JPH08500977A - マスピン，腫瘍抑制活性を有する新規なセルピン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 マスピン（配列番号１）と実質的に同一であるタンパク質をコードするＤＮＡ、マスピンに特異的な抗体、およびこの種のＤＮＡと抗体の診断、スクリーニング、治療方法への利用。

Description

【発明の詳細な説明】マスピン、腫瘍抑制活性を有する新規なセルピン 本出願は１９９２年９月１日に出願され本出願とともに同一人によって所有さ れている現在係属中のＵＳＳＮ第０７／９３８，８２３号（参考として本出願中 に取り込まれている）の一部継続出願である。この係属中の出願は順繰りに１９ ９２年２月２８日の出願で現在放棄されているＵＳＳＮ第０７／８４４，２９６ 号の一部継続出願であり、この出願は順繰りに１９９１年２月２８日の出願で現 在放棄されているＵＳＳＮ第０７／６６２，２１６号の一部継続出願である。連邦政府後援の研究についての説明 ここに記載の本発明は一部米国政府の援助のもとに行われた（Ｒｕｔｈ Ｓａ ｇｅｒ博士に対するＮＩＨ袖助金ｎｏｓ．ＰＯ１ ＣＡ２２４２７およびＯＩＧ ＣＡ３９８１４）。従って、米国政府は本発明について確かに権利を保有して いる。発明の背景 本発明の分野は腫瘍抑制遺伝子である。 細胞レベルでの癌は遺伝子の多重変化に起因する多重調節機構の崩壊を特徴と する。主要な癌関連作用をもつ特異遺伝子についての研究は、増殖の制御および 浸潤と拡散の制御という２つの基礎過程に焦点を合わせている。両過程とも複雑 であり、遺伝子発現における癌関連の変化は特殊なタンパク質の活性の増加およ び減少の両方を包含する。 転移性拡散は一次腫瘍細胞がリンパ管および血管中に侵入し遠隔の器官に散布 された場合に発生する（Ｆｉｄｌｅｒ等、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓ ｔ．、第８２巻、第１６６頁、１９９０年；Ｌｉｏｔｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．、第５１巻、第５０５４頁、１９９１年；Ｎｉｃｏｌｓｏｎ， Ｓｅｍｉ ｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．、第２巻、第１４３頁、１９９１年；およびＣｈ ｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第４巻、第８０２頁 、１９９２年）。転移に含まれる多くの工程には、基底膜および細胞外マトリッ クス （ＥＣＭ）へのタンパク質分解的攻撃、血管内異物侵入につながる内皮細胞への 粘着、および循環系から腫瘍細胞が増殖しうる肺および骨のような組織中への後 からの溢血が含まれる。正常細胞では、これら浸潤および転移の過程は遺伝的に プログラムされた複雑な一連の調節機構によって遮断されている。これらの保護 障壁を越えて浸潤および転移をもたらすためには、遺伝子発現において多重な変 化が必要であり、その結果、腫瘍進行に寄与する遺伝子機能が増加または減少す ることになる。 タンパク質分解活性が増加すると浸潤が増大し、このことは浸潤性腫瘍細胞中 でセリンプロテアーゼの活性（Ｔｅｓｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓ ｉｓ Ｒｅｖ．、第９巻、第３５３頁、１９９０年；Ｄａｎｏ等、Ａｄｖ．Ｃａ ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第４４巻、第１３９頁、１９８５年；Ｆｏｅｋｅｎｓ等、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５２巻、第６１０１頁、１９９２年；Ｏｓｓｏｗｓ ｋｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５２巻、第６７５４頁、１９９２年；Ｓｕｍ ｉｙｏｓｈｉ、Ｉｎｔ．Ｊ．ＣａｎｅｒＮ第５０巻、第３４５頁、１９９２年； Ｄｕｆｆｙ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５０巻、第６８２７頁、１９９２年 ；およびＭｅｉｓｓａｕｅｒ等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、第１９２巻、第 ４５３頁、１９９１年）；メタロプロテアーゼ（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅ ｎ編、マトリックス・メタロプロテイナーゼ会議議事録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｓｏｆ ｔｈｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｃｏｎ ｆｅｒｅｎｃｅ）、Ｄｅｓｔｉｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈ ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９０年；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．、第３０２巻、第１５７頁、１９９１年；Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅ ｎｓｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、第９巻、第２８９ 頁、１９９０年；ＤｅＣｌｅｒｃｋ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５２巻、第 ７０１頁、１９９２年；Ｂａｓｓｅｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ、第３４８巻、第６９９ 頁、１９９０年；Ｗｏｌｆ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 、第９０巻、第１８４３頁、１９９３年；およびＳａｔｏ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 、第７巻、第７７頁、１９９２年）；およびカテプシン（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔ等 、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．、第９巻、第３２１頁、１９９０年； お よびＫｏｂａｙａｓｈｉ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５２巻、第３６１０頁 、１９９２年）が増加することによって証明された。腫瘍浸潤に関係があると知 られている主要セリンプロテアーゼはプラスミノーゲン活性化カスケードを仲介 する。この経路ではプラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性化体によってプラ スミンに変換される。プラスミンは、メタロプロテアーゼの活性化を経て直接に または間接にＥＣＭの多くの成分を分解する広範囲のセリンプロテアーゼである 。プラスミノーゲン活性化体の活性は、プラスミノーゲン活性化体抑制タンパク 質：ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、およびプロテアーゼ・ネクシンによって負に調節 される（Ｃｈｅｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第４巻 、第８０２頁、１９９２年）。 