CN101649351A

CN101649351A - 诊断和治疗癌症的方法和用于其中的组合物

Info

Publication number: CN101649351A
Application number: CN200910164562A
Authority: CN
Inventors: 玛丽-克里斯蒂娜·里奥; 内斯林·塔贝尔德圣·阿杜安; 乌尔里希·魏德勒
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2003-07-28
Filing date: 2004-07-28
Publication date: 2010-02-17
Also published as: ATE363075T1; ES2286539T3; JP2005130848A; JP4113167B2; DE602004006566T2; CN1576840A; US20050032101A1; CN100541198C; DE602004006566D1; CA2469094A1

Abstract

本发明涉及癌症的诊断，为此的组合物及治疗癌症的治疗方法。本发明提供诊断和治疗癌症的方法和用于其中的组合物。多核苷酸和多肽SMAGP是肿瘤特异的。因此SMAGP的诊断对肿瘤诊断是有价值的。除了其诊断价值外，抗SMAGP的抗体也可作为治疗性试剂用于治疗肿瘤。

Description

诊断和治疗癌症的方法和用于其中的组合物

本申请是于2004年7月28日提交的中国专利申请号200410058713.X的分案申请。

技术领域

本发明涉及癌症的诊断，为此的组合物及治疗癌症的治疗方法。

背景技术

在欧洲和美国，癌症是继心脏病之后第二主要的死亡原因。癌症的特征表现为失控的细胞生长，从而导致对正常组织的局部侵入或异常生长的全身性扩散。特定类型的癌症或癌症发展的特定阶段可能涉及两个元素。

活体中发挥功能的各种组织的细胞分裂或生长通常以有序和可控的方式发生。这是通过精细的生长调控机制完成的，其中包括接触，发出信号及邻近细胞间的其他通讯。在机能组织中，刺激型或抑制型生长信号通常在细胞间进行交换。当没有刺激信号时，细胞通常不进行分裂，而当抑制信号占主导地位时，细胞将停止分裂。然而，在癌细胞中，这种发出信号或通讯是有缺陷的或完全被破坏。因此细胞将持续分裂；侵入邻近结构中，并脱离原来的肿瘤块，在机体的其他部位形成新的生长点。其后转为恶性的过程称为转移。

癌症通常是指恶性肿瘤而非良性肿瘤。良性肿瘤细胞与正常的周围细胞是一样的。这些类型的肿瘤几乎总是包裹在纤维囊中，不具有转移到机体其他部分的能力。这些肿瘤影响局部器官但并不会损伤它们；它们通常保持很小，多年后也不会产生症状。只有当肿瘤长的太大而干扰其他器官时才有治疗的必要。相反，恶性肿瘤比良性肿瘤生长的更快；它们渗入并破坏局部组织。一些恶性肿瘤可以通过血液或淋巴系统扩散到全身。恶性肿瘤的不可预测及失控生长，使其非常危险，而且在很多情况下是致命的。这些肿瘤在形态上是原组织的非典型形态，而且不被包裹。恶性肿瘤通常会在手术切除后复发。

因此，治疗通常针对的是恶性癌症或恶性肿瘤，发明一种癌症形成早期征候的敏感标志物及鉴定与之相关的有效的生长抑制剂是非常重要的。

转移过程是一个几个连续步骤均必须成功完成的级联过程。第一步包括癌症细胞从原始肿瘤中脱离，随后降解并侵入到细胞外基质(ECM)及周围组织中。一旦肿瘤细胞成功地渗入并在淋巴和/或血管系统中存活，它们将由于物理限制(如毛细血管的大小)而俘获一个次级位点，其生长能力由细胞与器官环境(如化学因子激活)的分子间相互作用决定。最后，需要血管供应的补充而形成肉眼可见的转移瘤(Chambers，A.F.，等，Nat.Rev.Cancer 2(2002)563-572；Welch，D.R.，Clin.Exp.Metastasis 15(1997)272-306)。

根据转移中所涉及的大量不同的细胞和分子过程，转移的细胞通常表现出大范围有助于其转移能力的基因改变。这包括致癌基因的激活，金属蛋白酶和活动因子的补充，以及多种粘着分子的表达和/或功能性的改变(Hunter，K.W.，等，Cancer Res.61(2001)8866-8872；Skubitz，A.P.，Cancer Treat.Res.107(2002)305-329)。此外，已描述了8个已知作为转移抑制子的基因(Steeg，P.S.，Nat.Rev.Cancer 3(2003)55-63)。尽管对本领域的了解在逐步提高，但许多参与转移过程的关键遗传和生化事件仍然需要确定。

WO 02/08288描述了分泌的和跨膜多肽及其编码核酸。图130所示的是SMAGP的多肽序列。

发明内容

发明概述

令人惊讶地发现，编码多肽SMAGP(小细胞粘附糖蛋白)的核酸在肿瘤细胞，特别是在转移性肿瘤细胞中过量表达，而在正常细胞中的表达是非常低的。因此，SMAGP是一种有价值的新型靶位点，用于诊断和治疗癌症，优选的诊断和治疗结肠癌，肺癌，胰腺癌和乳腺癌以及转移瘤，优选地为肝脏中的转移瘤。另外，SMAGP在肿瘤发展的早期和晚期发展阶段表现出不同的定位，因此也是一种有价值的用于区分肿瘤阶段的工具。

因此本发明提供了一种确定在患者中癌症相关的SMAGP存在的方法，包括

(i)从怀疑包含肿瘤细胞或其部分的患者中获得生物样品；

(ii)检测样品中编码SMAGP的核酸的量或SMAGP多肽的量；和

(iii)将所述核酸或多肽的量与预先测定的表明在所述细胞中癌症相关的SMAGP表达或存在的校准线的标准值进行比较，从而确定所述患者中癌症相关的SMGAP的表达或存在。

本发明进一步提供了一种包含上述方法检测患者中存在或不存在癌症的方法。

另外，本发明提供了一种检测患者的组织或体液待测样品是否含有肿瘤细胞或来源于肿瘤细胞的方法，其中使用了待测样品和第二个来源于同一个体或同一种族不同个体的非肿瘤细胞的样品，该方法包括以下步骤：

(a)将每个样品在严谨杂交条件下与核酸探针进行温育，所述核酸探针选自由下述核酸序列组成的组：

(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，或其片段；

(ii)与(i)中的任何核酸序列互补的核酸序列；

(iii)在严谨条件下与(i)中的序列杂交的核酸序列；和

(iv)在严谨条件下与(ii)中的序列杂交的核酸序列；和

(b)测定每份样品与所述探针杂交的大约量，和

(c)将待测样品杂交的大约量与所述第二个样品杂交的大约量进行比较，从而鉴定待测样品是否比所述第二个样品含有更大量的特定核酸或核酸混合物。

本发明还包括一种检测肿瘤的方法，包括

a)将怀疑患有癌症的患者样品与核酸探针进行温育，所述样品选自体液，细胞或所述细胞的细胞提取物或细胞培养物上清组成的组，由此所述样品含有核酸，所述核酸探针选自由下述核酸组成的组：

