KR20100014670A - 과산화수소 액적에 기초한 분석평가법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개선된 과산화수소 분석평가 및 이러한 분석평가를 행하는 액적 작동기를 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 액적 작동기는 액적에 기초한 과산화수소 분석평가를 행하는 데 이용될 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 과산화수소 분석평가의 결과를 분석하기 위한 검출기와도 연관될 수 있다. 이들은 액적 작업을 제어하고/하거나 과산화수소 분석평가를 행하기 위한 검출을 행하는 시스템의 구성요소로서 제공될 수도 있다. 상기 검출기에 의한 측정은 샘플 중에서의 피분석물의 존재를 정량하는데 이용될 수 있다.
과산화수소 분석평가, 액적 작동기,

Description

과산화수소 액적에 기초한 분석평가법{HYDROGEN PEROXIDE DROPLET-BASED ASSAYS}
1. 관련 당국의 지원 정보
본 발명은 미국의 국립보건원에 의해 부여된 DK066956-02 및 GM072155-02 하의 정부 지원에 의해 이루어진 것이다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 소정의 권리를 지닌다.
2. 관련 출원
참조로 본원에 각각 원용된 여기에 인용된 특허 출원에 부가해서, 본 출원은 미국 가특허출원 제60/892,971호(출원일: 2007년 3월 5일, 발명의 명칭: "Hydrogen Peroxide Droplet-Based Assays") 및 미국 가특허출원 제60/980,186호(출원일: 2007년 10월 16일, 발명의 명칭: "Hydrogen Peroxide Droplet-Based Assays")와 관련된 것으로 이들을 우선권으로 주장하며, 이들 기초 출원의 개시 내용은 참조로 본원에 원용된다.
3. 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 개선된 과산화수소 분석평가(혹은 분석시험)(assay)의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 과산화수소 액적에 기초한 분석평가뿐만 아니라, 이러한 분석평가를 행하기 위한 액적 작동기(droplet actuator)에 관한 것이 다.
4. 발명의 배경 기술
각종 분석평가법은 표적 분자의 간접적인 분석을 위한 중간체로서 과산화수소를 이용한다. 예를 들어, 글루코스는 글루코스 산화효소를 이용해서 과산화수소를 생성하고, 당해 과산화수소를 과산화효소와 함께 이용해서 기질을 산화시켜 검출가능한 신호, 예컨대, 색 변화 등을 발생시킴으로써 측정될 수 있다. 이러한 산화가능한 기질의 예로는 암플렉스 레드(Amplex Red)(인비트로겐사(Invitrogen) 제품) 및 PS-ATTO(루미겐사(Lumigen) 제품)를 들 수 있다. 과산화수소 분석평가를 소형화하고/하거나 촉진시키기 위한 접근법이 당업계에 필요하다
액적 작동기는 광범위하게 다양한 액적 작업을 행하는 데 이용된다. 액적 작동기는 전형적으로 기판의 액적 작업 표면상에서 액적 작업을 수행하기 위해 배치된 전극과 관련된 당해 기판을 포함한다. 액적 작동기는, 그 안에서 액적 작업이 일어날 수 있는 간극을 형성하도록, 상기 액적 작업 표면으로부터 일반적으로 병렬 방식으로 이간된 상부 기판도 포함할 수 있다. 상기 간극은 액적 작동기 상에서 조작될 유체와 혼화되지 않는 필러 유체(filler fluid)로 충전될 수 있다. 과산화수소에 기초한 분석평가를 포함하는 액적 작동기의 능력을 확대할 필요가 있다.
