CN101663403A - 基于微滴的过氧化氢测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改进的过氧化氢测定的方法，以及用来进行这些测定微滴执行机构。本发明的微滴执行机构用来进行基于微滴的过氧化氢测定。这些微滴执行机构还可以与用来分析本发明的过氧化氢测定的结果的检测器连接。这些微滴执行机构可以作为某些系统的组成元件，这些系统控制用来进行过氧化氢测定的微滴操作和/或检测。可利用检测器的测量结果确定样品中存在的被分析物的量。

Description

基于微滴的过氧化氢测定
授权信息
本发明依据美国国家卫生研究院授予的DK066956-02和GM072155-02受到政府支持。美国政府对本发明拥有部分权力
相关申请
除了本申请引用的专利申请以外，本专利申请还与下列申请相关，并主张其优先权：2007年3月5日递交的美国临时专利申请第60/892,971号，名称为“基于过氧化氢微滴的测定”，和2007年10月16日递交的美国临时专利申请第60/980,186，名称为“基于过氧化氢微滴的测定”，其全部内容作为参考并入本申请。
技术领域
本发明总体上涉及改进的过氧化氢测定领域。本发明特别涉及基于微滴的过氧化氢测定，以及用来进行这些测定的微滴执行机构。
背景技术
很多种测定都使用过氧化氢作为媒介物对目标分子进行间接分析。例如，对葡萄糖进行测量时，可利用葡萄糖氧化酶产生过氧化氢，并利用过氧化氢和过氧化物酶将一底物氧化，产生可检测到的信号，例如颜色变化。适合的可氧化底物包括Amplex Red(Invitrogen公司生产)和PS-ATTO(Lumigen公司生产)。本领域存在将过氧化氢分析小型化和/或加速的需要。
微滴执行机构被用来进行多种微滴操作。微滴执行机构通常包括一基板，并关联多个电极以便在基板的微滴操作表面上进行微滴操作。微滴执行机构还可具有顶板，一般将顶板与微滴操作表面平行设置并隔开，形成一个间隙，微滴操作就发生在该间隙中。间隙内可充满填充液，填充液不与微滴执行机构上被操作的流体相融。有必要扩展微滴执行机构的能力，使其能够进行基于过氧化氢测定。
发明内容
本发明提供一种改进的过氧化氢测定，以及用来进行这种测定的微滴执行机构。本发明的微滴执行机构可进行基于微滴的过氧化氢测定。
在一个实施例中，提供了一种通过过氧化氢测定对分析物进行检测的方法。该方法包括以下步骤：将过氧化氢测定试剂和样品结合到一微滴中，该微滴的体积在大约1nL至10μL之间，并在微滴中进行测定，产生可检测的信号。
在另一实施例中，提供了一种进行过氧化氢测定的方法，包括以下步骤：将过氧化氢测定试剂和样品结合到一微滴中，并在微滴中进行测定，产生可检测的信号，该测定产生一个基本上为线性的结果。
在另一实施例中，提供了一种进行过氧化氢测定的方法，包括以下步骤：将过氧化氢测定试剂和样品结合到一微滴中，并在微滴中进行测定，产生可检测的信号，其中，基本上所有的分析物都被消耗；对该信号进行检测；对该信号进行分析，确定分析物在样品中的量。
在另一实施例中，提供了一种利用单一检测器在单一微滴执行机构上检测多个分析物的方法。该方法包括以下步骤：提供一微滴执行机构装置，该微滴执行机构装置包括一基板，该基板上关联了多个用来在基板的微滴操作表面上进行微滴操作的多个电极，以及一个或多个与微滴操作表面连通的储槽，包括一种或多种用来进行测定的试剂，其中过氧化氢是中间物。
该方法还包括以下步骤：利用微滴操作将多个样品微滴与多个试剂结合，在单一微滴执行机构上进行多个过氧化氢测定。
定义
以下在本说明书中使用的术语具有如下含义。
“启动”指一个或多个电极结构使一个或多个电极的电气状态发生变化，并且导致一个微滴操作的产生。
“微滴”指微滴执行机构上具有一定体积的流体，它至少部分地被填充液约束。例如，微滴可以完全被填充液包绕或是被填充液和微滴执行机构的一个或多个表面约束。微滴的形状可以是多种多样的，非限定的例子大致包括：碟形、弹头形、截球形、椭圆形、球形、部分被压扁的形状、半球形、卵形、圆柱形、以及微滴操作期间形成的各种形状，例如融合或分离或是该形状与微滴执行机构的一个或多个表面接触时产生的形状。
“微滴操作”指任何对微滴执行机构上的微滴进行的操纵。例如，微滴操作可包括：将微滴加载到微滴执行机构上、由源微滴分出一个或多个微滴、将一个微滴分离、隔开或分割为两个或更多的微滴、将一个微滴由一个位置在运送至任意方向上的另一位置、将两个或更多微滴融合或结合为一个单一微滴、稀释一个微滴、混合一个微滴、搅拌一个微滴、将一微滴变形、将一个微滴保持在某一位置上、培养一个微滴、加热一个微滴、蒸发一个微滴、冷却一个微滴、处理掉一个微滴、将一个微滴运送至微滴执行机构之外、其他本说明书中描述的微滴操作；以及/或者上述操作的组合。类似于“融合”、“结合”的用语用来描述由两个或更多微滴产生一个微滴的过程。应该理解，当使用类似的用语描述两个或更多的微滴时，可以使用任何能够使两个或更多微滴结合到一个微滴中的微滴操作的组合。例如，可以通过以下操作实现“将微滴A与微滴B融合”：将微滴A运送到静止的微滴B处并与之接触、将微滴B运送到静止的微滴A处并与之接触、或运送微滴A和B使两者互相接触。用语“分离”、“隔开”和“分割”不用来专指操作后产生的微滴的某特定尺寸(即，操作产生的微滴的尺寸与原微滴的尺寸相同或不同均可)或是产生的微滴的某特定数量(操作产生的微滴的数量可以是2个、3个、4个、5个或更多)。用语“混合”在这里是指能够使微滴内一种或多种成分更为均匀地分布的微滴操作。“加载”微滴操作的实例包括微量渗析加载、压力辅助加载、自动加载、被动加载和移液加载。微滴操作可利用各种技术借助电极和/或电场进行，例如，电湿润和/或介电电泳。