(i)SEQ ID NO：1所示的核酸或与所述序列互补的核酸，和

(ii)与(i)中核酸之一杂交的核酸，和

b)对杂交进行检测，优选地通过样品核酸和/或核酸探针的另外的结合配偶体或通过X-射线放射显影进行检测。

c)将所述核酸杂交的量与预先测定的表明所述样品中癌症相关的SMAGP表达的校准线的标准值进行比较，从而确定所述患者是否患有癌症。

所述癌症优选地是结肠癌，肺癌，胰腺癌或乳腺癌。

优选地，通过与SMAGP核酸或多肽结合的结合试剂进行检测。更优选地，结合试剂是指在严谨条件下与SMAGP核酸杂交的探针或抗体，优选地是与SMAGP多肽，优选细胞外结构域结合的单克隆抗体。

所有这些方法也可以通过使用抗体来实现，其中SMAGP多肽通过抗体与多肽之间的相互作用进行检测。

本发明还提供一种监测患者中癌症，特别是转移性癌症进程的方法。在该方法中，在至少两个不同的时间点及时检测癌症患者的生物样品(例如体液，如血液，细胞裂解物或RNA样品的反转录物)中SMAGP核酸或多肽的量并进行比较。

根据量的改变，可以推测出所述癌症的进程信息。特别是转移的形成导致SMAGP的产生增加，例如mRNA的表达。

本发明进一步包括诊断试剂盒，其含有一种或多种在使用样品的诊断试验中用于与SMAGP核酸杂交的寡核苷酸探针或引物或抗体，所述样品获自患有或怀疑患有癌症的患者。

本发明进一步包括治疗有效量的抗SMAGP多肽的抗体在治疗癌症，优选地治疗转移性癌症中的应用。优选地，对胰腺肿瘤局部给药该抗体。

本发明进一步包括与多肽SMAGP结合的抗体在生产用于抑制肿瘤细胞的增殖和/或侵入潜力的组合物中的应用。本发明进一步包括依照本发明的抗体的应用，其中在体外对细胞培养物给药该组合物。

本发明进一步包括依照本发明的抗体的应用，其中组合物是一种药物组合物，其中将所述药物组合物对患有肿瘤，特别是转移性肿瘤的哺乳动物受试者进行给药。

在本发明另外的实施方案中，以治疗有效剂量对患者给药抗SMAGP多肽的抗体，从而治疗癌症和/或预防和/或抑制癌症引起的转移。

发明详述

SMAGP基因表现出与人的肿瘤细胞系转移潜能及与肿瘤细胞，特别是结肠癌，乳腺癌和胰腺癌明确的关系。编码的蛋白是一种小的跨膜糖蛋白，它在进化中是非常保守的。用对SMAGP特异的抗体的免疫组化分析表明，该蛋白位于正常上皮结构质膜的侧面。在肿瘤发展过程中，SMAGP的表达水平及定位或者是保守的，或者是与紊乱的上皮结构相关的改变。据推测，SMAGP通过其C末端尾与蛋白4.1及MAGUK蛋白相互作用，以控制细胞骨架装配和信号传导途径，从而在细胞与细胞的粘附中起作用。

此处所用的术语“SMAGP”是指编码序列为SEQ ID NO：2的多肽的核酸，优选地是SEQ ID NO：1的DNA序列和相关的mRNA序列以及SEQ IDNO：2的编码多肽。由于SMAGP是一种跨膜受体蛋白，因此该多肽在诊断方面是非常令人感兴趣的，优选地是作为与SMAGP多肽胞外结构域结合的抗体的表位。因此，优选的是使核酸样品和探针针对该区域，特别是针对其中与其他基因和多肽同源性较低的部分。

SMAGP是一种由97个氨基酸组成并具有III型信号锚定序列的跨膜蛋白。SMAGP多肽包括34个氨基酸(aa 1-34)的胞外结构域，跨膜结构域(aa 35-55)及胞内结构域(aa 56-97)，参见图7。

贯穿本申请所用的短语“核酸或蛋白”是指具有SMAGP活性的核酸或多肽，当通过重组DNA技术进行生产时，其实质上相对于细胞物质或培养基来说是游离的，或当进行化学合成时，其实质上相对于化学前体或其他化学物质是游离的。这种核酸优选地是不含有衍生该核酸的生物中天然侧接该核酸的序列(即位于核酸5’和3’端的序列)。

此处所用的“SMAGP核酸探针和引物”是指用于通过杂交方法来检测SMAGP核酸的核酸片段。杂交技术及条件对本领域中的熟练人员是已知的。例如这种杂交条件如下：中度严谨条件，其包括用5x SSC，0.5％SDS，1.0mmol/l EDTA，pH 8.0的溶液洗涤，接着在50-60℃5x SSC过夜杂交，用含有0.1％SDS的2x SSC室温洗涤40分钟，之后用0.1x SSC，0.1％SDS在50℃洗涤40分钟，并更换一次新鲜溶液。作为高度严谨杂交条件，也可能使用更高的温度进行杂交(例如在65-70℃)。核酸探针及引物通常由至少约50个连续位置的SMAGP核酸片段，最优选的是200-300个核苷酸组成。探针和引物的优化可根据现有技术来进行。例如可使用在(http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)中可获得的软件设计这种探针和引物。

对于高选择性，优选地是使用相对低的盐和/或高的温度条件，例如盐浓度从约0.02mol/l到约0.15mol/l，温度从约50℃到约70℃。

在诊断检测中，可使用特异探针和引物鉴定SMAGP多肽。通常该方法包括通过扩增方法，例如PCR方法扩增样品中的靶序列。定量检测可通过PCR技术来完成，优选地是通过使用例如Roche Diagnostics GmbH，DE公司的

进行定量RT-PCR。

在本发明的优选实施方案中，检测前对样品的编码核酸进行扩增，例如通过已知的PCR技术进行扩增。在核酸诊断领域通常使用的是衍生的(标记的)核酸探针。该探针与来源于结合在载体上的样品的变性DNA，RNA或RT-DNA进行接触，在该过程中，根据核酸探针的长度，组成及得到的预期杂合子的熔解温度，其使得标记的DNA或RNA与同源DNA或RNA结合，来选择温度，离子强度，pH和其他缓冲液条件(杂交也参见Wahl，G.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)3683-3687)。合适的载体是基于硝酸纤维素(例如Schleicher和Schüll，BA 85，Amersham Hybond，C.)的膜或载体物质，粉末状加固的或结合的硝酸纤维素，或用各种官能基团(例如硝基)衍生的尼龙膜(例如Schleicher和Schüll，Nytran；NEN，Gene Screen；Amersham Hybond M.；Pall Biodyne)。

