CN101679520A

CN101679520A - huTNFR1选择性拮抗剂

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Publication number: CN101679520A
Application number: CN200880009245A
Authority: CN
Inventors: 克劳斯·普菲岑迈尔; 彼得·谢里奇; 罗兰德·康特曼; 赛宾·明克尔
Original assignee: Universitaet Stuttgart
Current assignee: Universitaet Stuttgart
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2010-03-24
Anticipated expiration: 2028-03-13
Also published as: EP1972637B1; JP5534819B2; US9045535B2; EP1972637A1; US20130244341A1; CA2680085C; US8404238B2; WO2008113515A2; CA2680085A1; US20100150916A1; ES2368764T3; CN101679520B; ATE514714T1; WO2008113515A3; JP2010521508A; PL1972637T3; EP2121759A2

Abstract

本发明涉及一种特异性结合人肿瘤坏死因子1型受体(huTNFR1)的配体，该配体包括能够降低在人类中配体的免疫原应答的一种或多种人源氨基酸序列，以及能够选择性结合huTNFR1的一种或多种氨基酸序列。本发明进一步涉及编码所述配体的核酸和用于治疗与huTNFR1相关的疾病的药物组合物。

Description

huTNFR1选择性拮抗剂

技术领域

本发明涉及特异性结合于人肿瘤坏死因子1型受体(huTNFR1)的配体，该配体包含一种或多种能够降低在人类中配体的免疫原应答的人源氨基酸序列，和一种或多种能够选择性结合于huTNFR1的氨基酸序列。本发明进一步涉及编码所述配体的核酸以及用于治疗与huTNFR1相关的疾病的药物组合物。

背景技术

TNF是调节炎症及凋亡的关键细胞因子。依赖于细胞类型和周围环境，TNF可具有相反作用，免疫刺激或免疫抑制，TNF可介导凋亡，也可抗凋亡(Locksley等，Cell，2001，No.104，p.487-501；Aggarwal B.B.，Nat.Rev.Immunol.，2003，No.3，p745-756J)。在人类中，TNF是总体上调节先天性免疫系统和炎症反应的必需细胞因子，它也已被认为是许多慢性和急性疾病的中心致病介体。具体地，在分别伴随有TNF和TNFR1过表达的风湿性关节炎(RA)、炎症性肠病如Morbus克罗恩(MorbusCrohn)病和溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、银屑病、一些罕见遗传性疾病如颌骨增大症和周期性发热综合症中(ChatzantoniK，Mouzaki A.，Curr.Top.Med.Chem.，2006，No.6，p.1707-1714；Ueki等，Cell，2007，No.128，p.71-83；Simon A.，Vandcr Meer J.W.，Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.2007，No.292，p.R86-R98)，TNF体系已被确定为病理相关介体。在导致所谓细胞因子症状的暴发型病毒或细菌感染中，已知TNF的参与是关键性的，大量文献证实其在感染性休克和多脏器衰竭中，作为介体的至关重要的作用。TNF还牵涉其他许多疾病，特别是包括肥胖症和2型糖尿病在内的代谢病(Hotamisligil G.S.，Nature，2006，No.444，p.860-867；Storz等，FEBS Lett.，1998，No.440，p 41-45)和某些类型的肝炎(Kusters等，Eur.J.Immunol.，1997，No.27，p.2870-2875)。此外，尽管TNF在某些癌症局部治疗中具有已知治疗活性，其也被认为是其他恶性疾病的肿瘤启动子，可能是通过NF-κB介导的凋亡抑制和其他存活途径(Luo等，Antibody engineering methods andprotocols，2004，Humana Press，Towota，p.135-159)。因此，临床试验当前也开发出抗TNF的策略，作为一些恶性血液病(例如AML)的治疗方案。从机械论的观点，已证明在包括TNFR敲除小鼠在内的许多模型中，TNF R1是TNF的病理表型的主要介体(Locksley等，Cell，2001，No.104，p 487-501；Aggarwal et al.，Nat.Rev.Immunol.，2003，No.3，p.745-756)。

在一些慢性炎症疾病中，TNF中和试剂，特别是抗TNF抗体和可溶性TNFR-Fc融合蛋白，被广泛应用于临床上。三种干扰TNF作用的药物已被批准：Remicade(Vilcek and Feldmann，2004)(Centocor/Tanabe)、Enbrel(Immunex/Wyeth)和Humira(Celltech/Abbott)。这些药物均靶向TNF本身。这些药物被批准用于治疗风湿性关节炎(RA)、青少年RA、银屑病关节炎、克隆氏症(Crohn’s disease)和僵直性脊椎炎。TNF靶向药物在RA上显示巨大成功，但是其治疗效果仅仅持续有限的时间，而且有些患者对抗TNF抗体治疗是先验的(priori)不作反应的(refractory)或者会产生抗性。此外，例如在克罗恩病(Morbus Crohn)方面，利用CDP 571(一种人源化TNF特异性单克隆抗体)的临床试验结果确实是比预期前景差，需要开发出新的观念和靶向TNF/TNFR体系的试剂。

除了预期的一般性免疫抑制之外，获批准的抗TNF药物还显示出额外的副作用，如产生抗dsDNA抗体、狼疮和神经炎症性疾病。患者在一般性TNF阻断下的免疫抑制状态伴随着感染传染性疾病的风险增加，包括共生体在内。在“Lenercerpt研究”(1999)中，用于治疗MS的抗TNF药剂的临床试验不得不停止，因为疾病状态变得更坏，而不是更好。当时未预期的不良反应的机械论背景目前较为清楚，其涉及TNFR1和TNFR2在该疾病中的差异化作用，TNFR1信号传播神经元坏死，TNFR2信号活化髓鞘片再生。总之，如下概述，更多的证据显示旨在受体选择性靶向TNF作用的全新治疗策略在多数情形下应优于对TNF信号传导的一般性阻断。例如，在下面详述的一些动物疾病模型中，TNF作用的矛盾效应通过不同受体TNFR1和TNFR2的不同功能来解释。目前，所获得的有关受体水平上的TNF作用机制的知识确实开发出新型治疗策略，旨在对其中一种受体进行药理学阻断，从而潜在地导致更特异化效果。

例如，视网膜缺血为糖尿病的并发症，其中的视网膜神经元经历TNF诱导的凋亡，从而导致失明。TNFR2敲除小鼠的视网膜显示出凋亡增加，但是TNFR1敲除小鼠的视网膜与野生型相比，显示出凋亡减少(Fontaine等，J.Neurosci，2002，No.22，RC216)。

同样，EAE为多发性硬化(MS)的动物模型。其特点在于直接针对髓鞘产生原发性自体免疫炎症。髓鞘特异化反应随后减退，而其他抗原表位取代成为自体免疫抗原。在TNF敲除小鼠显示对髓鞘的较弱原发性炎症的同时，髓鞘特异化免疫反应不再减退。在TNFR1敲除小鼠中，原发性炎症同等减弱，但是随后减退，这表明TNFR2足以介导TNF的长期免疫抑制功能，同时该炎症通过TNFR1介导(Kassiotis G.，Kollias G.，J.Exp.Med.，2001，No.193，p.427-434；Kollias等，Curr.Dir.Autoimmun.，2002，No.5，p.30-50；Owens等，Nat.Med.，2001，No.7，p.161-166)。

同样，在诱导毒素(双环己酮草酰二腙(cuprizone))的可逆的CNS脱髓鞘作用的小鼠模型中，类似于多发性硬化(MS)中的脱髓鞘作用/再生阶段，有说服力的证据是，撤回毒素下的髓鞘再生是TNF依赖性的，并且选择性需要TNFR2信号传导、引起少突细胞前体扩增以及分化为形成少突细胞的成熟髓鞘片(Arnett等，Nat.Neurosci.，2001，No.4，p.1116-1122)。少突细胞再生的TNF依赖性的发现反映出人类患有MS的情形：旨在用TNFR1-Fc融合蛋白进行MS完全TNF阻断的临床试验中，TNF的阻断伴随着疾病的恶化而不是治疗效果，这与上述动物模型的结果一致。