用语“顶部”和“底部”在整个说明书仅仅是为了方便起见指微滴执行机构的顶部基板和底部基板，因为微滴执行机构的功能与其空间位置无关。
当本说明书中出现将某一特定元件，例如一个层、一个区域或一个基板置于另一元件“之上”的描述时，该元件可以是直接位于另一元件之上，或者可以同时存在多个介入元件(例如，一个或多个涂层、层、夹层、电极或触点)。还应理解，用语“置于...之上”和“形成于...之上”可以互换使用，都是用来描述某给定元件相对于另一元件是如何定位或放置的。因此，用语“置于...之上”和“形成于...之上”并非用来限定某种特殊的材料运送方法、放置方法或制造方法。
当任何形式的液体(例如，一个微滴或一个连续体，不论其是运动中的或是静止的)被描述为位于一电极、阵列、矩阵或表面“之上”、“处”或“上方”时，是指该液体既可能与该电极/阵列/矩阵/表面接触，也可能与插设于该液体和电极/阵列/矩阵/表面之间的层或膜接触。
当一个微滴被描述为“位于”或“加载于”一微滴执行机构“之上”时，应该理解为：该微滴以有助于利用该微滴执行机构对该微滴进行微滴操作的方式被布置在该微滴执行机构之上，该微滴以有助于感测来自微滴的信号或其性质的方式被布置在该微滴执行机构之上，并且/或者该微滴已经在微滴执行机构开始了微滴操作。
附图说明
图1是根据本发明一实施例提供基于过氧化氢的葡萄糖测定的各个方面。
图2是显示样品中与缓冲剂中信号产生速率的简图。
图3是测量样品中分析物(葡萄糖)的量的终点测定。
具体实施方式
本发明涉及改进的过氧化氢测定的方法，以及用来进行这些测定微滴执行机构。本发明的微滴执行机构用来进行基于微滴的过氧化氢测定。这些微滴执行机构还可以与用来分析本发明的过氧化氢测定的结果的检测器连接。这些微滴执行机构可以作为某些系统的组成元件，这些系统控制用来进行过氧化氢测定的微滴操作和/或检测。可利用检测器的测量结果确定样品中存在的被分析物的量。
1.1过氧化氢测定
总体来说，利用氧化酶在存在可氧化物的情况下产生过氧化氢。在存在过氧化物酶和过氧化氢的情况下，底物可被转化为一个信号分子。该信号分子可产生或被用于产生一个可测量的信号，例如颜色变化、化学发光或荧光。本发明提供一种基于微滴的过氧化氢分析，利用微滴操作将包含有可氧化分析物的样品微滴与一个或多个微滴结合，这些微滴包含氧化酶、过氧化物酶和可在存在过氧化物和过氧化物酶的情况下被用来产生一个信号分子的底物。例如，可利用一个或多个微滴操作搬运包含可氧化分析物的微滴，使其与一个或多个包含氧化酶、过氧化物酶和/或底物的微滴接触。可针对可氧化分析物选择特定的氧化酶，例如，为葡萄糖选择葡萄糖氧化酶。可针对底物选择特定的过氧化物酶，例如，辣根过氧化物酶。
作为举例，本发明可提供一种基于葡萄糖测定的过氧化氢，图1展示了该测定的各个方面。总体来说，将包含葡萄糖的样品在存在一定量的过氧化物酶与葡萄糖氧化酶结合，例如，辣根过氧化物酶和一个信号分子的情况下与葡萄糖氧化酶结合，以便产生可检测的信号。其他适合于利用本发明的过氧化氢测定进行检测的分析物包括：肌酸酐、乳酸、丙酮酸、胆红素、谷氨酸和其他血液中存在的代谢物。
本发明的测定可使用一底物，该底物在适宜的酶并具有过氧化氢的条件下产生信号分子。实例包括Lumigen公司提供的PS-ATTO(ultra)和Invitrogen公司提供的Amplex Red。信号分子可选择那些允许在微升或较小微滴内进行检测的，例如，通过吸光度、化学发光或荧光。
1.2微尺度过氧化氢测试
在一实施例中，本发明提供一种微尺度过氧化氢测定。在该实施例中，将样品与过氧化氢测定试剂在一微滴中结合。反应产生一信号，并且该信号被检测到。该信号用来确定样品中存在的目标分析物的量。过氧化氢测定试剂可以包括，例如，氧化酶、过量的过氧化物酶、以及可在过氧化氢和过氧化物酶存在的情况下转换为信号分子的底物。该试剂还可包括任何其他的适于加强反应的试剂或辅因子。
在一实施例中，反应在一部分或完全被油(例如硅油)包绕的微滴内进行。在另一实施例中，反应在微滴执行机构的表面上进行。可通过微滴操作将试剂在微滴执行机构的表面上结合。微滴执行机构还可包括一离开表面的顶板，从而行成一个间隙，微滴被设置于该间隙中。信号可在微滴还在微滴执行机构上时产生。还有，还可利用微滴操作将一个或多个包含一个或多个过氧化氢试剂的微滴在存在检测器的情况下与样品结合，从而捕获到最大量的信号。