5. 본 발명의 간단한 설명
본 발명은 개선된 과산화수소 분석평가 및 이러한 분석평가를 행하는 액적 작동기를 제공한다. 본 발명의 액적 작동기는 액적에 기초한 과산화수소 분석평가를 행하는 데 이용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 피분석물(analyte)을 검출하기 위한 과산화수소 분석평가를 행하는 방법이 제공된다. 이 방법은 과산화수소 분석평가 시약(hydrogen peroxide assay reagents)과 샘플을 약 1 nℓ 내지 약 10 ㎕의 범위의 체적을 지니는 액적 속에 배합시키는(combine) 단계; 및 상기 액적의 분석평가를 행하여 검출가능한 신호를 얻는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 과산화수소 분석평가를 행하는 방법이 제공되며, 이 방법은 과산화수소 분석평가 시약과 샘플을 액적 속에 배합시키는 단계; 및 상기 액적의 분석평가를 행하여 검출가능한 신호를 얻는 단계를 포함하되, 상기 분석평가는 실질적으로 선형 결과(substantially linear result)를 산출한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 피분석물을 검출하기 위한 과산화수소 분석평가를 행하는 다른 방법이 제공된다. 이 방법은 과산화수소 분석평가 시약과 샘플을 액적 속에 배합시키는 단계; 상기 액적의 분석평가를 행하여 검출가능한 신호를 얻는 단계로서, 이때 상기 피분석물의 거의 모두가 소비되는 것인 신호 획득 단계; 상기 신호를 검출하는 단계; 및 상기 신호를 분석하여 상기 샘플 중의 피분석물의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 단일의 검출기를 이용해서 단일의 액적 작동기 상에서 다수의 피분석물을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 기판의 액적 작업 표면상에서 액적 작업을 행하기 위하여 배치된 전극을 포함하는 기판; 및 과산화수소가 중간체인 분석평가를 행하기 위한 1종 이상의 시약을 포함하는 액적 작업 표면과 유체 연통하는 1개 이상의 저장소를 포함하는 액적 작동기 장치를 제공하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 액적 작업을 이용해서 다수의 샘플 액적을 다수의 시약과 배합하여 단일의 액적 작동기 상에서 다수의 과산화수소 분석평가를 행하는 단계를 추가로 포함한다.
6. 정의
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 이하의 용어는 표시된 의미를 지닌다.
1개 이상의 전극과 관련해서 "활성화하다"란 액적 작업에서 초래되는 1개 이상의 전극의 전기적 상태의 변화를 수행하는 것을 의미한다.
"액적"이란 필러 유체에 의해 적어도 부분적으로 둘러싸인 액적 작동기 상의 액체의 체적을 의미한다. 예를 들어, 액적은 필러 유체에 의해 완전히 둘러싸일 수 있거나, 혹은 필러 유체와 액적 작동기의 1개 이상의 면에 의해 둘러싸일 수 있다. 액적은 광범위하게 다양한 형상을 취할 수 있고; 그 형상의 비제한적인 예로는 일반적으로 원반 형상, 슬러그(slug) 형상, 절두된 구, 타원체, 구형상, 부분적으로 압착된 구, 반구, 계란형, 원통형 및 액적 작업 동안 형성된 각종 형상, 예컨대, 액적 작동기의 1개 이상의 면과 이러한 형상의 접촉 결과로서 형성되거나 융합되거나 분할된 바와 같은 형상을 들 수 있다.
"액적 작업"이란 액적 작동기 상에서의 액적의 임의의 조작(manipulation)을 의미한다. 액적 작업으로는, 예를 들어, 액적을 액적 작동기 속으로 반입(loading)하는 단계; 소스 액적으로부터 1개 이상의 액적을 분배하는 단계; 액적을 2개 이상의 액적으로 분리 혹은 분할 혹은 쪼개는 단계; 액적을 하나의 위치에서부터 임의의 방향의 다른 위치로 이송하는 단계; 2개 이상의 액적을 단일의 액적으로 융합하거나 배합하는 단계; 액적을 희석하는 단계; 액적을 혼합하는 단계; 액적을 교반하는 단계; 액적을 변형시키는 단계; 액적을 적소에 유지시키는 단계; 액적을 배양하는 단계; 액적을 가열하는 단계; 액적을 기화시키는 단계; 액적을 냉각시키는 단계; 액적을 배치시키는 단계; 액적 작동기로부터 액적을 이송하는 단계; 본 명세서에 기재된 기타 액적 작업; 및/또는 이들의 임의의 배합을 들 수 있다. "융합하다"(merge), "융합", "배합하다"(combine), "배합" 등의 용어는 2개 이상의 액적으로부터 1개의 액적을 작성하는 것을 기술하는 데 이용된다. 단, 이러한 용어가 2개 이상의 액적과 관련하여 이용될 경우, 2개 이상의 액적을 1개의 액적으로 배합한 결과를 얻는 데 충분한 액적 작업의 배합이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있음을 이해할 필요가 있다. 예를 들어, "액적 A를 액적 B와 융합"하는 것은 액적 A를 정지 상태의 액적 B와 접촉시켜 이송시키거나, 액적 B를 정지 상태의 액적 A와 접촉시켜 이송시키거나, 또는 액적 A 및 액적 B를 서로 접촉시켜 이송시킴으로써 실현될 수 있다. "분할", "분리" 및 "쪼갬"이란 용어는 얻어지는 액적의 크기(즉, 얻어지는 액적의 크기는 동일하거나 상이할 수 있음) 또는 얻어지는 액적의 개수(얻어지는 액적의 개수는 2, 3, 4, 5 이상일 수 있음)와 관련해서 임의의 특별한 성과를 의미하도록 의도된 것은 아니다. "혼합"이란 용어는 액적 내의 1개 이상의 성분의 더욱 균질한 분포를 가져오는 액적 작업을 의미한다. "반입" 액적 작업의 예로는, 미세 투석 반입, 압력 원조 반입, 로봇 반입, 수동 반입 및 피펫 반입 등을 들 수 있다. 액적 작업은, 예컨대, 전기습윤(electrowetting) 및/또는 유전영동(dielectrophoresis) 등의 각종 수법을 이용해서 전극 및/또는 전계에 의해 매개될 수 있다.