此外，例如一旦通过神经传递素谷氨酸酯(glutamate)明显触发NMDA受体，小鼠的皮层神经元经历兴奋性毒素死亡。谷氨酸酯是从诸如敲击时出现的缺血条件下(氧气缺乏)的垂死组织中释放出来的。可使得原始培养的神经元，充分抵抗包括PI3K-AKT-NF-κB途径的TNFR2依赖性兴奋性中毒。相比之下，TNFR1信号促进了谷氨酸酯诱导的细胞死亡(Marchetti等，J.Biol.Chem.，2004，No.279，p.32869-32881)，从而表明在CNS中TNFR1和TNFR2的不同作用。

因此，在急性和慢性神经变性、视网膜缺血、敲除模式以及多发性硬化的各种模型中，TNF的完全阻断不具有明显的治疗效果，相反却直接损害或降低受影响组织的再生能力。因而，特异化阻断TNFR1、炎性TNFR以及维持TNFR2功能，给出了用于这些疾病的有前景的治疗方法。

同样，在分别伴随有TNF和TNFR1过表达的风湿性关节炎(RA)、银屑病以及一些罕见遗传性疾病如颌骨增大症和周期性发热综合症中，TNFR1被认为或已被明确地确定为疾病的有关受体。TNFR1和2的不同功能在克罗恩病方面也变得明显起来，其中，仅一小部分患者对抗TNF疗法作出反应，而在SLE(Komata等，Tissue Antigens，1999，No.53，p.527-533)中，分别抵抗治疗和疾病易感性，均与TNFR2突变有关联。

因此，利用受体选择性抗体以靶向TNFR1代表一种在这些慢性炎性疾病中建立抗TNF策略的替代方案(alternative)。这样可看出患者体内的特殊关联性，所述患者在经过重复治疗周期时变得对抗TNF试剂不作反应。此外，由于全面并持续的TNF阻断与先天的和适应的免疫应答的功能性缺陷有关联，起因于传染性疾病的并发症的风险在这些患者体内大量增加。选择性干扰TNFR1通过TNFR2维持TNF的应答，这应该有益于患者的全面免疫能力。

发明人之前对人TNFR1特异的拮抗小鼠单克隆抗体(mab)H398的体内和体外功能研究支持选择性TNFR1阻断作为强有力的治疗方案(Thoma等，J.Exp.Med.，1990，No.172，p.1019-1023；Grell等，Cell，1995，No.83，p.793-802；Moosmayer等，Ther.Immunol.，1995，No.2，p.31-40)。该鼠源性抗体及其重组小鼠scFv衍生物通过竞争性抑制TNF结合人TNFR1，在体外广泛中和TNF活性；显示mab在防止狒狒体内细菌诱导的致命性休克症状方面是有效的，其中H398表现与该物种的TNFR1交叉反应。无法评估临床试验中抗体H398在TNF依赖性的慢性疾病方面的治疗效果，因为抗体为鼠源性(mouse origin)，需要承受对鼠源性抗体的急性不良反应和/或经过重复性治疗周期迅速发展的免疫应答的风险。

因此，需要有新型物质，该物质作为患者体内的TNF拮抗剂，应该有效并特异地与人TNFR1(huTNFR1)相互作用，并且经过给药于人后应该具有降低的(即可耐受的)免疫原应答。

发明内容

因此，本发明隐含的技术问题是提供新型低免疫原huTNFR1-配体，其作为适于人的TNF作用拮抗剂，作为治疗各种TNF介导的疾病的治疗剂。

根据本发明，上述问题通过提供huTNFR1-配体解决，该配体包括具有如下的蛋白质结构(proteinaceous construct)：(i)一种或多种人源氨基酸序列，该人源氨基酸序列能够降低在人中所述huTNFR1-配体的免疫原应答，以及(ii)一种或多种非人源氨基酸序列，该非人源氨基酸序列能够选择性结合于huTNFR1。

在此，术语“huTNFR1-配体”是指当给药于人时能够选择性结合人TNF 1型受体(huTNFR1)并同时显示降低的免疫原应答的任何分子或分子组。通过结合于huTNFR1，所述huTNFR1-配体作为TNF和淋巴毒素-α(LTα)的拮抗剂，它们是TNFR1的其他天然配体。

此处所用的术语“huTNFR1”并不仅涉及人TNF 1型受体，同样还包括其中的任何部分，或者在结构上和/或功能上与huTNFR 1有关的任何其他受体。

表达方式“降低的免疫原应答”是指一种免疫原应答，其相比于仅包括非人源氨基酸序列的huTNFR 1-配体的免疫原应答而降低。仅包括非人源氨基酸序列的huTNFR1-配体的实例包括非人源哺乳动物源，如啮齿动物源的肽、蛋白质和核酸，如鼠源性抗体。

在此所用的表达方式“蛋白质结构”并不特别限定，其指含有一个或多个肽键的任何分子或分子组，优选肽序列，并且结合于huTNFR1，同时显出在在人类中降低的免疫原应答。根据本发明的蛋白质结构可进一步包括核酸和有机及无机化合物，如糖类或脂肪酸。此外，蛋白质结构可包括经过共价键或非共价键独立关联的一组分子，如融合蛋白。根据本发明的另一个实施方案，蛋白质结构可进一步与附加分子联合，如聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇，即可将它PEG化。

本发明的huTNFR1-配体和/或蛋白质结构可通过任何本领域技术人员已知的合适方法生产，像如通过包括构建合适质粒或载体并在微生物或任何更高级的有机体内的表达的重组方法，或者通过自动肽合成，如固相肽合成。

在此所用的表达方式“人源氨基酸序列”是指在在人类中可发现的该氨基酸序列。但是，该表达方式并不仅限于恰好在在人类中发现的该氨基酸序列，还包括与人氨基酸序列有50％或更高相似性的那些氨基酸序列。人源氨基酸序列的具体实例为包含于人抗体内的氨基酸序列或者其中的片段。

此外，在此所用的表达方式“非人源氨基酸序列”是指可在非人类动物如非人哺乳动物体内发现的任何氨基酸序列。例如，非人源氨基酸序列可以是非人抗体，如鼠源性抗体的序列。

在本发明的蛋白质结构中，人源氨基酸序列的优势在于降低患者诸如免疫原的风险，这些优势与对非人源氨基酸序列huTNFR1(例如在鼠源抗体H398中所发现的)的选择相结合。

根据如上述限定的huTNFR1-配体的另一个实施方案，蛋白质结构包括人源化抗体或者其中的至少一个片段。

在此所用的术语“抗体”是指可结合于抗原的任何种类的抗体，包括天然抗体、变异抗体以及(半)合成抗体，只要该抗体允许在给药人体时伴随有对其降低的免疫原应答。在优选的实施方案中，该抗体或者其中的片段是通过如重组核酸技术而获得的人源化抗体(“人源化重组抗体”)或者其中的至少一个片段，或者抗体类的重组蛋白质。作为实例，对其没有限制，一个片段可包含在抗体类重组蛋白，如双链抗体(diabodies)、scFv-Fc融合蛋白以及scFv-CH3融合蛋白。

抗体，或者其中的至少一个片段，或者抗体类重组蛋白质，可包含一种或多种突变或变异，如增加、删除或替代的氨基酸或核酸，只要对与huTNFR1的相互作用没有负效应即可。此外，该抗体，或者其中的至少一个片段，或者抗体类重组蛋白质，可包含一种或多种突变或变异，如增加、删除或替代的氨基酸或核酸，其对huTNFR1的相互作用具有正面效应并改善所述分子的拮抗活性。特别地，该突变变体具有更好的亲和力和/或更好的抑制活性。

根据本发明，术语“片段”是指如上述限定的抗体的任何部分，只要其具有通过一个(单价)或两个(二价)抗原(huTNFR1)结合位点结合于所要的抗原的能力即可。另外，本发明的片段可包括来自所述抗体的几个不同部分。蛋白质水解(proteolytically)或重组产生的抗体的单价片段的实例包括：抗原结合片段(Fab)、单链可变区片段(scFv)、可变区片段(Fv)、二硫键稳定性Fv(dsFv)、免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白轻链可变区(VL)、互补决定区(CDRs)及其组合。本发明的蛋白水解加工或重组的二价片段的实例包括：F(ab)₂、双链抗体、scFv-Fc融合蛋白质以及scFv-CH3融合蛋白质。

