JP2011160812A - 細菌輸送およびcns侵襲を低減させるための組成物およびこの組成物を使用する方法 - Google Patents
細菌輸送およびcns侵襲を低減させるための組成物およびこの組成物を使用する方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本明細書では、細菌感染(例えば肺炎球菌感染)、鼻輸送、鼻腔内コロニー形成および中枢神経系侵襲を低減または防止するように設計された組成物を提供する。肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸、またはノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸のいずれかの抗原部分を含む組成物も提供する。さらに、本明細書で開示した組成物を作成および使用する方法も提供する。特に、本明細書で教示した作用因子または組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体内で抗体を産生する方法も提供する。本明細書で教示した組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体における鼻輸送または肺炎球菌感染を低減および防止する方法も提供する。
【選択図】なし
Description
本出願は、2003年11月10日に出願された米国仮出願第60/518,799号の利益を主張し、米国仮出願第60/518,799号は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
本発明は、National Institutes of Healthからの助成金DC 04976、AI 21548、およびP30 DK 54781の下での、そしてNational Institute of Allergy and Infectious Diseasesとの契約NO1 AI 65299の下での、政府支援によって実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
ストレプトコッカス・ニューモニエは、肺、中枢神経系(CNS)、中耳、および鼻道を含む複数の器官に感染しうる、かなり遍在性のヒト病原体である。これらの組織の感染は、気管支炎、肺炎、髄膜炎、および副鼻腔感染症などの様々な症状を引き起こす。S.ニューモニエは、ヒトの細菌性髄膜炎の主因であり、抗生剤処置にも関わらず、著しい死亡率および罹患率に関係している。非特許文献1。S.ニューモニエ髄膜炎は、永続的な神経性続発症を引き起こすことがある。先進国と開発途上国でのS.ニューモニエ髄膜炎の発生率は、100,000人に付きそれぞれ1〜2人および20人である。非特許文献2。米国での肺炎球菌性髄膜炎の致死率は、約18%である。非特許文献3。肺炎球菌性髄膜炎の最高の出現率は、1〜4歳の子供(すべての細菌性髄膜炎の30%)で、続いて15〜19歳(14%)および1〜11月齢の乳児(13%)で発生する。非特許文献2。高齢者も先進国と発展途上国の両方で、連鎖球菌性髄膜炎によって深刻に冒されている。非特許文献4;非特許文献5。
S.ニューモニエが鼻輸送と、それに続く疾患を引き起こす機構は、比較的知られていない。今日までいずれの研究も、鼻輸送を低減または防止する機構を確定していない。上咽頭のコロニー形成は、下気道、副鼻腔、全身、および脳への肺炎球菌の蔓延への前提条件と見なされており、当業界で必要なものは、粘膜免疫を初期肺炎球菌性コロニー形成の部位に供給する手段である。上咽頭での初期肺炎球菌性コロニー形成の防止は、鼻輸送を防止し、個人間でのS.ニューモニエの蔓延を低減するであろう。その上、上咽頭の粘膜表面へ免疫を提供することは、S.ニューモニエによって続いて引き起こされる疾患を防止または低減する。
本明細書では、細菌感染(たとえば肺炎球菌感染)、鼻輸送、鼻腔内コロニー形成、およびCNS浸潤を低減または防止するように設計された組成物を提供する。必要に応じて、組成物は、粘膜投与のために設計されている。本明細書では、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸(pneumococcal teichoic acid)、肺炎球菌性リポテイコ酸(pneumococcal lipoteichoic acid)、これらのいずれか1つの抗原部分およびこれらの無毒化作用因子を含有する組成物が提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目2)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ60%を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目3)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ70%を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目4)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ80%を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目5)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ90%を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目6)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも7%の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目7)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも7%の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ60%を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目8)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも7%の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ70%を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目9)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも7%の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ80%を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目10)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも7%の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ90%を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目11)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの少なくとも5個のN末端アミノ酸の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目12)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの少なくとも10個のN末端アミノ酸の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目13)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの少なくとも15個のN末端アミノ酸の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目14)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのC末端アミノ酸の少なくとも10%の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目15)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのC末端アミノ酸の少なくとも20%の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目16)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのC末端アミノ酸の少なくとも30%の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目17)
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのC末端アミノ酸の少なくとも35%の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
(項目18)
無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
(項目19)
アジュバントをさらに含む、項目18に記載の組成物。
(項目20)
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を投与する工程
を包含する、方法。
(項目21)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を投与する工程
を包含する、方法。
(項目22)
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を投与する工程
を包含する、方法。
(項目23)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目22に記載の方法。
(項目25)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目22に記載の方法。
(項目26)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目22に記載の方法。
(項目27)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減または防止する方法であって、該方法は、
該鼻輸送を低減または防止する条件下で、該被験体に肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原性フラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
(項目28)
被験体において肺炎球菌感染を低減または防止する方法であって、該方法は、
該感染を低減または防止する条件下で、該被験体に肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原性フラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
(項目29)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目28に記載の方法。
(項目33)
被験体において肺炎球菌感染を低減または防止する方法であって、該方法は、
該感染を低減または防止する条件下で、該被験体に肺炎球菌ノイラミニダーゼ抗体またはそのフラグメントを投与する工程
を包含し、該投与工程は、
該被験体の粘膜表面に該抗体を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目34)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目33に記載の方法。
(項目37)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目33に記載の方法。
(項目38)
肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
(項目39)
前記組成物が鼻スプレーである、項目38に記載の組成物。
(項目40)
前記組成物がネブライザ溶液である、項目38に記載の組成物。
(項目41)
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目38に記載の組成物。
(項目42)
項目38に記載の組成物を含む、容器。
(項目43)
前記容器が鼻スプレー器である、項目42に記載の容器。
(項目44)
前記容器がネブライザである、項目42に記載の容器。
(項目45)
前記容器が吸入器である、項目42に記載の容器。
(項目46)
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目47)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目48)
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目49)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目48に記載の方法。
(項目51)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目48に記載の方法。
(項目52)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目48に記載の方法。
(項目53)
肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸からのホスホコリンまたはその抗原部分、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
(項目54)
前記組成物が鼻スプレーである、項目53に記載の組成物。
(項目55)
前記組成物がネブライザ溶液である、項目53に記載の組成物。
(項目56)
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目53に記載の組成物。
(項目57)
項目53に記載の組成物を含む、容器。
(項目58)
前記容器が鼻スプレー器である、項目57に記載の容器。
(項目59)
前記容器がネブライザである、項目57に記載の容器。
(項目60)
前記容器が吸入器である、項目57に記載の容器。
(項目61)