"상부" 및 "하부"란 용어는, 액적 작동기가 공간 내의 그의 위치에 관계없이 기능을 하므로, 단지 편의상 액적 작동기의 상부 기판 및 하부 기판과 관련한 설명 부분에서 이용된다.
층, 영역 혹은 기판(또는 기질) 등의 주어진 구성 요소(component)가 다른 구성 요소 "위"에 배치 혹은 형성되는 것으로 여기서 언급되고 있을 경우, 그 주어진 구성 요소는 다른 구성 요소 위에 직접 있을 수 있거나, 혹은 대안적으로는, 중개 구성 요소(예를 들어, 1개 이상의 피막, 층, 중간층, 전극 혹은 컨택트)도 존재할 수 있다. 또한, "위에 배치된" 및 "위에 형성된"이라는 용어는, 주어진 구성 요소가 다른 구성 요소와 관련해서 위치결정되거나 놓이는 방법을 기술하는 데 호환적으로 사용되는 것도 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, "위에 배치된" 및 "위에 형성된"이라는 용어는 재료 이송, 증착 혹은 제조의 특정 방법과 관련해서 어떠한 제한을 도입하기 위해 의도된 것은 아니다.
임의의 형태의 액체(예를 들어, 이동 중이든지 정지 상태이든지 간에 액적 혹은 연속체 등)가 전극, 어레이, 매트릭스(matrix) 혹은 표면 "위에"(혹은 "상에"), "에서" 혹은 "위쪽에" 있는 것으로 기술될 경우, 이러한 액체는 전극/어레이/매트릭스/표면과 직접 접촉하고 있을 수 있거나, 혹은, 당해 액체와 전극/어레이/매트릭스/표면 사이에 개입된 1개 이상의 층 혹은 막과 접촉하고 있을 수도 있다.
액적이 액적 작동기 "위에" 있거나 혹은 "위에 반입"되는 것으로 기술될 경우, 액적은 당해 액적에 대해 액적 작업을 수행하기 위하여 액적 작동기를 이용해서 용이하게 하는 방식으로 액적 작동기 위에 배열되고/되거나, 액적은 당해 액적으로부터 신호의 성질(즉, 특성)의 감지를 용이하게 하는 방식으로 액적 작동기 위에 배열되고/되거나, 액적은 액적 작동기 상에서 액적 작업을 받게 되는 것임을 이해할 필요가 있다.
7. 도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 과산화수소에 기초한 글루코스 분석평가를 제공하는 각종 양상을 예시한 도면;
도 2는 완충제 중에서의 신호 생성과 비교하여 샘플 중에서의 신호 생성 속도를 나타낸 속도 개요를 예시한 도면;
도 3은 샘플 중에서의 피분석물(글루코스)의 양을 측정하기 위한 종말점 분석평가를 예시한 도면.