例如，该抗体或者其中至少一个片段可以是衍生自鼠源性抗体H398的人源化抗体或者其中的至少一个片段。

关于抗体的人源化技术不受限定，只要该抗体结合于所要的抗原即可。人源化的实例包括但不限于，互补决定区移植(CDR移植)(Jones等1986，Nature 321，522-525)，特异性决定残基移植(specificity determining residue grafting)(SDR移植)(Kashmiri等，2005，Methods 36，25-34)，可变区重塑(Roguska等.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，969-973)，通过CDR移植的基于结构的选择和人源化(Hwang等，2005，Methods 36，35-42)，以及脱免疫(delmmunization)方案(Hellendorn等，2004，Cancer Cell International 4(Sppl.I)，20)。

在此所用的表达方式“人源化抗体”是指利用蛋白质工程减少外来(“非人”)蛋白质序列的量的任何抗体，其通过将人抗体内发现的序列与如啮齿动物抗体不变区和/或可变区框架或框架残基进行交换达到。

在本发明的具体实施方案中，上述限定的huTNFR1-配体的蛋白质结构可以是人源化抗体，该抗体含有人源氨基酸序列和非人如啮齿动物源的该序列。

此处所用的术语“scFv”是指任何免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合，其通过接头连接，接头是如由丝氨酸、甘氨酸或者任何其他的天然或非天然氨基酸组成的肽。

在上述限定的huTNFR1-配体的进一步的实施方案中，该至少一个片段选自：由所述片段的Fab区、scFv、基因工程或翻译后加工的重组衍生物和所述片段的化学改性衍生物组成的组。

根据上述限定的huTNFR1-配体的具体实施方案，该至少一个片段是包括根据SEQ ID NO.：9的氨基酸序列的scFv。

在上述限定的huTNFR1-配体的进一步的实施方案中，该蛋白质结构包括：选自由SEQ ID NOs：1至6或其中的部分组成的、赋予与huTNFR1结合的组的一种或多种互补决定区(CDRs)，其中所述CDRs优选包含于一种或多种非人源氨基酸序列中，该氨基酸序列能够选择性结合如在上文蛋白质结构(ii)所述的huTNFR1。

上述限定的huTNFR1-配体的CDRs，如SEQ ID NO s：1至6，可以任何组合存在，如可存在两种、三种、四种、五种或六种所述CDRs。另外，任何一种CDRs的多拷贝或遗传性变型均可存在于本发明的huTNFR1-配体中，只要当给药于人时配体显示对人TNFRI的充分亲和力和降低的免疫原应答即可。

根据huTNFR1-配体的具体实施方案，该蛋白质结构包括根据SEQ ID NO.：7的氨基酸序列作为重链可变区(VH)，以及根据SEQ ID NO.：8的氨基酸序列作为轻链可变区(VL)。

在本发明的还另一个实施方案中，上述限定的huTNFR1-配体包括允许与生物学上可接受的化合物特异性相互作用的附加标签。不特别限定有关本发明中所用的标签，只要当给药于人体时其对huTNFR1-配体与huTNFR1的结合或者免疫原应答没有影响或具有耐受性负面影响即可。合适标签的实例包括His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep-标签、Calmodulin-标签、GST-标签、MBP-标签以及S-标签。

在上述限定的huTNFR1-配体的另一个实施方案中，蛋白质结构进一步包括通过翻译后化学接合或者通过重组基因技术非共价结合或共价结合其中的生物学上可接受的化合物。

在此所用的表达方式“生物学上可接受的化合物”并不特别限定，是指用于生物环境中如有机体中的任何化合物，还包括所述生物学上可接受的化合物的药物学可接受性。对其没有任何限制，根据本发明的生物学上可接受化合物的实例是，肽、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类，以及其他有机和无机化合物。生物学上可接受化合物优选发挥附加正效应，例如改进的生物化学/生物物理性能，如增加的溶解性、延长的稳定性、改进的拮抗活性，以及改进的药动学性能，如增加的体内半衰期、增强的组织渗透、血脑屏障通过和降低的毒性。

根据旨在改进上述限定的huTNFR1-配体的药动学性能的一个具体实施方案，生物学上可接受化合物选自由血清蛋白组成的组。

在如上述限定的huTNFR1-配体的另一个实施方案中，该生物学上可接受化合物为白蛋白。根据具体实施方案，该生物学上可接受化合物为人血清蛋白(HSA)。

在如上述限定的huTNFR1-配体的进一步的实施方案中，生物学上可接受化合物包括白蛋白结合区(如来自细菌)、由天然或非天然氨基酸组成的白蛋白结合肽、具有白蛋白结合活性的一种或多种酰链、聚乙二醇或甲氧基-聚乙二醇。在上述限定的huTNFR1-配体的还进一步的实施方案中，生物学上可接受化合物包括对血清蛋白成分特异的另一种抗体或其片段，或者结合血清成分的天然或合成配体(例如白蛋白)。

在旨在改进如上述限定的huTNFR1-配体的药动学性能的进一步的实施方案中，生物学上可接受化合物包括靶向细胞表面分子或者细胞外基质成分的另一抗体。作为实例，抗HIR(人胰岛素受体)或者抗TR(转铁蛋白受体)抗体已用于经过血脑屏障的主动转运，以及递送化合物至大脑(Boado等，2007，Bioconjug.Chem.，Epub ahead of press)。

在旨在改进如上述限定的huTNFR1-配体的功能性活性的进一步的实施方案中，生物学上可接受化合物包括结合TNFR1另一抗原决定部位的抗体，区别于通过上述限定的TNFR1配体所识别的抗体，从而改进该双特异性试剂的总结合性(binding)(亲和力)和选择性。

根据上述限定的huTNFR1-配体的另一个实施方案中，该蛋白质结构包括根据SEQ ID NO.：10的融合蛋白。

本申请的另一方面涉及编码上述限定的huTNFR1-配体的核酸。

本发明的核酸并不特别限定，并且可包含DNA或RNA。该核酸可进一步包括用于检测或分离步骤的序列，像如荧光标签或组氨酸标签(His-tag)。该核酸可进一步包含人工构件如人工DNA、RNA或PNA构件。此外，本发明的核酸可以任何合适方式生产，如重组或通过化学合成，如固相合成。

本发明的另一方面涉及包括上述限定的核酸序列的载体。本发明的载体并不特别限定，只要其可用于转染合适宿主细胞并适于外源基因表达即可。

用于构建载体的方法对于本领域技术人员是公知的，并且描述于各种出版物中。特别地，用于构建合适载体的技术，包括功能性成分如启动子、增强子、终止和多腺苷酸化信号、选择标记、复制起点、剪接信号和前导序列的描述，相当详细地评述于Sambrook等，1989及在其中所引用的参考资料中。载体可包括但并不限于，质粒载体、噬菌粒、黏粒、人工/小染色体(如ACE)、MAR载体，或者病毒载体，如杆状病毒、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、噬菌体。适于原核表达的载体的实例包括pAB1(Kontermann等，1997)。真核表达载体也代表性地包括促进细菌内载体增殖的原核序列如复制起点和用于在细菌内选择的抗生素抗性基因。包含可操作性连接一种或多种多核苷酸的克隆位点的多种真核表达载体，对于本领域技术人员来说是公知的，并且一些可从如下公司商购：例如Stratagene，LaJolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI；BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA；Lonza Biologics PLC，Slough，Berkshire，England。真核载体的实例为pCDNA3、pSecTag和pEE 6.4。

在优选的实施方案中，表达载体包括至少一种核酸序列，该核酸序列是编码目标肽/多肽/蛋白质的转录和翻译核苷酸序列必需的调节序列。

本发明进一步方面涉及寄主细胞，该寄主细胞包含上述限定的核酸或上述限定的载体。本发明的寄主细胞并不特别限定，其包括用于生产huTNFR1-配体和/或蛋白质结构或其中的部分的所有细胞。适于本发明的寄主细胞的实例包括原核细胞和真核细胞，如酵母、植物细胞、昆虫细胞以及不同种源的哺乳动物细胞和整个转基因有机物(转基因植物，转基因动物)。原核细胞的实例包括大肠杆菌(E.coli)/TG1和假单胞种(spec)。动物细胞的实例包括仓鼠细胞，优选BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1和CHODG44细胞或者该细胞系任何一种的衍生物/子代。在本发明的进一步实施方案中，寄主细胞为小鼠骨髓瘤细胞，优选NS0和Sp2/0细胞或者该细胞系任何一种的衍生物/子代，可用于表达本发明huTNFR1-配体的哺乳动物细胞的实例概括于表1中。

