球菌株系nanA基因编码的对应于SEQ IDNO：19的氨基酸序列定义了肺炎球菌神经氨酸酶的具体序列并定义了该蛋白的具体氨基酸序列。特别公开的是本文公开的此序列的变体，所述变体与所述序列具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99百分比同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白或核酸的同源性。例如，同源性可在比对两个序列后计算，以使所述同源性处于其最高水平。

计算同源性的另一方式是通过公布的算法执行。用于比较的序列的最优比对可通过以下实施：Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988)的相似性搜索方法、这些算法的计算机实施(Wisconsin遗传性软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或目测。可获得核酸的相同类型的同源性，通过例如在以下中公开的算法：Zuker，M.Science 244：48-52，1989；Jaeger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：7706-7710，1989；Jaeger等人，Methods Enzymol.183：281-306，1989；它们至少由于与核酸比对相关的材料而通过引用并入本文。

其抗原部分或其免疫原部分意指分子或化合物(如，神经氨酸酶、磷酸胆碱、肺炎球菌磷壁酸、肺炎球菌脂磷壁质)的引发免疫应答的任何表位，所述免疫应答诸如体液免疫应答、细胞免疫应答或抗体产生，其中所述免疫应答是针对所述分子。优选地，抗原部分引发针对分子或肺炎链球菌的免疫性。优选地，抗体可针对或干扰神经氨酸酶的活性位点。

可由所公开的神经氨酸酶和组合物引发的一种免疫应答形式可以是抗-神经氨酸酶免疫应答。抗-神经氨酸酶免疫应答意指针对一种或多种神经氨酸酶的免疫应答，所述神经氨酸酶诸如，例如细菌神经氨酸酶，肺炎球菌神经氨酸酶，肺炎链球菌神经氨酸酶，NanA和NanB。优选的抗-神经氨酸酶免疫应答是中和一种或多种神经氨酸酶的那些。例如，中和神经氨酸酶的抗-神经氨酸酶免疫应答可降低或消除神经氨酸酶的酶活性。中和性抗-神经氨酸酶免疫应答可通过任何合适的方式评估。免疫应答可以是可结合于一种或多种神经氨酸酶的抗体的产生。优选所述免疫应答不是针对或对抗其中产生所述免疫应答的动物中的神经氨酸酶，其中所述动物诸如，例如小鼠或人类。因此，例如，优选所述免疫应答是针对一种或多种神经氨酸酶，诸如，例如细菌神经氨酸酶，肺炎球菌神经氨酸酶，肺炎链球菌神经氨酸酶，NanA和NanB，但不针对人类神经氨酸酶。

评估和确定给定的去毒的、修饰的或变体神经氨酸酶(neuramindase)或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的其片段的有用方式是将所述去毒的、修饰的或变体神经氨酸酶或其片段施用于动物诸如小鼠，或用所述去毒的、修饰的或变体神经氨酸酶或其片段免疫接种动物诸如小鼠，收集产生的抗体，并检验所述抗体降低或消除感兴趣的神经氨酸酶的酶活性的能力，其中所述感兴趣的神经氨酸酶诸如，例如细菌神经氨酸酶，肺炎球菌神经氨酸酶，肺炎链球菌神经氨酸酶，NanA或NanB。测量感兴趣的神经氨酸酶的酶活性的有用方式是通过Lock等人(Microb.Pathog.4：33-43，1988)的方法。

评估和确定给定的去毒的、修饰的或变体神经氨酸酶或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的其片段的其他方式是将所述去毒的、修饰的、变体神经氨酸酶或其片段施用于动物诸如小鼠，或用所述去毒的、修饰的或变体神经氨酸酶或其片段免疫接种动物诸如小鼠，用肺炎链球菌攻击所述动物并评估可从所述动物中回收或在所述动物中发现的菌落形成单位，诸如来自或在所述动物的鼻部洗液、鼻部组织、嗅球、血液、肺和脑中，或以任何合适的方式评估鼻部携带。

本文描述的抗原部分具有根据表1所示的R6株系NanA编号的氨基酸残基。相对于R6 NanA的编号进行描述的每个抗原部分具有来自其他株系包括也显示于表1的TIGR4 NanA的对应的NanA氨基酸。为了引发对抗鼻部建群的保护，用于免疫接种的NanA的肽部分可以足够大，以维持其整体的构象结构。因此，可对SEQ ID NO：19进行其中其整体构象结构得以保持的修饰。

抗原片段的实例包括但不限于，对应于nanA-R6氨基酸序列的残基63-361、存在或不存在保守氨基酸取代或修饰的残基。其他实例包括神经氨酸酶的Asp区域(对应于NanA-R6氨基酸序列的残基383-390、541-548、609-616和674-681)和对应于NanA-R6氨基酸序列的340-350、360-370、568-578、600-610、760-770的区域，所述区域存在或不存在保守氨基酸取代或修饰。任选地，定向于干扰神经氨酸酶的活性位点的抗体可结合于或避免结合于位于SEQ ID NO：15的残基347、364、663或721处的NanA的精氨酸残基；或可结合于或避免结合于位于SEQ ID NO：15的残基383-390、541-548、609-616和674-681处的NanA的Asp盒。此外，所述抗体还可结合或避免结合于位于SEQ ID NO：15的残基575处的缬氨酸或位于SEQ ID NO：15的残基752处的酪氨酸。所述抗体还可结合于或避免结合于上文所列的SEQ ID NO：15的残基的任何组合。

NanA片段的其他实例包括R6 NanA的氨基酸1至340、330至630、620至800、700至1030和330至800。此外，提供了为这些片段的两种或更多种的融合物的片段。融合的片段包括但不限于，与区域620-680融合的区域1至340。融合的片段可表达为重组蛋白。可将编码这些片段的片段克隆于表达载体(pET载体；Novagen，Inc.)，并纯化蛋白。

NanA片段的另一实例可包括存在或不存在保守氨基酸取代或修饰的SEQ ID NO：19。SEQ ID NO：19是对应于SEQ ID NO：15(R6 NanA)的氨基酸残基230-800和对应于SEQ ID NO：16的氨基酸残基215-785的571个氨基酸残基的片段。SEQ ID NO：19的取代、突变或缺失可如上文所述地进行。可任选地进行的一种取代包括用苯丙氨酸取代如表1所示的R6的酪氨酸残基752(TIGR4的737)。可进行的第二种任选的取代包括用苏氨酸取代如表1所示的R6的位置647(TIGR4的632)的谷氨酸残基。本文提及的各种修饰的任一种可组合于一种神经氨酸酶或其片段。

片段可作为合成多肽从载体产生。片段可用于免疫接种动物以产生抗体以及使该片段明确以评估三维结构。此外，提供了编码如本文所述的存在或不存在保守或非保守氨基酸修饰或取代的片段的核酸。还提供了包含所述核酸的载体或表达系统。

本文提供了组合物，所述组合物包含特异性结合肺炎球菌神经氨酸酶或其片段的分离的抗体，其中所述肺炎球菌神经氨酸酶或其片段包括SEQID NO：19。此类抗体用于发展对肺炎链球菌的被动免疫性。所述抗体组合物还包含药学可接受载运体。任选地，所述组合物可适合施用于粘膜表面，但也公开了施用的其他路径，包括如本文所述的全身施用。

本文还公开了产生肺炎球菌神经氨酸酶或肺炎球菌神经氨酸酶的任何表位的特异性抗体的方法，其中所述肺炎球菌神经氨酸酶或肺炎球菌神经氨酸酶的任何表位包括SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：19的任何表位。任选地，所述抗体可通过用有效量的本文公开的组合物接触受治疗者的鼻粘膜而在受治疗者中(即体内)产生。另外，还公开了产生肺炎球菌神经氨酸酶(包括SEQ ID NO：19)的任何组合的特异性抗体的方法，所述方法是通过用有效量的组合物接触受治疗者的鼻粘膜，所述组合物包含神经氨酸酶和/或其片段的组合。

任选地，本文描述的药剂，无论是天然存在的、去毒的或另外地修饰的，均可任选地作为例如在载体内的核酸施用。所述核酸的表达然后将造成受治疗者与由此表达的所期望的多肽接触。因此，例如，如果编码肺炎球菌神经氨酸酶或SEQ ID NO：19的核酸以可在受治疗者中表达的形式施用于受治疗者，则受治疗者与神经氨酸酶接触。

在本文描述的方法中，其包括将外源DNA施用和摄取入受治疗者的细胞(即，基因转导或转染)，所公开的核酸可以是以裸露的DNA或RNA形式，或所述核酸可以在用于将所述核酸递送于细胞的载体中，藉此编码抗体的DNA片段处于启动子的转录调节下，如本领域普通技术人员容易理解的。所述载体可以是可商业获得的制品，诸如腺病毒载体(QuantumBiotechnologies，Inc.，Laval，Quebec，Canada)。核酸或载体向细胞的递送可经由多种机制。作为一个实例，递送可经由脂质体，其使用可商业获得的脂质体制品诸如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)、以及根据本领域的标准程序开发的其他脂质体。此外，所公开的核酸或载体可通过基因枪或其他递送方法诸如电穿孔(其技术可从Genetronics，Inc.(San Diego，CA)获得)以及通过SONOPORATION仪器(ImaRx Pharmaceutical Corp.、Tucson，AZ)体内递送。

作为一个实例，载体递送可经由病毒系统，诸如可包装重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统(参见如，Pastan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：4486，1988；Miller等人，Mol.Cell.Biol.6：2895，1986)。然后重组逆转录病毒可用于进行感染，进而向感染的细胞递送编码例如肺炎球菌神经氨酸酶或广泛中和抗体(或其活性片段)的核酸。将核酸引入哺乳动物细胞的准确方法当然不限于使用逆转录病毒载体。用于此程序的其他技术是广泛可得的，包括使用腺病毒载体(Mitani等人，Hum.Gene Ther.5：941-948，1994)、腺伴随病毒(AAV)载体(Goodman等人，Blood84：1492-1500，1994)、慢病毒载体(Naidini等人，Science 272：263-267，1996)、假型逆转录病毒载体(Agrawal等人，Exper.Hematol.24：738-747，1996)。还可使用物理转导技术，诸如脂质体递送以及受体介导的机制和其他内吞机制(参见，例如，Schwartzenberger等人，Blood 87：472-478，1996)。本文公开的组合物和方法可与这些或其他常用的基因转移方法中的任一种联合使用。

作为一个实例，如果编码抗体的核酸以腺病毒载体递送于受治疗者的细胞，将腺病毒施用于人类的剂量范围可为每次注射约10⁷至10⁹蚀斑形成单位(pfu)，但也可高达每次注射10¹²pfu(Crystal，Hum.Gene Ther.8：985-1001，1997；Alvarez和Curiel，Hum.Gene Ther 8：597-613，1997)。受治疗者可接受单次注射，或如果另外的注射是必需的，它们可以以六个月的间隔(或其他适当的时间间隔，如技术人员所确定的)重复不定的时间段和/或直至治疗已建立效力。

如果使用，核酸或载体的胃肠外施用的一般特征在于注射。注射剂可制备为常规形式，无论是作为液体溶液或悬浮液、适合在注射之前溶解或悬浮于液体的固体形式、或作为乳浊液。胃肠外施用的最近修改的方法涉及使用缓释或持续释放系统，以使维持恒定的剂量。参见，如美国专利第3,610,795号，其通过引用并入本文。有关治疗化合物的合适制剂和各种施用路径的其他讨论，参见如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿制药科学与实践)(第19版)，A.R.Gennaro编，Mack PublishingCompany，Easton，PA 1995。

还公开了在受治疗者中减轻或预防肺炎球菌鼻部携带的方法，所述方法包括使受治疗者的鼻粘膜与有效量的本文公开的组合物接触。此类施用可用于产生针对肺炎球菌感染或鼻部携带的主动或被动免疫性或保护免受肺炎球菌感染或鼻部携带。

还提供了在受治疗者中减轻或预防肺炎球菌感染的方法，所述方法包括使受治疗者的粘膜表面与有效量的本文公开的组合物接触。例如，所述方法可预防肺炎球菌脑膜炎、中耳炎、肺炎或溶血性尿毒症。预防或减轻可通过减轻鼻部携带和或预防CNS侵入、全身侵入或欧氏管或下气道侵入而发生。

术语如本文所提供的化合物的有效量意指无毒但足以提供期望的结果的化合物量。如下文将指出的，需要的准确量将随受治疗者而不同，这取决于受治疗者的物种、年龄和总体状况、所治疗的疾病的严重程度、使用的具体化合物、其施用模式和类似因素。因此，不可能指定准确的有效量。不过，适当的有效量可由本领域普通技术人员确定。

本文描述的组合物的剂量或量大到足以产生递送发生所凭借的方法的期望效应。剂量不应过大，以致产生不利的副作用，诸如不需要的交叉反应、过敏反应和类似反应。一般而言，剂量将随受治疗者的年龄、状况、性别和疾病程度而不同，并可由本领域技术人员确定。剂量可由个体医师基于牵涉的受治疗者的临床状况进行调整。剂量、剂量方案和施用路径可变化。对于抗原的鼻部应用，优选的剂量包括每次免疫接种为约1-1000μg，或约1-1000μg之间的任何量，包括例如10-100μg。

特定剂量的化合物或组合物根据本文所述方法的施用效率可通过评估医疗史、体征、症状和已知用于评估受治疗者的状态的客观的实验室检验的特定方面来确定，所述受治疗者具有肺炎球菌(pneomococcal)感染或为肺炎球菌携带者。这些体征、症状和客观的实验室检验将根据所治疗或预防的具体疾病或状况而不同，如治疗此类患者的任何医师或进行此领域的实验的研究者所知的。例如，如果基于与适当的对照组和/或对疾病在一般群体或特定个体中的正常进展的了解的比较：1)受治疗者的身体状况显示出改善(如，鼻部携带被减轻或消除)，2)疾病、感染或鼻部携带的进展显示被稳定、减缓、或逆转，或3)对治疗疾病或状况的其他药物的需要被减少或消除，则特定的治疗方案将被认为是有效的。例如，减轻或预防受治疗者或群体中的鼻部携带、避免或降低CNS侵入或其他次级肺炎球菌感染的发生将指示有效性。此类效应可在单一受治疗者中(如，通过用传统的粘膜表面擦拭检测的细菌数量的降低)或群体中(如，使用流行病学研究)确定。

本文描述的化合物和药物组合物可以许多方式施用于受治疗者，所述方式取决于是期望局部治疗还是全身治疗，以及待治疗的区域。因此，例如，本文描述的化合物或药物组合物可以以静脉内、皮下、肌内、包囊于脂质体或微球、作为至眼睛表面的眼用溶液和/或软膏剂、作为鼻喷雾剂、作为雾化溶液或作为至鼻腔或气道的气溶胶施用。此外，化合物或药物组合物可经阴道、直肠、鼻内、口、通过吸入、口或通过插管施用于受治疗者。任选地，组合物可通过静脉内、皮下、肌内或腹膜内注射施用。组合物可制备为常规形式，无论是作为液体溶液或悬浮液、适合溶解或悬浮于液体的固体形式、或作为乳浊液。任选地，施用可通过缓释或持续释放系统进行，以使维持恒定的剂量。参见，如美国专利第3,610,795号，其由于其中教导的方法而通过引用并入本文。

本文教导的组合物包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳浊液，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和有机酯诸如油酸乙酯。水性载运体包括水、醇/水溶液、乳浊液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。运载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。也可存在防腐剂和其他添加剂，诸如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体和类似添加剂。

用于局部施用的制剂可包括软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、气溶胶、雾化溶液和粉剂。常规的药物载运体，水性、粉末或油状基质，增稠剂和类似物质可以是必需的或期望的。

用于口服施用的组合物可包括粉剂或颗粒剂、于水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、散剂(sachets)或片剂。增稠剂、增味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。

本文提供了在受治疗者中减轻或预防鼻部携带或肺炎球菌感染的方法，所述方法包括向受治疗者施用有效量的神经氨酸酶抑制剂。优选地，所述神经氨酸酶抑制剂抑制肺炎球菌神经氨酸酶活性而不显著降低受治疗者的内源神经氨酸酶。因此，例如，如果将神经氨酸酶施用于人类，所述抑制剂将优选地抑制肺炎球菌神经氨酸酶而不降低人类神经氨酸酶活性，或不使人类神经氨酸酶活性降低至在人类中造成不利的副作用。已知的神经氨酸酶抑制剂的实例包括DANA、NANA、扎那米韦和奥司他韦。

本文提供了在受治疗者中减轻或预防鼻部携带或肺炎球菌感染的方法，所述方法包括向受治疗者施用有效量的组合物，所述组合物包含针对肺炎球菌神经氨酸酶的抗体或其片段或针对任何神经氨酸酶的部分的抗体。例如，可施用针对SEQ ID NO：19的抗体。任选地，此施用包括使受治疗者的粘膜表面与所述组合物接触。还提供了含有所述抗体的组合物和容器。

本发明的抗体还可优先结合于神经氨酸酶或其片段的抗原部分。例如，本发明抗体可优先结合于SEQ ID NO：19的抗原部分。

术语抗体在本文使用其广泛含义，并包括多克隆抗体和单克隆抗体两种。具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及片段也可用于本文描述的组合物和方法，其中所述片段诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、scFv和类似片段，包括杂合片段。因此，提供了保留结合于其特异性抗原的能力的抗体的片段。例如，保留神经氨酸酶结合活性的抗体的片段包括在术语抗体片段的含义内。此类抗体和片段可通过本领域已知的技术制备，并可根据“实施例”和产生抗体和筛选抗体特异性和活性的一般方法(参见Harlow和Lane.Antibodies，A Laboratory Manual(抗体实验室手册)Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988))中描述的方法来筛选其特异性和活性。

抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的轭合物可用于本发明的组合物。此类轭合物描述于，例如，美国专利第4,704,692号，其内容通过引用特此并入。可使用体外测定或通过类似方法来检验抗体的期望活性，此后可根据已知的临床检验方法检验其体内治疗和/或预防活性。

用于本文的术语单克隆抗体指从大致均一的抗体群体获得的抗体，所述大致均一的抗体群体即，除了可存在于抗体分子的小子集中的可能的天然存在的突变之外，群体内的个体抗体是相同的。所公开的单克隆抗体可使用产生单克隆抗体的任何程序制备。例如，所公开的单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的那些杂交瘤方法。在杂交瘤方法中，小鼠或其他合适的宿主动物典型地用免疫剂免疫接种，以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合于所述免疫剂。替代地，可体外免疫接种淋巴细胞，如使用本文描述的HIV Env-CD4-共受体复合物。

单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备，诸如美国专利第4,816,567号(Cabilly等人)中描述的那些。编码所公开的单克隆抗体的DNA可使用常规的程序容易地分离和测序(如，通过使用能够特异性结合于编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。还可使用噬菌体展示技术来产生和筛选抗体或活性抗体片段的文库，所述噬菌体展示技术如，Burton等人的美国专利第5,804,440号和Barbas等人的美国专利第6,096,441号所描述的。