8. 발명의 상세한 설명
본 발명은 개선된 과산화수소 분석평가 및 이러한 분석평가를 행하는 액적 작동기를 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 액적 작동기는 액적에 기초한 과 산화수소 분석평가를 행하는 데 이용될 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 과산화수소 분석평가의 결과를 분석하기 위한 검출기와도 연관될 수 있다. 이들은 액적 작업을 제어하고/제어하거나 과산화수소 분석평가를 행하기 위한 검출을 행하는 시스템의 구성요소로서 제공될 수도 있다. 상기 검출기에 의한 측정은 샘플 중에서의 피분석물의 존재를 정량하는데 이용될 수 있다.
8.1.1 과산화수소 분석평가
일반적으로, 산화가능한 피분석물의 존재에서의 산화효소는 과산화수소를 생성하는 데 이용된다. 과산화효소와 과산화수소의 존재 하에, 기질은 신호 분자로 변환될 수 있다. 상기 신호 분자는 예컨대, 색 변화, 화학발광 혹은 형광과 같은 측정가능한 신호를 생성하거나 혹은 이들을 생성하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은, 산화가능한 피분석물을 포함하는 샘플 액적이 산화효소, 과산화효소, 및 과산화효소와 과산화수소의 존재 하에 신호 분자를 생성하는 기질을 포함하는 1개 이상의 액적과 배합되는 것인 액적에 기초한 과산화수소 분석평가법을 제공한다. 예를 들어, 산화가능한 피분석물을 포함하는 액적은 하나 이상의 액적 작업을 이용해서 산화효소, 과산화효소, 및/또는 기질을 포함하는 1개 이상의 액적과 접촉시켜 이송될 수 있다. 상기 산화효소는 예컨대, 글루코스용의 글루코스 산화효소와 같이, 산화가능한 피분석물에 특이적으로 선택될 수 있다. 과산화효소는 기질에 특이적으로 선택될 수 있고, 예컨대 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)일 수 있다.
일례로서, 본 발명은 과산화수소에 기초한 글루코스 분석평가를 제공할 수 있고, 도 1 은 상기 분석평가의 각종 양상을 예시하고 있다. 일반적으로, 글루코스를 포함하는 샘플이 서양고추냉이 과산화효소 등과 같은 소정량의 과산화효소 및 검출가능한 신호를 생성하는 신호 분자의 존재 하에 글루코스 산화효소와 배합된다. 본 발명의 과산화수소 분석평가를 이용한 검출이 가능한 기타 적절한 피분석물의 예로는 크레아틴, 락트산염, 피루브산염, 빌리루빈, 글루탐산염, 및 혈액에 존재하는 기타 대사 산물을 들 수 있다.
적절한 효소 조건 하에 과산화수소의 존재 중에 신호 분자를 생성하는 기질이라면 어떠한 것이라도 본 발명의 분석평가에 이용될 수 있다. 그 예로는 루미겐사로부터의 PS-ATTO(울트라) 및 인비트로겐사로부터의 암플렉스 레드를 들 수 있다. 신호 분자는, 예컨대, 흡광도, 화학발광 및/또는 형광에 의해 마이크로리터 혹은 보다 소량의 액적의 검출을 허용하도록 선택될 수 있다.
8.1.2 미세규모( microscale )의 과산화수소 분석평가
일 실시예에 있어서, 본 발명은 미세규모의 과산화수소 분석평가를 제공한다. 본 실시예에 있어서, 샘플은 미소액적(microdroplet) 중의 과산화수소 분석평가 시약과 배합된다. 당해 반응은 신호를 생성하며, 이 신호는 검출된다. 상기 신호는 샘플 내에 존재하는 표적 피분석물의 양을 결정하는데 이용된다. 과산화수소 분석평가 시약은, 예를 들어, 산화효소, 과잉량의 과산화효소, 및 과산화수소와 과산화효소의 존재 하에 신호 분자로 변환될 수 있는 기질을 포함할 수 있다. 상기 시약은 또한 반응을 증강시키는데 적합한 임의의 추가의 시약 또는 보조인자를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 반응은 오일, 예컨대, 실리콘 오일에 의해 부분적으로 혹은 완전히 둘러싸인 액적 내에서 일어난다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 반응은 액적 작동기 표면상에서 일어난다. 상기 시약은 액적 작업을 이용해서 액적 작동기 표면상에서 배합될 수 있다. 상기 액적 작동기는 또한 그 안에 액적이 배열되는 간극을 형성하도록 상기 표면으로부터 이간된 상부 기판을 포함할 수도 있다. 신호의 검출은 액적이 액적 작동기상에 있는 상태에서 일어난다. 또한, 액적 작업은, 최대량의 신호가 포획될 수 있도록, 검출기의 존재 하에 상기 1종 이상의 과산화수소 시약을 포함하는 1개 이상의 액적을 샘플과 배합하는데 이용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 과산화수소 분석평가는 매우 작은 샘플 체적을 이용해서 수행될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 샘플 체적은 약 1 nℓ 내지 약 10 ㎕, 또는 약 10 nℓ 내지 약 1 ㎕, 또는 약 500, 400, 300, 200, 100 nℓ 미만의 범위이다. 반응 체적은 마찬가지로 작을 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에 있어서, 상기 샘플 및 모든 과산화수소 시약을 포함하는 반응 체적은 약 1 nℓ 내지 약 10 ㎕, 또는 약 10 nℓ 내지 약 1 ㎕, 또는 약 500, 400, 300, 200, 100 nℓ 미만의 범위이다.