表1：真核生产细胞系

细胞系顺序号

NS0 ECACC No.85110503

Sp2/0-Ag 14 ATCC CRL-1581

BHK21 ATCC CCL-10

BHK TK- ECACC No.85011423

HaK ATCC CCL-15

2254-62.2(BHK-21衍生物) ATCC CRL-8544

CHO ECACC No.8505302

CHO野生型 ECACC 00102307

CHO-K1 ATCC CCL-61

CHO-DUKX(＝CHO duk-，CHO/dhfr-) ATCC CRL-9096

CHO-DUKX B11 ATCC CRL-9010

CHO-DG44 (Urlaub等，1983)

CHO Pro-5 ATCC CRL-1781

V79 ATCC CCC-93

B14AF28-G3 ATCC CCL-14

HEK293 ATCC CRL-1573

COS-7 ATCC CRL-1651

U266 ATCCTIB-196

HuNS1 ATCC CRL-8644

CHL ECACC No.87111906

最优选在无血清条件下建立、采用、完全培养寄主细胞，可选地在无任何动物源蛋白质/肽的培养基中培养寄主细胞。商业上可获得的培养基如Ham′s F12(Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium(DMEM；Sigma)、极限必需培养基(MEM；Sigma)、Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S-lnvtirogen)、无血清CHO培养基(Sigma)和无蛋白CHO培养基(Sigma)，均为代表性的适合的营养液。任何一种培养基必要时可用如下的多种化合物实例补充：荷尔蒙和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、类胰岛素生长因子)、盐(如氯化钠、钙盐、镁盐、磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苷、胸苷)、谷酰胺(glutamine)、葡萄糖或者其他等效能源(equivalent energysources)、抗生素和痕量元素。也可包括适合浓度的任何其他必要补充物，此对本领域技术人员是公知的。在本发明中，优选无血清培养基，但是补充有合适量的血清的培养基也可用于培养寄主细胞。为了表达选择基因的遗传修饰细胞的生长和选择，将合适的选择试剂加入培养基中。

此外，提供了一种药物组合物，该组合物包括上述限定的治疗有效量的huTNFR1-配体以及可选地选自由下述组成的组的一种或多种附加成分：药物学可接受载体、药物学可接受盐、助剂、稳定剂、稀释剂和溶剂，或者其中的任何组合。

根据另一个实施方案，上述限定的药物组合物用于治疗：风湿性关节炎、银屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性炎症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代谢病、急性神经退行性疾病、慢性神经退行性疾病(优选多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病)、以TNF/TNFR1作为致病介体(causative pathologic mediator)的基因遗传疾病(优选周期性发热综合症、颌骨增大症和癌)。

如上所述，本发明的huTNFR1-配体可进一步用于制备药剂，用于治疗任何TNF有关的疾病。

进一步提供用于治疗患有选自下述疾病的患者的方法：风湿性关节炎、银屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性炎症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代谢病、急性神经退行性疾病、慢性神经退行性疾病(优选多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病)、以TNF/TNFR1作为致病介体的基因遗传疾病(优选周期性发热综合症、颌骨增大症和癌)，该方法包括将治疗有效量的上述限定的huTNFR1-配体给药于所需患者的步骤。

根据本发明，上述限定的huTNFR1-配体可用于根据现有技术(Jespers等，1994，Biotechnology)的导向选择步骤，以分离来自人免疫球蛋白基因文库的功能等效性huTNFR1特异性抗体，从而进一步减小所述试剂的潜在免疫原(immunogenicity)。

因此，根据本发明的另一方面，提供huTNFR1-配体，该配体包括具有如下的蛋白质结构：(i)一种或多种人源氨基酸序列，该人源氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFR1-配体的免疫原应答，以及(ii)一种或多种氨基酸序列，该氨基酸序列能够选择性结合于huTNFR1，该huTNFR1是通过将上述限定的蛋白质结构用作模板导向选择而获得的。

此外，提供一种方法用于生产huTNFR1-配体，该配体当施用于人体时具有降低的免疫原应答，该方法包括以下步骤：(a)提供上述限定的蛋白质结构，(b)利用所述蛋白质结构的一种或多种氨基酸序列，特别是非人源氨基酸序列，作为模板，通过导向选择，识别能够选择性结合huTNFR1的一种或多种人源氨基酸序列，以及(c)构建所述配体，该配体包括在步骤(b)下识别的至少一种或多种氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及包括具有下述的蛋白质结构的huTNFR1-配体的用途：(i)一种或多种人源氨基酸序列，该人源氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFR1-配体的免疫原应答，以及(ii)一种或多种非人源氨基酸序列，该非人源氨基酸序列能够选择性结合于huTNFR1，在识别和构建另一低免疫原huTNFR1-配体中作为模板用于导向选择，该低免疫原huTNFR1-配体包括基本为或仅为人源的氨基酸序列。

附图说明

图1表示下述序列的比对：小鼠单抗抗体H398V_H和V_L序列、最接近人种系序列的V_H(VH1-69＝1-e＝DP-88)和V_L(A3＝DPK15)，以及通过CDR移植产生的人源化V_H和V_L序列(IZI-06.1VH，IZI-06.1VL)。H398和人种系序列之间不同的氨基酸用星号标记。表示出了框架区(FR)和互补决定区(CDRs)。

图2表示密码子优化的IZI-06.1VH和IZI-06.1VL(上道(lane))的DNA序列和相应氨基酸(下道)；各氨基酸始开始和末端的斜体字不属于IZI-06.1VH和IZI-06.1VL，而是涉及用于克隆/加工的氨基酸序列并包含某些限制酶的剪切位点。

图3表示H398FV(浅灰色)和IZI-06.1FV(深灰色)主链的重叠模型结构，a)两个模型结构的侧视图，b)CDR区H1-H3和L1-L3的俯视图。用WAM(Whitelegg和Rees，2000)产生模型，WAM-用于在(Web.5Prot.Eng.13，819-824)上模拟抗体的改进算法。结构通过Pymol可视化(DeLano Scientific，San Carlos，CA，USA)。

图4表示产生细菌载体以表达Fab片段的克隆方案。

图5a表示IMAC(1)准备后，利用非还原的12％的凝胶的SDSPAGE之后，在硝化纤维素上的蛋白质印迹(western blot)。经过根据标准程序的抗人Fab-AP、AP染色的检测，将15μL样品应用于凝胶。缩写：PP＝周质提取物，DL＝IMAC中的流动，W＝清洗组分(Wash fraction)，F＝组分(Fraction)。

图5b表示在12％凝胶上SDS PAGE后IMAC(1)纯化的考马斯染色。标记的左边部分表示非还原凝胶，右边部分表示在还原条件下的凝胶。样品体积为15μL。

图6表示结合于受体阳性细胞的IZI-06.1-Fab的饱和结合曲线和衍生的斯卡查德图。已减去非特异性结合。所得数据显示，结合TNFR1-Fas的IZI-06.1-Fab是饱和的和具有特异性的，其表观亲和力K_D等于0.778nM。

图7表示小鼠胚胎成纤维细胞的流式细胞术分析，其稳定表达由TNFR1的胞外域(ED)和死亡受体Fas的胞质域组成的嵌合受体，TNFR1-Fas(A)，或者由TNFR2-ED和Fas组成的嵌合受体(TNFR2-Fas)(B)，或者删除了TNFR1的半胱氨酸富集域(CRD)的嵌合受体，ΔCRD1-TNFR1-Fas(C和D)，或者CRD1交换突变体，该突变体由含有TNFR2的CRD1的TNFR1-Fas分子组成，CRD1_TNFR2-TNFR1-Fas(E和F)。这些转染子用2.5μg/ml的IZI-06.1-Fab(A-C、E，白色柱状图)、TNFR1特异性抗体mAb225(D和F，白色柱状图)、TNFR2特异性抗体80M2(B，白色加粗柱状图)在冰上孵育两小时，或者仅仅用二抗作为对照进行处理(灰色柱状图)。孵育缓冲液为PBA(PBS+0.05％牛血清白蛋白+0.02％NaN3)。细胞用FITC标记的二抗孵育(80M2和mAb225：山羊抗小鼠IgG；IZI-06.1Fab：山羊抗组氨酸标签(anti-HIS-tag))，细胞通过流式细胞术分析。对活细胞进行门控，并给出各抗体的总荧光密度(MnX)。(Con＝对照值)。