体外方法也适合于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段，这可使用本领域已知的常规技术实现。例如，消化可使用木瓜蛋白酶执行。木瓜蛋白酶消化的实例描述于1994年12月22日公布的WO94/29348和美国专利第4,342,566号。抗体的木瓜蛋白酶消化典型地产生两个称为Fab片段的相同的抗原结合片段和残留的Fc片段，其中所述相同的抗原结合片段中的每一个片段具有单一抗原结合位点。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点但仍能够交联抗原的片段。

无论是否连接于其他序列，抗体片段还可包括特定区域或特殊氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选择的修饰，只要所述抗体或抗体片段的活性与未修饰的抗体或抗体片段相比没有显著改变或受损。这些修饰可提供一些另外的性质，诸如移除/添加能够进行二硫键键合的氨基酸、增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，所述抗体或抗体片段必须拥有生物活性性质，诸如特异性结合于其相关抗原。所述抗体或抗体片段的功能或活性区可通过诱变蛋白质的特定区域、然后表达并检验所表达的多肽来鉴别。此类方法对本领域技术人员是很显然的，并可包括编码抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变。(Zoller，M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3：348-354，1992)。

如本文所用，术语抗体还可指人类抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(如，从小鼠、大鼠或兔获得的那些)是人类的天然抗原，并因此在施用于人类时可产生不期望的免疫应答。因此，在所述方法中使用人类或人源化抗体起到降低施用于人类的抗体诱发不期望的免疫应答的几率的作用。因此，包含抗体的组合物任选地包含人源化抗体或完全的人类抗体。抗体人源化技术一般涉及使用重组DNA技术操作编码抗体分子的一种或多种多肽链的DNA序列。因此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或抗体链(或其片段，诸如Fv、Fab、Fab′或抗体的其他抗原结合部分)，所述嵌合抗体或抗体链含有整合于人类(接受者)抗体的骨架的来自非人类(供体)抗体的抗原结合位点部分。

所公开的人类抗体可使用任何技术制备。用于人类单克隆抗体生产的技术的实例包括Cole等人(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，第77页，1985)和Boerner等人(J.Immunol.，147(1)：8695，1991)描述的那些。人类抗体(和其片段)还可使用噬菌体展示文库制备(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581，1991)。

所公开的人类抗体还可从转基因动物获得。例如，已描述了能够响应免疫接种产生全套(full repertoire)人类抗体的转基因突变体小鼠(参见，如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551 255(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.，7：33(1993))。特别地，这些嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失造成内源抗体产生的完全抑制，而人类种系抗体基因阵列向此种系突变体小鼠的成功转移造成抗原攻击后人类抗体的产生。具有期望活性的抗体可使用本文描述的Env-CD4-共-受体复合物选择。

为了产生人源化抗体，将接受者(人类)抗体分子的一种或多种互补决定区(CDR)的残基置换为来自供体(非人类)抗体分子的一种或多种CDR的残基，已知所述供体抗体分子具有期望的抗原结合特性(如，对靶抗原的一定水平的特异性和亲和性)。在一些实例中，人类抗体的Fv骨架(FR)残基被置换为对应的非人类残基。人源化抗体还可含有既不是在接受者抗体也不是在导入的CDR或骨架序列中发现的残基。一般而言，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。在实践中，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自啮齿动物抗体的相似位点的残基取代的人类抗体。人源化抗体一般含有抗体恒定区(Fc)的至少一个部分，典型地人类抗体的抗体恒定区的至少一个部分(Jones等人，Nature，321：522 525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323 327(1988)；和Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.，2：593 596(1992))。

人源化非人类抗体的方法是本领域公知的。例如，人源化抗体可根据Winter和同事(Jones等人，Nature，321：522 525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323 327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534 1536(1988))的方法、通过将啮齿动物的CDR或CDR序列取代为人类抗体的对应序列而产生。可用于产生人源化抗体的方法还描述于美国专利第4,816,567号(Cabilly等人)、美国专利第5,565,332号(Hoogenboom等人)、美国专利第5,721,367号(Kay等人)、美国专利第5,837,243号(Deo等人)、美国专利第5,939,598号(Kucherlapati等人)、美国专利第6,130,364号(Jakobovits等人)和美国专利第6,180,377号(Morgan等人)。

抗体的施用可如本文公开的进行。也存在抗体递送的核酸方法。抗体和抗体片段还可作为编码抗体或抗体片段的核酸制品(如，DNA或RNA)施用于患者或受治疗者，以使受治疗者自身的细胞摄取所述核酸并产生和分泌所编码的抗体或抗体片段。核酸的递送可通过本领域已知的任何手段进行。

本文还公开了容器，其包含本文教导的药剂和组合物。特别地，所述容器可以是鼻喷雾器、雾化器、吸入器、瓶或含有用于施用于粘膜表面的形式的组合物的任何其他装置。任选地，所述容器可递送计量剂量的组合物。

应理解，本文描述的方面不限于特定的合成方法或特定的施用方法，因而此类方法当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅是为了描述特定方面的目的，而非意欲限制。

必须注意，如说明书和所附权利要求中使用的，单数形式一个、一种和所述包括复数对象，除非文中明确地有另外的指示。因此，例如，一种抗原片段的说法包括抗原片段的混合物，一种药物载运体或佐剂的说法包括两种或更多种此类载运体或佐剂的混合物，诸如此类。

如全文所用的，受治疗者意指个体。因此，受治疗者可包括驯养的动物(诸如猫、狗等)、牲畜(如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。在一个方面，受治疗者是哺乳动物，诸如灵长类或人类。

任选的或任选地意指随后描述的事件或情况可发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情形和其不发生的情形。例如，措辞任选地所述组合物可包含组合意指所述组合物可包含不同分子的组合或可不包括组合，因此该描述包括存在所述组合和不存在所述组合(即，组合的个体成员)两种情况。

范围在本文可表示为从约一个特定值，和/或至约另一特定值。当表示此类范围时，另一方面包括从一个特定值和/或至另一特定值。相似地，当值表示为近似值(通过使用前置的“约”)时，应理解所述特定值形成另一方面。还应理解，每个范围的端点在相对于另一端点和独立于所述另一端点时都是有意义的。

所公开的材料、组合物和组分可用于所公开的方法和组合物，可与所公开的方法和组合物联合使用，可用于制备所公开的组合物，或为所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，应理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用物、群组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的各种单独和集合组合和排列的具体参考，但是每种组合和排列都具体地包括和描述于本文。例如，如果公开并讨论一种抑制剂，并且讨论可对包括所述抑制剂在内的许多分子进行的许多修饰时，则具体地包括可能的所述抑制剂和所述修饰的每个和每种组合和排列，除非有具体指示相反的含义。因此，如果公开了一类分子A、B和C，以及一类分子D、E和F和组合分子A-D的实例，则即使没有单独地指出每一个，仍单独和集合地包括每一个。因此，在此实例中，具体包括了组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个，并且应当认为其根据A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D的公开内容而公开。类似地，还具体地包括和公开这些的任何子集或组合。因此，例如，具体包括亚组A-E、B-F和C-E，并且应认为其根据A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D的公开内容而公开。这一概念应用于本申请的所有方面，包括但不限于所公开的组合物的制备和使用方法中的步骤。因此，如果有许多可执行的另外步骤，应理解，这些另外步骤的每一个可与所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合一起执行，并且每个此类组合都是具体地包括的并应视为是公开的。

实施例

提出下列实施例，以向本领域普通技术人员提供如何制备和评估本文描述和要求保护的化合物、组合物、物品、设备和/或方法的完整的公开内容和描述，并且所述实施例仅旨在是示例性的，而不旨在限制发明人视为他们的发明的范围。已尽力确保数值(如，量、温度等)的精确，但是一些误差和偏差应考虑在内。除非另外指明，部分是以重量计的部分，温度用℃或为室温，并且压力是大气压或接近大气压。反应条件有许多变化和组合，所述反应条件如组分浓度、期望的溶剂、溶剂混合物、温度、压力和可用于优化所描述的过程获得的产物纯度和产率的其他反应范围和条件。优化此类过程条件仅需要合理和常规的实验。

实施例1鼻部肺炎链球菌在携带过程中渗透嗅觉组织

材料和方法

肺炎球菌株系

本研究采用两种有荚膜的肺炎链球菌株系EF3030、血清型19F，和TIGR4株系，血清型4，以及从亲代株系D39、血清型2衍生的无毒的无荚膜株系R36A。Avery等人，(1944)J.Exp.Med.79：137-158。选择EF3030株系是因为在不存在菌血症下，其易于在呼吸道建群(Briles等人，(1992)Infect.Immun.60：111-116)，并且静脉内接种后不能维持菌血症。TIGR4株系毒性较强，但在无菌血症下以适度的鼻部接种物建群。

小鼠

CBA/CAHN/xid(xid)小鼠株系获自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。这些小鼠的Bruton酪氨酸激酶基因的突变造成其无法响应不依赖胸腺的II型抗原(Amsbaugh等人，(1972)J.Exp.Med.136：931-949；Berning等人，(1980)J.Immunol.46：506-513)，但是相对地允许正常的T细胞依赖性免疫应答。这些小鼠不能响应荚膜多糖，并可重复地易感肺炎球菌感染。xid小鼠在无病原条件下饲养，并在7-12周龄时使用。

组织采集

从眼窝后血管丛将血液采集入肝素化的毛细管。在采集鼻部洗液(NW)、肾、脾和肺之前，将小鼠用70％乙醇消毒。为了防止血液污染NW，将气管切一切口，并将外径为0.075cm的2.0cm长的Tygon管(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)插入鼻咽，同时连接至充满林格氏溶液的注射器。注射器的液体通过鼻部排出，收集三滴。

鼻咽相关性淋巴网状组织(NALT)、ON/E、OB和脑的剩余部分根据已描述的方法获得。van Ginkel等人，(2000)J.Immunol.165：4778-4782；Wu等人，(1997)Scand.J.Immunol 46：506-513。用解剖显微镜(microsope)小心切下脑的三叉神经节。ON/E、OB、三叉神经节、NALT和颈淋巴结CLN各自在0.5ml林格氏溶液中匀浆，而脑和肾各自在1.0ml林格氏溶液中匀浆。

组织糜/血液/外部排泄物中肺炎链球菌的定量

在无菌林格氏溶液中制备组织和体液的八种连续的三倍稀释物，并将其涂布于含有4μg/ml硫酸庆大霉素的血琼脂平板。涂布并于烛罐(candlejar)中孵育24小时后，计数CFU。结果表示为CFU/器官、CFU/NW或CFU/ml血液。

肺炎链球菌株系EF3030的GLS预孵育

为了阻断GLS结合位点，将3X10⁷CFU的肺炎链球菌株系EF3030与来自人类脑的20μg脱唾液酸-GM1或来自牛脑的125μg混合的GLS(18％GM1、55％GD1a、15％GD1b、10％GT1b、2％其他GLS)(Calbiochem-Novabiochem Corporation，Inc.，La Jolla，CA)在冰上孵育30分钟。在使用之前一天，将GLS溶解于PBS并剧烈混合。两性GLS在PBS中形成允许肺炎链球菌与糖部分相互作用的胶束。孵育后，5μl/鼻孔鼻部应用于xid小鼠而不进一步清洗。4天后分析组织的CFU。

通过PCR检测肺炎链球菌的肺炎球菌溶血素基因

为了通过PCR检测肺炎链球菌，组织通过冻融裂解于含0.1％脱氧胆酸的1％SDS中并在37℃下孵育1小时。使用十六烷基三甲基溴化铵/NaCl沉淀法除去蛋白(Ausubel等人，(1987)Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学最新方案)，第二版，2.4.4，其由于教导了十六烷基三甲基溴化铵/NaCl沉淀法而通过引用并入本文)。10μg DNA用于PCR扩增。将肺炎球菌溶血素(ply)-特异性引物Ply15’-ATTTCTGTAACAGCTACCAACGA-3’(SEQ ID NO：1)和Ply2 5’-GAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC-3’(SEQ ID NO：2)添加至PCR混合物以扩增400bp片段。PCR反应包括5min在94℃的变性步骤，然后是扩增循环：94℃(1min)、55℃(1min)和72℃(1min)，共30个循环。溴化乙锭染色的PCR片段的图像在Alpha Imager TM IS-3400(Alpha InnotechCorporation，San Leandro，CA)上采集。

具有PspA-特异性抗体的OB的免疫荧光染色

小鼠用5X10⁵CFU的TIGR4株系鼻部攻击。将OB在10％缓冲的福尔马林中固定。4μm石蜡切片(van Ginkel(2000)J.Immunol.165：4778-4782)进行PspA家族2抗体(1∶100)染色，方法是将它们在室温下在加湿室中孵育4hr。载玻片在PBS中洗涤，用生物素化的山羊F(ab’)2抗-兔IgG(1∶200)(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)染色，洗涤，然后用链霉亲和素-FITC(1∶100)(BD-PharMingen，San Diego，CA)染色。荧光图像用使用DEI-750 CE数码彩色摄影机(Optronics，Goleta，CA)的Nikon显微镜采集，并用Scion Image软件(Scion Corporation，Frederick，MD)进行处理。

统计学

数据表示为平均值±一个标准误差，并通过使用非配对的MannWhitney双样品秩检验或student t-检验的统计分析对结果进行比较以确定CFU的显著差异。

结果

肺炎球菌荚膜在鼻部建群和CNS侵入中的作用

为了检查通过初级嗅感觉神经元摄取的肺炎链球菌，在第1天和第4天测量了EF3030和无荚膜的株系R36A在鼻道建群和进入CNS的能力(图1)。虽然在第1天在ON/E中对两种株系都观察到了高CFU，但是在第4天R36A在ON/E和所有其他组织中是很大程度上不存在的，这与指示长期的建群需要一些荚膜的更早结果一致。Magee和Yother(2001)Infect.Immun.69：3755-3761。EF3030显示在第1天和第4天清晰地存在于OB和脑中，并且在第4天以高数量存在于NW和NALT中。这些发现与鼻部攻击后EF3030肺炎链球菌向OB和脑的轴突运输一致。

鼻部建群和CNS侵入的动力学

在观察的39天内的所有时间点，EF3030均保持于ON/E、OB、NW和NALT中(图2)。在脑和CLN中观察到了数量低得多的CFU，并且存在的这些CFU一般在第18天和第25天观察到。令人感兴趣的，除了第1天(图1)和第18、25和39天(图2)外，肺未展示肺炎链球菌。菌血症对神经组织分布没有贡献，因为在所用的鼻部剂量下(图2)，在用株系EF3030执行的任何实验过程中，未检测到小鼠血流中的CFU。鼻部应用后1、3、6、12和24hr和此后的每天，监测血液的菌血症，共一周。未在血液中检测到细菌。

三叉神经节的肺炎链球菌感染

三叉神经元支配鼻咽，因此，预期肺炎链球菌在感染鼻粘膜后将存在于三叉神经节。为了检验这一点，在接种4天后分离不同的组织和血液，并在新的实验中分析EF3030的存在。在ON/E和OB中以及在三叉神经节中(表3)检测到了EF3030株系。这一发现还支持脱唾液酸-GM1充当肺炎链球菌的神经元靶向的受体。其他GLS可能也起作用。

表3显示鼻部递送后肺炎链球菌株系EF3030在不同组织中的分布。组织在鼻部应用1x10⁷CFU的株系EF3030后第4天分离。将血液(50μl)、ON/E、OB和脑组织糜稀释，然后涂布于血琼脂。将三叉神经节汇集、匀浆然后涂布于此培养基。所示为5只小鼠的平均肺炎球菌CFU±SE，并代表三次单独的实验。在脑和血液中未检测到肺炎链球菌。

表3

神经节苷脂抑制肺炎球菌建群

在鼻部应用之前，将EF3030株系与于PBS中的脱唾液酸-GM1或混合的GLS胶束孵育。当在鼻部应用后4天进行评估时，GLS混合物显示最强的抑制效应和NW中降低10倍的CFU(P＝0.0365)。在ON/E中观察到混合的GLS预孵育所造成的最大CFU下降(下降617倍；P＝0.0134)。同样惊人的还有肺(P＝0.0320)(图3)和CNS组织(P＝0.0078)(图3)中的差异，其中对照中存在平均204和166CFU，而当与GLS孵育时，肺炎链球菌是不可检测的(检测限＝3CFU)。脱唾液酸-GM1预孵育的效力低于混合的GLS，但在CNS(图3)和肺(图3)中仍分别使建群降低了25倍和63倍。肺被吸入的肺炎链球菌感染，而GLS明显地抑制肺炎链球菌与肺中相对大量存在的脱唾液酸-GM1的连接。这表明GLS在向表皮细胞的初始连接中起作用。GLS处理没有改变肺炎球菌的存活性。在这些实验过程中，未在血液中检测到肺炎链球菌。因此，GLS构成了肺炎球菌连接于鼻道的神经上皮细胞以及肺和CNS感染的重要靶标。

鼻部攻击后OB中的肺炎链球菌积累的检测

OB中的EF3030的数量一般来说太低，以至于无法通过可行的显微术显现细菌。为了显现鼻部应用后OB中的肺炎链球菌，使用了毒性更强的株系TIGR4。在攻击后第1、3、6、12或24hr和此后的每一天，检验来自代表性小鼠的血液样品。未观察到菌血症。小鼠在攻击后一周被处死，并分析组织的CFU(图4A和4B)。仅5X10⁵TIGR4CFU的剂量造成OB中～300CFU(图3)。肺炎链球菌通过用PspA-特异性抗体染色在OB中显现(图4D-F)。在被攻击的小鼠的OB中，即小球层(图4F)和外丛状层(图4E)中检测到肺炎链球菌。对照小鼠的OB中不存在肺炎链球菌(图4D)。

鼻部施用后6天，还通过NW、ON/E和OB的肺炎球菌溶血素基因的PCR扩增检测了TIGR4株系(图4C)。在此间隔采集的血流或在非感染小鼠的任何样品中，不存在PCR可检测的肺炎链球菌。

实施例2.肺炎球菌-NanA在鼻咽携带和CNS靶向中的作用

在遗传背景和NanA位置两方面均不同的三种肺炎链球菌株系中产生NanA突变体。株系EF3030(19F型)和D39(2型)均表达共价连接于细胞壁的NanA，而TIGR4株系(4型)表达分泌于环境的截短的NanA。

还评估了NanB在建群中的作用。

细菌株系和生长条件

本研究中使用的株系列于表4。

表4.

^*Tettelin等人(2001)Science 293：498-506.

Briles等人(2003)J Infect Dis 188：339-348

Avery等人(1979)J.Exp.Med 149：297-326；McDaniel等人(1987)Microb.Pathog.3：249-260.

^§Berry等人(2000)Infect.Immun.68：133-140.