기타 이점은 분석평가를 위한 소형화된 형식으로 보다 신속한 반응속도론으로 인한 결과로의 저감된 시간, 및 다중화(multiplexing)로 인한 보다 높은 처리량을 포함한다. 예를 들어, 일 실시예에 있어서, 상기 시스템은 약 5, 4, 3, 2 혹은 1분 미만, 또는 약 45 혹은 30 초 미만에서 과산화수소 분석평가를 수행한다.
8.1.3 실질적으로 선형 반응 속도를 지니는 과산화수소 분석평가
도 2 는 완충제 중에서의 신호 생성과 비교하여 샘플 중에서의 신호 생성 속도를 나타낸 속도 개요를 예시하고 있다. 글루코스, 글루코스 산화효소, 과산화수소효소, 및 화학발광 혹은 형광 수용체가 이용되었다. 이 분석평가 조건은 신호 생성의 초기 속도를 평가하도록 설계되었다. 샘플 중에서의 글루코스는 모두 소비되지 않았고, 반응 속도는 초기에 선형 속도였다. 실선은 완충제 중의 반응을 나타낸다. 저해제가 없기 때문에, 샘플 중의 글루코스의 양에 비례하는 직선 반응 속도가 관찰되었다. 점선은 혈청 중에서의 반응을 나타낸다. 초기 속도의 지연이 관찰되었고, 이것은 혈청 중의 저해제의 존재로 인한 것으로 생각된다. 이 샘플에 있어서, 반응속도는 초기 지연 후에만 선형으로 된다. 상기 지연은 예를 들어 1 내지 5분일 수 있다. 수초 내에 샘플 중에서의 피분석물(글루코스)의 양을 정량하는 바람직한 용도에 대해서, 이들 분석평가 조건은 바람직하지 않다.
본 발명자들은, 놀랍게도, 초기 지연이 과잉량의 과산화효소, 예컨대, 서양고추냉이 과산화효소를 제공함으로써 저해제의 존재 하에 해소될 수 있다는 것을 발견하였다. 이와 같이 해서, 내인성 저해제의 효과는 저감되거나 제거될 수 있다. 과산화효소 농도를 증가시킴으로써, 또한 글루코스 산화효소 농도를 일정하게 유지함으로써, 본 발명자들은 혈청 내에서 선형 반응속도를 관찰하였다. 지연은 중요하지 않은 점까지 최소화되었다. 일 실시예에 있어서, 상기 과정은 약 1 ug/㎖ 내지 약 100 μg/㎖ 범위에서 HRP를 이용한다. 본 실시예에 있어서, 글루코스 산화효소는 전형적인 양, 예컨대, 약 200 μg/㎖이다.