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目53に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目62)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目53に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目63)
被験体において肺炎球菌感染を低減または防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目53に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目64)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目63に記載の方法。
(項目66)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目63に記載の方法。
(項目67)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目63に記載の方法。
(項目68)
肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分、肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸からのホスホコリンまたはその抗原部分、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
(項目69)
前記組成物が鼻スプレーである、項目68の組成物。
(項目70)
前記組成物がネブライザ溶液である、項目68の組成物。
(項目71)
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目68の組成物。
(項目72)
項目68に記載の組成物を含む、容器。
(項目73)
前記容器が鼻スプレー器である、項目72に記載の容器。
(項目74)
前記容器がネブライザである、項目72に記載の容器。
(項目75)
前記容器が吸入器である、項目72に記載の容器。
(項目76)
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異性な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目68に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目77)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目68に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目78)
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目68に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目79)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目78に記載の方法。
(項目81)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目78に記載の方法。
(項目82)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目78に記載の方法。
(項目83)
肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸の非ホスホコリン抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
(項目84)
前記組成物が鼻スプレーである、項目83に記載の組成物。
(項目85)
前記組成物がネブライザ溶液である、項目83に記載の組成物。
(項目86)
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目83に記載の組成物。
(項目87)
項目83に記載の組成物を含む、容器。
(項目88)
前記容器が鼻スプレー器である、項目87に記載の容器。
(項目89)
前記容器がネブライザである、項目87に記載の容器。
(項目90)
前記容器が吸入器である、項目87に記載の容器。
(項目91)
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目83に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目92)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目83に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目93)
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目83に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目94)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目93に記載の方法。
(項目96)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目93に記載の方法。
(項目97)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目93に記載の方法。
(項目98)
肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分、肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸の非ホスホコリン抗原部分、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
(項目99)
前記組成物が鼻スプレーである、項目98に記載の組成物。
(項目100)
前記組成物がネブライザ溶液である、項目98に記載の組成物。
(項目101)
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目98に記載の組成物。
(項目102)
項目98に記載の組成物を含む、容器。
(項目103)
前記容器が鼻スプレー器である、項目102に記載の容器。
(項目104)
前記容器がネブライザである、項目102に記載の容器。
(項目105)
前記容器が吸入器である、項目102に記載の容器。
(項目106)
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目98に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目107)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目98に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目108)
