CN101653749A - 灌流用平板式沉降离心机 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于回收生物反应器内悬浮培养细胞的灌流用平板式沉降离心机。该离心机机盖上设有伸入转鼓内的进料/回收管、撇液管、培养基输送管及喷淋孔，均通过T型阀组分别与生物反应器、上清液储罐和培养基储罐连接。传动主轴与转鼓腔的连接采用骨架密封、机械密封、水密封和机械密封等四种密封串联。转鼓腔及各连接管可在位蒸汽灭菌。生物反应器内的培养物经进料/回收管送入转鼓，离心后细胞沉积于转鼓壁，上清液经撇液管吸出，培养基经培养基输送管及喷淋孔淋洗缓慢转动的转鼓壁上的沉积细胞，经回收/进料管将悬起的细胞回输生物反应器内。

Description

灌流用平板式沉降离心机

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种用于回收生物反应器内悬浮培养细胞的灌流用平板式沉降离心机

背景技术

动物细胞培养一般分为批式培养和连续灌流培养二种模式。与批式培养相比，灌流培养可以补充细胞生长所需的均衡营养、降低细胞生成的抑制细胞增殖和目的蛋白表达的代谢产物，提高细胞密度，增加单个细胞的目的蛋白产率，延长细胞培养周期，大幅度提高生物反应器的体积产率。在灌流培养工艺中，细胞的截留是一个十分重要的环节。

现有的细胞截留设备主要有罐内(外)旋转滤器、声场细胞截留装置、倾斜式细胞重力沉降器等。旋转滤器用于截留细胞的优点是操作方便，国外多家生物反应器制造商如荷兰Appllicon、德国Sartorius、瑞士Bioengineering和美国NBS已在小规格的生物反应器上广泛使用，但灌流过程中易漏出细胞和堵塞滤器，使灌流培养中断。Trampler.F(US5626767)Acoustic filter for separating and recyclingsuspended particles报道的声场细胞截留装置、谭文松等(ZL200310109264.2)和谭文松等(ZL200610118405.0)报道的细胞重力沉降装置的优点是没有机械力对细胞的损伤，可连续运行，但物料处理量有限，也在一定程度上存在细胞漏出。

离心分离装置是实现细胞培养物的固液分离的有效方法。刘长星(ZL94227190.4)、K.斯特罗肯等(ZL99807460.8)和孙富一(ZL200820012627.9)报道的普通转鼓式离心机为开放式运行，无法实现无菌分离，也无法与生物反应器的对接用于细胞灌流培养。普通转子式离心机中的离心杯虽可无菌密闭，但容量受限，不适合大体积培养物的离心分离，也无法实现沉淀细胞的自动重悬和回收。

本发明设计了一种新型离心机，利用离心机有效实现固液分离的优点，克服离心机开放运行和容量受限的缺点，设计清除上请和重悬回收细胞的装置，以用于生物反应器的连续灌流培养。

发明内容

为克服现有细胞截留装置和普通沉降式离心机用于生物反应器灌流培养的不足，本发明提供了一种平板式沉降离心机，本发明的平板式沉降离心机可用于生物反应器的细胞灌流培养，本发明还提供了平板式沉降离心机用于生物反应器细胞灌流培养的方法。该离心机可实现包括机腔4、转鼓5和外连管道9、10、12的在位蒸汽灭菌，可以清除细胞培养液离心上清7，可以用新鲜培养基重悬沉淀细胞6并将细胞回输生物反应器内。

本发明的灌流培用平板沉降式离心机结构中包括了一般沉降式离心机中的机盖8、固定螺栓16、转鼓5、底盘2、传动组1及控制装置等部件，还包括在机盖上安装的蒸汽输入管13、蒸汽压力表11，传动主轴17与离心机腔4之间的骨架密封22、机械密封21、水密封20和机械密封18等四种串联密封；还包括伸入转鼓内的进料/回收管11、撇液管10、培养基输送管12及喷淋管15，各管道通过T型阀组分别与生物反应器、上清液储罐和培养基储罐连接。纯蒸汽通过机盖上的蒸汽输入管13进入离心机腔4体和转鼓5腔，蒸汽压力表11显示离心机腔内压力，在0.15Mpa维持20min，即达到彻底保压在位灭菌的目的。进料/回收管伸至转鼓凹槽内，以减少输入的细胞培养物与转鼓的撞击，同时最大限度地回收重悬的细胞悬液。撇液管10伸向转鼓侧壁，撇液管与转鼓侧壁的距离可调，以吸取因不同细胞密度和不同体积的培养物而形成的不同厚度沉积细胞6表面的培养上清7。培养基输送管12的末端在转鼓内与转鼓内壁平行，称为喷淋管15，其外侧每间隔5cm有一个0.5mm的喷淋孔24，培养基的喷出速度可达1m/秒以上，淋洗缓慢转动的转鼓5侧壁上的沉积细胞6。