혈액, 혈청 및 혈장 등의 생물학적 유체에 대해서 과산화물에 기초한 분석평가를 행할 경우, 분석평가 결과의 직선성을 방해하는 분자가 생물학적 유체 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, 반응 성분 혹은 중간체와 경쟁하거나 소비할 수 있는 각종 저해제 혹은 성분이 생물학적 유체 중에 존재할 수도 있다. 그 예로는 헤모글로빈, 아스코르브산염(비타민 C), 빌리루빈, 글루타티온 및 카탈라제(catalase)를 들 수 있다. 본 발명은, 이러한 방해 물질이 존재하더라도, 샘플 중의 피분석물의 양을 확실하게 표시하는 선형 신호를 생성하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 방해 물질의 존재 하에 생물학적 유체 중의 피분석물의 양을 결정하기 위하여 과산화수소 분석평가를 행하는 방법을 제공하되, 이 방법은 일반적으로 혹은 실질적으로 선형 결과를 산출한다. 실질적으로 선형 결과는 피분석물을 포함하는 샘플을 산화효소, 과잉량의 과산화효소, 및 산화가능한 신호 분자, 예컨대, 암플렉스 레드와 배합함으로써 산출될 수 있다. 상기 과산화효소는 일반적으로 혹은 실질적으로 선형 결과를 얻기에 충분한 과잉량으로 제공될 수 있다.
8.1.4 플래시 과산화수소 분석평가
도 3 은 샘플 중에서의 피분석물(글루코스)의 양을 측정하기 위한 종말점('플래시'(flash)라는 용어로도 칭해짐) 분석평가를 예시하고 있다. 종말점 분석평가에 있어서, 피분석물이 모두 소비되고, 신호는 샘플 중에 포함된 피분석물의 전체량을 실질적으로 나타낸다. 종말점 분석평가에서의 반응 속도는 산화효소와 과산화효소의 양쪽 모두를 상승시킴으로써 증가된다. 당해 반응은 대략 1 내지 2분 내에 완결되었다. 혈청 중의 내인성 저해제의 효과는, 혈청 중의 저해제에 대한 피 분석물, 예컨대, 글루코스의 비가 저해제의 효과가 최소로 되어 전체 출력 신호에서 무시할 수 있는 정도로 높기 때문에 극히 적다. 종말점 분석평가의 측정은 센서 바로 밑에서 액적 작동기 중에서 수행될 수 있고, 따라서, 신호 출력의 포획을 최대화할 수 있다. 혈청과 시약은 액적 작업을 이용해서 배합될 수 있고, 신호의 포획은 즉시 일어날 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 과정은 약 1 ug/㎖ 내지 약 100 ug/㎖ 범위의 과산화효소(예컨대, 서양고추냉이 과산화효소)와 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ug/㎖를 초과하는 양 또는 약 1 mg/㎖를 초과하는 양의 산화효소(예컨대, 글루코스 산화효소)를 이용한다.
8.1.5 다중화된 과산화수소 분석평가
통상의 중간체인 과산화수소의 이용은, 하나의 통상의 중간체와 하나의 검출기 방식을 이용하는 다수의 피분석물의 분석을 제공한다. 따라서, 본 발명은 과산화수소 분석평가를 이용해서 분석하는 것이 가능한 다수의 피분석물을 분석하기 위한 시약을 포함하는 액적 작동기를 제공한다. 일 실시예에 있어서, 다수의 시약 액적과 샘플 액적은 액적 작동기 상에 제공되어 다수의 과산화수소 분석평가를 행하는 액적 작업을 이용해서 배합된다. 이 분석평가는 실질적으로 병렬 방식으로 혹은 순차적으로 수행될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 분석평가는 각 분석평가가 단일의 검출기의 존재 하에 수행될 수 있도록 순차로 수행된다. 검출 후에, 검출기로부터 떨어져 있는 액적 작업을 이용해서 액적으로서 반송될 수 있고, 후속의 분석평가는 액적 작업을 이용하는 검출기의 존재 하에 셋업될 수도 있다. 대안적으로, 분석평가는 검출기로부터 떨어져서 셋업되어, 당해 검출기의 실존 장 소로 이송될 수도 있다. 상기 액적 작동기 및/또는 검출 장치는 프로세서에 전자적으로 결합되어 당해 프로세서에 의해 제어될 수 있다. 상기 프로세서는, 예를 들어, 액적에 기초한 과산화수소 분석평가 프로토콜에 영향을 미치기 위하여 액적 작업 전극을 제어하도록 프로그램되어 있을 수 있다. 일 실시예에 있어서, 곡선이 초기에 선형이 아닌 경우, 다수의 반응이 순차 개시되어 당해 곡선이 선형으로 될 때까지 배양될 수 있고, 이 선형으로 되는 지점에서 액적 작업을 이용해서 검출기의 실존 장소로 순차 이송될 수 있다.