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目98に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
(項目109)
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目108に記載の方法。
(項目110)
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目108に記載の方法。
(項目111)
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目108に記載の方法。
(項目112)
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目108に記載の方法。
(項目113)
ホスホコリン抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
(項目114)
前記組成物が粘膜表面への投与に適切である、項目113に記載の組成物。
(項目115)
前記組成物が鼻スプレーである、項目113に記載の組成物。
(項目116)
前記組成物がネブライザ溶液である、項目113に記載の組成物。
(項目117)
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目113に記載の組成物。
(項目118)
項目113に記載の組成物を含む、容器。
(項目119)
前記容器が鼻スプレー器である、項目118に記載の容器。
(項目120)
前記容器がネブライザである、項目118に記載の容器。
(項目121)
前記容器が吸入器である、項目118に記載の容器。
(項目122)
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体にホスホコリン抗体またはそのフラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
(項目123)
前記投与が、前記被験体の鼻粘膜に前記抗体またはそのフラグメントを接触させる工程を包含する、項目122に記載の方法。
(項目124)
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体にホスホコリン抗体またはそのフラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
(項目125)
前記投与が、前記被験体の鼻粘膜に前記抗体またはそのフラグメントを接触させる工程を包含する、項目124に記載の方法。
本明細書に含まれ、その一部を構成する添付図面は、以下で述べる複数の態様を説明する。
本化合物,組成物,物品、器具、および/または方法を開示および説明する前に、以下で述べる態様が、具体的な合成方法または具体的な投与方法に制限されず、そのためもちろん変化することが理解されるべきである。本明細書で使用する用語が、特定の態様のみを説明する目的で使用され、制限的でないことも理解されるべきである。
(輸送中に嗅覚組織に浸透する鼻肺炎球菌)
(材料および方法)
(肺炎球菌性菌株)
S.ニューモニエEF3030、血清型19F、およびTIGR4菌株、血清型4の2つのカプセル化菌株、ならびに親菌株D39、血清型2に由来する無毒性の非カプセル状菌株R36Aを利用した。Avery et al.,(1944)J.Exp.Med.79:137−158。EF3030菌株は、菌血の非存在下で気道にただちにコロニー形成し(Briles et al.,(1992)Infect.Immun.60: 111−116)、静脈内接種後に菌血を持続できないため選択された。TIGR4菌株はさらに毒性であったが、中程度の鼻接種原によって、菌血なしにコロニー形成する。
CBA/CAHN/xid(xid)マウス菌株をJackson Laboratory(バーハーバー、メイン州)から得た。これらマウスのBrutonのチロシンキナーゼ遺伝子における変異は、胸腺独立性II型抗原への反応をできなくするが(Amsbaugh et al.,(1972)J.Exp.Med.136:931−949;Berning et al.,(1980)J.Immunol.46:506−513)、比較的な正常なT細胞依存性免疫反応を可能にする。これらのマウスは、カプセル状ポリサッカライドに反応できず、肺炎球菌感染を高い再現性で受けやすい。xidマウスは、病原体のない状態に維持され、7〜12週齢で使用される。
血液を後腹膜神経叢からヘパリン処理毛細管内に収集した。鼻洗浄液(NW)、腎臓、脾臓、および肺の収集前にマウスを70%エタノールによって消毒した。NWの血液汚染を防止するために、気管への切開を行って、外径0.075cm、2.0cm長のTygon管(Cole−Parmer、バーノンヒルズ、イリノイ州)を上咽頭に挿入し、同時にリンゲル液を充填した注射器に取り付けた。注射器からの液体は鼻を通じて排出して、3滴を収集した。
組織および体液の連続3倍希釈物8個を滅菌リンゲル液中で作成し、ゲンタマイシンサルフェート4μg/mlを含有する血液寒天プレートで平板培養した。CFUは平板培養およびロウソク瓶内でのインキュベーションの24時間後に数えた。結果は、CFU/器官、NWまたは血液1ml当たりのCFUとして表した。
GLS結合部位を遮断するために、S.ニューモニエ菌株EF3030 3X107CFUを、ヒト脳からのアシアロ−GM1 20μgまたはウシ脳からの混合GLS(18% GM1、55% GD1a、15% GD1b、10% GT1b、2% 他のGLS)125μgのどちらかを用いて、氷上で30分間インキュベートした(Calbiochem−Novabiochem Corporation,Inc.,ラホーヤ、カリフォルニア州)。GLSをPBSに溶解させ、使用1日前に完璧に混合した。両親媒性GLSは、PBS中でミセルを形成し、肺炎球菌に炭水化物部分と相互作用させる。インキュベーションの後、さらに洗浄せずに鼻孔ごとに5μlをxidマウスに鼻腔内投与した。4日後に組織をCFUについて分析した。
S.ニューモニエをPCRによって検出するために、組織を1% SDS中に0.1%デオキシコール酸を用いて凍結−解凍によって溶解させて、37℃で1時間インキュベートした。タンパク質は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド/NaCl沈殿法を使用して除去した(Ausubel et al.,(1987)Current Protocols in Molecular Biology,2nd:2.4.4、セチルトリメチルアンモニウムブロミド/NaCl沈殿法の教示については、参照により本明細書に組み入れられている)。DNA 10μgをPCR増幅に使用した。ニューモリシン(ply)特異性プライマーPly1 5’−ATTTCTGTAACAGCTACCAACGA−3’(配列番号1)およびPly2 5’−GAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC−3’(配列番号2)をPCR混合物に添加して、400bpフラグメントを増幅した。PCR反応は、94℃での5分間の変性工程と、それに続く増幅サイクル、つまり94℃(1分)、55℃(1分)、および72℃(1分)の30サイクルを含んでいた。エチジウムブロミド染色PCRフラグメントの画像をAlpha Imager TM IS−3400(Alpha Innotech Corporation,サンリアンドロ、カリフォルニア州)で収集した。