图8表示涉及由IZI-06.1.抑制TNFR1的图表。Kym I细胞在处理前一天接种于96孔板(在RPMI1640中10.000细胞/孔+5％FCS)。第二天将细胞用100ng/ml huTNF三倍稀释处理。对照为滴定PBS。16小时后细胞通过结晶紫实验分析。OD吸光度在550nm测得。将结果作为对照(PBS处理过的细胞)的百分数显示。上栏(Upper panel)：估计1.25ng/ml huTNF为足以诱导最大毒性的剂量。下栏(Lower panel)：25μg/ml H398、H398-Fab或人源化H398-Fab预孵育60分钟之后，应用1.25ng/ml恒量huTNF-，所有均以三倍稀释。16小时后细胞通过结晶紫实验分析。OD吸光度在550nm测得。将结果作为对照的百分数显示。

表9表示scFv IZI-06.1的组成是结构V_H-V_L(a)和V_L-V_H(b)以及scFv白蛋白融合蛋白质(c)。所有结构包含用于可溶性表达的N末端前导序列和六组氨酰标签(His6)，以及在scFv分子情况下的myc标签。接头序列显示为黑条。

根据本发明的huTNF R1-配体以高特异性结合人TNFR1，与该受体的CRD1相互作用。出乎意料地，huTNFR1-配体以非常高的特异性结合人TNFR1，远超出鼠源性抗体H398的特异性。因而，如上所述的人TNFR1-配体非常有效地防止TNFR1、TNF和LTα的配体天然产生的行为和生物活性，并优于现有技术中所述的鼠源性抗体H398的拮抗活性。由于人源氨基酸序列的含量，该配体具有有利的低免疫原性。因此，本发明的huTNFR1-配体允许治疗患有与TNFR1关联的疾病的患者，避免对配体产生急性不良反应和/或迅速产生免疫应答的风险，同时受益于针对huTNFR1的非人源氨基酸序列的高选择性和阻断效率。

具体实施方式

本发明将在下面实施例中进一步说明，但对本发明并没有任何限定。

实施例

实施例1：电子(in silico)生成基于小鼠单抗抗体H398序列和人种系IgV基因序列的抗TNF受体1拮抗剂

利用H398重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)(Moosmayer等，Ther.Immunol.，1995，No.2，p.31-40)氨基酸序列，在V base数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)和IgBlast中搜索相似的人种系V片段。该搜索识别出61.2-62.2％全相似性的几种V_H种系序列(DP75，DP8，DP88)以及80.0-81.0％相似性的几种V_L种系序列(DPK15，DPK13，DPK27，DPK28)。将所识别的序列与H398的V_H和V_L进行比对，CDR结构临界的氨基酸、V_H/V_L临界部分和游标区如所述识别(O′Brien S.，Jones T.，Antibody engineering，a lab manual，Springer，2001，p.567-590；Lo B.K.C，Antibodyengineering，methods and protocols，Humana Press，2004，p.135-159)。CDR区利用Kabat、Chothia、AbM和Contact的限定来指定(Martin A.C.R.，Antibody engineering，a lab manual，Springer，2001，p.422-439)。此外，L1-L3和H1-H2的规范分类确定如下：L1-4、L2-1、L3-1、H1-1、H2-3(Martin A.C.R.，Antibody engineering，a lab manual，Springer，2001，p.567-590)。对于CDR置换，CDRs限定如下：氨基酸L24-L34(CDRL1)、L46-L56(CDRL2)、L89-L97(CDRL3)、H26-H35(CDRH1)、H47-H65(CDRH3)和H95-H102(CDRH33)。我们选择V_H种系片段VH1-69(1-e，DP88)和V_L种系片段A3(DPK15)作为人受体序列。将所有的六个CDRs插入这些人可变种系片段(图1)。将所得特定序列分别指定为IZI-06.1VH(SEQ ID NO.：7)和IZI-06.1VL(SEQ ID NO.：8)。

实施例2：合成IZI-06.1VH和IZI-06.1VL的DNA序列

编码两个人源化可变区(IZI-06.1VH，(SEQ ID NO.：7)，IZI-06.1VL(SEQ ID NO.：8))的密码子优化DNA通过GeneArt(Regensburg，Germany)合成，并加入适当的克隆位点(图2)。

实施例3：H398和IZI-06.1Fv片段的模型结构

利用Web Antibody Modelling server(WAM)(Whitelegg N.R.J.，Rees A.R.，Web.Prot.Eng.，2000，No.13，p.819-824)产生H398和IZI-06.1Fv的模型结构。两个模型结构的比对显示出蛋白质主链和包括CDRs在内的侧链结构的高度一致性，除了CDRH3显示出轻微扭曲(图3)。这样，H398模型和IZI-06.1模型的CDRH3顶部的Asp96已从抗原结合口袋(pocket)移出约0.38nm。

实施例4：克隆IZI-06.1和构建单价Ig片段(Fab形式)

编码抗体IZI-06.1的可变重链和轻链区(V_H，V_L)的基因通过GeneArt合成，并插入含有适当克隆位点的载体pPCR-Script内(pPCR-Script-IZI-06.1-V_H，pPCR-Script-IZI-06.1-V_L)。为了克隆Fd片段(V_H-C_H1)(＝构建pAB1-IZI-06.1-Fd)，质粒pPCR-Script-IZI-06.1-V_H用限制酶Sfil和Xhol消化，将所得片段克隆入用相同酶消化的载体pAB1-C_H1中(含有人免疫球蛋白γ1重链的C_H1区的基因)。为了克隆轻链(V_L-C_L)(＝构建pAB1-IZI-06.1-L)，质粒pPCR-Script-IZI-06.1-V_L用限制酶Sfil和Ascl消化，将所得片段克隆入用相同酶消化的载体pAB1-C_H1(含有人C_？区的基因)。包括编码有核糖体结合位点(RBS)的载体和pelB前导序列的轻链基因是通过来自质粒pAB1-IZI-06.1-L的PCR、并利用引物A(5′-GAC CAT GAT TACGCC AAG CTT TCC ACG GCA TGC AAA TTC-3′)(SEQ ID NO.：11)和B(5′-ACG ACG GCC AGT TCT AGA TTA ACA CTC TCCCCT GTT GAA-3′)(SEQ ID NO.：12)来扩增。在该步中，分别在5′和3′末端引入Hindill和Xbal位点。PCR产物用限制酶Hindill和Xbal消化，并克隆入用相同酶消化的质粒pAB1-IZI-06.1-Fd中。这导致最终的细菌表达质粒pAB1-IZI-06.1-Fab，其编码抗体IZI-06.1的Fab片段，该抗体IZI-06.1包括Fd片段C-末端的六组氨酰标签。

实施例5：表达体系

载体：pAB1(Kontermann等，1997)

细胞：E.coli TG1(Stratagene，La Jolla，U.S.A.)