所有肺炎球菌株系储存于-80℃下10％甘油中，并通过转移至血琼脂平板进行培养，且在37℃下于5％CO2大气中孵育过夜。肺炎链球菌的培养物在含有0.5％酵母提取物的Todd-Hewitt培养基中培养至OD660为0.5，并在添加10％无菌甘油的相同肉汤中分成等份冷冻储存于-80℃。将携带抗生素抗性插入物的突变体在适当的抗生素中培养以确保突变的稳定性。

nanA突变体的构建

亲代背景分别为TIGR4、EF3030和D39的NanA突变体株系JW001、SAM001和JCP001通过插入重复诱变技术衍生(Yother等人(1992)J.Bact.174：610-618，其由于其中教导的技术而通过引用整体并入本文)(表4)。株系TIGR4和EF3030用作转化从等基因nanA株系D39制备的供体染色体DNA的接收者(Berry等人(2000)Infect.Immun.68：133-140)。在各种情形下，突变体与亲代株系回交三次。D39突变体也与我们的D39亲代株系回交三次以确保其与这些研究中使用的亲代株系是等基因的。D39的突变通过插入重复诱变实现，其允许缺失除成熟蛋白的约650个氨基酸的N-末端片段之外的全部(Berry等人(2000)Infect.Immun.68：133-140)。TIGR4/nanB等基因突变体使用插入重复诱变技术构建(Balachandran等人(2002)Infect.Immun.70：2536-2534；Yother等人(1992)J.Bact.174：610-618)。nanB的461-bp的内部部分使用引物nanBF和nanBR(表4)扩增，PCR使用Taq PCRMastermix(Invitrogen)和在95℃1min.、45℃1min.、72℃1min下的30个循环执行。将该片段克隆入pSF152。用质粒DNA进行的TIGR4株系的转化如前所述(Balachandran等人(2002)Infect.Immun.70：2526-2534)。nanA/nanB-TIGR4双突变体通过用从株系JW001制备的染色体DNA转化nanB/TIGR4突变体衍生。

小鼠毒力测定

雌性6-12周龄CBA/CaHN-XID/J(CBA/N)小鼠获自The JacksonLaboratory(Bar Harbor，MA)。这些小鼠的Bruton酪氨酸激酶基因的突变造成其无法响应不依赖胸腺的II型抗原，但是相对地允许正常的T细胞依赖性免疫应答(Amsbaugh等人1972J Exp Med.136：931-949；Briles等人1986 Curr.Top.Microbiol.Immunol.124：103-120；Potter等人1999 Int.Immunol.11：1059-64；Wicker和Scher 1986 Curr.Top.Microbiol.Immunol.124)。这些小鼠不能响应荚膜多糖，并可重复地易感肺炎球菌感染(Briles等人1986 Curr Top.Microbiol.Immunol.124：103-120；Briles等人1981 j.Exp.Med.153：694-705)。x-连锁的免疫缺陷(xid)小鼠在无病原条件下饲养，并在7-12周龄时使用。含有已知浓度的存活细胞的冷冻感染贮液在乳酸林格氏溶液中稀释。然后按照描述用体积为10μl的大约5x10⁵-1x10⁶个细胞鼻内(I.N.)感染小鼠(Wu等人1997b Microb.Pathog 23：127-137)。

组织采集

在执行鼻部清洗和组织采集之前，对所有小鼠实施安乐死。从眼窝后血管丛将血液采集入肝素化的毛细管。在采集鼻部洗液(NW)、鼻部组织(包括嗅觉上皮细胞(NT)、嗅球(OB)和脑之前，将小鼠用70％乙醇消毒。这些液体和组织的获得如上文所述。为了防止血液污染NW，将气管切一切口，并将外径为0.075cm的2.0cm长的Tygon管(Cole-Parmer，VernonHills，Ill)插入鼻咽，同时连接至充满林格氏溶液的注射器。注射器的液体通过鼻部排出，收集三滴。ON/E和OB各自在0.5ml林格氏溶液中匀浆，而脑的剩余部分在1.0ml林格氏注射液中匀浆。

存活的肺炎链球菌的定量

在无菌林格氏溶液中制备组织和体液的八种连续的三倍稀释物，并将其涂布于含有4μg/ml硫酸庆大霉素的血琼脂平板。涂布并在烛罐中于37℃孵育24小时后，计数菌落形成单位(CFU)。使用的神经氨酸酶活性的测定如先前所述(Lock等人1988 Microb Pathog 4：33-43，其由于所述测定方法而通过引用整体并入本文)。通过用双样品Mann-Whitney秩检验在野生型肺炎链球菌和突变体肺炎链球菌之间进行比较的分析来评估结果的显著性。

体外研究

测量了TIGR4和其nanA和nanB突变体结合特异性神经节苷脂的能力。所用的神经节苷脂包括混合的神经节苷脂、脱唾液酸-GM1、GM1、GD1a、GD1b、GT1(Calbiochem)和GM3神经节苷脂(Sigma)。GM3神经节苷脂缺乏参与肺炎球菌结合的末端或内部GalNAcβ1-4Gal序列并用作阴性对照。这些混合的、含有单唾液酸、双唾液酸或三唾液酸的神经节苷脂容易地结合于ELISA平板。与TIGR4株系短期孵育后的初始数据表明，肺炎链球菌结合于脱唾液酸-GM1包被的平板，但不结合于BSA-、GM-3或GM1-包被的平板。使用神经节苷脂包被的平板，比较了野生型TIGR4株系、TIGR4株系的稳定不透明期变体和透明期变体、nanA、nanB和nanA/nanB突变体株系结合于这些平板的能力。这些分析包括在神经节苷脂包被的平板上短期孵育(1hr)和长期孵育(24hr)。通过在含有0.5％酵母提取物的Todd Hewitt培养基中短暂孵育(10-15min.)从神经节苷脂平板上除去连接的肺炎链球菌，然后反复吸取释放的细菌并将其涂布于血琼脂平板。替代地，将含有0.5％酵母提取物的41℃ Todd Hewitt肉汤琼脂倾注于连接的肺炎链球菌的上方，并通过平板的底部计数菌落。对照包括无肺炎链球菌的平板和无神经节苷脂但有肺炎链球菌的平板。

检验神经节苷脂结合后，检验不同细胞系将肺炎链球菌连接至它们的细胞表面和内化这些细菌的能力。这些研究集中于大鼠神经元嗜铬细胞瘤细胞系PC12(ATCC)和巨噬细胞系P388D1。选择这两种细胞系是因为它们的特定属性。P388D1细胞系表达高亲和性PAF-R(Valone(1988)J.Immunol.140：2389-2394)，已报道其存在于小胶质细胞。PC12细胞系不表达可检测的PAF-R。Brewer等人，(2002)J.NeuroChem 82：1502-1511。将10²-10⁵肺炎球菌CFU添加至在6孔或24孔组织培养板中培养的这些细胞系，并在37℃下孵育15min.至6hr，然后充分洗涤所述细胞并分析黏附的肺炎链球菌。为了确定内化进入细胞的情况，在将所述细胞涂布于血琼脂或将所述细胞用含有0.5％酵母提取物的41℃ Todd Hewitt肉汤琼脂覆盖之前，用青霉素和庆大霉素清洗2hr。所用的两种细胞系反映出通常观察于CNS的PAF-R的体内表达。虽然活化的小胶质细胞像P388D1细胞系一样大量表达此受体，但PAF-R受体在神经元细胞诸如PC12细胞系上不存在，或仅以低水平表达于离散的神经元亚群。Mori等人，(1996)J.Neurosci 16：3590-3600；Bennett等人，(1998)Cell Dath Differ.5：867-875。肺炎链球菌黏附于两种细胞系表明，PAF-R不是黏附所必需的，并且存在替代的受体。相对于野生型TIGR4株系中观察的黏附，检验了TIGR4不透明变体和透明变体以及nanA-突变体、nanB-突变体和nanA/nanB双突变体对这些细胞系的黏附。为了进一步分析PAF-R与神经节苷脂在肺炎球菌黏附中的作用，缺乏PAF-R的COS-7细胞系(Gerard和Gerard(1994)J.Immunol.152：793-800；Honda等人，(1992)J.Lipid Med.5：105-107)用1029bp的人类PAFR开放阅读框使用pcDNA3.1/GS质粒如先前所报道地进行转染(Brewer等人，(2002)J.Neuro Chem 82：1502-1511，其由于其中教导的方法而通过引用整体并入本文)，和使用Transfast试剂(Promega)转染。单独的质粒用作对照，并在存在或不存在PAF-R下分析了影响肺炎球菌黏附的参数。此实验提供了关于PAF-R在黏附中的重要性的明确数据。PAF-R缺陷细胞系中的任何黏附都是由神经节苷脂介导的，并且随后被与神经节苷脂的预孵育阻断。为了进一步说明肺炎链球菌黏附于和穿透上皮细胞的能力，采用了Detroit 562人类咽上皮细胞系(ATCC)和A549人类肺上皮细胞系(ATCC)，使用transwell系统。使用-PCF Culture(Millipore，Billerica，Mass.)平板插入物培养所述上皮细胞系至汇合。汇合通过使用Millipore

电阻系统测量跨上皮的电阻来确定。至少500Ω/cm²的电阻表明达到完全汇合的上皮细胞单层。将这些细胞暴露于肺炎链球菌以检验它们附着、进入和穿透此上皮细胞层的能力。为了区分附着与内化，清洗所述上皮细胞并将其与含有青霉素和庆大霉素的培养基孵育2hr。初始的焦点是TIGR4株系、其nanA和nanB突变体和双突变体。TIGR4株系的稳定的透明变体和不透明变体已通过连续传代直至获得在体内攻击后不逆转的稳定变体而产生。比较了这些TIGR4变体附着、进入和横穿(tranverse)上皮细胞的能力。向孔中加载10³-10⁶CFU/孔，于EMEM培养基中。在0.5、1、2、4、8和24hr，收获上皮细胞层上方和下方的培养物并分析CFU。在用添加有0.5％酵母提取物和0.5％琼脂，并冷却至41℃的Todd-Hewitt肉汤覆盖细胞以确定与所述单层缔合的肺炎球菌CFU之前，将细胞层清洗5-6次。平板在37℃和5％CO2下孵育过夜，之后计数CFU。分析细胞系的PAF-R表达。从这些细胞系获得的总RNA通过RT-PCR分析，所述分析使用两种引物PAF-1(5′-CCGATACACTCTCTTCCCGA-3′(SEQ ID NO：3)；核苷酸151至170)和PAF-2(5′-ACAGTTGGTGCTAAGGAGGC-3′(SEQ ID NO：4)；核苷酸970至951)，得到838bp PCR产物(Stengel等人，(1997)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17：954-962，其由于其中教导的方法而整体并入本文)。如果存在PAF受体，则向培养物添加PAF受体抑制剂诸如奥替溴铵(Biomol ResearchLaboratories，Inc.Plymouth meeting，PA)或PAF(Biomol)，以确定PAF-R对上皮细胞黏附和穿透的贡献。奥替溴铵以高亲和力结合PAF-R。替代地，上文提到的COS7细胞用于此目的，并比较存在和不存在PAF-R的肺炎球菌黏附。

不同肺炎球菌株系侵入的程度与Transwell系统顶端和基底外侧区室中产生的炎性细胞因子相关。在不同的时间点收集上下两区室的培养物上清液并通过ELISA(BD PharMingen)分析，以确定炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的浓度。上皮细胞单层在醋酸酒精(acetic alcohol)中固定，并使用先前用于显现OB中的肺炎链球菌的PspA-特异性免疫荧光染色分析肺炎链球菌在细胞内的存在。荧光图像如先前所述(Martin等人，(1998)J.Immunol.160：3748-3758，其由于其中教导的方法而通过引用并入本文)地用装配有适当的滤光片的Leica/Leitz DMRB显微镜(Chromtechnology，Battleboro，VT)显现。图像用C5810数码彩色照相机(Mamamatsu Photonic System)采集并用Adobe photoshop和IP LABSpectrum软件处理。

结果

NanA和NanB突变体的建群

通过比较从鼻内(i.n.)感染的小鼠的鼻部洗液分离的肺炎球菌细胞的数量与用NanA突变体-株系感染的那些，评估了NanA突变对肺炎链球菌在CBA/N小鼠的鼻咽建群的能力的作用。包括了三种不同的肺炎球菌株系，因此允许在具有不同荚膜血清型和遗传背景的株系上研究NanA突变的作用。TIGR4/NanA-(JW001)、EF3030/NanA-(SAM001)和D39/NanA-(JCP001)分别为荚膜型4、19F和2(表4)。在荚膜型4临床分离株TIGR4的情形中，在编码LPETG(SEQ ID NO：13)基序的序列之前有终止密码子。没有此基序时，预期NanA被TIGR4分泌到环境中。对目前可得的另外四种肺炎球菌-NanA序列G54(19F型)、R6(2型)、Spanish 23F和670(6B型)的检查(Berry等人Gene 71：299-305；Hoskins等人2001 J.Bacteriol 183：5709-17；Tettelin等人2001 Science 293：498-506)表明它们具有用于共价连接于细胞壁的LPXTG(SEQ ID NO：14)基序(图5)。因此，本文包括的株系提供了其中NanA是分泌的和其中NanA是表面结合的株系的突变比较。

在TIGR4和EF3030二者的NanA突变体中均观察到建群的显著下降(图6和7)。

肺炎链球菌表达另一神经氨酸酶NanB。NanB相对于NanA之间共有相似程度的同源性。NanB与NanA共有43％同源性(24％同一性)。所述蛋白之间的共有残基表明它是唾液酸酶(Berry等人1996J.Bacteriol.178：4854-4860)。发现NanB的最优pH为4.5，相比之下，NanA的最优pH为6.5至7。即使在其最优pH下，NanB的唾液酸酶活性为NanA在它的最优pH下的约1/100。即便如此，为了查看NanB是否是建群和直接侵入CNS需要的，构建了株系TIGR4/NanB-(JW002)(TIGR4遗传背景下NanB缺陷的突变体)以及株系TIGR4/NanAB-(JW003)(其为NanA和NanB二者表达缺陷的)。用JW002感染小鼠得到的建群水平与TIGR4株系几乎相同(图8)。此外，双突变体(JW003)中未发生相对于NanA突变体的建群的显著降低(图9)。

肺炎链球菌向CNS的进入

为了跟踪肺炎链球菌向鼻部组织(包括嗅觉神经)的运动，测试了嗅球和脑剩余部分的肺炎链球菌的存在。发现无论遗传背景如何，鼻部组织和嗅球中的NanA突变体相对于野生型株系数目显著降低。在处死时，将所有小鼠放血，并且没有小鼠在血液中展示可检测的肺炎链球菌(＜12CFU/ml血液)，表明肺炎链球菌直接地从鼻腔移动到CNS组织。NanB突变体对肺炎链球菌进入鼻部组织或嗅球没有影响(图8)。

NanA突变体在鼻咽和CNS中建群和持续的能力明显削弱。这在荚膜血清型和NanA与表面附着两方面均不同的株系中观察到。虽然NanA只是影响细菌细胞表面和宿主亲近的许多表面结构中的一员，但是它的参与是鼻部携带以及将肺炎链球菌靶向CNS所必需的。破坏NanA显著降低了建群和向CNS的靶向。这一结果在TIGR4和EF3030二者中观察到。

在超过一个月的时间内，株系EF3030(19F型)以极高效率在鼻咽建群。不过，虽然EF3030具有持续的能力，但是NanA的突变显著降低了鼻中的肺炎球菌细胞数量。TIGR4/NanA-株系中的减毒甚至更加显著，其中从鼻部洗液分离的细胞的数量在14天后跌至接近检测限。

在天然环境下，肺炎球菌与其他细菌种类共存。因此，NanA的其他功能可包括改变宿主蛋白的功能并有助于携带的长期稳定性。NanA还可增强肺炎链球菌与其他经口微生物包括脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)和流感嗜血杆菌(H.influenzae)竞争的能力，或通过使宿主糖蛋白成为可利用的碳源。

虽然这些研究的主要结果已证明NanA表达是小鼠中最优携带所必需的，但是这些数据也证明缺乏NanA的肺炎链球菌以低得多的数量发现于嗅球中。目前难以了解活性NanA对于肺炎链球菌在CNS组织中的存活是否重要。虽然从这些组织中回收的NanA突变体的数量比亲代株系低得多，但是它们在神经元组织中的真实存在说明肺炎链球菌进入脑后的NanA的另外的毒力效应。OB中神经氨酸酶突变体水平的降低非常有可能是减少的携带的结果。这一发现强调了携带是更具侵入性疾病的先决条件的原理，并且能够降低携带的干预诸如用NanA免疫接种将提供针对肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症的保护。

在nanA的已知序列中，TIGR序列是唯一不含表面锚的序列。在此株系中，移码造成在LPETG(SEQ ID NO：13)基序之前的分子截短(Tettelin等人2001 Science 293：498-506)。对于大多数株系，预期NanA的重要部分被分选酶共价连接于细胞壁(Mazmanian等人1999 Science 285：760-63)，已在电子显微照片中在细胞壁上检测到NanA(Camara等人Infect.Immun.62：3688-95)。在这些研究中，TIGR4以及EF3030展示出NanA依赖性携带和在嗅球中的存在。根据NanA活性在上清液或细菌沉淀中的定位的研究，显示与TIGR4不同，EF3030的NanA活性是细胞相关的。因此，NanA可促进建群，无论它是表面结合的或是分泌的。

实施例3神经节苷脂在肺炎链球菌致病中的作用

在分离ON/E之前15、30和60分钟，将纯化的神经氨酸酶NanA(Calbiochem)以于10μl PBS中的1、10和50μg鼻部施用。将组织在4％多聚甲醛中固定并制备石蜡切片。使用生物素化的-CT-B然后是链霉亲和素-FITC对GM1染色，并分析染色的强度。切片还通过轭合于罗丹明(rodamine)的脱唾液酸-GM1-特异性Ab染色，以确认与这些组织中脱唾液酸-GM1染色增加一致的GM1染色下降。在第1天和第4天，分析经受相同处理的小鼠平行组的肺炎链球菌株系TIGR4和EF3030的建群，以确保神经氨酸酶处理造成鼻部建群水平的升高。向小鼠鼻部给予高剂量的株系EF3030(1x10⁸CFU)，并在以下间隔分离ON/E：鼻部攻击后1、3、6和12hr、1和4天。ON/E如上所述地进行染色并分析GM1和脱唾液酸-GM1表达。如果在鼻部组织观察到降低的GM1表达和升高的脱唾液酸-GM1表达，则还检验NanA-缺陷株系和NanB-缺陷株系，因为预期它们不改变鼻道中的GM1表达。唾液酸残基的去除使得次末端二糖β-D-吡喃半乳糖基-(1-3)N-乙酰-D-半乳糖胺暴露，其代表Thompson-Friedenreich抗原的免疫显性基团，PNA对该基团具有高亲和性。因此，ON/E中PNA-结合位点的变更是神经氨酸酶活性的另一量度。从这些组织制备的冷冻切片容易地用PNA-FITC或PNA-HRP(Medac，Hamburg，Germany)染色，以基于显微术确定是否发生PNA-结合位点增加(Black等人，(2000)Pediatr.Infect.Dis J.19：187-195；Klein等人(1978)Klin.Wochenschr.56：761-765，其由于其中教导的方法而通过引用以其整体并入本文)。