在一实施例中，可使用超小的样品体积进行本发明的过氧化氢测定。在一实施例中，样品体积为大约1nL至大约10μL，或是大约10nL至大约1μL，或是小于大约500、400、300、200、100nL。类似地，反应体积也可以类似小。例如，在一实施例中，包括了样品和所有过氧化氢试剂的反应体积为大约1nL至大约10μL，或是大约10nL至大约1μL，或是小于大约500、400、300、200、100nL。
其他优点包括得到结果所需要的时间由于测定在微小规模下进行具有更快的动力学而缩短，而且由于是多路复用而提高了处理量。例如，在一实施例中，整个系统执行过氧化氢测定在小于大约5、4、3、2或1分钟完成、或小于大约45秒完成、或小于大约30秒完成。
1.3线性动力学的过氧化氢测定
图2是比较展示样品中信号产生速率与缓冲剂中信号产生速率的草图。使用了葡萄糖、葡萄糖氧化酶、过氧化氢、以及化学发光或荧光接收器。测定条件被设计为用来评估信号产生的初始速率。样品中所有的葡萄糖未被消耗，并且反应动力学位于一初始线性速率。实线代表缓冲剂中进行的反应。因为没有抵制剂，观察到的是直线的动力学与样品中的葡萄糖的量成正比。虚线代表血清中的反应。观察到初始速率中出现迟滞，估计是因为血清中存在抵制剂。在此例中，动力学的确变为线性，但是只能在初始的迟滞之后。举例来说，迟滞大约为1-5分钟。对于需要在若干秒内将样品中的分析物(葡萄糖)定量的应用来说，这种迟滞是不希望的。
本发明人令人惊奇地发现，通过提供过量的过氧化物酶，例如，辣根过氧化物酶，就可以在存在抵制剂的情况下克服初始迟滞现象。采用这种方式，可以减少或消除内源性抵制剂产生的影响。通过提高过氧化物酶的浓度，并将葡糖氧化酶的浓度固定，本发明人观察到血清呈现线性动力学。迟滞被减少到了无关紧要的程度。在一实施例中，整个过程采用大约1μg/ml至大约100μg/ml的HRP。在本实施例中，葡萄糖氧化酶可使用典型量，例如，大约200μg/ml。
在生物流体上进行基于过氧化物的测定时，例如血液、血清和血浆，生物流体中存在一些会干扰测定结果的线性的分子。例如，生物流体中可能会存在各种消耗反应成分或中间物或与其竞争的抵制剂或成分。举例如下：血红蛋白、抗坏血酸(维生素C)、胆红素、谷胱甘肽、以及过氧化氢酶。即使在存在干扰物质的情况下，本发明仍然能够提供一种产生能够可靠指示样品中分析物的量的线性信号。例如，本发明提供了一种在存在抵制物质的情况下进行过氧化氢测定以确定生物流体中分析物的量的方法，该方法产生大体上或基本上线性的结果。该基本上线性的结果可通过将包含分析物在内的样品与氧化酶、过量的过氧化物酶、以及可氧化的信号分子，例如Amplex Red得到。该过氧化物酶可过量提供，使其足以产生大体上或基本上线性的结果。
1.4瞬闪过氧化氢测定
图3所示为用来测量样品中分析物(葡萄糖)的量的终点(也称为“瞬闪”)测定。在所述终点测定中，所有的分析物都被消耗，并且信号基本上代表了样品中含有的分析物全部量。终点测定的反应动力学随着氧化酶和过氧化物酶升高而增加。反应在大约1-2分钟内完成。血清中内源的抵制剂的影响被降到了最小，因为分析物(如葡萄糖)与抵制剂在血清中的比率非常之高，以至于在整个信号输出中抵制剂的影响被降到最低和可被忽略。可在微滴执行机构中，直接在传感器下，进行终端测定的测量，以便使信号输出的捕获最大化。可利用微滴操作将血清与试剂结合，并且立即就可以捕获信号。在一实施例中，整个过程采用了大约1μg/ml至大约100μg/ml的过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)和超过大约200、300、400、500、600、700、800、900μg/ml，或超过大约1mg/ml的氧化酶(例如：葡糖氧化酶)。
1.5多重过氧化氢测定
使用共同的中间物过氧化氢提供了利用一个共同的中间物对多个分析物的分析和一个探测器方案。因此，本发明提供一种包括了利用过氧化氢测定用来分析多个易于分析的分析物的微滴执行机构。在一实施例中，通过微滴操作被结合的多个试剂微滴和样品微滴被提供于微滴执行机构上，以便进行多重过氧化氢测定。这些测定可以基本同时进行或依次进行。在一实施例中，依次进行测定，使每个测定都在单一检测器存在的情况下的进行。检测完成后，由于可以利用微滴操作将微滴运离检测器，因此可以利用微滴操作在检测器存在的情况下设定后续的测定。或者，可在检测器外设定后续的设定，然后被搬运到检测器处。微滴执行机构和/或检测装置可以电连接并由一处理器控制。例如，控制器可以被编程，通过控制微滴操作电极影响基于微滴的过氧化氢测定方案。在一实施例中，如果曲线开始不是线性的，可以依次开始和准备多重反应，直至曲线变为线性，这时可以利用微滴操作将他们依次移至检测器处。
2.微滴执行机构