マウスをTIGR4菌株5X105CFUで経鼻攻撃した。OBを10%緩衝ホルマリンで固定した。パラフィン画分4μm(van Ginkel(2000)J.Immunol.165:4778−4782)は、それらを室温にて加湿チャンバ内で4時間インキュベートすることによって、PspAファミリ2Abs(1:100)を染色した。スライドをPBSで洗浄して、ビオチン化ヤギF(ab’)2抗ウサギIgG(1:200)(Southern Biotechnology Associates,Inc.,バーミングハム、アラバマ州)で染色し洗浄して、ストレプトアビジン−FITC(1:100)(BD−PharMingen,サンディエゴ、カリフォルニア州)で染色した。蛍光画像は、Nikon顕微鏡によってDEI−750 CEデジタルカラービデオカメラ(Optronics,ゴレータ、カリフォルニア州)を用いて収集し、Scion Imageソフトウェア(Scion Corporation,フレデリック、メリーランド州)を用いて処理した。
データを平均±1標準誤差として表し、結果を統計解析により独立Mann Whitney2標本ランク検定またはStudent t検定を使用して比較して、CFUでの有意差を決定した。
(鼻腔内コロニー形成およびCNS浸潤での肺炎球菌性カプセルの役割)
一次感覚嗅覚ニューロンを通じた肺炎球菌の摂取を調査するために、EF3030および非カプセル化菌株R36Aが鼻道にコロニー形成して、CNSに侵入する能力を第1〜4日に測定した(図1)。第1日にON/Eでは両方の菌株で高いCFUが観察されたが、R36Aは第4日までにON/Eおよび他のすべての組織にほぼ非存在となり、長期のコロニー形成にはあるカプセルが必要であることを示した以前の結果と一致していた。Magee and Yother(2001)Infect.Immun.69:3755−3761。EF3030は、どちらの日でもOBおよび脳での明らかな存在を示し、第4日にはNWおよびNALTに多数が存在していた。これらの調査結果は、鼻腔内攻撃後のEF3030肺炎球菌のOBおよび脳への軸索輸送と一致していた。
EF3030は、観察した39日間に亘ってすべての時点でON/E、OB、NW、およびNALTにおいて維持された(図2)。脳およびCLNでは、はるかに少ない数のCFUが見られ、存在したこれらのCFUは一般に、第18および25日に見られた。興味深いことに、肺は第1日(図1)および第18、25および39日を除いて、肺炎球菌を示さなかった(図2)。使用した経鼻用量では、菌株EF3030を用いて実施したいずれの実験の間にも、CFUがマウス血流で検出されなかったため、菌血は神経組織分布に寄与しなかった(図2)。鼻腔内投与の1、3、6、12および24時間後およびそれに続く1週間にわたって毎日、血液を菌血について監視した。血液中に細菌は検出されなかった。
三叉神経細胞は上咽頭を刺激し、それゆえS.ニューモニエは、鼻粘膜の感染後の三叉神経節中に予想される。これを試験するために、接種4日後に各種の組織および血液を単離し、新たな実験でのEF3030の存在について分析した。EF3030菌株は、ON/EおよびOBで、そして三叉神経節で検出された(表3)。この調査はさらに、アシアロ−GM1がS.ニューモニエによる神経標的化のレセプタとして機能することを裏付けた。他のGLSも同様に役割を果たしやすい。
EF3030菌株を鼻腔内投与前に、アシアロ−GM1または混合GLSミセルを用いてPBS中でインキュベートした。GLS混合物は、最強の阻害効果を示し、鼻腔内投与の4日後に評価したときに、NWにてCFUを10分の1に減少させた(P=0.0365)。混合GLSプレインキュベーションの結果としてのCFUの最大の減少は、ON/Eで見られた(617分の1への減少;P=0.0134)。コントロールでは平均204および166のCFUが存在する肺(P=0.0320)(図3B)およびCNS組織(P=0.0078)(図3A)の差は、まさに顕著であるが、これに対して肺炎球菌は、GLSでインキュベートしたときに検出不可能であった(検出限界=3CFU)。アシアロ−GM1プレインキュベーションは、混合GLSよりも効率的ではなかったが、それでもCNS(図3A)および肺(図3B)においてそれぞれ、コロニー形成を25分の1および63分の1に減少させた。肺は吸入した肺炎球菌によって感染し、肺に比較的豊富に存在するアシアロ−GM1へのその結合はGLSによって明らかに阻害された。このことはGLSが上皮細胞への初期結合で役割を果たすことを示した。GLS処置は、肺炎球菌の生存能力を変更させなかった。この実験の間に肺炎球菌は血液中で検出されなかった。それゆえGLSは、鼻道の神経−上皮への肺炎球菌結合ならびに肺およびCNSの感染に関して重要な標的を構成する。
OB中のEF3030の数は一般に少なすぎて、顕微鏡による細菌の描出は実現できなかった。鼻腔内投与後のOB中のS.ニューモニエを描出するために、さらに毒性の菌株TIGR4を使用した。攻撃の1、3、6、12または24時間後およびその後毎日、代表のマウスからの血液サンプルを試験した。菌血は観察されなかった。攻撃の1週間後にマウスを殺処分して、CFUについて組織を分析した(図4Aおよび4B)。わずか5X105のTIGR4 CFUの用量が、OBに〜300CFUを生じた(図3)。OB中のPspA特異性Absを染色することによって、肺炎球菌を描出した(図4D〜F)。肺炎球菌は、攻撃されたマウスのOB、すなわち糸球体層(図4F)および外部網状層(図4E)で検出された。コントロールマウスのOBには、肺炎球菌は存在しなかった(図4D)。
(上咽頭輸送における肺炎球菌−NanAの役割およびCNSの標的化)
NanA変異体を、遺伝子的背景およびNanAの局在化の両方で異なるS.ニューモニエの3つの菌株にて産生させた。菌株EF3030(19F型)およびD39(2型)はどちらも、細胞壁に共有結合するNanAを発現するが、TIGR4菌株(4型)は、環境へ分泌される切断NanAを発現した。
本試験で使用した菌株を表4に挙げる。
親バックグラウンドTIGR4、EF3030およびDD39それぞれのNanA変異体菌株JW001、SAM001、およびJCP001を挿入複製突然変異誘発技法によって得た(そこで教示された技法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Yother et al.(1992)J.Bact.174:610−618)(表4)。菌株TIGR4およびEF3030は、レシピエントとして、同質遺伝子nanA菌株D39から作成したドナー染色体DNAの形質転換に使用した(Berry et al.(2000)Infect.Immun.68:133−140)。それぞれの場合で、変異体は、親菌株への戻し交雑を3回行った。D39変異体も我々のD39親菌株への戻し交雑を3回行って、それがこれらの試験で使用した親菌株との同質遺伝子であることを確認した。D39の変異は、成熟タンパク質のアミノ酸約650個のN末端フラグメント以外のすべての欠失を可能にする挿入複製突然変異誘発によって作成した(Berry et al.(2000)Infect.Immun.68:133−140)。TIGR4/nanB同系変異体は、挿入複製突然変異誘発技法を使用して作成した(Balachandran et al.(2002)Infect.Immun.70:2536−2534;Yother et al.(1992)J.Bact.174:610−618)。nanBの461bp内部部分を、プライマー:nanBFおよびnanBR(表1)を使用して増幅し、PCRは、Taq PCR Mastermix(Invitrogen)を使用して、95℃にて1分間、45℃にて1分間、72℃にて1分間を30サイクル実施した。フラグメントは、pSF152内へクローニングした。TIGR4菌株のプラスミドDNAによる形質転換は、前と同様であった(Balachandran et al.(2002)Infect.Immun.70:2526−2534)。nanA/nanB−TIGR4ダブル変異体は、nanB/TIGR4変異体の菌株JW001から作成した染色体DNAによる形質転換によって得た。