基本原理：根据标准步骤，在P_Lac调控下表达IZI-06.1-Fab，并进行IPTG诱导。通过加入氨苄青霉素(bla-Gen)完成筛选。

N-末端peLB前导序列允许周质表达靶基因产物，前者通过周质内的蛋白酶解加工从靶蛋白中去除。用EDTA和溶菌酶去稳定细菌细胞壁，将靶蛋白作为可溶性蛋白分离。剩余的细菌细胞用蔗糖/硫酸镁缓冲液以球芽形式维持渗透性稳定，避免细胞溶解。细胞通过离心被分离。

表达：

步骤：分批、摇瓶培养

预培养：50mL LB培养基加入100μg/mL氨苄青霉素和1％葡萄糖，接种一个大肠杆菌单菌落。30℃，摇床孵育(125rpm)，过夜。

主要培养：1L LB培养基加入100μg/mL氨苄青霉素和1％葡萄糖，接种5％(V/V)预培养物(pre-culture)。30℃摇床孵育(125rpm)。在OD₆₀₀(～3小时孵育时间)通过加入IPTG(1mM最终浓度)诱导蛋白质表达。表达时间为在25℃时3.5小时。

提取：在4000g时离心10分钟，收集培养物。重悬沉淀物(pellets)于50mL周质溶解缓冲液PPA(PPA：30mM Tris-HCl，1mM EDTA，20％蔗糖)中。加入50μg/mL溶菌酶，冰上孵育悬浮物30分钟。然后18.000g离心去除球芽。上清液(周质提取物)用200×体积PBS透析，过夜。

该表达/提取方案的典型收率为～1-2mg Fab IZI-06.1/L培养物。

实施例6：纯化

基本原理：用两个连续IMAC进行三步纯化方案，然后是尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography)(SEC)。IZI-06.1携带C-末端myc-His-标签(见pAB1，克隆策略)。第一和第二步纯化为IMAC(固定金属离子亲和色谱法)。His-标签内的组氨酸残基在琼脂糖基质上特异结合配体螯合的镍离子。第二步IMAC用于浓缩产物。SEC利用EPLC以半制备方式进行(Pharmacia，Germany)。该步根据表观分子量分离，允许分离靶蛋白较高分子量的集合物，以及较高和较低分子量的蛋白质和非蛋白质污染物。特别地，错折叠和/或非加工靶蛋白质IZI-06.1在SEC中显示较高的表观分子量，可从正确折叠的生物活性的产物中分离。

IMAC(1)：

柱：HiTrap 5mL(镍离子螯合)(Amersham Pharmacia)。

上样：4×50mL周质提取物(透析)。

流速：0.5-1.0mL/min

洗涤组分：25mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0；0.5M NaCl；25mM咪唑，5×体积_(柱)。

洗脱：25mM磷酸钠缓冲液pH 8.0；0.5M NaCl；500mM咪唑，

组分：8×3.5mL

IZI-06.1主要在组分2和3中洗提(图5a，5b)。

合并组分2-4并用500×体积PBS透析。所得透析液通过第二步IMAC浓缩(IMAC2)。

IMAC(2)：

柱：HiTrap 1mL(镍离子螯合)(Amersham Pharmacia)。

上样：2×3mL从IMAC(1)透析的组分(进行两次)。

流速：0.5-1.0mL/min

洗脱：25mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0；0.5M NaCl；500mM咪唑

组分：8×1.0mL

SEC/FPLC：

柱：Superdex 200(Pharmacia)

洗脱液：PBS(无菌过滤)

上样：200μL组分2或3，来自IMAC(2)

流速：0.25mL/min

组分：Nr.1-5：1mL，Nr.5-35：0.5mL

IZI-06.1Fab主要存在组分24/25中(通过生物测定的活性Fab)，少量在组分20/21中(较小活性的Fab，可能主要为错折叠蛋白质)。

实施例7：IZI-06.1Fab的功能活性

结合特征，通过等效结合研究确定结合亲和力：

为了确定对TNFR1的亲和力，在4℃用放射性标记的IZI-06.1Fab进行饱和结合研究。利用氯胺T法用¹²⁵I标记抗体。概括地说，室温下，10μg纯化蛋白质和3.7×10⁷贝克勒尔Na¹²⁵I以及氯胺T在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中孵育。用二硫化钠(Na-disulfite)和过量NaI终止反应，利用PD10柱(Pharmacia)通过凝胶过滤分离标记蛋白质。收集1毫升组分。在组分2和3中洗提蛋白质，游离¹²⁵I在组分7至9中检测。所得蛋白质浓度为2.7μg/mL，放射性为120.000cpm/ng。通过孵育恒量的带有增加数量的表达小鼠成纤维细胞的TNFR1-Fas的标记IZI-06.1Fab来确定生物活性材料。所得双曲线用于拟合通过线性回归的单位点结合方程，并且外推的最大结合值(B_max)表示生物活性材料的百分数(约10％)。来自该分析的数据用于计算在下述实验中所用的抗体浓度。

为了确定IZI-06.1Fab的亲和力(K_D值)，200.000个TNFR1-Fas阳性细胞在冰上孵育3小时，标记的IZI-06.1浓度增加(在150μl的总体积中2.5-50ng)。作为结合缓冲液，使用磷酸盐缓冲盐水+2％胎牛血清+0.02％NaN₃。通过共孵育具有未标记IZI-06.1各自浓度180倍的细胞来确定非特异性结合。结合的¹²⁵I-Fab用γ计数器确定，所得数据用于拟合单位点结合双曲线，该曲线含有饱和结合常数K_D：

结合量(Bound)＝(B_max×[IZIFab])/([IZIFab]+K_D)

数据的曲线配合适度是通过执行线性化变换来评价的，也称为斯卡查德图。所得数据显示，结合于TNFR1的IZI-06.1是饱和的和具有特异性的，表观亲和力K_D＝0.778nM。

结合特征，TNFR1选择性，通过受体区交换/删除的抗原决定部位定位和FACS分析：

His-标签阳性IZI-06.1-Fab用于确定分别为TNFR1结合或TNFR1-Fas结合的特异性，还用于表征通过抗体衍生物识别出的抗原决定部位。图7A表示间接的免疫荧光流式细胞计数术分析。相比于阴性对照，IZI-06.1-Fab阳性染色TNFR1-Fas嵌合体表达细胞(检测试剂：FITC标记的His特异性抗体。已知相比于使用TNFR1特异性mab225的间接IF(图7D)，相对低密度的染色的主要原因在于所用的不同的二次检测试剂(His-标签特异性检测抗体对抗小鼠Ig检测抗体))。相比于阴性对照，没有特异性结合出现于TNFR2-Fas表达细胞上，TNFR2特异性抗体80M2作为阳性对照(图7B)。没有特异性染色出现于TNFR1-Fas结构为阳性的细胞上，其中膜远端半胱氨酸富集区(CRD)已被去除(图7C)。不过，该结构易被另一TNFR1特异性mab，mab225检测出(图7D)。此外，没有特异性染色出现于表达功能性(信号活性)TNFR1-Fas结构的细胞上，其中膜远端CRD1已被TNFR2的置换(图7E)。再有，该受体嵌合体易被mab225检测出，已知其结合CRD1外侧的TNFR1。图7C-F中所示数据因而允许得出此结论：IZI-06.1识别TNFR1的CRD1。发明人知道，CRD1关键性地涉及到通过影响CRD2构造的TNF结合，后者连同CRD3提供其中一种配体直接接触位点(发明人未公开出版的资料)。

抑制TNF作用：

检测Kym-1人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)细胞系模型中纯化的IZI-06.1Fab的拮抗活性，其为TNF高度敏感(LD50低于100pg/ml sTNF，无需抑制蛋白质合成)，通过TNFR1和TNFR2应答(后者信号途径先前显示经由NF-κB信号传导诱导内生TNF表达，随后膜凋亡自养信号传导经由TNFR1表达TNF(Grell等.，EMBO J.，1999，No.18，p.3034-3043))。将IZI-06.1Fab的拮抗活性与小鼠mab H398和酶法制备的来自H398的Fab比较。图8显示通过IZI-06.1Fab由Kym-1细胞上细胞毒素行为介导的有效而完整的TNF阻断，与H398Fab相比，浓度低两倍至四倍。相比于较低浓度下的单价Fabs，如上述结果所期望的全长mab，显示较高的中和活性，可能由于二价试剂的较低解离速率(lower offrate)(较高亲和力)。重要的是，mab H398不会达到体外分析中在该灵敏度下的TNF活性完全阻断，因为在高浓度下它由拮抗剂转变为不完全激动剂。这可通过TNFR交联的剂量依赖性增加来解释，从而潜在形成配体独立性、功能性TNFR信号传导复合体(也参见Moosmayer等，Ther.Immunol.，1995，No.2，p.31-30)。