举例来说，适合本发明使用的微滴执行机构见2005年6月28日授予Pamula等人的美国专利6,911,132，名称为“Apparatus for ManipulatingDroplets by Electrowetting-Based Techniques”；2006年1月30日递交的美国专利申请11/343,284，名称为“Apparatuses and Methods forManipulating Droplets on a Printed Circuit Board”；2004年8月10日授权的美国专利6,773,566，名称为“Electrostatic Actuators forMicrofluidics and Methods for Using Same”和2000年1月24日授权的美国专利6,565,727，名称为“Actuators for Microfluidics WithoutMoving Parts”，这两项专利均被授予Shenderov等人；以及Pollack等人于2006年12月11日提交的国际申请PCT/US2006/47486，发明名称为“Droplet-Based Biochemistry”。这些专利文献的公开内容作为参考并入本申请。
3.液体
对于本发明可用的液体样本参见上节中列出的专利文献，特别是2006年12月11日提交的国际申请PCT/US2006/47486，发明名称为“基于微滴的生物化学”(Droplet-Based Biochemistry)。在一些实施例中，该液体包括生物样品，例如全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰液、脑脊髓液、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、渗出液、渗出物、囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、排泄物样品、液化组织、液化有机体、生物棉签、生物冲洗液。
4.填充液
间隙通常被填充液填充。例如，这种填充液可以是一种低粘度油，例如硅油；或是一种气体，例如空气或惰性气体。填充液的其他例子见2006年12月11日提交的国际申请PCT/US2006/47486，发明名称为“基于微滴的生物化学”(Droplet-Based Biochemistry)，该国际申请的全部公开内容作为参考并入本申请。
结束语
以上结合附图对实施例进行了详细描述，附图中展示了本发明的一些特定实施例。其他一些具有不同结构和操作方式的实施例也在本发明的范围之内。
本说明书仅为了阅读方便而分为若干章节。这些章节标题不对本发明的范围构成限制。
应该理解本发明的一些细节可以变化而不脱离本发明的范围。此外，以上的详细说明仅仅是为了展示本发明，不对本发明构成限制，本发明由后附的权利要求定义

Claims (30)

1、一种进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于该方法包含以下步骤：将过氧化氢测定试剂和样品结合到体积范围在大约1nL至大约10μL的微滴中并在微滴中进行测定从而产生一可检测的信号。
2、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的过氧化氢测定试剂包括氧化酶、过氧化物酶和在过氧化物酶和过氧化氢存在的情况下产生一信号分子的基板。
3、根据权利要求2所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的过氧化物酶包括辣根过氧化物酶。
4、根据权利要求2所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的分析物包括葡萄糖和包括有葡萄糖氧化酶的该氧化酶。
5、根据权利要求2所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的样品包括生物流体并且该过氧化物酶的提供量按能够产生基本上为线性的结果提供。
6、根据权利要求5所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的结果具有小于5秒的延迟时间。
7、根据权利要求5所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的结果基本上没有延迟时间。
8、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的微滴具有范围在大约10nL至1μm的尺寸。
9、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其中所述的微滴具有范围在大约10nL至500nL的尺寸。
10、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的过氧化氢测定试剂与样品的结合包括利用一个或多个微滴操作将一个或多个样品微滴与一个或多个过氧化氢测定试剂结合。