メス6〜12週齢CBA/CaHN−XID/J(CBA/N)マウスは、Jackson Laboratory(バーハーバー、マサチューセッツ州)から得た。これらマウスのBrutonのチロシンキナーゼ遺伝子における変異は、胸腺独立性II型抗原への反応をできなくするが、比較的な正常なT細胞依存性免疫反応を可能にする(Amsbaugh et al.1972 J Exp Med.136:931−949;Briles et al.1986 Curr.Top.Microbiol.Immunol.124:103−120;Potter et al.1999 Int.Immunol.11:1059−64;Wicker and Scher 1986 Curr.Top.Microbiol.Immunol.124)。これらのマウスは、カプセル状ポリサッカライドに反応できず、肺炎球菌感染を高い再現性で受けやすい(Briles et al.1986 Curr Top.Microbiol.Immunol.124:103−120;Briels et al.1981 J.Exp.Med.153:694−705)。X連鎖免疫不全(xid)マウスは、病原体のない状態に維持され、7〜12週齢で使用した。既知の濃度の生細胞を含有する凍結感染ストックを乳酸リンゲル液で希釈した。次にマウスに体積10μl中のおよそ5X105−1X106細胞を用いて、上述のように経鼻的に(I.N.)感染させた(Wu et al.1997 Microb.Pathog 23:127−137)。
すべてのマウスは、鼻洗浄および組織収集を実施する前に安楽死させた。血液を後腹膜神経叢からヘパリン処理毛細管内に収集した。鼻洗浄液(NW)、鼻組織(嗅上皮(NT)、嗅球(OB)を含む)、および脳の収集前に、マウスを70%エタノールで消毒した。これらの体液および組織を上述のように得た。NWの血液汚染を防止するために、気管への切開を行って、外径0.075cmを有する2.0cm長のTygon管(Cole−Parmer)を上咽頭に挿入し、同時にリンゲル液を充填した注射器に取り付けた。注射器からの液体は鼻を通じて排出して、3滴を収集した。ON/EおよびOBをそれぞれリンゲル液0.5ml中でホモジナイズし、脳の残りをリンゲル注射液剤1.0ml中でホモジナイズした。
組織および体液の連続3倍希釈物8個を滅菌リンゲル液中で作成し、ゲンタマイシンサルフェート4μg/mlを含有する血液寒天プレートで平板培養した。コロニー形成単位(CFU)は平板培養およびロウソク瓶内でのインキュベーションの24時間後に数えた。ノイラミニダーゼ活性に使用したアッセイは、前に述べられている(アッセイ方法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Lock et al 1988 Microb Pathog 4:33−43)。野生種肺炎球菌と変異体肺炎球菌との間の比較を行う2標本Mann−Whitneyランク検定を用いた解析によって、結果の有意性を評価した。
TIGR4、ならびにそのnanAおよびnanB変異体が特異性ガングリオシドに結合する能力を測定した。使用したガングリオシドは、混合ガングリオシド、アシアロ−GM1、GM1、GD1a、GD1b、GT1(Calbiochem)およびGM3ガングリオシド(Sigma)を含む。GM3ガングリオシドは、肺炎球菌性結合に関与する末端または内部GalNAcβ1−4Gal配列を欠いており、負のコントロールとして使用される。これらのガングリオシドを含有する混合、モノ−、ジ−またはトリ−シアル酸は、ELISAプレートにただちに結合する。TIGR4菌株を用いた短期インキュベーション後の初期データは、肺炎球菌がアシアロ−GM1コーティングプレートに結合するが、BSA−、GM−3、またはGM1コーティングプレートには結合しないことを示している。ガングリオシドコーティングプレートを使用して、野生種TIGR4菌株、TIGR4菌株、nanA、nanB、およびnanA/nanB変異体菌株の安定不透明および透明相改変体によるこれらのプレートへの結合能力を比較する。これらの解析は、ガングリオシドコーティングプレートへの短期インキュベーション(1時間)および長期インキュベーション(24時間)を含む。結合した肺炎球菌は、0.5%酵素抽出物を含有するTodd Hewitt培地中での短期インキュベーション(10〜15分間)によってガングリオシドプレートから除去され、放出された細菌の反復ピペッティングおよび血液寒天プレート上での平板培養が続く。あるいは41℃の、0.5%酵素抽出物を含有するTodd Hewittブロス寒天を結合した肺炎球菌の上に注入して、プレートの底からコロニーをカウントする。コントロールは、肺炎球菌のないプレートおよびガングリオシドはないが、肺炎球菌のあるプレートを含んでいる。
(NanAおよびNanB変異体のコロニー形成)
S.ニューモニエがCBA/Nマウスの上咽頭にコロニー形成する能力に対するNanA変異の効果を、鼻腔内(i.n.)感染させたマウスの鼻洗浄から単離された肺炎球菌細胞の数を、NanA変異体菌株で感染させたマウスの肺炎球菌細胞の数と比較することによって評価した。これらの異なる肺炎球菌菌株が含まれ、それゆえカプセル血清型および遺伝的背景が異なる菌株に対するNanA変異の効果が調査された。TIGR4/NanA−(JW001)、EF3030/NanA−(SAM001)およびD39/NanA−(JCP001)はそれぞれ、カプセル型4、19Fおよび2であった(表4)。カプセル型4臨床アイソレート、TIGR4の場合、LPETG(配列番号13)モチーフをコード化する配列の前に停止コドンがある。このモチーフがないと、NanAは、TIGR4によって環境中へ分泌されることが予想される。現在入手できる残りの4つの肺炎球菌−NanA配列、G54(19F型)、R6(2型)、Spanish 23Fおよび670(6B型)の試験(Berry et al.Gene 71:299−305;Hoskins et al.2001 J.Bacteriol 183:5709−17;Tettelin et al.2001 Science 293:498−506)は、細胞壁への共有結合のためのLPXTG(配列番号14)モチーフを有することを示した(図5)。したがってここに含まれる菌株は、NanAが分泌され、表面結合されている菌株における変異の比較を提供した。
S.ニューモニエの鼻組織(嗅神経を含む)への移動を追跡するために、嗅球および脳の残りをS.ニューモニエの存在について試験した。NanA変異体は、遺伝的背景とは無関係に、鼻組織および嗅球において、野生種菌株の数と比べて著しい数の減少が見られた。殺処分時に、すべてのマウスから採血したが、いずれも血液中に検出可能な肺炎球菌を示さず(<12CFU/ml血液)、肺炎球菌が鼻腔からCNS組織へ直接移動することを示している。NanB変異体は、肺炎球菌の鼻組織または嗅球内への侵入に対する影響を持たなかった(図8)。