为了检测待测样品中是否含有肿瘤细胞，应对与靶核酸或核酸杂交的的大约核酸量进行测定。虽然本发明包括了定量测定方法，但杂交的大约量不需要定量测定。典型地，例如，杂交的大约量通过对杂交检测的视觉观察而进行定量确定。例如，如果用凝胶来分离样品中与靶核酸杂交的标记核酸，则可视觉检查得到的条带。当对来源于同一种族而无肿瘤细胞的个体中分离的核酸进行杂交时，使用相同的操作流程。通过比较待测样品中杂交的大约量与无肿瘤细胞的样品中杂交的大约量来判断待测样品中是否含有比无肿瘤细胞的样品中更大量的靶核酸或核酸。

根据本发明的另一种方法，不需要使用第二个样品。为了检测SMAGP基因的表达是否上调，将SMAGP mRNA水平与细胞中标准基因(管家基因(参见，例如Shaper，N.L.，等，J.Mammary Gland Biol.Neoplasia 3(1998)315-324；Wu，Y.Y.，和Rees，J.L.，Acta Derm.Venereol.80(2000)2-3))的mRNA水平进行比较，优选地通过RT-PCR实现。

如按照本发明所示，SMAGP核酸在肿瘤样品中比无肿瘤细胞样品中的表达量更大。因此含肿瘤细胞的待测样品将比无肿瘤细胞的样品具有更大量的SMAGP核酸。为了鉴定待测样品为含有上调的SMAGP核酸，即其中细胞是肿瘤细胞或是乳腺癌肿瘤细胞，优选地是待测样品中SMAGP核酸的大约量比无肿瘤细胞的样品中的大约量高很多。例如，具有上调的SMAGP基因的待测样品可能比无肿瘤细胞的样品的SMAGP基因的量高大约5-大约60倍。

探针与核酸的杂交方法对于本领域的技术人员而言是已知的，并在例如，WO 89/06698，EP-A 0 200 362，US 2,915,082，EP-A 0 063 879，EP-A0 173 251，EP-A 0 128 018中所述。

然后，通过在充分洗涤及饱和以防止非特异结合后，将载体与抗体或抗体片段温育来检测杂交DNA或RNA。抗体或抗体片段针对杂交过程中掺入到核酸探针的物质。抗体依次被标记。然而，也可以使用直接标记的DNA。与抗体温育后，再次进行洗涤，以只检测特异结合的抗体偶联物。然后，根据已知方法，通过抗体或抗体片段的标记进行检测。

例如，可以如下进行表达的检测：

-与固定的整个细胞及固定的组织涂片进行原位杂交，

-克隆杂交(细胞)和蚀斑杂交(噬菌体和病毒)，

-Southern杂交(DNA检测)，

-Northern杂交(RNA检测)，

-血清型分析(例如，通过slot-blot分析血清中细胞类型)，

-扩增后(例如，PCR技术)。

因此，依照本发明的核酸在肿瘤诊断和表征中是有价值的标志物。

根据本发明，SMAGP表达的抑制物(例如抗体或反义核苷酸)可用于在体内抑制肿瘤进程。

本发明进一步提供鉴定和分离SMAGP拮抗物或SMAGP表达的抑制物(例如抗体或反义核苷酸)的方法。这种拮抗物或抑制物可用于在体内抑制肿瘤进程及造成肿瘤细胞大量凋亡。

根据本发明，提供了鉴定和分离在治疗癌症过程中具有效能的SMAGP拮抗物的方法。这些方法包括调控依照本发明的多肽表达的方法，鉴定与依照本发明的蛋白选择性结合的SMAGP拮抗物的方法，及鉴定可调控所述多肽活性的SMAGP拮抗物的方法。这些方法进一步包括调控，优选地抑制SMAGP基因转录成mRNA的方法。这些方法可以体外或体内进行，并且可利用和建立本发明的细胞系和转基因动物模型。

SMAGP拮抗物定义为一种降低或抑制SMAGP，一种多肽的生物活性和/或抑制SMAGP基因转录或翻译的物质或化合物。一般来说，SMAGP拮抗物的筛选程序包括将候选物质与其中在适于测定SMAGP活性的条件下由SMAGP表达介导侵入的宿主细胞接触。

可通过几种方法测定SMAGP活性。典型地，通过改变细胞生理性，例如增加运动性或体外侵入性，或通过改变分化状态，或通过改变细胞代谢从而导致增殖的提高，活化是明显的。

可通过重组方法或合成方法生产SMAGP多肽。当在原核生物中通过重组方法进行生产时，得到的是非糖基化的SMAGP多肽。借助于本发明所提供的核酸序列，可以在任何理想的细胞(例如除人细胞以外，还在其他哺乳动物的细胞中)的基因组中寻找SMAGP基因或其变异体，从而鉴定这些并分离编码SMAGP蛋白的基因。该过程及合适的杂交条件对于本领域的技术人员而言是已知的，并描述在例如Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，USA，和Hames，B.D.，Higgins，S.G.，Nucleic AcidHybridisation：A Practical Approach(1985)IRL Press，Oxford，英国。既然是这样，在这些出版物中所述的标准操作通常用于实验。

借助于编码SMAGP多肽的核酸，可以可再生的方式和大量的方式获得依照本发明的多肽。对于原核或真核生物中的表达，例如原核宿主细胞或真核宿主细胞，根据本领域熟练人员熟知的方法将核酸插入到合适表达载体中。这种表达载体优选地含有可调控的/可诱导的启动子。然后将这些重组载体导入到合适的宿主细胞中进行表达，例如大肠杆菌作为原核宿主细胞或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，畸胎癌细胞系PA-1，sc9117(Büttner，R.，等，Mol.Cell.Biol.11(1991)3573-3583)，昆虫细胞，CHO或COS细胞作为真核宿主细胞，在允许异源基因表达的条件下培养转化或转导的宿主细胞。根据已知方法将蛋白从宿主细胞或宿主细胞的培养液上清液中分离出来。这类方法描述在例如Ausubel I.，FrederickM.，Current Protocols in Mol.Biol.(1992)，John Wiley和Sons，New York中。如果在细胞培养物中不是以可溶形式存在，则还需要进行体外蛋白再活化。

SMAGP多肽或其片段在重组产生后可通过已知的蛋白纯化技术，包括免疫沉淀，凝胶过滤，离子交换层析，层析聚焦，等电聚焦，选择性沉淀，电泳等进行亲和层析而纯化，并可用于产生抗SMAGP的抗体。

本发明进一步包括适于表达SMAGP的重组表达载体，用该表达载体转染的重组宿主细胞，以及重组产生SMAGP基因编码的蛋白的方法。

可根据现有技术中已知的方法生产抗SMAGP的抗体。例如，利用含有全长多肽或其片段的多肽可以产生单克隆或多克隆抗体。例如，从SMAGP衍生的合适多肽包括氨基酸83-97。

得到的抗体可通过标准技术，例如酶联免疫吸附测定来筛选其与SMAGP结合的能力。例如，在Mole，“Epitope Mapping”，In：Methods inMolecular Biology，卷10，Manson(编辑)，105-116页，The Humana Press，Inc.，1992；Price“Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies”，In：Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，和Clinical Application，Ritter和Ladyman(编辑)，60-84页，Cambridge University Press，1995；Morris(编辑)，Epitope MappingProtocols 25，Humane Press，Inc.，1996；和Coligan等(编辑)，CurrentProtocols in Immunology，9.3.1-9.3.5页和9.4.1-9.4.11页，John Wiley&Sons，1997中描述了鉴定抗原表位和生产抗体的方法。