总之，根据本发明，其中一个惊人而想不到的关键特征是，TNFR1特异性拮抗剂IZI-06.1Fab显示出相比于现有的相同特异性的小鼠Fab的更优良的TNFR1阻断活性，并优于全长mab，这是由于其完全缺乏受体交联能力，即，IZI-06.1Fab缺乏任何固有的信号传导潜能，所以成为名副其实的TNFR1拮抗剂。

实施例8：单链IZI-06.1Fab及其衍生物

克隆和表达scFv IZI-06.1(V_H-V_L)：

scFv IZI-06.1(V_H-V_L)是通过两步法产生的：克隆入噬菌体载体pHEN2，引入编码的如下载体：15个残基接头(GGGGSGGGGSGGSAQ)(SEQ ID NO.：13)、N-末端pelB前导序列、C-末端myc标签、六组氨酰标签(His6)。为了可溶性表达，通过消化带有限制酶Sfil和Notl的pHEN2-scFv IZI-06.1(V_H-V_L)质粒DNA，将所得片段克隆入用相同酶消化的表达载体pAB1来获得scFv编码序列。表达和纯化如下进行：2L 2×TY、100μg/mL氨苄青霉素、0.1％葡萄糖，与20ml过夜培养的转化TG1接种，在37℃生长至指数期(OD₆₀₀＝0.8)。蛋白质表达通过加入1mM IPTG来诱导，在室温下让细菌再生长3小时。细胞通过离心收获，并悬浮于100ml 30mM Tris-HCl，pH 8.0，1mMEDTA，20％蔗糖中。加入5mg溶菌酶后，细胞在冰上孵育15至30分钟。加入10mM Mg₂SO₄后，细胞以10.000g在4℃下离心30分钟。上清液用PBS透析并负载于Ni-NTA柱上(Qiagen，Hilden，Germany)，该柱用50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，500mM NaCl，20mM咪唑进行平衡。清洗后(50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，500mM NaCl，35mM咪唑)，His标记的重组抗体片段用50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，500mM NaCl，100mM洗脱。合并蛋白质组分并用PBS透析。蛋白质浓度以分光光度确定并利用各蛋白质所计算的E值(E-value)进行计算。

克隆和表达scFv IZI-06.1白蛋白融合蛋白质：

scFv IZI-06.1(V_H-V_L)人白蛋白融合蛋白质是通过如下产生的：将DNA编码的来自质粒pAB1的scFv IZI-06.1(V_H-V_L)作为Sfil-Notl片段克隆入含有cDNA编码的人白蛋白的质粒pSecTagA-HAS中。质粒DNA用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)转染入HEK293细胞中。稳定转染子通过用博莱霉素Zeocin(300μg/ml)选择来产生。在RPMI，5％FCS至90％的汇合中扩增和生长细胞。针对蛋白质生产，细胞在Opti-MEM(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中培养，每三天置换培养基3-4次。合并上清液并通过硫酸铵沉淀法浓缩(60％饱和度)蛋白质，然后负载于Ni-NTA柱(Qiagen，Hilden，Germany)。通过IMAC的纯化如上所述进行。

序列表

<110>斯图加特大学

<120>huTNFR1选择性拮抗剂

<130>无

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>1

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Tyr Ile Asn

1 5 10

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>2

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly His Ala Tyr Tyr Asn Glu

1 5 10 15

Lys Phe Lys Ala

20

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>3

Trp Asp Phe Leu Asp Tyr

1 5

<210>4

<211>18

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

Trp Tyr

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>5

Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser AsnArg Phe Ser

1 5 10

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>6

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210>7

<211>115

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>IZI-06.1 VH-人源化抗体片段

<400>7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly His Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ala Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210>8

<211>113

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>IZI-06.1VL-人源化抗体片段

<400>8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210>9

<211>288

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>scFv IZI-06.1VH-VL-人源化抗体片段

<400>9

Met Lys Tyr Leu Leu pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

20 25 30

Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly His Ala

65 70 75 80

Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys

85 90 95

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Phe Leu Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg

165 170 175

Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp

180 185 190

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val

195 200 205

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

225 230 235 240

Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu

260 265 270

Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His

275 280 285

<210>10

<211>867

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>scFv IZI-06.1HSA融合蛋白

<400>10

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Pro Val Asp Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln

20 25 30

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys

35 40 45

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Tyr Ile Asn Trp Val Arg

50 55 60

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Tyr

65 70 75 80

Ser Gly His Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala Arg Val Thr Ile

85 90 95

Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

100 105 110

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Phe Leu

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser

165 170 175

Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr

180 185 190

Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

225 230 235 240

Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro

245 250 255

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe

275 280 285

Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe

290 295 300

Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val

305 310 315 320

Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala

325 330 335

Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

340 345 350

Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys

355 360 365

Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp

370 375 380

Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met

385 390 395 400

Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu

405 410 415

Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu

420 425 430

Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala

435 440 445

Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp

450 455 460

Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu

465 470 475 480

Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu

485 490 495

Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val

500 505 510

Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu

515 520 525

Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn

530 535 540

Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu

545 550 555 560

Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro

565 570 575

Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

580 585 590

Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Phe Leu

595 600 605

Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu

610 615 620

Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala

625 630 635 640

Ala Asp Phe His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro

645 650 655

Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe

660 665 670

Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr

675 680 685

Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser

690 695 700

Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala

705 710 715 720

Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln

725 730 735

Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys

740 745 750

Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu

755 760 765

Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe

770 775 780

Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile

785 790 795 800

Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala

805 810 815

Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

820 825 830

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu

835 840 845

Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Gly Gly His His His

850 855 860

His His His

865

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物A

<400>11

gaccatgatt acgccaagct ttccacggca tgcaaattc 39

<210>12

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B

<400>12

acgacggcca gttctagatt aacactctcc cctgttgaa 39

<210>13

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>残基接头

<400>13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln

1 5 10 15

<210>14

<211>345

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IZI-06.1VH-人源化抗体片段VH

<400>14

caggttcagc tggttcagag cggtgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc gatttctaca ttaactgggt gcgtcaggca 120

ccgggtcagg gcctggaatg gattggcgaa atttatccgt atagcggcca tgcatattac 180

aacgaaaaat tcaaagcgcg tgtgaccatt accgcggata aaagcaccag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgttgggat 300

tttctggatt attggggcca gggcaccacc gttacggtct cgagt 345

<210>15

<211>339

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>IZI-06.1VL-人源化抗体片段

<400>15

gatattgtga tgacccagag cccgctgtct ctgccggtca cgccgggtga accggcgagc 60

attagctgcc gtagcagcca gagcctgctg catagcaacg gcaacaccta tctgcattgg 120

tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataccgtgag caaccgtttt 180

agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggtagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240

agccgtgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgca gccagagcac ccatgtgccg 300

tatacctttg gcggtggcac caaagtggaa attaaacgt 339

<210>16

<211>867

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>scFv IZI-06.1-人源化抗体片段

<400>16

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60

atggcccagg ttcagctggt tcagagcggt gcggaagtga aaaaaccggg cagcagcgtg 120

aaagtgagct gcaaagcgag cggctatacc tttaccgatt tctacattaa ctgggtgcgt 180

caggcaccgg gtcagggcct ggaatggatt ggcgaaattt atccgtatag cggccatgca 240

tattacaacg aaaaattcaa agcgcgtgtg accattaccg cggataaaag caccagcacc 300

gcgtatatgg aactgagcag cctgcgtagc gaagataccg cggtgtatta ttgcgcgcgt 360

tgggattttc tggattattg gggccagggc accaccgtta cggtctcgag tggtggaggc 420

ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtagt gcacaagata ttgtgatgac ccagagcccg 480

ctgtctctgc cggtcacgcc gggtgaaccg gcgagcatta gctgccgtag cagccagagc 540

ctgctgcata gcaacggcaa cacctatctg cattggtatc tgcagaaacc gggccagagc 600

ccgcagctgc tgatttatac cgtgagcaac cgttttagcg gcgtgccgga tcgctttagc 660

ggcagcggta gcggcaccga ttttaccctg aaaattagcc gtgtggaagc ggaagatgtg 720

ggcgtgtatt attgcagcca gagcacccat gtgccgtata cctttggcgg tggcaccaaa 780

gtggaaatta aacgtgcggc cgcagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatggg 840