8.2 액적 작동기
본 발명에 이용하는 데 적합한 액적 작동기 구성의 예는 미국 특허 제6,911,132호(공고일: 2005년 6월 28일, 발명자: Pamula et al., 발명의 명칭: "Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques"); 미국 특허 출원 제11/343,284호(출원일: 2006년 1월 30일, 발명의 명칭: "Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board"); 미국 특허 제6,773,566호(공고일: 2004년 8월 10일, 발명자: Shenderov et al., 발명의 명칭: "Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same"); 미국 특허 제6,565,727호(공고일: 2000년 1월 24일, 발명자: Shenderov et al., 발명의 명칭: "Actuators for Microfluidics Without Moving Parts"); 및 국제 특허 출원 제PCT/US 06/47486호(출원일: 2006년 12월 11일, 발명자: Pollack et al., 발명의 명칭: "Droplet-Based Biochemistry")를 참조할 수 있고, 이들 개시 내용은 참조로 본원에 병합된다.
8.3 유체
본 발명의 접근법에 따라 유용한 샘플 유체의 예로는 상기 8.2 부문에 열거된 특허, 특히, 국제 특허 출원 제PCT/US 06/47486호(출원일: 2006년 12월 11일, 발명의 명칭: "Droplet-Based Biochemistry")를 참조하면 된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 유체는 생물학적 샘플, 예컨대, 전혈(whole blood), 림프 유체, 혈청, 혈장, 땀, 눈물, 타액, 가래, 뇌척수액, 약막액, 정액, 질 분비액, 장액(serous fluid), 윤활액, 심장막액, 복수(peritoneal fluid), 흉수, 누출액, 삼출액, 낭액(cystic fluid), 담즙, 소변, 위액, 장관액(intestinal fluid), 배설물 샘플, 유체화된 조직, 유체화된 유기체, 생물학적 약솜 및 생물학적 세정액이다.
8.4 필러 유체
본 발명의 분석 평가에 이용되는 액적은 필러 유체에 의해 완전히 혹은 부분적으로 둘러싸여 있을 수 있다. 상기 필러 유체는, 예를 들어, 실리콘 오일 등의 저점도 오일일 수 있다. 필러 유체의 기타 예는 국제 특허 출원 제PCT/US 06/47486호(출원일: 2006년 12월 11일, 발명의 명칭: "Droplet-Based Biochemistry")에서 제공된다.
9. 끝맺는 말
이상의 실시예의 상세한 설명은, 본 발명의 구체적인 실시예를 예시한 첨부 도면을 참조하고 있다. 상이한 구조 및 작동을 구비한 기타 실시예는 본 발명의 범주로부터 벗어나는 것은 아니다.
본 명세서는 단지 독자의 편의를 위해 각 부분으로 분할되어 있다. 표제는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안된다.
단, 본 발명의 각종 상세는 본 발명의 범주로부터 벗어나는 일없이 변경될 수 있다. 또한, 위에서 서술된 내용은 단지 설명을 목적으로 한 것일 뿐, 제한의 목적으로 제시된 것은 아니며, 본 발명은 이하의 청구의 범위에 의해 규정된다.