根据本发明有用的，特别是用于治疗目的的抗体可通过降低肿瘤细胞增殖和侵入潜能而进行鉴定。基于此目标，将肿瘤细胞或肿瘤细胞系，优选地为细胞系SUIT-2007，用抗SMAGP的抗体进行处理，然后用细胞增殖试剂WST-1(一种四唑盐试剂，Roche Diagnostics GmbH，DE)和Matrigel侵入检测法(BDS Biosciences，www.bdbiosciences.com)测定其增殖和侵入潜能。

抗SMAGP抗体可衍生自任何动物物种，或是嵌合的或是人源化的抗体。特别优选地是人抗体。例如，人单克隆抗体可从构建的应答于抗原刺激而产生特异的人抗体的转基因小鼠中获得。在该技术中，将人的重链和轻链基因座元件导入到源自包含靶向破坏的内源重链和轻链基因座的胚胎干细胞系的小鼠株系中。转基因小鼠可以合成针对人抗原特异的人抗体，该小鼠可用于生产分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法描述在例如Green，L.L.，等，Nat.Genet.7(1994)13-21；Lonberg，N.，等，Nature 368(1994)856-859；和Taylor，L.D.，等，Int.Immun.6(1994)579-591。

可通过多种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括用蛋白A-琼脂糖亲和层析，大小排阻层析及离子交换层析(参见，例如，Coligan在2.7.1-2.7.12页及2.9.1-2.9.3页；Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG)”，In：Methods in MolecularBiology，卷10，79-104页，The Humana Press，Inc.，1992)。

根据本发明，该抗体可用于免疫测定。通过将生物样品与抗体接触，然后将生物样品与结合抗体的可检测的标记分子接触可以进行检测。抗体可与抗生物素蛋白/链霉抗生物素(或生物素)偶联，可检测的标记分子可包括生物素(或抗生物素蛋白/链霉抗生物素)。对本领域的技术人员来说，该基本技术的很多变型都是众所周知的。备选地，抗体可与可检测的标记偶联，形成免疫偶联物。合适的可检测标记物包括例如放射性同位素，荧光标记，化学发光标记，酶标记，生物发光标记或胶体金。对本领域的普通技术人员来说，制备和检测这些可检测标记的免疫偶联物的方法是熟知的，并在下面进行详细描述。

优选地，根据本发明的抗体可用于治疗肿瘤患者，特别是转移性肿瘤患者。这种使用含抗SMAGP抗体的药物组合物进行治疗的方法其优势可在体内胰腺肿瘤模型中得到证实。该模型由Alves，F.，等，Pancreas 23(2001)227-235描述。该体内模型包括重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠中的导管腺癌同位移植模型。合适的人结肠腺癌模型KM12由Morikawa，K.，等，Cancer Res.48(1988)6863-6871描述。SCID小鼠中的转移细胞系KM12SM和KM12L4A同位移植产生肿瘤和形成转移。基于皮下注射的NIH-H460细胞系的人肺肿瘤模型由Corti，C.，等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.122(1996)154-160描述。NIH-H460细胞系由肺巨细胞癌衍生，并在皮下注射到无胸腺小鼠中后在肺部产生转移瘤。合适的乳腺癌模型是基于来源于导致肿瘤和转移形成的乳腺癌细胞系MDA-MB-435的同位(在裸鼠)移植肿瘤(John，C.M.，等，Clin.Cancer Res.9(2003)2374-2383)。

一般来说，抗SMAGP抗体的给药剂量根据多种因素，例如受试者年龄，体重，身高，性别，常规的医疗条件及以前病史而改变。作为一个示例，可以低蛋白剂量例如每剂量为20到100毫克30蛋白，给药一次或重复给药来给药抗SMAGP抗体组合物。备选地，可以每剂量30-90毫克蛋白，或每剂量40-80毫克蛋白，或每剂量50-70毫克蛋白的剂量来给药抗体。

优选地，通过局部导管通过静脉，肌内灌输对受试者给药抗体组分，优选地是直接针对或临近胰腺器官。可以通过持续灌输或通过单个或多个药丸进行给药。

可根据已知方法配制含抗SMAGP抗体的药物组合物，以制备药学上有用的组合物，从而将治疗性蛋白与药用载体形成混合物。如果接受的患者可耐受它的给药，则认为该组合物是“药用载体”。无菌磷酸盐缓冲的盐水是一种药用的载体的实例。其他合适的载体对本领域中的技术人员来说是已知的，例如参见Gennaro(编辑)，Remington’s PharmaceuticalSciences，第19版，Mack Publishing Company，1995。

为了达到治疗目的，对患者给药治疗有效量的抗SMAGP抗体和药用载体。如果给药剂量是生理上有效的，则认为抗体和药用载体的组合是以“治疗有效量”给药的。

优选地，以液态可注射或可灌注形式提供含抗SMAGP抗体的药物组合物。

以下提供的实施例，参考文献，序列表和附图用于帮助理解本发明，其真正范围列于后附的权利要求中。应理解在不偏离本发明精神的情况下可对阐述的程序进行修改。

附图简述

图1大鼠和人具有不同转移潜能的等基因腺癌细胞系体系中SMAGPmRNA表达的Northern Blot分析。每个泳道的琼脂糖甲醛胶上样10μg总RNA。通过溴化乙啶染色28S和18S核糖体RNA估测等量上样的总RNA。每个细胞系均显示出非转移(-)，低转移(±)或高转移(+)潜能。(A)等基因大鼠胰腺腺癌细胞系：BSp73-AS和BSp73-ASML。(B)等基因大鼠前列腺腺癌细胞系：G，AT-1，AT-3，AT-6，MAT-Lu和MAT-LyLu。(C)等基因大鼠乳腺腺癌细胞系：MTPa，MTC，MTLn2和MTLn3。(D)等基因人胰腺腺癌细胞系：S2-028和S2-007。(E)等基因人结肠腺癌细胞系：KM12C，KM12SM和KM12L4。(F)等基因人结肠腺癌细胞系：HCT116和HCT116-cl5.5。在所有体系中，SMAGP mRNA的高水平表达与具有转移潜能的癌细胞相关。

图2SMAGP的免疫表征。用N-糖苷酶F(PNGaseF)，唾液酸酶和O-糖苷酶进行酶法去糖基化反应前后，SMAGP与MTLn3(泳道c-f)和HCT116-cl5.5细胞(泳道g-k)的蛋白提取物进行Western Blot分析。N-糖基化的运铁蛋白，α-酸和核糖核酸酶B糖蛋白作为N-糖苷酶F处理(泳道a-b)的阳性对照。SMAGP通过加入唾液酸和O-糖基化进行翻译后修饰。