在鼻部施用株系TIGR4或EF3030之前，特异性阻断GM1位点。这通过使用三种方式实现：1)CT-B与非-神经节苷脂对照蛋白，如卵清蛋白，2)针对GM1(Calbiochem)的抗体与正常的兔免疫球蛋白，或3)在UAB蛋白质分析和肽合成核心实验室(UAB Protein Analysis and PeptideSynthesis Core Facility)合成的GM1-特异性肽。GM1-特异性肽的抑制是最佳的方法，因为预期CT-B和有可能的GM1抗体引起并发的炎症。在这些实验中，ON/E和OB在应用肺炎球菌CFU后的1和4天分析。阻断GM1的替代方法是使用GM1-结合肽，所述GM1-结合肽是通过使用噬菌体展示十五肽文库选择GM1-结合肽发现的。此GM1-结合肽VWRLLAPPFSNRLLP(SEQ ID NO：5)对GM1具有高亲和性(10¹⁰M^-1)，并且IC₅₀为1.0μM。Matsubura等人，(1999)FEBS Letters 456：253-256。具有相同长度并且由相同的氨基酸以随机选择的顺序组成的肽用作对照。在体内使用之前，通过ELISA确认了两种肽的GM1-结合能力。最初，在应用3x10⁶CFU的株系EF3030之前10分钟，将100μg这两种肽在10μl林格氏溶液或PBS中鼻部施用。应用后第1天和第4天，分析ON/E的CFU，以获得相对于未处理的CBA/N小鼠的CFU数。

阻断实验用PAF(Biomol Research Laboratories，Inc.Plymouth meeting，PA)和PAF-R拮抗剂奥替溴铵(Biomol)执行。此化合物以高亲和力与PAF-R结合。单独检验每种神经节苷脂。除了混合的神经节苷脂之外，还检验了脱唾液酸-GM1、GM1、GD1a、GD1b、GT1(Calbiochem)和GM3(Sigma)抑制鼻部建群的能力，如攻击后第1天和第4天所评估的。不同的神经节苷脂能够阻断此过程。GM3神经节苷脂充当阴性对照，因为它缺乏公布的C-多糖结合基序。基于神经节苷脂预孵育后的EF3030建群呈现的数据，混合的神经节苷脂比脱唾液酸-GM1更加有效地阻断建群。这表明除脱唾液酸-GM1之外，还有其他神经节苷脂参与鼻道、肺和脑的肺炎球菌建群过程。这些神经节苷脂抑制研究集中于TIGR4株系和其神经氨酸酶突变体。与TIGR4株系在神经节苷脂-包被的ELISA板的短期体外孵育证明TIGR4株系与脱唾液酸-GM1的连接。肠毒素提供了不同地阻断鼻道中的肺炎链球菌-神经节苷脂相互作用的另一手段。CT和LTh-1二者都是血清组I热不稳定肠毒素(Pickett等人，(1986)J.Bacteriol 165：348-352)并显示相似的虽然略有不同的神经节苷脂结合特异性。Fukuta等人，(1988)InfectImmun.56：1748-1753。CT(List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，CA)结合于GM1并以更低程度结合于GD1b。LTh-1展示与GM1和GD1b的优先结合，并且微弱地结合于GM2和脱唾液酸-GM1。Fukuta等人，(1988)Infect Immun.56：1748-1753。如果GM1是与肺炎链球菌相互作用的主要神经节苷脂，则使用LTh-1不仅将阻断GM1神经节苷脂，而且还可能阻断脱唾液酸-GM1，脱唾液酸-GM1可代表不需要神经氨酸酶活性的天然的低频率结合位点。血清组II的热不稳定肠毒素展示不同的神经节苷脂结合特异性，特别是热不稳定肠毒素LT-IIb。此毒素结合于GD1a并以更低程度结合于GT1b，且未显示对GM1的亲和性。Fukuta等人，(1988)Infect Immun.56：1748-1753。LT-IIa以高亲和性结合于GD1b，并以较低亲和性结合于GM1、GT1b、GQ1b、GD2、GD1a和GM2。Fukuta等人，(1988)Infect Immun.56：1748-1753。LT-II毒素由TD.Connell博士慷慨提供。为了优化鼻部剂量和优化观察抑制肺炎球菌与ON/E的连接的最优时间段，最初对选择的肠毒素执行了剂量响应研究(1.0或10μg)，所述肠毒素在鼻部应用肺炎链球菌的过程中给予。如果在第4天观察到鼻部建群的抑制，则将观察延长至第11天，在此过程中每两天给予肠毒素。测量CBA/N小鼠的ON/E和OB中的CFU。

实施例4C-多糖特异性抗体在肺炎球菌建群中的作用

肺炎球菌C-多糖(也称为磷壁酸)与肺炎球菌F-抗原(也称为脂磷壁质)在结构上相同。Fischer等人(1993)Eur.J.Biochem 215：851-857。这是革兰氏阳性细菌中肺炎链球菌的独特特征。这些分子上的免疫显性决定簇是磷酸胆碱(PC)残基，并且针对PC的Ab保护免受腹膜内或鼻部的肺炎球菌攻击。Briles等人，(1984)Eur.J.Immunol.14：1027-1030；Briles等人，(1981)Nature 294：88-90；Yother等人，(1982)Infect.Immun.36：184-188；Briles等人，(1984)J.Mol.Cell.Immunol.1：305-309。因此，研究了PC-特异性Ab的作用，无论它是通过被动转移或主动鼻部免疫接种获得的。对于保护性PC-特异性Ab的被动转移，即，使用了IgG3(59.6C5)和IgM(22.1A4)两种同种型的T15独特型单克隆Ab(mAb)。Briles等人，(1981)Nature 294：88-90。已显示T15独特型比M603或511独特型对小鼠中的肺炎球菌感染更具保护性(Briles等人，(1984)Eur.J.Immunol.14：1027-1030)，推测是通过更有效地结合C-多糖。被动Ab转移包括随鼻部应用的肺炎链球菌直接应用T15Ab(100μg)，并与i.v.或i.p.施用的Ab进行降低鼻部建群的比较。随时间监测建群(第4、11、18天)，并且如果在这些实验的不同组之间未观察到显著的差异，每两天鼻部应用mAb(20μg)。CBA/N小鼠不产生T15独特型抗-PC Ab。预期抗-PC-特异性Ab的被动转移不在鼻道中诱导粘膜IgA或其他同种型的PC-特异性Ab。为了诱导鼻部Ab，采用了两种不同的方法。一种是直接鼻部应用蛋白酶处理的R36A株系，已知其可诱导对C-多糖的Ab应答。虽然已研究了抗-PC Ab的保护性免疫，但是没有获得关于它们在粘膜表面诸如鼻道的作用的数据。CBA/N小鼠X-染色体连锁的免疫缺陷造成无法产生T15独特型的抗-PCAb。为了确定此无能力的重要性，将CBA/N小鼠与其野生型对应物CBA/J小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，Maine)进行了比较。用株系R36A免疫接种以诱导抗-PC Ab涉及通过蛋白水解去除表面蛋白(Krause(1970)Adv.Immunol.12：1-56)。鼻部免疫接种的替代方法是将PC如先前所述地偶联于蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)(Krause(1970)Adv.Immunol 12：1-56；Chesebro和Metzger(1972)Biochemistry 11：766-771，其由于其中教导的方法而通过引用并入本文)。PC-KLH的鼻部免疫接种用粘膜佐剂CT进行，以优化粘膜免疫应答。最后一次免疫接种后2-3周攻击小鼠，以防止CT对建群的影响。以一周的间隔执行三次鼻部免疫接种。使用C-多糖和PC-特异性ELISA如本领域技术人员常规执行的那样监测血清Ab滴度。对于PC-特异性ELISA，PC如先前所述地偶联于BSA(Chesebro和Metzger(1972)Biochemistry 11：766-771，其由于其中教导的方法而通过引用并入本文)。除了血清之外，还测量了鼻部洗液、唾液和支气管灌洗液中的Ab滴度。这些分析包括IgA、IgM、IgG和IgG亚类在粘膜分泌物和血清二者中的分布。使用诱导最佳的粘膜Ab滴度的方案，用TIGR4株系执行粘膜攻击研究，TIGR4株系以～5x10⁶CFU鼻部施用于小鼠，之后在第4和11天监测建群。在免疫接种研究中，将正常的和完全免疫活性的小鼠(CBA/J株系)与CBA/N小鼠进行了如先前研究中的比较。Wallick等人，(1983)J.Immunol.130：2871-2875。

实施例5神经氨酸酶-特异性免疫性在肺炎链球菌致病中的作用

为了在鼻部攻击之前鼻部免疫接种小鼠，使用了可商业获得的肺炎链球菌来源的神经氨酸酶(Calbiochem，Darmstadt，Germany)。不过，使用含有组氨酸标签的表达载体(Invitrogen，Carlsbad，California)将nanA基因克隆和表达于大肠杆菌，以获得足量的蛋白质用于计划的研究。在存在或不存在CT下，将3.4％甲醛处理的神经氨酸酶的鼻部免疫接种与相对的未处理的神经氨酸酶进行比较以优化粘膜免疫应答。这些免疫接种在CBA/N和CBA/J两种小鼠中进行。间隔一周给予三次鼻部免疫接种，在此过程中通过ELISA监测血清和唾液Ab滴度。用TIGR4株系攻击免疫小鼠，并比较第4天和第11天ON/E、OB、脑、血液、脾和肺的建群。为了阻断宿主相互作用，同时诱导神经氨酸酶特异性Ab和C-多糖-特异性Ab二者。使用神经氨酸酶鼻部免疫接种和通过T15独特型mAb转移的被动免疫保护的组合方案。

实施例6神经氨酸酶-PC轭合物保护针对肺炎链球菌的鼻部攻击的 效力

小鼠用联合CT作为鼻部佐剂的神经氨酸酶和PC-KLH免疫接种，以评估与单独使用各种抗原相比的保护增强和第11天EF3030和TIGR4株系鼻部建群的降低。此外，还如上所示地分析了鼻部洗液、唾液和血清中的Ab滴度，以关联免疫参数和鼻道中的肺炎链球菌保护程度。为了产生更优化的免疫应答，将磷酸胆碱直接偶联于神经氨酸酶。检验了此构建体在用或不用CT作为佐剂递送时，鼻部和全身免疫接种后在CBA/N和CBA/J小鼠二者中的免疫原性。通过ELISA测量了鼻部洗液、唾液和血浆中的Ab滴度。攻击研究用10⁷CFU的株系EF3030或10⁶TIGR4执行。在攻击后第11天处死小鼠并分析血液、鼻部洗液、ON/E、OB和脑中观察到的CFU。以偶联PC的神经氨酸酶进行的免疫接种通过增加对这两种毒性组分的粘膜和全身Ab水平增强了保护。通过使用其他粘膜佐剂改变抗原-特异性IgG亚类分布。CT产生Th2基序、LT基序(一种混合的Th2/Th1基序)和CpG基序，诸如DNA寡核苷酸(ODN)1826，一种具有IgG亚类分布的相关变化的Th1型应答。不同的佐剂进一步增强了神经氨酸酶-C-多糖-特异性免疫性保护针对肺炎链球菌鼻部建群的能力，并导致了配制新的肺炎球菌疫苗的方法。

实施例7鼻部攻击后通过抗-磷酸胆碱-特异性单克隆抗体抑制肺炎链 球菌的鼻部建群。

总计1X10⁶CFU的TIGR4株系与5μg IgG3亚类或IgM同种型的抗-磷酸胆碱单克隆抗体孵育。每个鼻孔施用总计5μl。所示分别为应用9小时和12小时后500ml鼻部洗液中的CFU。对两种单克隆抗体，都观察到了超过80％的显著降低。所示为每组5只小鼠的平均值+SD。数据显示于图10。

实施例8鼻部肺炎链球菌应用后的神经元损伤和炎症

在鼻部应用肺炎链球菌株系EF3030后的第1、3、7和14天，从处理的小鼠中分离ON/E、OB和脑，并通过组织学方法分析其中的炎症反应。比较了D39或TIGR4株系与其nanA突变体株系产生炎症反应的能力。在处死时，以25℃的PBS灌注小鼠，然后以10ml Zamboni固定剂(于0.1M磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛、15％苦味酸)灌注。摘除OB和ON/E，然后将其在新鲜的4％多聚甲醛(PFA)中4℃下放置过夜。然后在切片之前，将组织转移至30％蔗糖溶液4℃48hr以进行低温保护。然后将组织在OCT中冷冻，并将切片(6μm)置于预先包被的显微镜载玻片(于盐水中的10％BSA)。最初，执行苏木精和伊红(H&E)染色以检测此时间段内OB、三叉神经节和ON/E中的任何炎性细胞浸润物(infitrate)。为了评估神经元损伤，对神经生长因子β1(NGF-β1)进行了染色。NGF-β1在神经元损伤后产生，并起防止凋亡和刺激神经细胞的新生长的作用。三叉神经节和OB切片用浓度为0.2μg/ml的生物素化的兔抗-人类NGF-β1Ab染色。Ab染色的切片在4℃孵育过夜。载玻片用PBS润洗，然后与亲和素-生物素-复合物(ABC)Vectastain(Vector Laboratories，Burlingame，CA)在25℃反应30min。组织用PBS润洗3次，然后与二氨基联苯胺(DAB)反应5-10min，如先前所报道的。载玻片再润洗3次，并将切片用C.S.苏木精复染30sec。在H₂O中清洗后，载玻片在100％醇和二甲苯中脱水。NGF-β1的增加提供了神经元组织损伤程度的指示。神经元牵连的另一指示是小胶质细胞的活化。活化的小胶质细胞展示变形虫样、球形外形，而静止细胞(处于G_o/G_l)具有分叉的、分枝外观。活化后的此变化允许技术人员区分静止和活化的小胶质细胞。对于小胶质细胞，在肺炎链球菌攻击后使用F4/80抗体或抗-MAC-1(MI/70)以激活活化状态。除了神经元损伤和小胶质细胞活化之外，还评估了在OB中的凋亡诱导。为此，分析了活性胱天蛋白酶3(一种Asp-Glu-Val-Asp特异性蛋白酶)的诱导，因为它对于启动凋亡途径是重要的。在免疫组织化学中可使用活性胱天蛋白酶3特异性的Ab(Cell SignalingTechnology，Inc.，Beverly，MA)来检测凋亡。如果通过免疫组织化学在神经元组织中检测到胱天蛋白酶3活性，则使用胱天蛋白酶-3测定试剂盒(Molecular probes，Eugene，OR)基于底物蛋白水解后诱导的荧光信号定量活性。

实施例9肺炎链球菌通过逆向轴突运输靶向嗅球的能力

首先，评估了鼻部和i.v.接种后处理的小鼠的神经元组织、OB和脑中的肺炎链球菌积累。i.v.接种后，神经元组织中的任何肺炎链球菌通过血液进入。采集鼻部攻击后第1、4、11和18天的组织。在该情形中，注射后的所有时间点的每克脑和OB中的细菌数量应该是相似的。相反，对于在鼻内接种后通过鼻道进入的细菌，OB中的积累(表示为每组织重量)先于在脑中观察到的积累，并一般保持领先于后者。

第二，执行了鼻部应用后的肺炎链球菌体内成像。使用锝-99(Tc-99m)-标记的TIGR4、稳定的不透明变体和透明变体、EF3030和缺乏nanA和/或nanB的TIGR4突变体以使用γ照相机成像显现它们在小鼠中的存在，如先前使用原始由Waibel等人(1999)Nature Biotechnol.17：897-901描述的策略用腺病毒所执行的。由于该同位素的短半衰期(6hr)，这允许在鼻部应用后大约前24hr进行成像，并允许分析鼻道中发生的早期事件。对于肺炎链球菌的长期成像，使用表达荧光素酶或表达GFP的肺炎球菌EF3030(或TIGR4)株系来显现体内的生物发光。使用了从Xenogen公司(Alameda，California)可商业获得的表达荧光素酶的肺炎链球菌株系EF3030。先前已报道了使用此肺炎球菌株系的成功的体内成像。使用生物发光成像系统(IVIS系统，Xenogen，Inc.)对小鼠成像以检测荧光素酶表达。采集以相同位置定向的小鼠的图像，并始终在i.p.注射2.5mg荧光素后10min进行。在成像过程中，小鼠保持在37℃安氟醚麻醉下。对每只小鼠执行数次成像，从用表达荧光素酶的肺炎链球菌鼻部攻击后第2天开始到第18天。成像的图像采集时间在20sec至10min范围内。数据采集软件确保没有像素在图像采集过程中被饱和。使用Xenogen提供的软件定量来自感兴趣的区域的光发射(相对光子/sec)。光发射的强度用生物发光图像的伪色缩放来代表。生物发光图像典型地是覆盖于同时采集的小鼠的黑白照片之上。此体内成像集中于分析肺炎链球菌从鼻道进入OB的能力。在成功转移荧光素酶基因后，此生物发光研究扩展至nanA TIGR4突变体。

实施例10用NanA片段免疫接种后的体内保护

构建了三种NanA片段。构建的片段为NanA571 SEQ ID NO：19、NanA215 SEQ ID NO：21和NanA186 SEQ ID NO：23。这些片段在SEQ IDNO：30的NanA序列中的相对位置显示于表5。

表5：

所述片段在TIGR4编码区中的相对位置。

图11显示所述片段相对于R6 NanA和TIGR4 NanA的比对。NanA571是以其氨基酸数目命名的重组蛋白。此重组蛋白含有来自TIGR4的NanA的大的中央区段，对应于R6 NanA的氨基酸#230-#800，参见表1(从信号肽的起点开始计数)或成熟蛋白的#173-747。它具有存在于TIGR4株系中的相同的截短的C-末端。所述中央部分覆盖所有4个“Asp”盒，并且还包括为活性位点残基的部分的酪氨酸和谷氨酸。所述重组蛋白具有唾液酸酶活性。计算的带前导序列的NanA571的分子量为约66,735道尔顿，pI8.88。仅链球菌部分的分子量为约63,986道尔顿pI 8.87。

NanA571重组蛋白的序列如下所示：

MGHHHHHHHHHSSGHIEGRHMPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSL

RSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEE

VQKRSQLFKRSDLEKKLPEGAALTEKTDIFESGRNGNPNKDGIKSYRIPA

LLKTDKGTLIAGADERRLHSSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITN

LRDNPKASDPSIGSPVNIDMVLVQDPETKRIFSIYDMFPEGKGIFGMSSQ

KEEAYKKIDGKTYQILYREGEKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVD

PVKPAYSDKGDLYKGDQLLGNIYFTTNKTSPFRIAKDSYLWMSYSDDD

GKTWSAPQDITPMVKADWMKFLGVGPGTGIVLRNGPHKGRILIPVYTT

NNVSHLDGSQSSRVIYSDDHGKTWHAGEAVNDNRQVDGQKIHSSTMN

NRRAQNTESTVVQLNNGDVKLFMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKDIK

RYPQVKDVYVQMSAIHTMHEGKEYIILSNAGGPKRENGMVHLARVEE

NGELTWLKHNPIQKGEFAYNSLQELGNGEYGILYEHTEKGQNAYTLSFR

KFNWEFLSKNLISPTEAN SEQ ID NO：18

斜体的氨基酸衍生自克隆载体。

为了构建所述载体，使用以下寡核苷酸通过聚合酶链式反应从肺炎链球菌株系TIGR4扩增编码NanA的SP1693_TIGR4基因的内部基因片段：

5′-GGAATTCCATATGCCGACAGCAGAACTACCTAAAGGC-3′SEQID NO：24正向(N2N_1844_Nde1)和5′-CGCGGATCCTCATACTGGGTTAGGAAAGTCGCT-3’SEQ ID NO：25(N2N402_BamH1)。