(S.ニューモニエ病原性におけるガングリオシドの役割)
精製ノイラミニダーゼ、NanA(Calbiochem)をPBS 10μl中1、10および50μgにて、ON/E単離の15、30、および60分前に鼻腔内投与する。組織を4%パラホルムアルデヒドで固定して、パラフィン切片を作成した。GM1はビオチン化CT−Bを使用して、続いてストレプトアビジン−FITCによって染色し、染色強度を解析する。切片はローダミンに結合させたアシアロ−GM1特異性Absによっても染色して、これらの組織においてGM1染色の減少がアシアロ−GM1染色の増加と同時に起きることを確認する。同じ処置を受けるマウスの並行群をS.ニューモニエ菌株TIGR4およびEF3030によるコロニー形成について、第1日および第4日に解析して、ノイラミニダーゼ処置が鼻腔内コロニー形成レベルの上昇を引き起こしたことを確認する。マウスに菌株EF3030の高用量(1x108CFU)を鼻腔内投与して、ON/Eは、鼻腔内攻撃後の第1日および第4日に以下の間隔、すなわち、1、3、6、および12時間にて単離する。ON/Eを上で概説したように染色し、GM1およびアシアロ−GM1発現について解析する。GM1の減少およびアシアロ−GM1発現の上昇が鼻組織で観察される場合、NanAおよびNanB欠損菌株も、それらが鼻道でのGM1発現を変化させることが期待されないため、試験を行う。シアル酸残基の除去は、Thompson−Friedenreich抗原の抗原決定基に相当する、次端部ジサッカライド、β−D−ガラクトピラノシル−(1−3)N−アセチル−D−ガラクトサミンを露出させ、そのためにPNAは高い親和性を有する。それゆえON/E中のPNA−結合部位における変化は、ノイラミニダーゼ活性の別の尺度である。これらの組織から作成した凍結切片をPNA−FITCまたはPNA−HRPでただちに染色して(Medac,ハンブルク、ドイツ)、顕微鏡検査に基づいてPNA−結合部位の増加が生じたかどうかを判定する(そこで教示した方法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Black et al.,(2000)Pediatr.Infect.Dis J.19:187−195;Klein et al.(1978)Klin.Wochenschr.56:761−765)。
(肺炎球菌性病原性におけるCポリサッカライド特異性抗体の役割)
テイコ酸としても既知の肺炎球菌性Cポリサッカライドは、リポテイコ酸としても既知の肺炎球菌F抗原と構造的に同じである。Fischer et al.(1993)Eur.J.Biochem 215:851−857。これはグラム陽性細菌の中でS.ニューモニエ独自の特徴である。これらの分子の主要抗原決定基は、ホスホリルコリン(PC)残基であり、PCに対するAbsは、i.p.または経鼻肺炎球菌攻撃に対して保護的である。Briles et al.,(1984)Eur.J.Immunol.14:1027−1030;Briles et al.,(1981)Nature 294:88−90;Yother et al.,(1982)Infect.Immun.36:184−188;Briles et al.,(1984)J.Mol.Cell.Immunol.1:305−309。それゆえ受動伝達または能動鼻腔内免疫化のどちらかによって得られたPC特異性Absの役割が調査される。保護性PC特異性Absの受動伝達では、すなわちIgG3(59.6C5)およびIgM(22.1A4)アイソタイプの両方のT15イディオタイプモノクローナルAbs(mAbs)が使用される。Briles et al.,(1981)Nature 294:88−90。T15イディオタイプは、おそらくCポリサッカライドをより効率的に結合することによって、マウスの肺炎球菌感染に対してM603またはM511イディオタイプよりも保護性であることが示されている(Briles et al.,(1984)Eur.J.Immunol.14:1027−1030)。受動Abs伝達は、鼻腔内投与された肺炎球菌を用いたT15 Abs(100μg)の直接投与を含み、鼻腔内コロニー形成を低減するためのi.v.またはi.p.投与されたAbsと比較する。コロニー形成は経時的に監視し(第4日、第11日、第18日)、これらの実験の異なる群の間で著しい相違が観察されない場合、mAbs(20μg)を1日おきに鼻腔内投与する。CBA/Nマウスは、T15イディオタイプ抗PC Absを生成しない。抗PC特異性Absの受動伝達が、鼻道中で粘膜IgAまたはPC特異性Absの他のアイソタイプを誘発することは予想されない。鼻Absを誘発するために、2つの異なる手法を取る。1つは、Cポリサッカライドに対するAb反応を誘発することが既知である、プロテアーゼ処置R36A菌株の直接鼻腔内投与である。抗PC Absの保護免疫が試験されてきたが、鼻道などの粘膜表面でのその役割に関するデータは入手できない。CBA/NマウスX染色体関連免疫不全は、T15イディオタイプの抗PC Absの産生不能を引き起こす。この不能の重要性を判定するために、CBA/Nマウスをその野生種対応物のCBA/Jマウス(Jackson Laboratories)と比較する。抗PC Abs誘発のための菌株R36Aによる免疫化は、表面タンパク質のタンパク質分解除去を含む。Krause(1970)Adv.Immunol.12:1−56。鼻腔内免疫化の代わりの手法は、上述したようなPCのタンパク質キーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH)へのカップリングである(そこで教示した方法について、参照により本明細書に組み入れられている、Krause(1970)Adv.Immunol 12:1−56;Chesebro and Metzger(1972)Biochemistry 11:766−771)。PC−KLHを用いた鼻腔内免疫化は、粘膜免疫反応を最適化するために、粘膜アジュバントCTを用いて実施される。マウスは、コロニー形成に対するCTの効果を防止するために、最後の免疫化の2〜3週間後に攻撃される。1週間間隔で3回の鼻腔内免疫化を実施する。当業者によって通常実施される通りにCポリサッカライドおよびPC特異性ELISAを使用して、血清Ab力価を監視する。PC特異性ELISAでは、PCは上述のようにBSAに結合される(そこで教示した方法について、参照により本明細書に組み入れられている、Chesebro and Metzger(1972)Biochemistry 11:766−771)。血清に加えて、鼻洗浄液、唾液、および気管支洗浄液中のAb力価を測定する。これらの解析は、粘膜分泌物および血清の両方でのIgA、IgM、IgG、およびIgG−サブクラス分布を含む。最適な粘膜Ab力価を誘起するプロトコルを使用して、第4日および第11日にコロニー形成が監視された後にマウスに〜5x106CFUで投与される、TIGR4菌株による粘膜攻撃試験を実施する。免疫化試験では、正常な完全免疫適格性マウス(CBA/J菌株)はもちろんのこと、CBA/Nマウスも以前の試験と同様に使用する。Wallick et al.,(1983)J.Immunol.130:2871−2875。
(S.ニューモニエ病原性におけるノイラミニダーゼ特異性抗体の役割)