图3人正常组织中SMAGP mRNA表达的Northern Blot分析。每个泳道上样20μg总RNA。用18S RNA探针的膜杂交作为上样对照。在几乎所有被研究的组织中均观察到SMAGP由弱到强的表达。

图4人正常组织和癌组织中SMAGP表达的免疫组化分析。A-D：分别为正常乳腺，子宫内膜，结肠和肝(胆道)组织。SMAGP主要位于上皮细胞的质膜侧面。E-H：来自结肠癌患者的肿瘤样品。E和G：为原发肿瘤，F和H：肝脏转移瘤。C：来自同一个患者的正常结肠组织。分化良好的肿瘤(E和F)表现出SMAGP的强表达，位于质膜上的蛋白是或多或少保守的。相反，未分化的肿瘤与蛋白的细胞质定位(G和H)相关，而且SMAGP表达降低(H)。放大倍数：A-D放大200倍；E-H放大100倍。

图5在人胰腺组织中检测hSMAGP mRNA表达。

图6通过实时定量RT-PCR测定人结肠组织中hSMAGP mRNA的表达。结果表示为归一化的hSMAGP mRNA表达水平。正常样品，原发肿瘤和转移瘤样品分别以白色，阴影线和点线表示。来源于同一个患者的样品一起配对。N为正常结肠；Ta为Duke A stadium结肠癌；Tb为Duke Bstadium结肠癌；Tc为Duke C stadium结肠癌；Td为Duke D stadium结肠癌；M为肝脏转移瘤；NL为正常肝组织。

图7SMAGP的结构域结构。

具体实施方式

实施例1

细胞培养

在转移行为具有显著差异的等基因肿瘤细胞系的有效性为转移过程的研究提供了良好的模式。为了此目的，使用了大鼠肿瘤细胞体系BSp73，它包括两个稳定的由一系列自发的大鼠胰腺肿瘤移植而得到的变异体：非转移性BSp73-AS变异体和转移性BSp73-ASML变异体(Matzku，S.，等，Invasion Metastasis 3(1983)109-123)。先前的研究已证实它构成一个合适的细胞模型以鉴定转移相关基因。为了鉴定与转移表型相关的表面分子，产生了抗转移BSp73-ASML细胞系的膜蛋白的单克隆抗体，并鉴定了仅存在于转移变异体表面的四种蛋白(CD44v，D6.1A，C4.4A和EGP314)。通过几种非转移性肿瘤细胞的稳定转染子证明它们参与转移过程。基因的表达足以赋予转移潜能或促进转移级联过程的各个步骤(Claas，C.，等，J.Cell.Biol.141(1998)267-280；Gunthert，U.，等，Cell 65(1991)13-24；Rosel，M.，等，Oncogene 17(1998)1989-2002；和Wurfel，J.，等，Oncogene 18(1999)2323-2334)。另外，在许多人类癌症中，CD44v的失控表达与较差的预后相关。

大鼠胰腺腺癌细胞系BSp73-AS和BSp73-ASML由Mazku，S.，等，Invasion Metastasis 3(1983)109-123所描述。大鼠前列腺腺癌细胞系G，AT-1，AT-3，AT-6，MAT-Lu和MAT-LyLu(Isaacs，J.T.，等，Prostate 9(1986)261-281)购自欧洲动物细胞保藏中心(ECACC，Salisbury，UK)。人结肠腺癌细胞系KM12C，KM12SM和KM12L4由Morikawa，K.，等，Cancer Res.48(1988)6863-6871所描述。人结肠腺癌细胞系HCT116由Brattain，M.G.，等，Cancer Res.41(1981)1751-1756所描述。HCT116-cl5.5是从来源于肺转移瘤的HCT116体内分离而得到的，并鉴定为具有高转移性。以上所述的细胞系在补加10％胎牛血清和2mM L-谷氨酸的无抗生素的RPMI 1640中进行培养。大鼠乳腺腺癌细胞系MTPa，MTC，MTLn2和MTLn3由Neri，A.，等，J.Natl.Cancer Inst.68(1982)507-517所描述，并在补加10％胎牛血清的MEM-α中培养。人胰腺腺癌细胞系S2-028和S2-007由Taniguchi，S.，等，Clin.Exp.Metastasis 10(1992)259-266所描述，并在补加10％胎牛血清和2mM L-谷氨酸的D-MEM中进行培养。所有细胞系均无支原体污染。

实施例2

Northern Blotting

用RNeasy midi kit(Qiagen，Hilden，德国)从冷冻细胞中分离总RNA。10μg总RNA在变性1％琼脂糖甲醛胶中进行大小分离，并点样(NorthernMax^TM blotting kits，Ambion)到尼龙膜(BrightStar-Plus^TM，Ambion，Austin，USA)上。紫外交联(UV Stratalinker 2400，Stratagene，La Jolla，USA)后，用[α-³²P]dATP标记的cDNA(Tarbé，N.，等，AnticancerRes.22(2002)2015-2027)杂交斑点。通过溴化乙啶对核糖体RNA的染色证实琼脂糖甲醛胶上等量上样的总RNA。通过使用商品化的人总RNA blots(Northern Territory^TM，Invitrogen，Huntsville，USA)测定人正常组织中SMAGP mRNA的表达。每泳道上样20μg总RNA，并通过18SRNA的定量来检查等量的上样量。如上述进行印迹。通过RT-PCR制备大鼠及人SMAGP mRNA的cDNA探针，所用引物对分别如下：

B1(TTGTGGTATCCAGCCTCCA)(SEQ ID NO：3)/

B2(GGCTCCAACACTGAGACACTG)(SEQ ID NO：4)及

H105(ACAAAGGCAGCTACGTCACC)(SEQ ID NO：5)/

106(CTTTCTCCATGTCCCTGGTC)(SEQ ID NO：6)。

得到的探针分别对应于大鼠及人SMAGP mRNA 3’UTR的290bp和295bp区域。

实施例3

RACE-PCR

用SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，Palo Alto，USA)通过RACE-PCR获得全长的rSMAGP cDNA序列。根据制造商的说明书，将1μg BSp73-ASML细胞系总RNA进行反转录。5’和3’非翻译区分别用Clontech通用引物和rSMAGP序列特异引物B140(5’-GAT GAA GTA CTCTTC CTT CTC TTT GC-3’)(SEQ ID NO：7)及B139(5’-AAG GGG AGCCCA GCG CCA TCC TCC AG-3’)(SEQ ID NO：8)通过PCR进行扩增。将PCR产物克隆到

载体(Invitrogen)上，并用310测序仪(Applied Biosystems，Foster City，USA)进行测序。

实施例4

抗体和Western Blotting

兔抗SMAGP的多克隆抗体由Eurogentech S.A.(Herstal，比利时)公司生产。将对应于hSMAGP(SEQ ID NO：2)残基83-97的合成肽ESDLAKGSEKEEYFI偶联到KLH(匙孔血蓝蛋白)上，并注射到兔中。将抗该合成肽的免疫反应血清进行亲和纯化。单克隆兔抗体根据Spieker-Polet，H.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)9348-9352进行生产。