反应在总体积为50μl的混合物中执行30个循环，所述混合物含有3.0mM MgCl2、125μM dNTP、50皮摩各引物和2.5单位Taq DNA聚合酶。所述循环为94℃，1min.；55℃，1min；72℃，5分钟。将此～1725bp扩增的基因片段克隆于使用T-加尾(T-tailed)形式的Topo 4载体。通过PCR鉴定阳性克隆，然后测序，纯化质粒DNA，然后将其用NdeI和BamHI消化，然后将～～1845bp nanA基因片段并入载体的NdeI和BamHI位点之间。使用了pET16b(Novagen，Inc.Darmstadt，Germany)，其具有强T7启动子和翻译信号。在此载体中，存在N-末端His标签和因子Xa克隆位点。DNA测序证实重组质粒pNanA571含有插入载体pET16b的预期的基因片段。

将pNanA571转化入大肠杆菌株系Rosetta Blue(pLysS)(DE3)以生产蛋白。该表达株系含有处于诱导型UV5启动子控制之下的T7启动子的染色体拷贝。它还含有用于稀有密码子的额外的tRNA和使裂解更加容易的pLysS(T7溶菌酶)。用IPTG诱导后，表达含有野生型NanA蛋白的氨基酸#230至#800的截短蛋白。存在于重组蛋白N-末端的六组氨酸残基通过镍层析方法简化了该蛋白的纯化。如果需要，它们可以用因子Xa切割除去。

克隆了pNanA215并纯化了NanA215。所述蛋白质称为NanA215。此重组蛋白含有来自株系TIGR4(SP1693)的NanA的近-N-末端区段，其包括氨基酸残基347-561(编号包括SP)。这对应于成熟蛋白的294-508。所包括的区域覆盖4个“Asp”盒中的两个，但不包括实际的活性位点残基。所制备的重组蛋白没有唾液酸酶活性。rNanA蛋白包括来自NanA的215个氨基酸和来自下文所示的载体的其他氨基酸。计算的带前导序列的分子量为27,062道尔顿pI 6.74。仅链球菌部分的分子量为24,152道尔顿pI5.87。

构建了NanA215载体。使用以下寡核苷酸通过聚合酶链式反应从肺炎链球菌株系TIGR4扩增编码NanA的nana_TIGR4基因的内部基因片段：

5′-GGAATTCCATATGCGTATTCCA-3′SEQ ID NO：26(JW1A_Nde1正向)和5′-CGCGGATCCATCGGCTTTGACCATCGGAG-3′SEQ IDNO：27(JW1A_BamH1反向)。反应在总体积为50μl的混合物中执行30个循环，所述混合物含有3.0mM MgCl2、125μM dNTP、50皮摩各引物和2.5单位Taq DNA聚合酶。所述循环为94℃，1min.；55℃，1min；72℃，5分钟。将此645bp扩增的基因片段克隆于使用T-加尾形式的Topo 4载体。通过PCR和测序鉴定阳性克隆。纯化质粒DNA，然后将其用NdeI和BamHI消化，然后将～645bp nanA基因片段并入载体pET16b(Novagen，Inc.，Darmstadt，Germany)的NdeI和BamHI位点之间。

pET16b载体具有强T7启动子和翻译信号。在此载体中，存在N-末端His标签和因子Xa克隆位点。DNA测序证实重组质粒pNanA216含有插入载体pET16b的预期的基因片段。

将pNanA216转化入大肠杆菌株系Rosetta Blue(pLysS)(DE3)以生产蛋白。该表达株系含有处于诱导型UV5启动子控制之下的T7启动子的染色体拷贝。用IPTG诱导后，表达含有野生型NanA蛋白的大约氨基酸#347至#561的截短蛋白。存在于重组蛋白N-末端的六组氨酸残基通过镍层析方法简化了该蛋白的纯化。如果需要，它们可以用因子Xa切割除去。

NanA215重组蛋白的序列如下所示：

MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMRIPALLKTDKGTLIAGADERRLH

SSDWGDIGMVIRRSEDNGKTWGDRVTITNLRDNPKASDPSIGSPVNIDM

VLVQDPETKRIFSIYDMFPEGKGIFGMSSQKEEAYKKIDGKTYQILYREG

EKGAYTIRENGTVYTPDGKATDYRVVVDPVKPAYSDKGDLYKGDQLLG

NIYFTTNKTSPFRIAKDSYLWMSYSDDDGKTWSAPQDITPMVKADPGC

SEQ ID NO：20

斜体的氨基酸来自载体。

纯化了NanA571和NanA215蛋白。为了从构建体pNanA571和pNanA218纯化所述蛋白，亲和镍层析方法步骤使用了结合缓冲液的Novagen(Darmstadt，Germany)系统。蛋白质初始释放于下列缓冲液：20mMTris-HCl pH 7.9、500mM NaCl、200mM M咪唑。通过考马斯蓝染色的筛选仅主要显示估计纯度超过90％的NanA571的单一条带。

构建了pNanA186并纯化了NanA186。所述蛋白质称为NanA186。此重组蛋白含有来自株系TIGR4(SP1693)的NanA的“近-N-末端”区段，其包括氨基酸残基157-342(编号包括SP)。所包括的区域没有覆盖4个“Asp”盒中的任一个或活性位点残基。所制备的重组蛋白没有唾液酸酶活性。计算的带前导序列的分子量为23,580道尔顿pI 9.49。仅链球菌部分的分子量为20,855道尔顿pI 9.55。

NanA186重组蛋白的序列如下所示：

MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSATKK

DEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFT

VEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRA

NNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRSQLFKRSDLEKKLPEGAAL

TEKTDIFESGRNGNPNKDGSGC SEQ ID NO：22

斜体的氨基酸衍生自载体。

构建了NanA186的载体。使用以下寡核苷酸通过聚合酶链式反应从肺炎链球菌株系TIGR4扩增编码NanA的SP1693_TIGR4基因的内部基因片段：

5′-GGAATTCCATATGGAGTTTAAGCCAGATG-3′SEQ ID NO：28(nanA_sanofi_F)和5′-CGCAGTGGATCCATCTTTATTTGGGTTACCGT-3′SEQ ID NO：29(nanA_sanofi_R)。反应在总体积为50μl的混合物中执行30个循环，所述混合物含有3.0mM MgCl2、125μM dNTP、50皮摩各引物和2.5单位Taq DNA聚合酶。所述循环为94℃，1min.；55℃，1min；72℃，5分钟。将此556bp扩增的基因片段克隆于使用T-加尾形式的Topo4载体。通过PCR鉴定阳性克隆并测序。然后纯化质粒DNA并将其用NdeI和BamHI消化，将～556bp nanA基因片段并入pET16b载体(Novagen，Inc.，Darmstadt，Germany)。该载体具有强T7启动子和翻译信号。在此载体中，存在N-末端His标签和因子Xa克隆位点。DNA序列证实pNanA_186含有预期的基因片段。

将pNanA186转化入大肠杆菌株系Rosetta Blue(pLysS)(DE3)以生产蛋白。此株系含有处于诱导型UV5启动子控制之下的T7启动子的染色体拷贝。用IPTG诱导后，表达含有野生型NanA蛋白的大约氨基酸#157至#342的截短蛋白。存在于N-末端的六组氨酸残基通过金属亲和层析方法简化了纯化。如果需要，它们可以用因子Xa切割除去。

使用纯化的蛋白免疫接种CBA/CAHN-XID(CBA/N)小鼠。小鼠通过滴注含有50μg重组神经氨酸酶A(NanA)的10μl于小鼠的单个鼻孔进行鼻内免疫接种，每次10μl，一周两次(周一和周四)，持续3周。在前两周中，接种包括4微克的霍乱毒素B亚基(Sigma，St.Louis，MO)作为佐剂。免疫接种的稀释剂是乳酸林格氏注射液(Abbot Labs，Abbot Park，Ill)。在免疫接种的最后一周不施用此佐剂，以避免先天免疫的非特异性刺激。对照动物接受相同的6次免疫接种，只是用CTB和乳酸林格氏液但不含重组NanA。示例性免疫接种方案显示于图12。

小鼠的每个实验组还接受由不相关的蛋白(从PET32A载体(Novagen，Darmstadt，Germany)克隆的硫氧还蛋白)组成的模拟免疫接种。在来自大肠杆菌的所有蛋白分离物中，存在一定的LPS污染。为了控制此LPS刺激任何非特异性先天免疫应答，调整模拟蛋白的量，以使制品中含有与免疫原中存在的相同量的LPS。在所有其他方面，此免疫接种与重组NanA片段的相同。

最后一次免疫接种后三周(起点后42天)，用6x10⁵CFU的TIGR4肺炎链球菌攻击小鼠。此株系先前已用于建群研究。参见Briles等人，Infect.Immunol.73：6945-6951(2005)和van Ginkel等人，Proc Natl Acad Sci USA100：13263-13267(2003)。建群后7天，以过多剂量的CO₂使小鼠安乐死。

对于每只小鼠，采集鼻部洗液、鼻部组织、所有肺组织、嗅叶和剩余的脑。还采集了血液样品。这些程序先前已有描述。参见Briles等人，Infect.Immunol.73：6945-6951(2005)和van Ginkel等人，Proc Natl Acad Sci USA100：13263-13267(2003)。将血液和鼻部洗液系列稀释并涂布于血琼脂平板以检测肺炎链球菌。将所述组织各自匀浆、系列稀释和涂布。确定菌落形成单位的数量，并基于计数的CFU数量和涂布的稀释度计算总鼻部洗液、总鼻部组织、总肺样品、总嗅叶和总脑中的菌落形成单位数量。

在图13-18中，菌血症小鼠的计算值用实心黑色方块代表，以区分它们与建群的小鼠。在图19-24中，菌血症小鼠用+表示，而死亡小鼠用x表示。未进行死亡小鼠血液或组织中的CFU确定。更合适的数据点绘制为等于或略高于该组的任何小鼠的最高数据值。

图13-18显示用NanA571、模拟免疫原和对照免疫接种引发的保护。图19-24重复了NanA571和其相关的模拟和对照免疫接种的小鼠的相同数据。图19-24还包括NanA186和NanA215的免疫接种数据。在图19-24显示的数据中，所有片段的模拟和对照免疫接种汇集在一起。

观察到，在用TIGR4的CBA/N小鼠建群中，仅有非常少的小鼠有菌血症或死亡。大多数小鼠在第7天建群而没有菌血症。一些模拟免疫接种的小鼠或对照小鼠具有菌血症，并且少量死亡，但是数量太小，以至于在这些研究中没有针对菌血症或死亡的统计保护(图13和19)。所述模型确实在几乎所有小鼠中产生了建群，从而提供了研究针对建群的保护的机会。在大多数对照小鼠中，观察到肺炎链球菌向肺和脑的侵入。确定了用NanA进行的免疫接种是否可防止在建群之后发生的侵入。

用NanA571进行的免疫接种产生了针对鼻部携带的切实保护，如通过检测鼻部洗液(图14)和鼻部组织(图15)中的肺炎链球菌所测量的。同样地，用NanA进行的免疫接种完全防止了肺炎链球菌到达肺、嗅球或脑(图16、17或18)。

然而，未观察到更小片段的神经氨酸酶NanA186和NanA215产生针对建群的统计学显著的保护(图20和21)。NanA的这两种片段也不引发针对向肺、嗅球或脑的侵入的保护(图22、23和24)。

具有571个氨基酸的片段不含分子的N-末端或C-末端，但是它覆盖基于其他细菌神经氨酸酶而预测的对酶活性重要的所有氨基酸。rNanA571片段引发针对建群的保护。使用神经氨酸酶活性测定也发现此片段具有酶促活性。此类测定描述于Berry等人，J.Bacteriol 178：4854-4860(1996)。

实施例11pNanA571中的位点特异性突变

为了产生去毒的神经氨酸酶，以该蛋白内的两个位点为靶标进行了位点特异性突变。要诱变的位点是基于图25中给出的fugue比对和它与鼠伤寒沙门氏菌或霍乱弧菌的神经氨酸酶中先前进行突变的位点的比较。选择的第一个位点是E647，其被转变为苏氨酸，第二个位点是Y752，其被转变为苯丙氨酸。根据与结构已被解析的其他神经氨酸酶的类似性，推测Y752位于形成活性位点的裂缝的底部，它可能在活性位点与底物的环结构相互作用。推测谷氨酸残基E647通过贡献质子参与催化。

向pNanA571引入位点特异性突变，产生NanA571_E647T和NanA571_Y752F。纯化具有这两种突变的每一种的重组蛋白，并使用MUAN测定在37℃、pH 7.0检验其神经氨酸酶活性。使用此测定，在野生型NanA571蛋白的活性为3.9mol/min/mg的条件下，没有一种突变展示任何可检测的神经氨酸酶活性。活性的全部消除和基于与先前已知的结构的比对推测的活性一致。

贯穿本申请，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用特此并入本申请，以更全面地描述本文描述的化合物、组合物和方法。

可对本文描述的化合物、组合物和方法进行各种修饰和变化。根据本说明书的考虑和本文公开的化合物、组合物和方法的实施，本文描述的化合物、组合物和方法的其他方面将是显然的。预期说明书和实施例被视为是示例性的。

序列表

<110>UAB研究基金会

<120>减轻细菌携带及CNS侵入

<130>20674-071WO1

<160>41

<170>用于Windows的FastSEQ版本4.0

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

atttctgtaacagctaccaa cga                                        23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

gaattccctg tcttttcaaa gtc                                       23

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

ccgatacact ctcttcccga                                                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

acagttggtg ctaaggaggc                                                20

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成产生的肽

<400>5

Val Trp Arg Leu Leu Ala Pro Pro Phe Ser Asn Arg Leu Leu Pro

1                5                  10                  15

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cgcggatcct catactgggt taggaaagtc gtcg                                34

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

ggaattccat atgccgacag cagaactacc taaaggc                            37

<210>8

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

ggaattccat atgctggcaa atgaaactca actttcgggg g                       41

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

cgcggatcca tcggctttga ccatcggag                                     29

<210>10

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

ggaattccat atgcgtattc cagcacttct caagacag                           38

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

ggaacattac ctcgcaaaag g                                        21

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

tacccgcagg cataacatc                                           19

<210>13

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>示例性基序

<400>13

Leu Pro Glu Thr Gly

1                5

<210>14

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>示例性基序

<220>

<221>变体

<222>3

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>14

Leu Pro Xaa Thr Gly

1                5

<210>15

<211>1035

<212>PRT

<213>肺炎链球菌

<400>15

Met Ser Tyr Phe Arg Asn Arg Asp Ile Asp Ile Glu Arg Asn Ser Met

 1               5                  10                  15

Asn Arg Ser Val Gln Glu Arg Lys Cys Arg Tyr Ser Ile Arg Lys Leu

            20                  25                  30

Ser Val Gly Ala Val Ser Met Ile Val Gly Ala Val Val Phe Gly Thr

        35                  40                  45

Ser Pro Val Leu Ala Gln Glu Gly Ala Ser Glu Gln Pro Leu Ala Asn

    50                  55                  60

Glu Thr Gln Leu Ser Gly Glu Ser Ser Thr Leu Thr Asp Thr Glu Lys

65                  70                  75                  80

Ser Gln Pro Ser Ser Glu Thr Glu Leu Ser Gly Asn Lys Gln Glu Gln

                85                  90                  95

Glu Arg Lys Asp Lys Gln Glu Glu Lys Ile Pro Arg Asp Tyr Tyr Ala

            100                 105                 110

Arg Asp Leu Glu Asn Val Glu Thr Val Ile Glu Lys Glu Asp Val Glu

        115                 120                 125

Thr Asn Ala Ser Asn Gly Gln Arg Val Asp Leu Ser Ser Glu Leu Asp

    130                 135                 140

Lys Leu Lys Lys Leu Glu Asn Ala Thr Val His Met Glu Phe Lys Pro

145                 150                 155                 160

Asp Ala Lys Ala Pro Ala Phe Tyr Asn Leu Phe Ser Val Ser Ser Ala

                165                 170                 175

Thr Lys Lys Asp Glu Tyr Phe Thr Met Ala Val Tyr Asn Asn Thr Ala

            180                 185                 190

Thr Leu Glu Gly Arg Gly Ser Asp Gly Lys Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr

        195                 200                 205

Asn Asp Ala Pro Leu Lys Val Lys Pro Gly Gln Trp Asn Ser Val Thr

    210                 215                 220

Phe Thr Val Glu Lys Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val Arg

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly Asn

                245                 250                 255

Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala Thr

            260                 265                 270

Lys Arg Ala Asn Asn Thr Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg Asn

        275                 280                 285

Leu Thr Val Tyr Asn Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys Arg

    290                 295                 300

Ser Gln Leu Phe Lys Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu Gly

305                 310                 315                 320

Ala Ala Leu Thr Glu Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn Gly

                325                 330                 335

Lys Pro Asn Lys Asp Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu

            340                 345                 350

Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg Leu

        355                 360                 365

His Ser Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser Glu

    370                 375                 380

Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu Arg

385                 390                 395                 400

Asp Asn Pro Lys Ala Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn Ile

                405                 410                 415

Asp Met Val Leu Val Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser Ile

            420                 425                 430

Tyr Asp Met Phe Pro Glu Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser Gln

        435                 440                 445

Lys Glu Glu Ala Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile Leu

    450                 455                 460

Tyr Arg Glu Gly Glu Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly Thr

465                 470                 475                 480

Val Tyr Thr Pro Asp Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val Asp

                485                 490                 495

Pro Val Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asn

            500                 505                 510

Gln Leu Leu Gly Asn Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro Phe

        515                 520                 525

Arg Ile Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp

    530                 535                 540

Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys Ala

545                 550                 555                 560

Asp Trp Met Lys Phe Leu Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val Leu

                565                 570                 575

Arg Asn Gly Pro His Lys Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr Thr

            580                 585                 590

Asn Asn Val Ser His Leu Asn Gly Ser Gln Ser Ser Arg Ile Ile Tyr

        595                 600                 605

Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp

    610                 615                 620

Asn Arg Gln Val Asp Gly Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn Asn

625                 630                 635                 640

Arg Arg Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn Gly

                645                 650                 655

Asp Val Lys Leu Phe Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala

            660                 665                 670

Thr Ser Lys Asp Gly Gly Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg Tyr

        675                 680                 685

Pro Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr Met

    690                 695                 700

His Glu Gly Lys Glu Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro Lys

705                 710                 715                 720

Arg Glu Asn Gly Met Val His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu

                725                 730                 735

Leu Thr Trp Leu Lys His Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ala Tyr

            740                 745                 750

Asn Ser Leu Gln Glu Leu Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr Glu

        755                 760                 765

His Thr Glu Lys Gly Gln Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Lys Phe