gccgcacatc accatcatca ccattaa 867

<210>17

<211>2604

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>scFv IZI-06.1HSA融合蛋白

<400>17

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccacc ggttgacgcg 60

gcccagccgg ccatggccca ggttcagctg gttcagagcg gtgcggaagt gaaaaaaccg 120

ggcagcagcg tgaaagtgag ctgcaaagcg agcggctata cctttaccga tttctacatt 180

aactgggtgc gtcaggcacc gggtcagggc ctggaatgga ttggcgaaat ttatccgtat 240

agcggccatg catattacaa cgaaaaattc aaagcgcgtg tgaccattac cgcggataaa 300

agcaccagca ccgcgtatat ggaactgagc agcctgcgta gcgaagatac cgcggtgtat 360

tattgcgcgc gttgggattt tctggattat tggggccagg gcaccaccgt tacggtctcg 420

agtggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggta gtgcacaaga tattgtgatg 480

acccagagcc cgctgtctct gccggtcacg ccgggtgaac cggcgagcat tagctgccgt 540

agcagccaga gcctgctgca tagcaacggc aacacctatc tgcattggta tctgcagaaa 600

ccgggccaga gcccgcagct gctgatttat accgtgagca accgttttag cggcgtgccg 660

gatcgcttta gcggcagcgg tagcggcacc gattttaccc tgaaaattag ccgtgtggaa 720

gcggaagatg tgggcgtgta ttattgcagc cagagcaccc atgtgccgta tacctttggc 780

ggtggcacca aagtggaaat taaacgtgcg gccgcaggtg gatcaggcgg tgatgcacac 840

aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat ttgggagaag aaaatttcaa agccttggtg 900

ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag tgtccatttg aagatcatgt aaaattagtg 960

aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt gttgctgatg agtcagctga aaattgtgac 1020

aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct tcgtgaaacc 1080

tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg agagaaatga atgcttcttg 1140

caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc cgattggtga gaccagaggt tgatgtgatg 1200

tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca tttttgaaaa aatacttata tgaaattgcc 1260

agaagacatc cttactttta tgccccggaa ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct 1320

gcttttacag aatgttgcca agctgctgat aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat 1380

gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct gccaaacaga gactcaagtg tgccagtctc 1440

caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca tgggcagtag ctcgcctgag ccagagattt 1500

cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag ttagtgacag atcttaccaa agtccacacg 1560

gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt gctgatgaca gggcggacct tgccaagtat 1620

atctgtgaaa atcaagattc gatctccagt aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg 1680

ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg gaaaatgatg agatgcctgc tgacttgcct 1740

tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag gatgtttgca aaaactatgc tgaggcaaag 1800

gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa tatgcaagaa ggcatcctga ttactctgtc 1860

gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat gaaaccactc tagagaagtg ctgtgccgct 1920

gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg ttcgatgaat ttaaacctct tgtggaagag 1980

cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag ctttttgagc agcttggaga gtacaaattc 2040

cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag aaagtacccc aagtgtcaac tccaactctt 2100

gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg ggcagcaaat gttgtaaaca tcctgaagca 2160

aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta tccgtggtcc tgaaccagtt atgtgtgttg 2220

catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc accaaatgct gcacagaatc cttggtgaac 2280

aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttcccaa agagtttaat 2340

gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata tgcacacttt ctgagaagga gagacaaatc 2400

aagaaacaaa ctgcacttgt tgagctcgtg aaacacaagc ccaaggcaac aaaagagcaa 2460

ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct tttgtagaga agtgctgcaa ggctgacgat 2520

aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa aaacttgttg ctgcaagtca agctgccggt 2580

ggccaccatc atcaccatca ctaa 2604

Claims

1.一种huTNFR1-配体，所述huTNFR1-配体包括具有以下的蛋白质结构：

(i)一种或多种人源氨基酸序列，所述人源氨基酸序列能够降低在人类中所述huTNFR1-配体的免疫原应答，以及

(ii)一种或多种非人源氨基酸序列，所述非人源氨基酸序列能够选择性地结合于huTNFR1。

2.根据权利要求1所述的huTNFR1-配体，其中所述蛋白质结构包括人源化抗体或者其至少一个片段。

3.根据权利要求2所述的huTNFR1-配体，其中所述至少一个片段选自由所述片段的Fab区、scFv、基因工程或翻译后加工的重组衍生物和所述片段的化学修饰衍生物组成的组。

4.根据权利要求3所述的huTNFR1-配体，其中所述至少一个片段是包含根据SEQ ID NO.：9的氨基酸序列的scFv。

5.根据权利要求1至4任一项所述的huTNFR1-配体，其中所述蛋白质结构包括一种或多种互补决定区(CDRs)，所述互补决定区选自由赋予与huTNFR1结合的SEQ ID NOs：1至6或其部分组成的组。

6.根据权利要求1至5任一项所述的huTNFR1-配体，其中所述蛋白质结构包括根据SEQ ID NO.：7的氨基酸序列作为重链可变区(VH)，以及根据SEQ ID NO.：8的氨基酸序列作为轻链可变区(VL)。

7.根据权利要求1至6任一项所述的huTNFR1-配体，其包括附加标签，所述附加标签允许与生物学上可接受的化合物特异性相互作用。

8.根据权利要求1至7任一项所述的huTNFR1-配体，所述蛋白质结构进一步包括通过翻译后化学接合或者通过重组基因技术非共价结合至其上或共价结合至其上的生物学上可接受的化合物。

9.根据权利要求8所述的huTNFR1-配体，其中所述生物学上可接受化合物选自由血清蛋白组成的组。

10.根据权利要求8或9所述的huTNFR1-配体，其中所述生物学上可接受化合物为白蛋白。

11.根据权利要求8至10任一项所述的huTNFR1-配体，其中所述蛋白质结构包括根据SEQ ID NO.：10的带有人血清白蛋白的融合蛋白。

12.一种编码根据权利要求1至11任一项所述的huTNFR1-配体的核酸。

13.一种载体，包括根据权利要求12所述的核酸序列。

14.一种寄主细胞，包含根据权利要求12所述的核酸或根据权利要求13所述的载体。

15.一种药物组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求1至11任一项所述的huTNFR1-配体，以及可选地选自由以下组成的组的一种或多种附加成分：药物学可接受载体、药物学可接受盐、助剂、稳定剂、稀释剂和溶剂，或其任何组合。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗：风湿性关节炎、银屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性炎症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代谢病、急性神经退行性疾病、慢性神经退行性疾病，优选选自多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病，以TNF/TNFR1作为致病介体的基因遗传疾病，优选选自周期性发热综合症、颌骨增大症和癌。

17.一种治疗患有选自下述的疾病的患者的方法：风湿性关节炎、银屑癣、克罗恩病、结肠炎溃疡以及其他慢性炎症和/或自身免疫性疾病、急性暴发性病毒或细菌性感染、代谢病、急性神经退行性疾病、慢性神经退行性疾病，优选选自多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病，以TNF/TNFR1作为致病介体的基因遗传疾病，优选选自周期性发热综合症、颌骨增大症和癌，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至11任一项所述的huTNFR1-配体给药于所需患者的步骤。

18.一种huTNFR1-配体，所述huTNFR1-配体包括具有以下的蛋白质结构：

(ii)一种或多种氨基酸序列，所述氨基酸序列能够选择性结合于huTNFR1，

所述huTNFR1-配体通过使用根据权利要求1至11任一项所述的蛋白质结构作为模板进行导向选择获得。

19.一种生产当施用于人类时具有降低的免疫原应答的huTNFR1-配体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据权利要求1至11任一项所述的蛋白质结构，

(b)利用蛋白质结构的一种或多种氨基酸序列，作为模板，通过导向选择，识别一种或多种能够选择性结合huTNFR1的人源氨基酸序列，以及

(c)构建包括在步骤(b)下识别的至少一种或多种氨基酸序列的所述配体。

20.包括具有下述的蛋白质结构的huTNFR1-配体的用途：

(ii)一种或多种非人源氨基酸序列，所述非人源氨基酸序列能够选择性结合于huTNFR1，

作为间质用于导向选择识别和构建另一低免疫原huTNFR1配体，所述低免疫原huTNFR1-配体基本上仅包括人源氨基酸序列。