鼻腔内攻撃前にマウスを鼻腔内免疫化するために、市販のS.ニューモニエ由来ノイラミニダーゼを使用する(Calbiochem)。しかしながら、提案された試験に十分な量のタンパク質を得るために、NanA遺伝子はヒスチジンタグ含有発現ベクター(Invitrogen)を使用してE.コリ内でクローニングおよび発現させる。粘膜免疫反応を最適化するために、3.4%ホルムアルデヒド処置ノイラミニダーゼの鼻腔内免疫化を対の未処置ノイラミニダーゼと、CTの存在下または非存在下で比較する。これらの免疫化は、CBA/NおよびCBA/Jマウスの両方で実施する。3回の鼻腔内免疫化を1週間おきに与え、その間に血清および唾液Abs力価をELISAによって監視する。免疫マウスをTIGR4菌株によって攻撃して、ON/E、OB、脳、血液、脾臓、および肺のコロニー形成を第4日および第11日に比較する。宿主の相互作用を遮断するために、ノイラミニダーゼおよびCポリサッカライド特異性Absの両方を同時に誘発させる。鼻腔内免疫化をノイラミニダーゼおよびT15イディオタイプmAbsの伝達による受動免疫保護と組み合せた計画を使用する。
(S.ニューモニエを用いた鼻腔内攻撃に対して保護するためのノイラミニダーゼ−PC結合体の有効性)
保護の向上を評価し、単独で使用された各抗原と比較して第11日のEF3030およびTIGR4菌株による鼻腔内コロニー形成を低下させるために、マウスを鼻腔内アジュバントとしてのCTと組み合せたノイラミニダーゼおよびPC−KLHによって免疫化する。加えて、鼻洗浄液、唾液、および血清のAb力価を上述のように解析して、免疫パラメータを鼻道内での肺炎球菌に対する保護度と関連付ける。さらに最適な免疫反応を発生させるために、ホスホコリンをノイラミニダーゼに直接結合させる。この作成物を、CBA/NおよびCBA/Jマウスの両方における鼻腔内および全身免疫化の後に、アジュバントとしてのCTを用いて、またはCTなしに送達したときに免疫原性について試験を行う。鼻洗浄液、唾液、および血漿のAb力価をELISAによって測定する。攻撃試験は、菌株EF3030 107CFUまたはTIGR4 106CFUを用いて実施する。マウスを攻撃後、第11日に殺処分して、血液、鼻洗浄液、ON/E、OB、および脳で観察されたCFUについて解析した。PCに結合させたノイラミニダーゼによる免疫化は、粘膜および全身Abレベルを上昇させることによって、これらの2つの毒性成分に対する保護を向上させる。抗原特異性IgGサブクラスの分布は、他の粘膜アジュバントを使用することによって変更される。CTは、Th2−、LT混合Th2/Th1−、およびCpGモチーフ、たとえばDNAオリゴヌクレオチド(ODN)1826 a Th1型反応をIgGサブクラス分布の関連する変化と共に引き起こす。各種のアジュバントは、ノイラミニダーゼ−Cポリサッカライド特異性免疫がS.ニューモニエによる鼻腔内コロニー形成から保護する能力をさらに向上させ、新たな肺炎球菌性ワクチン手法の考案をもたらす。
(鼻腔内攻撃後のS.ニューモニエの鼻腔内コロニー形成の、抗ホスホコリン特異性モノクローナル抗体による阻害)
合計1X106CFUのTIGR4菌株を、IgG3サブクラスまたはIgMアイソタイプのどちらかの抗ホスホコリンモノクローナル抗体5μlでインキュベートした。合計5μlを鼻孔ごとに投与した。投与9時間および12時間後の鼻洗浄液500ml中のCFUをそれぞれ示す。どちらのモノクローナル抗体でも、重大な80%超の減少が見られた。1グループ当たりマウス5匹の平均+SDを示す。データを図10に示す。
(S.ニューモニエ鼻腔内投与後の神経細胞損傷および炎症)
S.ニューモニエ菌株EF3030の鼻腔内投与後、第1日、第3日、第7日および第14日に処置マウスからON/E、OB、および脳を単離して、炎症性反応について組織学的に解析する。D39またはTIGR4菌株をそのnanA変異体菌株と、炎症性反応を発生させるその能力について比較する。殺処分時に、マウスを25℃のPBSを用いて潅流して、Zamboni固定液10ml(0.1Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド、15%ピクリン酸による潅流を続ける。OBおよびON/Eを除去し、次に4℃の新しい4%パラホルムアルデヒド(PFA)中に一晩置いた。次に、切断前に凍結を防止するために、組織を4℃の30%スクロース溶液に移して48時間置いた。次に組織をOCT中で凍結させ、切片(6μm)を事前にコーティングした顕微鏡スライド上に置いた(生理的食塩水中10%BSA)。最初にヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を実施して、この期間中にOB、三叉神経節およびON/Eに浸透する(infitrate)炎症性細胞を検出する。神経細胞損傷を評価するために、神経成長因子β1(NGF−β1)を染色する。NGF−β1は、神経細胞損傷の後に生成され、アポトーシスを防止し、神経細胞の新たな成長を刺激するように機能する。三叉神経節およびOB切片をビオチン化ウサギ抗ヒトNGF−β1Abによって0.2μg/mlの濃度で染色する。Ab染色切片を4℃にて一晩インキュベートする。スライドをPBSですすぎ、次にアビジン−ビオチン複合体(ABC)のVectastain(Vector Laboratories,バーリンゲーム、カリフォルニア州)によって25℃にて30分間反応させた。組織をPBSで3回すすぎ、次に以前に報告したようにジアミノベンジデン(DAB)と5〜10分間反応させる。スライドをさらに3回すすぎ、切片をC.S.ヘマトキシリンによって30秒間対比染色する。H2Oでの洗浄後、スライドを100%アルコールおよびキシレン中で脱水する。NGF−β1の増加は、神経細胞組織の損傷度の指標を与える。神経細胞関与の別の指標は、小膠細胞の活性化である。活性化された小膠細胞は、アメーバ様球状形状を示し、これに対して静止細胞(G0/G1)は、樹枝状の分裂した外観を有する。活性化時のこのような変化によって、静止および活性化小膠細胞を区別できる。小膠細胞では、S.ニューモニエ攻撃後の活性化状態に対処するために、F4/80抗体または抗MAC−1(MI/70)が使用される。神経細胞損傷および小膠細胞活性化に加えて、OBのアポトーシスの誘発が評価される。このために、活性カスパーゼ3である、Asp−Glu−Val−Asp特異性プロテアーゼの誘発がアポトーシス経路の開始において重要であるため、それが解析される。活性カスパーゼ3(Cell Signaling Technology,Inc.,ビバリー、マサチューセッツ州)に対して特異性のAbは、アポトーシスの検出のために免疫組織化学で使用できる。カスパーゼ3活性が免疫組織化学によって神経細胞組織で検出されると、活性は、基質のタンパク質分解後の蛍光信号に基づくカスパーゼ−3アッセイキット(Molecular probes,ユージーン、オレゴン州)を用いて定量される。
(逆行性軸索輸送による、S.ニューモニエが嗅球を標的化する能力)
第一に、鼻腔内またはi.v.接種後の処置マウスの神経細胞組織、OBおよび脳への肺炎球菌の蓄積を評価する。i.v.接種後、神経細胞組織のどの肺炎球菌も血液を通じて侵入する。鼻腔内攻撃後の第1日、第4日、第11日および第18日の組織を収集する。その場合、脳およびOB1グラム当たりの細菌数は、注射後のすべての時点で同様なはずである。これに対して、鼻腔内接種後の鼻道を通じて侵入する細菌では、OBへの蓄積(組織重量当たりで表される)が先に起こり、一般に脳で観察される蓄積が待ち構えている。
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