    770                 775                 780

Asn Trp Asp Phe Leu Ser Lys Asp Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala Lys

785                 790                 795                 800

Val Lys Arg Thr Arg Glu Met Gly Lys Gly Val Ile Gly Leu Glu Phe

                805                 810                 815

Asp Ser Glu Val Leu Val Asn Lys Ala Pro Thr Leu Gln Leu Ala Asn

            820                 825                 830

Gly Lys Thr Ala Arg Phe Met Thr Gln Tyr Asp Thr Lys Thr Leu Leu

        835                 840                 845

Phe Thr Val Asp Ser Glu Asp Met Gly Gln Lys Val Thr Gly Leu Ala

    850                 855                 860

Glu Gly Ala Ile Glu Ser Met His Asn Leu Pro Val Ser Val Ala Gly

865                 870                 875                 880

Thr Lys Leu Ser Asn Gly Met Asn Gly Ser Glu Ala Ala Val His Glu

                885                 890                 895

Val Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Leu Gly Thr Ser Gly Glu Glu Pro Ala

            900                 905                 910

Pro Thr Val Glu Lys Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Leu Gly Thr Ser Gly

        915                 920                 925

Glu Glu Pro Ala Pro Thr Val Glu Lys Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Leu

    930                 935                 940

Gly Thr Ala Gly Glu Glu Ala Ala Pro Thr Val Glu Lys Pro Glu Phe

945                 950                 955                 960

Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Glu Pro Ala Val His Glu Ile Ala Glu

                965                 970                 975

Tyr Lys Gly Ser Asp Ser Leu Val Thr Leu Thr Thr Lys Glu Asp Tyr

            980                 985                 990

Thr Tyr Lys Ala Pro Leu Ala Gln Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Asn

        995                 1000                1005

Lys Glu Ser Asp Leu Leu Ala Ser Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu

    1010                1015                1020

Gly Leu Phe Thr Leu Gly Lys Lys Arg Glu Gln

1025                1030                1035

<210>16

<211>962

<212>PRT

<213>肺炎链球菌

<400>16

Met Asn Arg Ser Val Gln Glu Arg Lys Cys Arg Tyr Ser Ile Arg Lys

 1               5                  10                  15

Leu Ser Val Gly Ala Val Ser Met Ile Val Gly Ala Val Val Asn Gly

            20                  25                  30

Thr Ser Pro Val Leu Ala Gln Glu Gly Ala Ser Glu Gln Pro Leu Ala

        35                  40                  45

Asn Glu Thr Gln Leu Ser Gly Glu Ser Ser Thr Leu Thr Asp Thr Glu

    50                  55                  60

Lys Ser Gln Pro Ser Ser Glu Thr Glu Leu Ser Gly Asn Lys Gln Glu

65                  70                  75                  80

Gln Glu Arg Lys Asp Lys Gln Glu Glu Lys Ile Pro Arg Asp Tyr Tyr

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Leu Glu Asn Val Glu Thr Val Ile Glu Lys Glu Asp Val

            100                 105                 110

Glu Thr Asn Ala Ser Asn Gly Gln Arg Val Asp Leu Ser Ser Glu Leu

        115                 120                 125

Asp Lys Leu Lys Lys Leu Glu Asn Ala Thr Val His Met Glu Asn Lys

    130                 135                 140

Pro Asp Ala Lys Ala Pro Ala Phe Tyr Asn Leu Asn Ser Val Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ala Thr Lys Lys Asp Glu Tyr Phe Thr Met Ala Val Tyr Asn Asn Thr

                165                 170                 175

Ala Thr Leu Glu Gly Arg Gly Ser Asp Gly Lys Gln Asn Tyr Asn Asn

            180                 185                 190

Tyr Asn Asp Ala Pro Leu Lys Val Lys Pro Gly Gln Trp Asn Ser Val

        195                 200                 205

Thr Phe Thr Val Glu Lys Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val

    210                 215                 220

Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly

225                 230                 235                 240

Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala

                245                 250                 255

Thr Lys Arg Ala Asn Asn ThrVal Trp Gly Ser Asn Leu Gln  Ile Arg

            260                 265                 270

Asn Leu Thr Val Tyr Asn Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys

        275                 280                 285

Arg Ser Gln Leu Asn Lys Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu

    290                 295                 300

Gly Ala Ala Leu Thr Glu Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn

305                 310                 315                 320

Gly Asn Pro Asn Lys Asp Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu

                325                 330                 335

Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg

            340                 345                 350

Leu His Ser Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser

        355                 360                 365

Glu Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu

    370                 375                 380

Arg Asp Asn Pro Lys Ala Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn

385                 390                 395                 400

Ile Asp Met Val Leu Val Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Asn Ser

                405                 410                 415

Ile Tyr Asp Met Phe Pro Glu Gly Lys Gly Ile Asn Gly Met Ser Ser

            420                 425                 430

Gln Lys Glu Glu Ala Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile

        435                 440                 445

Leu Tyr Arg Glu Gly Glu Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly

    450                 455                 460

Thr Val Tyr Thr Pro Asp Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val

465                 470                 475                 480

Asp Pro Val Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly

                485                 490                 495

Asp Gln Leu Leu Gly Asn Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro

            500                 505                 510

Asn Arg Ile Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp

        515                 520                 525

Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys

    530                 535                 540

Ala Asp Trp Met Lys Phe Leu Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val

545                 550                 555                 560

Leu Arg Asn Gly Pro His Lys Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr

                565                 570                 575

Thr Asn Asn Val Ser His Leu Asp Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile

            580                 585                 590

Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn

        595                 600                 605

Asp Asn Arg Gln Val Asp Gly Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn

    610                 615                 620

Asn Arg Arg Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn

625                 630                 635                 640

Gly Asp Val Lys Leu Asn Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val

                645                 650                 655

Ala Thr Ser Lys Asp Gly Gly Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg

            660                 665                 670

Tyr Pro Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr

        675                 680                 685

Met His Glu Gly Lys Glu Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro

    690                 695                 700

Lys Arg Glu Asn Gly Met Val His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly

705                 710                 715                 720

Glu Leu Thr Trp Leu Lys His Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Asn Ala

                725                 730                 735

Tyr Asn Ser Leu Gln Glu Leu Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr

            740                 745                 750

Glu His Thr Glu Lys Gly Gln Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Asn Arg Lys

        755                 760                 765

Asn Asn Trp Glu Asn Leu Ser Lys Asn Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala

    770                 775                 780

Asn Asn Arg Asp Gly Gln Arg Arg Asp Gly Gln Arg Ser Tyr Trp Leu

785                 790                 795                 800

Gly Val Arg Leu Arg Ser Ile Gly Gln Gln Gly Ser Asn Pro Ser Ile

                805                 810                 815

Gly Lys Trp Asn Asn Ser Asp Asn Pro Asn Pro Val Asn Asn Gln Asp

            820                 825                 830

Leu Val Val Cys Ser Arg Asn Gly Arg Tyr Arg Thr Gly Asn Tyr Trp

        835                 840                 845

Tyr Ser Asn Arg Lys His Arg Lys Tyr Ala Asn Ser Ser Cys Lys Ser

    850                 855                 860

Ser Arg Cys Gln Ser Ser Trp Arg Ser Lys Trp Asn Gln Ser Ser Gly

865                 870                 875                 880

Ala Asn Ser Ser Arg Ile Tyr Arg Gly Ser Asn Trp Tyr Arg Ala Ser

                885                 890                 895

Cys Ser Asn Asn Arg Arg Val Asn Gly Ile Asn Phe Ala Cys Asn Ser

            900                 905                 910

Tyr Tyr Lys Lys Arg Leu Tyr Leu Gln Ser Ser Ser Cys Ser Ala Gly

        915                 920                 925

Thr Ser Asn Asn Arg Lys Gln Gly Glu Asn Pro Pro Ser Phe Thr Arg

    930                 935                 940

Thr Asn Ser Asn Leu Pro Trp Ser Val Tyr Ala Arg Glu Lys Glu Arg

945                 950                 955                 960

Thr Ile

<210>17

<211>382

<212>PRT

<213>Streptococcus typhimirium

<400>17

Met Thr Val Glu Lys Ser Val Val Phe Lys Ala Glu Gly Glu His Phe

 1               5                  10                  15

Thr Asp Gln Lys Gly Asn Thr Ile Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly Thr

            20                  25                  30

Thr Lys Tyr Phe Arg Ile Pro Ala Met Cys Thr Thr Ser Lys Gly Thr

        35                  40                  45

Ile Val Val Phe Ala Asp Ala Arg His Asn Thr Ala Ser Asp Gln Ser

    50                  55                  60

Phe Ile Asp Thr Ala Ala Ala Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp

65                  70                  75                  80

Asn Lys Lys Ile Ala Ile Tyr Asn Asp Arg Val Asn Ser Lys Leu Ser

                85                  90                  95

Arg Val Met Asp Pro Thr Cys Ile Val Ala Asn Ile Gln Gly Arg Glu

            100                 105                 110

Thr Ile Leu Val Met Val Gly Lys Trp Asn Asn Asn Asp Lys Thr Trp

        115                 120                 125

Gly Ala Tyr Arg Asp Lys Ala Pro Asp Thr Asp Trp Asp Leu Val Leu

    130                 135                 140

Tyr Lys Ser Thr Asp Asp Gly Val Thr Phe Ser Lys Val Glu Thr Asn

145                 150                 155                 160

Ile His Asp Ile Val Thr Lys Asn Gly Thr Ile Ser Ala Met Leu Gly

                165                 170                 175

Gly Val Gly Ser Gly Leu Gln Leu Asn Asp Gly Lys Leu Val Phe Pro

            180                 185                 190

Val Gln Met Val Arg Thr Lys Asn Ile Thr Thr Val Leu Asn Thr Ser

        195                 200                 205

Phe Ile Tyr Ser Thr Asp Gly Ile Thr Trp Ser Leu Pro Ser Gly Tyr

    210                 215                 220

Cys Glu Gly Phe Gly Ser Glu Asn Asn Ile Ile Glu Phe Asn Ala Ser

225                 230                 235                 240

Leu Val Asn Asn Ile Arg Asn Ser Gly Leu Arg Arg Ser Phe Glu Thr

                245                 250                 255

Lys Asp Phe Gly Lys Thr Trp Thr Glu Phe Pro Pro Met Asp Lys Lys

            260                 265                 270

Val Asp Asn Arg Asn His Gly Val Gln Gly Ser Thr Ile Thr Ile Pro

        275                 280                 285

Ser Gly Asn Lys Leu Val Ala Ala His Ser Ser Ala Gln Asn Lys Asn

    290                 295                 300

Asn Asp Tyr Thr Arg Ser Asp Ile Ser Leu Tyr Ala His Asn Leu Tyr

305                 310                 315                 320

Ser Gly Glu Val Lys Leu Ile Asp Asp Phe Tyr Pro Lys Val Gly Asn

                325                 330                 335

Ala Ser Gly Ala Gly Tyr Ser Cys Leu Ser Tyr Arg Lys Asn Val Asp

            340                 345                 350

Lys Glu Thr Leu Tyr Val Val Tyr Glu Ala Asn Gly Ser Ile Glu Phe

        355                 360                 365

Gln Asp Leu Ser Arg His Leu Pro Val Ile Lys Ser Tyr Asn

    370                 375                 380

<210>18

<211>593

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>18

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His

 1               5                  10                  15

Ile Glu Gly Arg His Met Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val

            20                  25                  30

Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly

        35                  40                  45

Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala

    50                  55                  60

Thr Lys Arg Ala Asn Asn Thr Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg

65                  70                  75                  80

Asn Leu Thr Val Tyr Asn Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys

                85                  90                  95

Arg Ser Gln Leu Phe Lys Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu

            100                 105                 110

Gly Ala Ala Leu Thr Glu Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn

        115                 120                 125

Gly Asn Pro Asn Lys Asp Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu

    130                 135                 140

Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg

145                 150                 155                 160

Leu His Ser Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser

                165                 170                 175

Glu Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu

            180                 185                 190

Arg Asp Asn Pro Lys Ala Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn

        195                 200                 205

Ile Asp Met Val Leu Val Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser

    210                 215                 220

Ile Tyr Asp Met Phe Pro Glu Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser

225                 230                 235                 240

Gln Lys Glu Glu Ala Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile

                245                 250                 255

Leu Tyr Arg Glu Gly Glu Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly

            260                 265                 270

Thr Val Tyr Thr Pro Asp Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val

        275                 280                 285

Asp Pro Val Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly

    290                 295                 300

Asp Gln Leu Leu Gly Asn Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro

305                 310                 315                 320

Phe Arg Ile Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp

                325                 330                 335

Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys

            340                 345                 350

Ala Asp Trp Met Lys Phe Leu Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val

        355                 360                 365

Leu Arg Asn Gly Pro His Lys Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr

    370                 375                 380

Thr Asn Asn Val Ser His Leu Asp Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile

385                 390                 395                 400

Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn

                405                 410                 415

Asp Asn Arg Gln Val Asp Gly Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn

            420                 425                 430

Asn Arg Arg Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn

        435                 440                 445

Gly Asp Val Lys Leu Phe Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val

    450                 455                 460

Ala Thr Ser Lys Asp Gly Gly Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg

465                 470                 475                 480

Tyr Pro Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr

                485                 490                 495

Met His Glu Gly Lys Glu Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro

            500                 505                 510

Lys Arg Glu Asn Gly Met Val His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly

        515                 520                 525

Glu Leu Thr Trp Leu Lys His Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ala

    530                 535                 540

Tyr Asn Ser Leu Gln Glu Leu Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr

545                 550                 555                 560

Glu His Thr Glu Lys Gly Gln Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Lys

                565                 570                 575

Phe Asn Trp Glu Phe Leu Ser Lys Asn Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala

            580                 585                 590

Asn

<210>19

<211>571

<212>PRT

<213>肺炎链球菌

<400>19

Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly

 1               5                  10                  15

Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met

            20                  25                  30

Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala Thr Lys Arg Ala Asn Asn

        35                  40                  45

Thr Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asn

    50                  55                  60

Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys Arg Ser Gln Leu Phe Lys

65                  70                  75                  80

Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu Gly Ala Ala Leu Thr Glu

                85                  90                  95

Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn Gly Asn Pro Asn Lys Asp

            100                 105                 110

Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly

        115                 120                 125

Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg Leu His Ser Ser Asp Trp

    130                 135                 140

Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser Glu Asp Asn Gly Lys Thr

145                 150                 155                 160

Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu Arg Asp Asn Pro Lys Ala

                165                 170                 175

Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Val Leu Val

            180                 185                 190

Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser Ile Tyr Asp Met Phe Pro

        195                 200                 205

Glu Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser Gln Lys Glu Glu Ala Tyr

    210                 215                 220

Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile Leu Tyr Arg Glu Gly Glu

225                 230                 235                 240

Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly Thr Val Tyr Thr Pro Asp

                245                 250                 255

Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Val Lys Pro Ala

            260                 265                 270

Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asp Gln Leu Leu Gly Asn

        275                 280                 285

Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro Phe Arg Ile Ala Lys Asp

    290                 295                 300

Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser

305                 310                 315                 320

Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys Ala Asp Trp Met Lys Phe

                325                 330                 335

Leu Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val Leu Arg Asn Gly Pro His

            340                 345                 350

Lys Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr Thr Asn Asn Val Ser His

        355                 360                 365

Leu Asp Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile Tyr Ser Asp Asp His Gly

    370                 375                 380

Lys Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp Asn Arg Gln Val Asp

385                 390                 395                 400

Gly Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn Asn Arg Arg Ala Gln Asn

                405                 410                 415

Thr Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn Gly Asp Val Lys Leu Phe

            420                 425                 430

Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala Thr Ser Lys Asp Gly

        435                 440                 445

Gly Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg Tyr Pro Gln Val Lys Asp

    450                 455                 460

Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr Met His Glu Gly Lys Glu

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro Lys Arg Glu Asn Gly Met

                485                 490                 495

Val His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu Leu Thr Trp Leu Lys

            500                 505                 510

His Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gln Glu

        515                 520                 525

Leu Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr Glu His Thr Glu Lys Gly

    530                 535                 540

Gln Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Lys Phe Asn Trp Glu Phe Leu

545                 550                 555                 560

Ser Lys Asn Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala Asn

                565                 570

<210>20

<211>240

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>20

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His

 1               5                  10                  15

Ile Glu Gly Arg His Met Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys

            20                  25                  30

Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg Leu His Ser Ser Asp

        35                  40                  45

Trp Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser Glu Asp Asn Gly Lys

    50                  55                  60

Thr Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu Arg Asp Asn Pro Lys

65                  70                  75                  80

Ala Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Val Leu

                85                  90                  95

Val Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser Ile Tyr Asp Met Phe

            100                 105                 110

Pro Glu Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser Gln Lys Glu Glu Ala

        115                 120                 125

Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile Leu Tyr Arg Glu Gly

    130                 135                 140

Glu Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly Thr Val Tyr Thr Pro

145                 150                 155                 160

Asp Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Val Lys Pro

                165                 170                 175

Ala Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asp Gln Leu Leu Gly

            180                 185                 190

Asn Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro Phe Arg Ile Ala Lys

        195                 200                 205

Asp Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp

210                 215                 220

Ser Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys Ala Asp Pro Gly Cys

225                 230                 235                 240

<210>21

<211>215

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>21

Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Ala Asp Glu Arg Arg Leu His Ser Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly Met

            20                  25                  30

Val Ile Arg Arg Ser Glu Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg Val

        35                  40                  45

Thr Ile Thr Asn Leu Arg Asp Asn Pro Lys Ala Ser Asp Pro Ser Ile

    50                  55                  60

Gly Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Val Leu Val Gln Asp Pro Glu Thr

65                  70                  75                  80

Lys Arg Ile Phe Ser Ile Tyr Asp Met Phe Pro Glu Gly Lys Gly Ile

                85                  90                  95

Phe Gly Met Ser Ser Gln Lys Glu Glu Ala Tyr Lys Lys Ile Asp Gly

            100                 105                 110

Lys Thr Tyr Gln Ile Leu Tyr Arg Glu Gly Glu Lys Gly Ala Tyr Thr

        115                 120                 125

Ile Arg Glu Asn Gly Thr Val Tyr Thr Pro Asp Gly Lys Ala Thr Asp

    130                 135                 140

Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Val Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys Gly

145                 150                 155                 160

Asp Leu Tyr Lys Gly Asp Gln Leu Leu Gly Asn Ile Tyr Phe Thr Thr

                165                 170                 175

Asn Lys Thr Ser Pro Phe Arg Ile Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Trp Met

            180                 185                 190

Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Gln Asp Ile

        195                 200                 205

Thr Pro Met Val Lys Ala Asp

    210                 215

<210>22

<211>211

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述；note＝

合成构建体

<400>22

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His

 1               5                  10                  15

Ile Glu Gly Arg His Met Glu Phe Lys Pro Asp Ala Lys Ala Pro Ala

            20                  25                  30

Phe Tyr Asn Leu Phe Ser Val Ser Ser Ala Thr Lys Lys Asp Glu Tyr

        35                  40                  45

Phe Thr Met Ala Val Tyr Asn Asn Thr Ala Thr Leu Glu Gly Arg Gly

    50                  55                  60

Ser Asp Gly Lys Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Asn Asp Ala Pro Leu Lys