进料/回收管11、撇液管10和培养基输送管12均通过快接法兰分别与接有T形阀组的生物反应器、培养上清液储罐和培养基储罐连接。离心机灭菌时，打开T形阀组的蒸汽阀门，彻底灭菌这些管路。该离心机可保证转鼓5、离心机腔4和连接管路9、10、12彻底灭菌。

传动主轴17与离心机腔4的结合处采用骨架密封22、机械密封21、水密封20和机械密封18等四种密封串联。离心机灭菌前先用蒸汽灭菌水密封15min，再启动输送泵使灭菌水自上19而下23通过灭菌的水密封。机盖与机体的结合处装有密封圈，备有固定螺栓16。该离心机可保证无菌密闭运行

本发明提供的灌流用平板式沉降离心机用于生物反应器的细胞灌流培养。

本发明提供了灌流用平板式沉降离心机用于生物反应器细胞灌流培养的方法。

本发明的优点在于：

(1)细胞回收率高。灌流装置的目的就是回收培养液中的细胞。本发明的离心机可通过调节离心转速和离心时间，充分沉淀悬浮细胞，使细胞回收率达99％以上。

(2)细胞的应力损伤小。离心机在250-600g的范围内运行，以及对沉淀细胞的喷淋洗脱，对细胞的应力损伤很小。实验表明回收细胞的生物学特性与正常培养细胞没有差异。

(3)培养上清可直接用于后续的分离纯化。撇出上清的澄清度高，可直接用于后续的超滤浓缩或柱层析分离。

(4)处理量大，易于放大。该发明的离心机可根据离心物料量和物料细胞密度，调整转鼓内撇液管与转鼓壁的距离，重复离心和撇出上清，最后一次洗脱回收细胞。因此，可一次处理离心机额定容积5-10倍的培养物体积。同时该离心机可通过增大转鼓体积，增加额定容积，易于放大，用于更大体积的生物反应器灌流培养。

(5)应用范围广。该发明的灌流沉降式离心机采用离心沉降原理实现固液分离，不仅适用于动物细胞的灌流培养，还可应用于其它类似的培养体系，实现回收细胞的继续培养。

附图说明

图1：灌流用平板式沉降离心机结构示意图

1传动组，2底盘，3机壳，4机腔，5转鼓，6沉淀细胞，7上清，8机盖，9撇液管，10进料/回收管，11压力表，12培养基输送管，13蒸汽管，14密封连接，15喷淋管，16固定螺栓

图2：传动主轴与离心机腔的密封连接

密封连接的放大图17传动主轴，18机械密封，19进水口，20水密封，21机械密封，22骨架密封，23出水口

图3：培养基输送管及喷淋孔

喷淋管的放大图 15喷淋管，24喷淋孔

具体实施方式

为进一步了解本实用新型离心设备的结构和使用，结合附图说明如下：

使用前首先备好灭菌的带T形阀组和快接法兰的生物反应器、上清液储罐和培养基储罐，各T形阀组通过快接法兰分别与离心机的进料/回收管10、撇液管9和培养基输送管12连接，T形阀组的蒸汽出口通过疏水阀接冷凝水管道。

首先灭菌水密封20。打开连接水密封的蒸汽阀门，灭菌15min。

灭菌离心机和连接管路。打开连接离心机的蒸汽阀门，以及各T形阀组的蒸汽开关，离心机腔4压力上升，至读数达0.15Mpa，保压20min。关闭各T形阀组的蒸汽阀门，自然冷却。