11、根据权利要求10所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的一个或多个微滴操作包括一电极引起的微滴操作。
12、根据权利要求10所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的一个或多个微滴操作包括一电场引起的微滴操作。
13、根据权利要求10所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的一个或多个微滴操作包括一电湿润引起的微滴操作。
14、根据权利要求10所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的一个或多个微滴操作包括一电泳引起的微滴操作。
15、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的分析物选自在氧化酶存在的情况下易于产生过氧化氢的存在于血液中的代谢物。
16、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的分析物选自肌酐酸、乳酸、丙酮酸、胆红素、谷氨酸酯。
17、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的微滴被不与该微滴融合的填充流体部分或完全地包绕。
18、根据权利要求17所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的填充流体包括油。
19、根据权利要求17所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的填充流体包括硅油。
20、根据权利要求1所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其中所述的测定包括瞬闪测定，在该测定中基本上所有分析物都被消耗。
21、根据权利要求20所述的进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的用来进行瞬闪测定的样品和试剂在具有传感器的情况下在微滴执行机构上利用一个或多个微滴操作被结合。
22、一种进行过氧化氢测定的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：将过氧化氢测定试剂和样品结合到一微滴中并在微滴中进行测定从而产生一可检测的信号，所述的测定产生一个基本上为线性的结果。
23.一种进行用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(a)将过氧化氢测定试剂和样品结合到一微滴中并在微滴中进行测定从而产生一可检测的信号，其中，几乎所有的分析物都被消耗；
(b)检测所述信号；及
(c)分析所述信号，确定样品中分析物的量。
24、根据权利要求23所述的用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的用来进行测定的样品和试剂在具有传感器的情况下在微滴执行机构上利用一个或多个微滴操作被结合。
25、根据权利要求23所述的用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的基本上所有的分析物在大约5分钟内被消耗。
26、根据权利要求23所述的用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的基本上所有的分析物在大约2分钟内被消耗。
27、根据权利要求23所述的用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的样品包括生物样品。
28、根据权利要求23所述的用来检测一分析物的过氧化氢测定的方法，其特征在于其中所述的样品选血液、血清和血浆。
29、一种利用单一检测器检测单一微滴执行机构上的多重分析物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(a)提供一微滴执行机构装置，该装置包括：
(i)一基板，该基板包括用来在该基板的微滴操作表面上进行微滴操作的电极；和
(ii)一个或多个储槽，该储槽与包括有一个或多个试剂的该微滴操作表面通过流体连通，用来进行测定，在该测定中过氧化氢为一媒介物；及
(b)利用微滴操作将多重样品微滴与多重试剂结合以便在单一微滴执行机构上进行多重过氧化氢测定。
30、根据权利要求29所述的利用单一检测器检测单一微滴执行机构上的多重分析物的方法，其特征在于其中所述的测定反应依次开始，并且将呈现于检测器的时间定时，从而使微滴在该测定反应具有基本上为线性动力学的阶段呈现于检测器。
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