65                  70                  75                  80

Val Lys Pro Gly Gln Trp Asn Ser Val Thr Phe Thr Val Glu Lys Pro

                85                  90                  95

Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val

            100                 105                 110

Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro

        115                 120                 125

Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala Thr Lys Arg Ala Asn Asn Thr

    130                 135                 140

Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asn Arg

145                 150                 155                 160

Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys Arg Ser Gln Leu Phe Lys Arg

                165                 170                 175

Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu Gly Ala Ala Leu Thr Glu Lys

            180                 185                 190

Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn Gly Asn Pro Asn Lys Asp Gly

        195                 200                 205

Ser Gly Cys

    210

<210>23

<211>186

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>23

Glu Phe Lys Pro Asp Ala Lys Ala Pro Ala Phe Tyr Asn Leu Phe Ser

 1               5                  10                  15

Val Ser Ser Ala Thr Lys Lys Asp Glu Tyr Phe Thr Met Ala Val Tyr

            20                  25                  30

Asn Asn Thr Ala Thr Leu Glu Gly Arg Gly Ser Asp Gly Lys Gln Phe

        35                  40                  45

Tyr Asn Asn Tyr Asn Asp Ala Pro Leu Lys Val Lys Pro Gly Gln Trp

    50                  55                  60

Asn Ser Val Thr Phe Thr Val Glu Lys Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys

65                  70                  75                  80

Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu

                85                  90                  95

Arg Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Thr His Val Gln

            100                 105                 110

Ile Gly Ala Thr Lys Arg Ala Asn Asn Thr Val Trp Gly Ser Asn Leu

        115                 120                 125

Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asn Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu

    130                 135                 140

Val Gln Lys Arg Ser Gln Leu Phe Lys Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys

145                 150                 155                 160

Leu Pro Glu Gly Ala Ala Leu Thr Glu Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser

                165                 170                 175

Gly Arg Asn Gly Asn Pro Asn Lys Asp Gly

            180                 185

<210>24

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

ggaattccat atgccgacag cagaactacc taaaggc                       37

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

cgcggatcct catactgggt taggaaagtc gct                                      33

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

ggaattccat atgcgtattc ca                                                  22

<210>27

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

cgcggatcca tcggctttga ccatcggag                                           29

<210>28

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

ggaattccat atggagttta agccagatg                                           29

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

cgcagtggat ccatctttat ttgggttacc gt                          32

<210>30

<211>800

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>30

Met Ser Tyr Phe Arg Asn Arg Asp Ile Asp Ile Glu Arg Asn Ser Met

 1               5                  10                  15

Ile Arg Ser Val Gln Glu Arg Lys Cys Arg Tyr Ser Ile Arg Lys Leu

            20                  25                  30

Ser Val Gly Ala Val Ser Met Ile Val Gly Ala Val Val Phe Gly Thr

        35                  40                  45

Ser Pro Val Leu Ala Gln Glu Gly Ala Ser Glu Gln Pro Leu Ala Asn

    50                  55                  60

Glu Thr Gln Leu Ser Gly Glu Ser Ser Thr Leu Thr Asp Thr Glu Lys

65                  70                  75                  80

Ser Gln Pro Ser Ser Glu Thr Glu Leu Ser Gly Asn Lys Gln Glu Gln

                85                  90                  95

Glu Arg Lys Asp Lys Gln Glu Glu Lys Ile Pro Arg Asp Tyr Tyr Ala

            100                 105                 110

Arg Asp Leu Glu Asn Val Glu Thr Val Ile Glu Lys Glu Asp Val Glu

        115                 120                 125

Thr Asn Ala Ser Asn Gly Gln Arg Val Asp Leu Ser Ser Glu Leu Asp

    130                 135                 140

Lys Leu Lys Lys Leu Glu Asn Ala Thr Val His Met Glu Phe Lys Pro

145                 150                 155                 160

Asp Ala Lys Ala Pro Ala Phe Tyr Asn Leu Phe Ser Val Ser Ser Ala

                165                 170                 175

Thr Lys Lys Asp Glu Tyr Phe Thr Met Ala Val Tyr Asn Asn Thr Ala

            180                 185                 190

Thr Leu Glu Gly Arg Gly Ser Asp Gly Lys Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr

        195                 200                 205

Asn Asp Ala Pro Leu Lys Val Lys Pro Gly Gln Trp Asn Ser Val Thr

    210                 215                 220

Phe Thr Val Glu Lys Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val Arg

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly Asn

                245                 250                 255

Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala Thr

            260                 265                 270

Lys Arg Ala Asn Asn Thr Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg Asn

        275                 280                 285

Leu Thr Val Tyr Asn Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys Arg

    290                 295                 300

Ser Gln Leu Phe Lys Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu Gly

305                 310                 315                 320

Ala Ala Leu Thr Glu Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn Gly

                325                 330                 335

Asn Pro Asn Lys Asp Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu

            340                 345                 350

Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg Leu

        355                 360                 365

His Ser Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser Glu

    370                 375                 380

Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu Arg

385                 390                 395                 400

Asp Asn Pro Lys Ala Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn Ile

                405                 410                 415

Asp Met Val Leu Val Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser Ile

            420                 425                 430

Tyr Asp Met Phe Pro Glu Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser Gln

        435                 440                 445

Lys Glu Glu Ala Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile Leu

    450                 455                 460

Tyr Arg Glu Gly Glu Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly Thr

465                 470                 475                 480

Val Tyr Thr Pro Asp Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val Asp

                485                 490                 495

Pro Val Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asp

            500                 505                 510

Gln Leu Leu Gly Asn Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro Phe

        515                 520                 525

Arg Ile Ala Lys Asp Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp

    530                 535                 540

Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys Ala

545                 550                 555                 560

Asp Trp Met Lys Phe Leu Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val Leu

                565                 570                 575

Arg Asn Gly Pro His Lys Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr Thr

            580                 585                 590

Asn Asn Val Ser His Leu Asp Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile Tyr

        595                 600                 605

Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp

    610                 615                 620

Asn Arg Gln Val Asp Gly Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn Asn

625                 630                 635                 640

Arg Arg Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn Gly

                645                 650                 655

Asp Val Lys Leu Phe Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala

            660                 665                 670

Thr Ser Lys Asp Gly Gly Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg Tyr

        675                 680                 685

Pro Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr Met

    690                 695                 700

His Glu Gly Lys Glu Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro Lys

705                 710                 715                 720

Arg Glu Asn Gly Met Val His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu

                725                 730                 735

Leu Thr Trp Leu Lys His Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ala Tyr

            740                 745                 750

Asn Ser Leu Gln Glu Leu Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr Glu

        755                 760                 765

His Thr Glu Lys Gly Gln Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Lys Phe

    770                 775                 780

Asn Trp Glu Phe Leu Ser Lys Asn Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala Asn

785                 790                 795                 800

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

cgcaaaatac aacctcaacg gtggtac                               27

<210>32

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

gtaccaccgt tgaggttgta ttttgcg                               27

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

aaggagagtt tgcctttaat tcgctccaag                            30

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

cttggagcga attaaaggca aactctcctt                            30

<210>35

<211>571

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>35

Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly

 1               5                  10                  15

Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met

            20                  25                  30

Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala Thr Lys Arg Ala Asn Asn

        35                  40                  45

Thr Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asn

    50                  55                  60

Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys Arg Ser Gln Leu Phe Lys

65                  70                  75                  80

Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu Gly Ala Ala Leu Thr Glu

                85                  90                  95

Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn Gly Asn Pro Asn Lys Asp

            100                 105                 110

Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly

        115                 120                 125

Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg Leu His Ser Ser Asp Trp

    130                 135                 140

Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser Glu Asp Asn Gly Lys Thr

145                 150                 155                 160

Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu Arg Asp Asn Pro Lys Ala

                165                 170                 175

Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Val Leu Val

            180                 185                 190

Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser Ile Tyr Asp Met Phe Pro

        195                 200                 205

Glu Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser Gln Lys Glu Glu Ala Tyr

    210                 215                 220

Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile Leu Tyr Arg Glu Gly Glu

225                 230                 235                 240

Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly Thr Val Tyr Thr Pro Asp

                245                 250                 255

Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Val Lys Pro Ala

            260                 265                 270

Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asp Gln Leu Leu Gly Asn

        275                 280                 285

Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro Phe Arg Ile Ala Lys Asp

    290                 295                 300

Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser

305                 310                 315                 320

Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys Ala Asp Trp Met Lys Phe

                325                 330                 335

Leu Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val Leu Arg Asn Gly Pro His

            340                 345                 350

Lys Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr Thr Asn Asn Val Ser His

        355                 360                 365

Leu Asp Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile Tyr Ser Asp Asp His Gly

    370                 375                 380

Lys Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp Asn Arg Gln Val Asp

385                 390                 395                 400

Gly Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn Asn Arg Arg Ala Gln Asn

                405                 410                 415

Thr Thr Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn Gly Asp Val Lys Leu Phe

            420                 425                 430

Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala Thr Ser Lys Asp Gly

        435                 440                 445

Gly Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg Tyr Pro Gln Val Lys Asp

    450                 455                 460

Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr Met His Glu Gly Lys Glu

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro Lys Arg Glu Asn Gly Met

                485                 490                 495

Val His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu Leu Thr Trp Leu Lys

            500                 505                 510

His Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gln Glu

        515                 520                 525

Leu Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr Glu His Thr Glu Lys Gly

    530                 535                 540

Gln Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Lys Phe Asn Trp Glu Phe Leu

545                 550                 555                 560

Ser Lys Asn Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala Asn

                565                 570

<210>36

<211>571

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>36

Pro Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly

 1               5                  10                  15

Val Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met

            20                  25                  30

Pro Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala Thr Lys Arg Ala Asn Asn

        35                  40                  45

Thr Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asn

    50                  55                  60

Arg Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys Arg Ser Gln Leu Phe Lys

65                  70                  75                  80

Arg Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu Gly Ala Ala Leu Thr Glu

                85                  90                  95

Lys Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn Gly Asn Pro Asn Lys Asp

            100                 105                 110

Gly Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly

        115                 120                 125

Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg Leu His Ser Ser Asp Trp

    130                 135                 140

Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser Glu Asp Asn Gly Lys Thr

145                 150                 155                 160

Trp Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu Arg Asp Asn Pro Lys Ala

                165                 170                 175

Ser Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Val Leu Val

            180                 185                 190

Gln Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser Ile Tyr Asp Met Phe Pro

        195                 200                 205

Glu Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser Gln Lys Glu Glu Ala Tyr

    210                 215                 220

Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile Leu Tyr Arg Glu Gly Glu

225                 230                 235                 240

Lys Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly Thr Val Tyr Thr Pro Asp

                245                 250                 255

Gly Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Val Lys Pro Ala

            260                 265                 270

Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asp Gln Leu Leu Gly Asn

        275                 280                 285

Ile Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro Phe Arg Ile Ala Lys Asp

    290                 295                 300

Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser

305                 310                 315                 320

Ala Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys Ala Asp Trp Met Lys Phe

                325                 330                 335

Leu Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val Leu Arg Asn Gly Pro His

            340                 345                 350

Lys Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr Thr Asn Asn Val Ser His

        355                 360                 365

Leu Asp Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile Tyr Ser Asp Asp His Gly

    370                 375                 380

Lys Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp Asn Arg Gln Val Asp

385                 390                 395                 400

Gly Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn Asn Arg Arg Ala Gln Asn

                405                 410                 415

Thr Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn Gly Asp Val Lys Leu Phe

            420                 425                 430

Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala Thr Ser Lys Asp Gly

        435                 440                 445

Gly Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg Tyr Pro Gln Val Lys Asp

    450                 455                 460

Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr Met His Glu Gly Lys Glu

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro Lys Arg Glu Asn Gly Met

                485                 490                 495

Val His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu Leu Thr Trp Leu Lys

            500                 505                 510

His Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ala Phe Asn Ser Leu Gln Glu

        515                 520                 525

Leu Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr Glu His Thr Glu Lys Gly

    530                 535                 540

Gln Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Lys Phe Asn Trp Glu Phe Leu

545                 550                 555                 560

Ser Lys Asn Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala Asn

                565                 570

<210>37

<211>483

<212>PRT

<213>北美水蛭

<400>37

Gly Glu Asn Ile Phe Tyr Ala Gly Asp Val Thr Glu Ser Asn Tyr Phe

 1               5                  10                  15

Arg Ile Pro Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Gly Thr Val Ile Ser Ala

            20                  25                  30

Ala Asp Ala Arg Tyr Gly Gly Thr His Asp Ser Lys Ser Lys Ile Asn

        35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Lys Ser Thr Asp Gly Gly Asn Thr Trp Ser Glu Pro

    50                  55                  60

Thr Leu Pro Leu Lys Phe Asp Asp Tyr Ile Ala Lys Asn Ile Asp Trp

65                  70                  75                  80

Pro Arg Asp Ser Val Gly Lys Asn Val Gln Ile Gln Gly Ser Ala Ser

                85                  90                  95

Tyr Ile Asp Pro Val Leu Leu Glu Asp Lys Leu Thr Lys Arg Ile Phe

            100                 105                 110

Leu Phe Ala Asp Leu Met Pro Ala Gly Ile Gly Ser Ser Asn Ala Ser

        115                 120                 125

Val Gly Ser Gly Phe Lys Glu Val Asn Gly Lys Lys Tyr Leu Lys Leu

    130                 135                 140

Arg Trp His Lys Asp Ala Gly Arg Ala Tyr Asp Tyr Thr Ile Arg Glu

145                 150                 155                 160

Lys Gly Val Ile Tyr Asn Asp Ala Thr Asn Gln Pro Thr Glu Phe Arg

                165                 170                 175

Val Asp Gly Glu Tyr Asn Leu Tyr Gln His Asp Thr Asn Leu Thr Cys

            180                 185                 190

Lys Gln Tyr Asp Tyr Asn Phe Ser Gly Asn Asn Leu Ile Glu Ser Lys

        195                 200                 205

Thr Asp Val Asp Val Asn Met Asn Ile Phe Tyr Lys Asn Ser Val Phe

    210                 215                 220

Lys Ala Phe Pro Thr Asn Tyr Leu Ala Met Arg Tyr Ser Asp Asp Glu

225                 230                 235                 240

Gly Ala Ser Trp Ser Asp Leu Asp Ile Val Ser Ser Phe Lys Pro Glu

                245                 250                 255

Val Ser Lys Phe Leu Val Val Gly Pro Gly Ile Gly Lys Gln Ile Ser

            260                 265                 270

Thr Gly Glu Asn Ala Gly Arg Leu Leu Val Pro Leu Tyr Ser Lys Ser

        275                 280                 285

Ser Ala Glu Leu Gly Phe Met Tyr Ser Asp Asp His Gly Asp Asn Trp

    290                 295                 300

Thr Tyr Val Glu Ala Asp Asn Leu Thr Gly Gly Ala Thr Ala Glu Ala

305                 310                 315                 320

Gln Ile Val Glu Met Pro Asp Gly Ser Leu Lys Thr Tyr Leu Arg Thr

                325                 330                 335

Gly Ser Asn Cys Ile Ala Glu Val Thr Ser Ile Asp Gly Gly Glu Thr

            340                 345                 350

Trp Ser Asp Arg Val Pro Leu Gln Gly Ile Ser Thr Thr Ser Tyr Gly

        355                 360                 365

Thr Gln Leu Ser Val Ile Asn Tyr Ser Gln ProIle Asp Gly Lys Pro

    370                 375                 380

Ala Ile Ile Leu Ser Ser Pro Asn Ala Thr Asn Gly Arg Lys Asn Gly

385                 390                 395                 400

Lys Ile Trp Ile Gly Leu Val Asn Asp Thr Gly Asn Thr Gly Ile Asp

                405                 410                 415

Lys Tyr Ser Val Glu Trp Lys Tyr Ser Tyr Ala Val Asp Thr Pro Gln

            420                 425                 430

Met Gly Tyr Ser Tyr Ser Cys Leu Ala Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val

        435                 440                 445

Gly Leu Leu Tyr Glu Lys Tyr Asp Ser Trp Ser Arg Asn Glu Leu His

    450                 455                 460

Leu Lys Asp Ile Leu Lys Phe Glu Lys Tyr Ser Ile Ser Glu Leu Thr

465                 470                 475                 480

Gly Gln Ala

<210>38

<211>361

<212>PRT

<213>绿色小单胞菌

<400>38

Gly Glu Pro Leu Tyr Thr Glu Gln Asp Leu Ala Val Asn Gly Arg Glu

 1               5                  10                  15

Gly Phe Pro Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Thr Val Thr Pro Asp Gly

            20                  25                  30

Asp Leu Leu Ala Ser Tyr Asp Gly Arg Pro Thr Gly Ile Asp Ala Pro

        35                  40                  45

Gly Pro Asn Ser Ile Leu Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Arg Thr

    50                  55                  60

Trp Gly Glu Gln Gln Val Val Ser Ala Gly Gln Thr Thr Ala Pro Ile

65                  70                  75                  80

Lys Gly Phe Ser Asp Pro Ser Tyr Leu Val Asp Arg Glu Thr Gly Thr

                85                  90                  95

Ile Phe Asn Phe His Val Tyr Ser Gln Arg Gln Gly Phe Ala Gly Ser

            100                 105                 110

Arg Pro Gly Thr Asp Pro Ala Asp Pro Asn Val Leu His Ala Asn Val

        115                 120                 125

Ala Thr Ser Thr Asp Gly Gly Leu Thr Trp Ser His Arg Thr Ile Thr

    130                 135                 140

Ala Asp Ile Thr Pro Asp Pro Gly Trp Arg Ser Arg Phe Ala Ala Ser

145                 150                 155                 160

Gly Glu Gly Ile Gln Leu Arg Tyr Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Ile

                165                 170                 175

Gln Gln Tyr Thr Ile Ile Asn Ala Ala Gly Ala Phe Gln Ala Val Ser

            180                 185                 190

Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Arg Thr Trp Arg Ala Gly Glu Ala Val

        195                 200                 205

Gly Val Gly Met Asp Glu Asn Lys Thr Val Glu Leu Ser Asp Gly Arg

    210                 215                 220

Val Leu Leu Asn Ser Arg Asp Ser Ala Arg Ser Gly Tyr Arg Lys Val

225                 230                 235                 240

Ala Val Ser Thr Asp Gly Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Thr Ile Asp

                245                 250                 255

Arg Asp Leu Pro Asp Pro Thr Asn Asn Ala Ser Ile Ile Arg Ala Phe

            260                 265                 270

Pro Asp Ala Pro Ala Gly Ser Ala Arg Ala Lys Val Leu Leu Phe Ser

        275                 280                 285

Asn Ala Ala Ser Gln Thr Ser Arg Ser Gln Gly Thr Ile Arg Met Ser

    290                 295                 300

Cys Asp Asp Gly Gln Thr Trp Pro Val Ser Lys Val Phe Gln Pro Gly

305                 310                 315                 320

Ser Met Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Ala Leu Pro Asp Gly Thr Tyr Gly

                325                 330                 335

Leu Leu Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ile Arg Tyr Ala Asn Phe Asn Leu