打开连接进料/回收管10上T形阀组的管路阀门，生物反应器通过进料/回收管10向离心机转鼓5内输入额定体积的细胞培养物，关闭该管路阀门。开启离心机，转速至1000-2000转/分钟，离心10min后，打开连接上清液储罐的管路阀门，通过撇液管9吸出离心上清7至上清液储罐，关闭该管路。可连续重复上述操作，根据生物量计算沉积细胞厚度，对照撇液管10与转鼓壁5的距离，决定重复次数。上清7吸除后，打开连接培养基管路的阀门，通过培养基输送管12和喷淋管15、喷淋孔25喷射新鲜培养基，低速转动转鼓5，洗脱转鼓壁上的沉淀细胞6，关闭该管路阀门。最后，打开回收/进料管11的管路阀门，通过回收/进料管11回收重悬的细胞培养物，回输生物反应器，完成一次完整的灌流操作。

下面通过实施例进一步说明本发明。应该解释的是，本发明实施例的方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：

本发明的一种规格的灌流离心机与30升生物反应器组合用于表达抗CD20抗原的重组单抗的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞的灌流培养。

灌流离心机主要参数：转鼓额定容积：8升，转鼓直径：300mm，转速：0-3000转/分钟。

细胞：表达抗CD20重组单抗的CHO工程细胞，在T25方瓶中置37℃含5％二氧化碳的培养箱传代培养。首先接种于5升生物反应器，至细胞密度达3×10⁶/ml转接于30升生物反应器，培养体积25升。

培养基：HyClone公司的HyQ SFM4CHO

灌流培养过程：细胞密度至3×10⁶/ml，每天灌流培养体积的三分之一，约8升，再用新鲜培养基补至原体积；细胞密度至6×10⁶/ml，每天灌流培养体积的三分之二，约16升，再用新鲜培养基补至原体积；细胞密度达1.2×10⁷/ml，每天按1个培养体积灌流，约25升，再用新鲜培养基补至原体积；细胞密度稳定在1.2×10⁷/ml附近，此时抗CD20重组单抗浓度稳定在600μg/ml；连续灌流培养20天，收获上清中的抗体总量为52g。每次灌流细胞回收率均大于99％。

Claims (9)

1.一种灌流用平板式沉降离心机，它包括机壳(3)、机盖(8)、固定螺栓(16)、底盘(2)、机腔(4)、转鼓(5)、密封连接(14)、传动组(1)及控制装置等部件，其特征在于机盖上安装有蒸汽输入管(13)、蒸汽压力表(11)，和深入转鼓内的进料/回收管(10)、撇液管(9)、培养基输送管(12)，这些管道通过T形阀组分别与生物反应器、上清液储罐和培养基储罐连接。

2.根据权利要求1所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于通过机盖上的进料/回收管(10)，可以将生物反应器内的细胞培养物导入转鼓(5)离心分离细胞，还可以将用新鲜培养基重悬的沉淀细胞(6)悬液送回生物反应器。

3.根据权利要求1-2之一所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于撇液管末端与转鼓壁的距离可根据沉淀细胞(6)的厚度调整。

4.根据权利要求1-3之一所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于通过机盖上的培养基输送管(12)和喷淋管(15)、喷淋孔(25)，可以用新鲜培养基淋洗转鼓壁上的沉淀细胞(6)，细胞悬液汇集于转鼓底部。

5.根据权利要求1-4之一所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于通过机盖与机身之间的密封圈，传动主轴(17)与离心机腔(4)之间的密封连接，可实现无菌封闭运行。

6.根据权利要求1-5之一所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于传动主轴(17)与离心机腔之间的密封连采用骨架密封(22)、机械密封(21)、水密封(20)和机械密封(18)等四种串联密封接通。

7.根据权利要求1-6之一所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于通过机盖上的蒸汽输入管、连接各管路的T形阀组，可用蒸汽对离心机及各连接管路保压在位灭菌。

8.根据权利要求1-7之一所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于该离心机用于生物反应器的灌流培养。

9.根据权利要求1-7之一所述的灌流用平板式沉降离心机，其特征在于该离心机与生物反应器连接用于灌流培养的方法。

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