Claims (30)

  1. 피분석물(analyte)을 검출하기 위하여 과산화수소 분석평가(assay)를 행하는 방법으로서,
    과산화수소 분석평가 시약(hydrogen peroxide assay reagents)과 샘플을 약 1 nℓ 내지 약 10 ㎕의 범위의 체적을 지니는 액적(droplet) 속에 배합시키는(combine) 단계; 및
    상기 액적의 분석평가를 행하여 검출가능한 신호를 얻는 단계를 포함하는 과산화수소 분석평가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 과산화수소 분석평가 시약은 산화효소, 과산화효소, 및 과산화효소와 과산화수소의 존재 하에 신호 분자를 생성하는 기질을 포함하는 것인, 과산화수소 분석평가 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 과산화효소는 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)를 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 피분석물은 글루코스를 포함하고, 상기 산화효소는 글루코스 산화효소를 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 유체를 포함하고, 상기 과산화효소는 실질적으로 선형 결과를 산출하는 양으로 제공되는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 결과는 적어도 5초 미만인 지연 시간(lag time)을 지니는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 결과는 실질적으로 지연 시간을 지니지 않는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 액적은 약 10 nℓ 내지 약 1 ㎕의 범위의 크기를 지니는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 액적은 약 1 nℓ 내지 약 500 nℓ의 범위의 크기를 지니는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 과산화수소 분석평가 시약과 샘플을 배합하는 단계는 하나 이상의 액적 작업(droplet operations)을 이용해서 1개 이상의 샘플 액적을 1종 이상의 과산화수소 분석평가 시약과 배합하는 단계를 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 액적 작업은 전극 매개(electrode mediated) 액적 작업을 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  12. 제10항에 있어서, 하나 이상의 액적 작업은 전계 매개 액적 작업을 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  13. 제10항에 있어서, 하나 이상의 액적 작업은 전기습윤 매개(electrowetting mediated) 액적 작업을 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  14. 제10항에 있어서, 하나 이상의 액적 작업은 전기영동 매개 액적 작업을 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 산화효소의 존재 하에 과산화수소의 생성이 가능한 혈액 중에 존재하는 대사 산물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 크레아틴, 락트산염, 피루브산염, 빌리루빈 및 글루탐산염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 액적은 당해 액적과 혼화되지 않는 필러 유체(filler fluid)에 의해 부분적으로 혹은 완전히 둘러싸여 잇는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 필러 유체는 오일을 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 필러 유체는 실리콘 오일을 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 분석평가는 상기 피분석물의 실질적으로 모두가 소비되는 플래시 분석평가(flash assay)를 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 플래시 분석평가를 행하기 위한 상기 샘플과 시약은 하나 이상의 액적 작업을 이용해서 액적 작동기 상에서 센서의 존재 하에 배합되는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  22. 과산화수소 분석평가를 행하기 위한 방법으로서,
    과산화수소 분석평가 시약과 샘플을 액적 속에 배합시키는 단계; 및
    상기 액적의 분석평가를 행하여 검출가능한 신호를 얻는 단계로서, 이때 상기 분석평가는 실질적으로 선형 결과를 산출하는 것인 신호 획득 단계를 포함하는 과산화수소 분석평가 방법.
  23. 피분석물을 검출하기 위한 과산화수소 분석평가를 행하기 위한 방법으로서,
    (a) 과산화수소 분석평가 시약과 샘플을 액적 속에 배합시키고, 상기 액적의 분석평가를 행하여 검출가능한 신호를 얻는 단계로서, 이때 상기 피분석물의 거의 모두가 소비되는 것인 신호 획득 단계;
    (b) 상기 신호를 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 신호를 분석하여 상기 샘플 중의 피분석물의 양을 결정하는 단계를 포함하는 과산화수소 분석평가 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 분석평가를 행하기 위한 상기 샘플과 시약은 하나 이상의 액적 작업을 이용해서 액적 작동기 상에서 센서의 존재 하에 배합되는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 피분석물의 실질적으로 모두는 약 5분 미만에 소비되는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 피분석물의 실질적으로 모두는 약 2분 미만에 소비되 는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 샘플을 포함하는 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 과산화수소 분석평가 방법.
  29. 단일의 검출기를 이용해서 단일의 액적 작동기 상에서의 다수의 피분석물을 검출하는 방법으로서,
    (a) (i) 기판의 액적 작업 표면 상에서 액적 작업을 행하기 위하여 배치된 전극을 포함하는 기판; 및
    (ii) 과산화수소가 중간체인 분석평가를 행하기 위한 1종 이상의 시약을 포함하는 액적 작업 표면과 유체 연통하는 1개 이상의 저장소
    를 포함하는 액적 작동기 장치를 제공하는 단계; 및
    (b) 액적 작업을 이용해서 다수의 샘플 액적을 다수의 시약과 배합하여 단일의 액적 작동기 상에서 다수의 과산화수소 분석평가를 행하는 단계를 포함하는, 단일의 검출기를 이용한 단일의 액적 작동기상에서의 다수의 피분석물의 검출방법.
  30. 제29항에 있어서, 분석평가 반응은 순차 개시되고, 검출기에의 제공은, 실질 적으로 선형 반응속도를 지니는 분석평가 반응의 상(phase) 동안 액적이 제공되도록 시간 조절되는 것인, 단일의 검출기를 이용한 단일의 액적 작동기상에서의 다수의 피분석물의 검출방법.
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