对于Western Blotting，用含蛋白酶抑制剂混合物(完全无EDTA的蛋白酶抑制剂，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)的RIPA缓冲液(50mM Tris-Cl pH7.5，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)提取蛋白。用

的12％Bis-Tris胶(Invitrogen，Carlsbad，USA)及MES的SDS电泳缓冲液(Invitrogen)在还原条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。当凝胶半干后，印迹到硝酸纤维素膜并在加入5％脱脂奶粉(Merck，Darmstadt，Germany)的TBS缓冲液(100mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl)中进行封闭。在与稀释1∶5000作为第一抗体的兔抗SMAGP温育后，将膜在含有0.1％Tween20的TBS缓冲液中进行洗涤，然后与偶联辣根过氧化物酶的抗兔作为第二抗体(Roche Diagnostics)进行温育，并再次进行洗涤。通过增强的化学发光(Lumi-light^PLUs WesternBlotting底物，Roche Diagnostics GmbH，Germany)进行抗体检测。

实施例5

去糖基化检测

100μg或更少的100℃变性5分钟的总细胞裂解物在反应缓冲液(0.05mM磷酸钠，pH7)和变性缓冲液(2％SDS，1M β-巯基乙醇)中进行酶促去糖基化实验。然后向溶液中加入Triton X-100至终浓度10％。在总体积50μl的溶液中分别加入N-糖苷酶F(PNGaseF)，唾液酸酶和O-糖苷酶(Sigma，Steinheim，Germany)至终浓度分别为100U/ml，100mU/ml和25mU/ml。样品在37℃温育3小时。人运铁蛋白，α-酸和核糖核酸酶B糖蛋白作为PNGaseF活性的阳性对照，在还原条件下进行SDS-PAGE分析，并通过考马斯蓝染色进行显色。去糖基化反应后，通过与兔抗SMAGP抗体的Western Blotting分析SMAGP。

实施例6

免疫组化分析

在磷酸盐缓冲的福尔马林(4％)中固定组织。用过氧化物酶-抗过氧化物酶体系(DAKO，Carpinteria，CA)对石蜡包埋的组织切片进行免疫组化分析，如前所述(Régnier，C.H.，等，J.Biol.Chem.270(1995)25715-25721)。所用抗SMAGP抗体稀释1∶1000。

实施例7

大鼠及人癌细胞系中与转移潜能相关的SMAGP mRNA的表达

在一组具有不同转移潜能的等基因肿瘤细胞系中分析SMAGPmRNA的表达。首先在大鼠胰腺，前列腺和乳腺肿瘤细胞系体系中(图1A-C)分析表达。在非转移性细胞系BSp73-AS，G和MTPa中没有检测到rSMAGP mRNA或者其水平很低。相反，发现在所有转移性细胞系(B5p73-ASML，AT-1，AT-3，AT-6，MAT-Lu，MAT-LyLu，MTLn2和MTLn3)中，除了弱转移性MTC细胞系之外，其表达均很强。图1D-F所示的是在一个乳腺癌和两个结肠人等基因肿瘤细胞体系中hSMAGPmRNA的表达。注意到相对于非转移或低转移性细胞(S2-028，KM12C和HCT1 16)来说，高转移性细胞(S2-007，KM12SM，KM12L4和HCT116-cl5.5)中hSMAGP mRNA是过量表达的。因此SMAGP在人和大鼠细胞系体系中的表达与它们的转移潜能相关。

实施例8

SMAGP蛋白的翻译后修饰

为了进一步表征SMAGP蛋白，制备了抗相应于hSMAGP C末端部分最后15个残基的合成肽的多克隆抗体，该最后15个残基在大鼠和人SMAGP中的保守性为80％。为了验证预期的SMAGP蛋白的翻译，在还原条件下对大鼠(MTLn3)和人(HCT116-cl5.5)肿瘤细胞的蛋白提取物进行Western Blot分析。观察到分别相应于SMAGP约23和25kDa的条带(图2中泳道c和g)。这表明该表达蛋白的大小比预计分子量约增加2倍。由于SMAGP一级序列中含有几个推测的糖基化位点，因此对通过N-糖苷酶F(PNGase F)，唾液酸酶和O-糖苷酶进行去糖基化后的蛋白提取物进行同样的Western Blot分析，以确定SMAGP是否被翻译后修饰。PNGase F处理(图2泳道d和h)对表观分子量(MW)没有影响，这表明SMAGP不是N-糖基化的。唾液酸酶处理(图1泳道e和i)导致一个小条带发生迁移，提示SMAGP被唾液酸修饰。另外用O-糖苷酶处理(图2泳道f和j)导致表观分子量显著迁移，这与存在O-糖基化位点是一致的。最后，单独用O-糖苷酶处理(图2泳道k)对SMAGP的MW没有影响，这表明有唾液酸连接到O-连接的寡糖上，已知这可以抑制O-糖苷酶的作用(Fukuda，M.，等，J.Biol.Chem.262(1987)11952-11957)。N-糖基化的运铁蛋白，α-酸和核糖核酸酶B糖蛋白作为PNGase F处理的阳性对照(图2泳道a和b)。

实施例9

在人正常组织中SMAGP的表达和亚细胞定位

通过Northern Blot分析，在一组正常人组织中估测SMAGP的分布(图3)。SMAGP mRNA的表达是相对普遍存在的，在胎盘中检测到最高的表达水平。在食管，结肠和脂肪组织中也检测到强烈的表达。

因此，通过抗SMAGP抗体在正常结肠，乳腺，肺和胆道组织中进行的免疫组化实验表明SMAGP蛋白在所有器官中都是强烈表达的(图4，A-D)。SMAGP的表达限制在以形成立体细胞形态的细胞-细胞粘附为特征的极化上皮结构中。在细胞中，该蛋白主要定位在质膜上。另外，在整个质膜上未观察到SMAGP，其仅定位于细胞-细胞上皮连接处的侧面膜区域。基点和顶点的膜侧面均没有SMAGP。在细胞质中也观察到较弱的染色。

实施例10

在人结肠原发肿瘤和转移瘤中SMAGP的表达及亚细胞定位

在来源于结肠癌患者的原发肿瘤和转移瘤中检测SMAGP。图4所示的是来源于同一个患者组织所获得的免疫组化染色的例子(C，正常结肠；E和G，原发肿瘤；F和H，肝转移瘤)。在原发肿瘤中，SMAGP的表达可保持相当高的水平(E)或表现出减弱的表达(G)。

此外，在某些情况下，SMAGP亚细胞定位是部分保守的(E)，而在另外的情况下，SMAGP不再限定于质膜上，而是或多或少存在于细胞质中(G)。在肝转移瘤中也获得了类似结果(F和H)。因此，对于一个给定的患者，在原发肿瘤和转移瘤中可观察到各种SMAGP表型，甚至这些表型根据区域可共存于同一个肿瘤中(F)。有趣的是，在所有被研究的原发肿瘤和转移瘤中，SMAGP蛋白表达的强烈水平和细胞膜定位均与一种保守的上皮结构相关(E和F相对于G和H)。对来源于乳腺癌和肺癌患者的原发肿瘤和转移瘤中也观察到同样结果。