            340                 345                 350

Ala Trp Leu Gly Gly Ile Cys Ala Pro

        355                 360

<210>39

<211>379

<212>PRT

<213>鼠伤寒沙门氏菌

<400>39

Glu Lys Ser Val Val Phe Lys Ala Glu Gly Glu His Phe Thr Asp Gln

 1               5                  10                  15

Lys Gly Asn Thr Ile Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Lys Tyr

            20                  25                  30

Phe Arg Ile Pro Ala Met Cys Thr Thr Ser Lys Gly Thr Ile Val Val

        35                  40                  45

Phe Ala Asp Ala Arg His Asn Thr Ala Ser Asp Gln Ser Phe Ile Asp

    50                  55                  60

Thr Ala Ala Ala Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Asn Lys Lys

65                  70                  75                  80

Ile Ala Ile Tyr Asn Asp Arg Val Asn Ser Lys Leu Ser Arg Val Met

                85                  90                  95

Asp Pro Thr Cys Ile Val Ala Asn Ile Gln Gly Arg Glu Thr Ile Leu

            100                 105                 110

Val Met Val Gly Lys Trp Asn Asn Asn Asp Lys Thr Trp Gly Ala Tyr

        115                 120                 125

Arg Asp Lys Ala Pro Asp Thr Asp Trp Asp Leu Val Leu Tyr Lys Ser

    130                 135                 140

Thr Asp Asp Gly Val Thr Phe Ser Lys Val Glu Thr Asn Ile His Asp

145                 150                 155                 160

Ile Val Thr Lys Asn Gly Thr Ile Ser Ala Met Leu Gly Gly Val Gly

                165                 170                 175

Ser Gly Leu Gln Leu Asn Asp Gly Lys Leu Val Phe Pro Val Gln Met

            180                 185                 190

Val Arg Thr Lys Asn Ile Thr Thr Val Leu Asn Thr Ser Phe Ile Tyr

        195                 200                 205

Ser Thr Asp Gly Ile Thr Trp Ser Leu Pro Ser Gly Tyr Cys Glu Gly

    210                 215                 220

Phe Gly Ser Glu Asn Asn Ile Ile Glu Phe Asn Ala Ser Leu Val Asn

225                 230                 235                 240

Asn Ile Arg Asn Ser Gly Leu Arg Arg Ser Phe Glu Thr Lys Asp Phe

                245                 250                 255

Gly Lys Thr Trp Thr Glu Phe Pro Pro Met Asp Lys Lys Val Asp Asn

            260                 265                 270

Arg Asn His Gly Val Gln Gly Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ser Gly Asn

        275                 280                 285

Lys Leu Val Ala Ala His Ser Ser Ala Gln Asn Lys Asn Asn Asp Tyr

    290                 295                 300

Thr Arg Ser Asp Ile Ser Leu Tyr Ala His Asn Leu Tyr Ser Gly Glu

305                 310                 315                 320

Val Lys Leu Ile Asp Asp Phe Tyr Pro Lys Val Gly Asn Ala Ser Gly

                325                 330                 335

Ala Gly Tyr Ser Cys Leu Ser Tyr Arg Lys Asn Val Asp Lys Glu Thr

            340                 345                 350

Leu Tyr Val Val Tyr Glu Ala Asn Gly Ser Ile Glu Phe Gln Asp Leu

        355                 360                 365

Ser Arg His Leu Pro Val Ile Lys Ser Tyr Asn

    370                 375

<210>40

<211>565

<212>PRT

<213>霍乱弧菌

<400>40

Val Ile Phe Arg Gly Pro Asp Arg Ile Pro Ser Ile Val Ala Ser Ser

 1               5                  10                  15

Val Thr Pro Gly Val Val Thr Ala Phe Ala Glu Lys Arg Val Gly Gly

            20                  25                  30

Gly Asp Pro Gly Ala Leu Ser Asn Thr Asn Asp Ile Ile Thr Arg Thr

        35                  40                  45

Ser Arg Asp Gly Gly Ile Thr Trp Asp Thr Glu Leu Asn Leu Thr Glu

    50                  55                  60

Gln Ile Asn Val Ser Asp Glu Phe Asp Phe Ser Asp Pro Arg Pro Ile

65                  70                  75                  80

Tyr Asp Pro Ser Ser Asn Thr Val Leu Val Ser Tyr Ala Arg Trp Pro

                85                  90                  95

Thr Asp Ala Ala Gln Asn Gly Asp Arg Ile Lys Pro Trp Met Pro Asn

            100                 105                 110

Gly Ile Phe Tyr Ser Val Tyr Asp Val Ala Ser Gly Asn Trp Gln Ala

        115                 120                 125

Pro Ile Asp Val Thr Asp Gln Val Lys Glu Arg Ser Phe Gln Ile Ala

    130                 135                 140

Gly Trp Gly Gly Ser Glu Leu Tyr Arg Arg Asn Thr Ser Leu Asn Ser

145                 150                 155                 160

Gln Gln Asp Trp Gln Ser Asn Ala Lys Ile Arg Ile Val Asp Gly Ala

                165                 170                 175

Ala Asn Gln Ile Gln Val Ala Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Val Val Thr

            180                 185                 190

Leu Ser Ile Asp Glu Ser Gly Gly Leu Val Ala Asn Leu Asn Gly Val

        195                 200                 205

Ser Ala Pro Ile Ile Leu Gln Ser Glu His Ala Lys Val His Ser Phe

    210                 215                 220

His Asp Tyr Glu Leu Gln Tyr Ser Ala Leu Asn His Thr Thr Thr Leu

225                 230                 235                 240

Phe Val Asp Gly Gln Gln Ile Thr Thr Trp Ala Gly Glu Val Ser Gln

                245                 250                 255

Glu Asn Asn Ile Gln Phe Gly Asn Ala Asp Ala Gln Ile Asp Gly Arg

            260                 265                 270

Leu His Val Gln Lys Ile Val Leu Thr Gln Gln Gly His Asn Leu Val

        275                 280                 285

Glu Phe Asp Ala Phe Tyr Leu Ala Gln Gln Thr Pro Glu Val Glu Lys

    290                 295                 300

Asp Leu Glu Lys Leu Gly Trp Thr Lys Ile Lys Thr Gly Asn Thr Met

305                 310                 315                 320

Ser Leu Tyr Gly Asn Ala Ser Val Asn Pro Gly Pro Gly His Gly Ile

                325                 330                 335

Thr Leu Thr Arg Gln Gln Asn Ile Ser Gly Ser Gln Asn Gly Arg Leu

            340                 345                 350

Ile Tyr Pro Ala Ile Val Leu Asp Arg Phe Phe Leu Asn Val Met Ser

        355                 360                 365

Ile Tyr Ser Asp Asp Gly Gly Ser Asn Trp Gln Thr Gly Ser Thr Leu

    370                 375                 380

Pro Ile Pro Phe Arg Trp Lys Ser Ser Ser Ile Leu Glu Thr Leu Glu

385                 390                 395                 400

Pro Ser Glu Ala Asp Met Val Glu Leu Gln Asn Gly Asp Leu Leu Leu

                405                 410                 415

Thr Ala Arg Leu Asp Phe Asn Gln Ile Val Asn Gly Val Asn Tyr Ser

            420                 425                 430

Pro Arg Gln Gln Phe Leu Ser Lys Asp Gly Gly Ile Thr Trp Ser Leu

        435                 440                 445

Leu Glu Ala Asn Asn Ala Asn Val Phe Ser Asn Ile Ser Thr Gly Thr

    450                 455                 460

Val Asp Ala Ser Ile Thr Arg Phe Glu Gln Ser Asp Gly Ser His Phe

465                 470                 475                 480

Leu Leu Phe Thr Asn Pro Gln Gly Asn Pro Ala Gly Thr Asn Gly Arg

                485                 490                 495

Gln Asn Leu Gly Leu Trp Phe Ser Phe Asp Glu Gly Val Thr Trp Lys

            500                 505                 510

Gly Pro Ile Gln Leu Val Asn Gly Ala Ser Ala Tyr Ser Asp Ile Tyr

        515                 520                 525

Gln Leu Asp Ser Glu Asn Ala Ile Val Ile Val Glu Thr Asp Asn Ser

    530                 535                 540

Asn Met Arg Ile Leu Arg Met Pro Ile Thr Leu Leu Lys Gln Lys Leu

545                 550                 555                 560

Thr Leu Ser Gln Asn

                565

<210>41

<211>570

<212>PRT

<213>肺炎链球菌

<400>41

Thr Ala Glu Leu Pro Lys Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val

 1               5                  10                  15

Leu Ser Arg Thr Ser Leu Arg Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro

            20                  25                  30

Asp Val Thr His Val Gln Ile Gly Ala Thr Lys Arg Ala Asn Asn Thr

        35                  40                  45

Val Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asn Arg

    50                  55                  60

Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Gln Lys Arg Ser Gln Leu Phe Lys Arg

65                  70                  75                  80

Ser Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu Gly Ala Ala Leu Thr Glu Lys

                85                  90                  95

Thr Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg Asn Gly Asn Pro Asn Lys Asp Gly

            100                 105                 110

Ile Lys Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr

        115                 120                 125

Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg Leu His Ser Ser Asp Trp Gly

    130                 135                 140

Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg Ser Glu Asp Asn Gly Lys Thr Trp

145                 150                 155                 160

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Asn Leu Arg Asp Asn Pro Lys Ala Ser

                165                 170                 175

Asp Pro Ser Ile Gly Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Val Leu Val Gln

            180                 185                 190

Asp Pro Glu Thr Lys Arg Ile Phe Ser Ile Tyr Asp Met Phe Pro Glu

        195                 200                 205

Gly Lys Gly Ile Phe Gly Met Ser Ser Gln Lys Glu Glu Ala Tyr Lys

    210                 215                 220

Lys Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Ile Leu Tyr Arg Glu Gly Glu Lys

225                 230                 235                 240

Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly Thr Val Tyr Thr Pro Asp Gly

                245                 250                 255

Lys Ala Thr Asp Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Val Lys Pro Ala Tyr

            260                 265                 270

Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asp Gln Leu Leu Gly Asn Ile

        275                 280                 285

Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Thr Ser Pro Phe Arg Ile Ala Lys Asp Ser

    290                 295                 300

Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala

305                 310                 315                 320

Pro Gln Asp Ile Thr Pro Met Val Lys Ala Asp Trp Met Lys Phe Leu

                325                 330                 335

Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Val Leu Arg Asn Gly Pro His Lys

            340                 345                 350

Gly Arg Ile Leu Ile Pro Val Tyr Thr Thr Asn Asn Val Ser His Leu

        355                 360                 365

Asp Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys

    370                 375                 380

Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp Asn Arg Gln Val Asp Gly

385                 390                 395                 400

Gln Lys Ile His Ser Ser Thr Met Asn Asn Arg Arg Ala Gln Asn Thr

                405                 410                 415

Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn Gly Asp Val Lys Leu Phe Met

            420                 425                 430

Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala Thr Ser Lys Asp Gly Gly

        435                 440                 445

Val Thr Trp Glu Lys Asp Ile Lys Arg Tyr Pro Gln Val Lys Asp Val

    450                 455                 460

Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr Met His Glu Gly Lys Glu Tyr

465                 470                 475                 480

Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro Lys Arg Glu Asn Gly Met Val

                485                 490                 495

His Leu Ala Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu Leu Thr Trp Leu Lys His

            500                 505                 510

Asn Pro Ile Gln Lys Gly Glu Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gln Glu Leu

        515                 520                 525

Gly Asn Gly Glu Tyr Gly Ile Leu Tyr Glu His Thr Glu Lys Gly Gln

    530                 535                 540

Asn Ala Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Lys Phe Asn Trp Glu Phe Leu Ser

545                 550                 555                 560

Lys Asn Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala Asn

                565                 570

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分包含SEQ ID NO：19的变体，所述变体与SEQID NO：19具有至少90％同源性并可引发抗-神经氨酸酶免疫应答，其中所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分不是由SEQ ID NO：15或SEQID NO：16组成的。

2.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶具有低于约60％的未去毒的神经氨酸酶活性的活性。

3.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶具有低于约10％的未去毒的神经氨酸酶活性的活性。

4.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少7％的天然存在的氨基酸的缺失。

5如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少5个N-末端氨基酸的缺失。

6.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少10个N-末端氨基酸的缺失。

7.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少15个N-末端氨基酸的缺失。

8.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少10％的C-末端氨基酸的缺失。

9.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含SEQ ID NO：35。

10.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含SEQ ID NO：36。

11.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述变体与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36具有至少90％、95％或99％同源性。

12.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述SEQ ID NO：19的变体与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性。

13.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述SEQ ID NO：19的变体与SEQ ID NO：19具有至少99％同源性。

14.一种组合物，其包含多肽和药学可接受载运体，所述多肽包含SEQID NO：19的变体的氨基酸序列，所述变体与SEQ ID NO：19具有至少90％同源性并可引发抗-神经氨酸酶免疫应答，其中所述多肽不是由SEQ IDNO：15或SEQ ID NO：16组成的。

15.如权利要求14所述的组合物，其还包含佐剂。

16.如权利要求14或15所述的组合物，其中所述变体是SEQ IDNO：35或SEQ ID NO.36。

17.如权利要求14或15所述的组合物，其中所述变体与SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：36具有至少90％、95％或99％同源性。

18.如权利要求14所述的组合物，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性。

19.如权利要求14所述的组合物，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少99％同源性。

20.一种减轻或预防受治疗者中的肺炎球菌鼻部携带的方法，所述方法包括在减轻或预防所述鼻部携带的条件下向受治疗者施用多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：19的变体的氨基酸序列，所述变体与SEQ ID NO：19具有至少90％同源性并可引发抗-神经氨酸酶免疫应答，其中所述多肽不是由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16组成的。

21.一种减轻或预防受治疗者中的肺炎球菌感染的方法，所述方法包括在减轻或预防所述感染的条件下向受治疗者施用多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：19的变体的氨基酸序列，所述变体与SEQ ID NO：19具有至少90％同源性并可引发抗-神经氨酸酶免疫应答，其中所述多肽不是由SEQ IDNO：15或SEQ ID NO：16组成的。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是脑膜炎。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是中耳炎。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是肺炎。

25.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是溶血性尿毒症。

26.如权利要求20或21所述的方法，其中所述变体是SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36。

27.如权利要求20或21所述的方法，其中所述变体与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36具有至少90％、95％或99％同源性。

28.如权利要求20或21所述的方法，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性。

29.如权利要求20或21所述的方法，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少99％同源性。

30.一种减轻或预防受治疗者中的肺炎球菌感染的方法，所述方法包括在减轻或预防所述感染的条件下向受治疗者施用针对多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：19的变体的氨基酸序列，所述变体与SEQ ID NO：19具有至少90％同源性并可引发抗-神经氨酸酶免疫应答，其中所述施用步骤包括用所述抗体接触受治疗者的粘膜表面。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是脑膜炎。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是中耳炎。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是肺炎。

34.如权利要求30所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是溶血性尿毒症。

35.如权利要求30所述的方法，其中所述变体是SEQ ID NO：35或SEQID NO：36。

36.如权利要求30所述的方法，其中所述变体与SEQ ID NO：35或SEQID NO：36具有至少90％、95％或99％同源性。

37.如权利要求30所述的方法，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性。

38.如权利要求30所述的方法，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少99％同源性。

39.一种组合物，其包含多肽和药学可接受载运体，所述多肽包含SEQID NO：19的变体的氨基酸序列，所述变体与SEQ ID NO：19具有至少90％同源性并可引发抗-神经氨酸酶免疫应答，其中所述组合物适合施用于粘膜表面，并且其中所述多肽不是由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16组成的。

40.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物是鼻喷雾剂。

41.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物是雾化溶液。

42.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物是气溶胶吸入剂。

43.如权利要求39至42中的任一项所述的组合物，其中所述变体是SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36。

44.如权利要求39所述的组合物，其中所述变体与SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36具有至少90％、95％或99％同源性。

45.如权利要求39所述的组合物，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少95％同源性。

46.如权利要求39所述的组合物，其中所述变体与SEQ ID NO：19具有至少99％同源性。

47.一种容器，其包含如权利要求39所述的组合物。

48.如权利要求47所述的容器，其中所述容器是鼻喷雾器。

49.如权利要求47所述的容器，其中所述容器是雾化器。

50.如权利要求47所述的容器，其中所述容器是吸入器。

Claims (35)

1.一种去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体，其中所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分不是由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO.16组成的。

2如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶具有低于约60％的未去毒的神经氨酸酶活性的活性。

3如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶具有低于约10％的未去毒的神经氨酸酶活性的活性。

4.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少7％的天然存在的氨基酸的缺失。

5.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少5个N-末端氨基酸的缺失。

6.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少10个N-末端氨基酸的缺失。

7.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少15个N-末端氨基酸的缺失。

8.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含未去毒的神经氨酸酶的至少10％的C-末端氨基酸的缺失。

9.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含SEQ ID NO：35。

10.如权利要求1所述的去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分，其中所述神经氨酸酶包含SEQ ID NO：36。

11.一种组合物，其包含多肽和药学可接受载运体，所述多肽包含SEQID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体，其中所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分不是由SEQ IDNO：15或SEQ ID NO·16组成的。

12如权利要求11所述的组合物，其还包含佐剂。

13.如权利要求11或12所述的组合物，其中所述变体是SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：36。

14.一种减轻或预防受治疗者中的肺炎球菌鼻部携带的方法，所述方法包括在减轻或预防所述鼻部携带的条件下向受治疗者施用多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体，其中所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分不是由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16组成的。

15.一种减轻或预防受治疗者中的肺炎球菌感染的方法，所述方法包括在减轻或预防所述感染的条件下向受治疗者施用多肽，所述多肽包含SEQ ID NO·19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体，其中所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分不是由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16组成的。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是脑膜炎。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是中耳炎。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是肺炎。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是溶血性尿毒症。

20.如权利要求14或15所述的方法，其中所述变体是SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36。

21.一种减轻或预防受治疗者中的肺炎球菌感染的方法，所述方法包括在减轻或预防所述感染的条件下向受治疗者施用针对多肽的抗体，所述多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体，其中所述施用步骤包括用所述抗体接触受治疗者的粘膜表面。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是脑膜炎。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是中耳炎。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是肺炎。

25.如权利要求21所述的方法，其中所述肺炎球菌感染是溶血性尿毒症。

26.如权利要求21所述的方法，其中所述变体是SEQ ID NO：35或SEQID NO：36。

27.一种组合物，其包含多肽和药学可接受载运体，所述多肽包含SEQID NO：19的氨基酸序列或可引发抗-神经氨酸酶免疫应答的该氨基酸序列的变体，其中所述组合物适合施用于粘膜表面，并且其中所述去毒的肺炎球菌神经氨酸酶或其抗原部分不是由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16组成的。

28.如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物是鼻喷雾剂。

29.如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物是雾化溶液。

30.如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物是气溶胶吸入剂。

31.如权利要求27至30中的任一项所述的组合物，其中所述变体是SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36。

32.一种容器，其包含如权利要求27所述的组合物。

33.如权利要求32所述的容器，其中所述容器是鼻喷雾器。

34.如权利要求32所述的容器，其中所述容器是雾化器。

35.如权利要求32所述的容器，其中所述容器是吸入器。

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