实施例11

在人胰腺组织中检测hSMAGP mRNA的表达

在10个人胰腺癌(图5，蓝线)和5个人正常胰腺组织(图5，白线)通过定量RT-PCR(Taqman Technology)评估了hSMAGP mRNA的表达。另外也在人胰腺肿瘤细胞系Capan I中测定了hSMAGP的表达。相对于在正常胰腺组织中所达到的hSMAGP表达的最高值来说，在5个癌样品中观察到过量表达，其倍数的变化表示在相应线条上面的括号中。Taqman分析方案

用PE公司的试剂进行PCR：

4μl SybrGreen缓冲液，4.8μl MgCl₂，3.2μl dNTPs，0.2μl UNG，0.2μl Amplitaq Gold，4μl引物混合物，1μl cDNA，22.6μl H₂O

所用PCR反应条件如下：

起始步骤：2min 50℃，10min 95℃，40个循环：15sec 95℃，1min 60℃

为了检测每个cDNA各自基因的表达，进行两个PCR反应(双检测)。同时，使用相同的cDNA用xsl3进行PCR。ABI序列检测程序表明每个PCR的CT值。对各自基因，将各个cDNA的CT值进行平均(即，两次测定的平均值。而对xsl3而言，每个cDNA只有一个值)。然后从上述平均值推测每个cDNA的xsl3值。仅健康cDNA的差异形成一个平均值。慢性胰腺炎，胰腺癌和健康胰腺cDNA的差异除以该平均值。然后，以基数2的次幂的方式表示这些商(因为在PCR中，产物在每个反应中加倍)。然后这些值的倒数即代表各个cDNA相对于健康cDNA的表达。

实施例12

在人结肠组织中检测hSMAGP mRNA的表达

首先在结肠癌患者的人组织样品中检测与肿瘤扩散相关的hSMAGP表达的临床病理学意义。通过定量RT-PCR(Light-Cycler technology)在9个正常结肠样品，9个结肠原发肿瘤样品(具有已知的Duke’s stadium)和9个肝转移瘤样品中评估mRNA的表达(图6)。正常和原发肿瘤样品来自同一个患者，而肝转移瘤来自不同患者。相对于正常结肠来说，独立于Dukes阶段，在所有配对的肿瘤中均观察到强烈的过量表达。此外，在转移瘤中SMAGP mRNA水平比9个原发肿瘤样品中的其中6个(75％的病历)所达到的数值高。以4个正常肝组织样品作为肝中hSMAGP表达的对照，证明hSMAGP在转移瘤中的高水平表达不是由器官的环境引起的。这些结果证实，相对于正常结肠粘膜来说，hSMAGP mRNA在人结肠肿瘤中是过量表达的，而且表明，相对于原发肿瘤来说，有75％的病历在肝转移瘤中的表达量增加。

通过RNeasy试剂盒(Qiagen)提取的总RNA在用寡聚dT和AMV反转录酶(Roche Diagnostics)进行第一链cDNA合成前用DNase I(Quiagen)进行处理。然后用含有Taq DNA聚合酶和Tgo DNA聚合酶(RocheDiagnostics)的特定酶混合物进行聚合酶链反应。

使用冷冻结肠组织样品中提取的总RNA进行定量RT-PCR。DNase I处理后，总RNA(1μg)用随机六碱基序列和AMV反转录酶(RocheDiagnostics)进行逆转录反应。根据hSMAGP序列，设计两个基因特异引物(H103：5’-AGA AGA TGG AGC CAG CAC AG-3’)(SEQ ID NO：9)和(H104：5’-ATC TGG ACG ATG GCA CTG G-3’)(SEQ ID NO：10)。这些引物位于两个不同外显子上，以避免基因组DNA的污染。通过LightCycler系统和

试剂盒(Roche Diagnostics)进行PCR反应的实时监测。优化后，在终体积20μl的PCR反应混合物中，包括4mM MgCl₂，0.4μM的每种引物，2μl cDNA溶液和2μl SYBR GreenI。每个实验重复进行两次。用一系列稀释(1∶10，1∶50和1∶80)的人结肠腺癌细胞系KM12SM cDNA产生靶基因hSMAGP和内源性参考18S RNA的校准曲线。对于每个样品，从校准曲线上测定靶基因和内源性参考RNA的相对量。样品中hSMAGP mRNA的表达水平通过对每个样品将hSMAGP mRNA的量除以18S RNA的量而进行归一化。

实施例13

SMAGP表达对大鼠转移形成的影响

用SMAGP或单独用载体(模拟转染)稳定转染大鼠胰腺腺癌的低转移性变异体——BSp73AS细胞。筛选到两个模拟转染克隆和四个克隆，其在SMAGP表达强度方面略有不同。这些克隆和未转染的BSp73AS及BSP73ASML细胞进行腹膜内注射或足内注射BDX大鼠(原始株系)，以控制转染的BSp73AS细胞转移能力的潜在增加。由于两个模拟转染克隆和四个SMAGP转染克隆的生长行为并没有显著不同，因此将来自这两个模拟转染克隆和四个SMAGP转染克隆的数据进行合并(表1)。

进行腹膜内施用后，BSp73AS和BSp73AS-模拟细胞在腹腔内专有地形成大的节结，BSp73AS和BSp73AS-模拟移植大鼠的平均存活时间为20天。而接受BSp73ASML细胞的大鼠的平均存活时间为40天。肿瘤在腹腔中长成栗粒状形式，而且所有的大鼠均死于肺部形成的栗粒状转移。在12个接受SMAGP-转染的BSp73AS细胞的大鼠中，6个在腹腔中发展为大的节结(类似于注射BSp73AS细胞的大鼠)，而另外6个表现为在腹腔中栗粒状肿瘤的生长。4个大鼠具有肝转移瘤，而2个大鼠分别在肾和卵巢中发展为转移瘤。在2个大鼠中，膈膜被肿瘤大量渗透。没有大鼠表现出肺转移瘤。这些结果证实转移潜能的增加(表1A)。

为了验证该发现，足内注射肿瘤细胞，这样可使转移过程更容易被追踪。当在足内施用后而不切除肿瘤时，所有的大鼠均在腿弯部的引流淋巴结处发展为转移瘤，但只有接受BSp73ASML(5/5)的大鼠和接受SMAGP转染的BSp73AS细胞(4/5)的大鼠在远处(旁主动脉，腹股沟和腋窝处)的淋巴结发展为转移瘤。另外，只有接受BSp73ASML(5/5)的大鼠和接受SMAGP转染的BSp73AS细胞(5/5)的大鼠发展为肺部转移瘤。BSp73ASML细胞发展为栗粒状转移瘤，而SMAGP转染的BSp73AS细胞发展为大的节结。该发现明确证实表达SMAGP的肿瘤细胞的转移能力增加(表1B)。

为了估测建立转移所需的时间，将肿瘤细胞进行足内注射，而且在28天后将肿瘤和引流淋巴结一起切除。表1C所示的数据仅涉及那些没有由于引流淋巴结的不完全切除而导致局部复发的动物(2只具有BSp73AS的大鼠，4只具有模拟转染的BSp73AS细胞的大鼠和1只具有SMAGP转染的BSp73AS细胞的大鼠)。在治疗的切除大鼠中，0/5具有BSp73ASML-，3/3具有BSp73A-，6/6具有模拟转染的BSp73AS-和9/14具有SMAGP转染的BSp73AS的大鼠存活。因此，转移的建立过程在SMAGP转染的BSp73AS中比在BSp73ASML细胞中更慢得多，但不同于未转染的和模拟转染的BSp73AS细胞，在施用肿瘤细胞后28天，36％大鼠SMAGP转染的BSp73AS细胞已迁移到引流淋巴结之外。

表1

SMAGP转染的BSp73AS细胞的转移生长

A.腹膜内施用后的生长

B.足内施用后的生长

C.足内施用和切除后的生长

^a表示淋巴结转移瘤被判断为+：Φ0.3-0.5，++：Φ＞0.5-1.0，+++：Φ＞1.0；

^b表示在引流淋巴结发展为局部复发的大鼠的数量被排除在外；^cna：未施用。

实施例14

体内转移检测

从德国Sulzfeld的Jackson实验室获得BDX大鼠。用于实验的雌性大鼠为8-12周龄。它们一次性接受5×10⁵个肿瘤细胞的腹膜内(i.p.)注射或后脚垫处的皮下注射(i.f.p)。如所述，i.f.p.施用后通过后脚的切断手术切除肿瘤。简而言之，通过Rompun/Ketanest将大鼠麻醉。用柳叶刀(skalpell)在关节下约5cm处通过环状切割除去皮肤。缝合(sueing)动脉并除去引流淋巴结后，切除腱，并通过关节切断术除去后脚。用皮肤覆盖伤口并进行缝合。通过i.p.施用后进行腹部触诊或i.f.p.施用后测定肿瘤直径及引流淋巴结的直径，每周对肿瘤的生长检测2次。当可触知的肿瘤块达到平均直径为2.5cm或当大鼠变得恶病质或贫血(可通过眼睛和耳朵的颜色来估测)或短促呼吸时，将它们麻醉并杀死。对大鼠进行尸检并对所有器官检测转移瘤的存在。

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1 5 10 15

ccg gtt ttt cag gcc cct gag aca atg tcc cca caa gct gaa gag gcc 96

Pro Val Phe Gln Ala Pro Glu Thr Met Ser Pro Gln Ala Glu Glu Ala

20 25 30

agc aca gca ctc att gca gtt gtt ata acc gtg gtg ttc ctt acc ctg 144

Ser Thr Ala Leu Ile Ala Val Val Ile Thr Val Val Phe Leu Thr Leu

35 40 45

ctc tca gtg gtg acc ttg atc ttc ttt tac ctg tac aag aat aaa ggc 192

Leu Ser Val Val Thr Leu Ile Phe Phe Tyr Leu Tyr Lys Asn Lys Gly

50 55 60

agc tac gtc acc tat gag cct gca gaa ggg gag ccc agc gcc atc ctc 240

Ser Tyr Val Thr Tyr Glu Pro Ala Glu Gly Glu Pro Ser Ala Ile Leu

65 70 75 80

cag atg gag act gac tca gcc aag ggc aaa gag aag gaa gag tac ttc 288

Gln Met Glu Thr Asp Ser Ala Lys Gly Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Phe

85 90 95

atc 291

Ile

<210>2

<211>97

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Asn Asn Leu Pro Ala Thr Pro Ser Pro Glu Glu Leu Met Thr Thr

1 5 10 15

Pro Val Phe Gln Ala Pro Glu Thr Met Ser Pro Gln Ala Glu Glu Ala

20 25 30

Ser Thr Ala Leu Ile Ala Val Val Ile Thr Val Val Phe Leu Thr Leu

35 40 45

Leu Ser Val Val Thr Leu Ile Phe Phe Tyr Leu Tyr Lys Asn Lys Gly

50 55 60

Ser Tyr Val Thr Tyr Glu Pro Ala Glu Gly Glu Pro Ser Ala Ile Leu

65 70 75 80

Gln Met Glu Thr Asp Ser Ala Lys Gly Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Phe

85 90 95

Ile

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B1

<400>3

ttgtggtatc cagcctcca 19

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B2

<400>4

ggctccaaca ctgagacact g 21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H105

<400>5

acaaaggcag ctacgtcacc 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物106

<400>6

ctttctccat gtccctggtc 20

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B140

<400>7

gatgaagtac tcttccttct ctttgc 26

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B139

<400>8

aaggggagcc cagcgccatc ctccag 26

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H103

<400>9

agaagatgga gccagcacag 20

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物H104

<400>10

atctggacga tggcactgg 19

Claims

1.一种确定患者中与转移相关的SMAGP存在的方法，其包含

(i)在来自怀疑含有肿瘤细胞或其部分的患者的生物样品中，检测编码SMAGP的核酸的量或多肽SMAGP的量；和

(iii)将所述核酸或多肽的量与预先测定的表明在所述细胞中转移相关的SMAGP表达或存在的校准线的标准值进行比较，从而确定所述患者中转移相关的SMAGP的表达或存在。

2.一种确定患者的组织或体液的待测样品是否包含具有转移潜能的肿瘤细胞或来源于转移的肿瘤细胞的方法，其中使用了待测样品和第二种来源于同一个体或同一种族不同个体的非肿瘤细胞的样品，该方法包含以下步骤：

(a)将每个各自样品在严谨杂交条件下与核酸探针进行温育，所述核酸探针选自由下述核酸序列组成的组：

(i)SEQ ID NO：5的核酸序列，或

(ii)SEQ ID NO：6的核酸序列，或

(iii)SEQ ID NO：9的核酸序列，或

(iv)SEQ ID NO：10的核酸序列，和

(b)测定每个各自样品与所述探针杂交的大约量，和

(c)将待测样品的大约杂交量与所述第二种样品的大约杂交量进行比较，以鉴定所述待测样品是否比所述第二种样品含有更大量的特异核酸或核酸混合物。

3.一种检测转移瘤的方法，其包含

a)将怀疑患有转移瘤的患者样品与核酸探针进行温育，所述样品选自由体液、细胞或所述细胞的细胞提取物或细胞培养物上清组成的组，由此所述样品包含核酸，所述核酸探针选自由下列组成的组：

(i)SEQ ID NO：5的核酸序列，或

(ii)SEQ ID NO：6的核酸序列，或

(iii)SEQ ID NO：9的核酸序列，或

(iv)SEQ ID NO：10的核酸序列，和

b)检测杂交，优选地通过所述样品核酸和/或所述核酸探针的另外的结合配偶体或通过X-射线放射显影进行检测；

c)将所述核酸杂交的量与预先测定的表明在所述样品中转移瘤相关的SMAGP表达的校准线的标准值进行比较，从而确定所述患者是否患有转移瘤。