乳房癌腫およびその他の癌中でのｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性 化因子）の発現が高まることが１９７０年代から多くの研究者によって報告され てきた（Ｔｅｓｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、第９ 巻、第３５３頁、１９９０年；Ｄａｎｏ等、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、 第４４巻、第１３９頁、１９８５年；Ｆｏｅｋｅｎｓ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ．、第５２巻、第６１０１頁、１９９２年；Ｏｓｓｏｗｓｋｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５２巻、第６７５４頁、１９９２年；ＳｕｍｉｙｏｓｈｉＮ Ｉｎ ｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第５０巻、第３４５頁、１９９２年；Ｄｕｆｆｙ等、Ｃ ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５０巻、第６８２７頁、１９９２年；およびＭｅｉｓ ｓａｕｅｒ等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、第１９２巻、第４５３頁、１９９ １年；Ｈｅｉｄｔｍａｎｎ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第４９巻、第６９６０ 頁、１９８９年；Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．、第６３巻、 第５９頁、１９９１年；Ｒｅｉｌｌｙ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第５０巻 、第２０８頁、１９９２年；Ｃａｊｏｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻、第６９３９頁、１９９０年；Ｆｏｕｃｒｅ等、Ｂｒ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第６４巻、第９２６頁、１９９１年；Ｓｈｉｒａｓｕｎａ等 、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５３巻、第１４７頁、１９９３年；およびＪａｎ ｉｃｋｅ等、Ｂｒ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．＆ Ｔｒｅａｔ．第２４巻、第１９５頁、 １９９３年）。さらに最近、ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２もまた悪性中で高まる ことが 分った（Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第５０巻、第３４５ 頁、１９９２年；Ｈｅｉｄｔｍａｎｎ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第４９巻、 第６９６０頁、１９８９年；Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ等、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．、 第６３巻、第５９頁、１９９１年；Ｒｅｉｌｌｙ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ 、第５０巻、第２０８頁、１９９２年；Ｃａｊｏｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻、第６９３９頁、１９９０年；Ｆｏｕｃｒｅ 等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第６４巻、第９２６頁、１９９１年；Ｓｈｉｒａ ｓｕｎａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５３巻、第１４７頁、１９９３年；お よびＪａｎｉｃｋｅ等、Ｂｒ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．＆ Ｔｒｅａｔ．、第２４巻、 第１９５頁、１９９３年）。これらの知見は正常細胞中ではプロテアーゼ／アン チプロテアーゼ平衡、腫瘍細胞ではそれが不均衡、という単純なパラダイムと矛 盾する。従って、ｕＰＡが転移性伝播においてどれだけ有効であるかの問題を混 乱させる。ｕＰＡレセプターおよびそれがｕＰＡ活性を変調するその重要性につ いての最近の研究（Ｔｅｓｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅ ｓ．、第９巻、第３５３頁、１９９０年；Ｖａｓｓａｌｌｉ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第１００巻、第８６頁、１９８５年；およびＬｕｎｄ等、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１０巻、第３３９９頁、１９９１年）はさらに高い水準の調節がある ことを示した。従って、ｕＰＡが基底膜およびＥＣＭの成分を分解することが出 来ることおよびそれがしばしば進行性乳房癌中で高められることは明白に確立さ れているが、乳房癌浸潤でのその明確な役割は未だ確立されていない。同様に、 乳房癌浸潤を抑制することにおいてのＰＡＩ−およびＰＡＩ−２の重要性は明白 には確立されていない（Ｔｅｓｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、第９巻、第３５３頁、１９９０年）。 マトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）はコラゲナーゼおよびストロ ームリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）を含む。ＩＶ型コラゲナーゼ（ゲラチナ ーゼ）は特に７２ｋＤａの形態で腫瘍浸潤中に活性であり、このことは攻撃的な ヒト腫瘍中でレベルが高まることによって示される（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖ ｅｎｓｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、第９巻、第２８ ９頁、１９９０年）。メタロプロテアーゼ活性の組織抑制物質、ＴＩＭＰ−１お よびＴＩＭＰ−２は、ＩＶ型コラゲナーゼを標的にし、ＴＩＭ−２は専ら７２ｋ Ｄａ形態と相互反応する（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第９巻、第５４１頁、１９９３年）。ストロー ムリシン−１（トランシン）及び−２はげっし歯類系での腫瘍進行に関与し、他 方ＰＵＭＰと呼称されるより小さい分子がヒト腫瘍細胞中で同定されている（Ｍ ａｔｒｉｓｉａｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、第３０２巻、第１５７頁、 １９９１年）。ストロームリシン−３についての広範な研究から進行性乳房癌と 強い相関があることが分っている（Ｂａｓｓｅｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ、第３４８巻 、第６９９頁、１９９０年；Ｗｏｌｆ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ、第９０巻、第１８４３頁、１９９３年）。このプロテアーゼは浸潤 性一次乳房癌腫に隣接する間質腺維芽細胞によって分泌され、上皮腫瘍細胞によ っては分泌されない。このことは腫瘍形成機構における細胞−細胞相互反応の重 要性を示している。発明の要旨 本願は、減法ハイブリッド形成法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ−ｈｙｂｒｉｄｉ ｚａｔｉｏｎ）によって初めて単離され、転移性カスケードの初期段階に対する 防御に関与する新規の遺伝子を開示する。この遺伝子はマスピン（ｍａｓｐｉｎ ）と呼称され、培養および正常乳房中の正常乳房上皮細胞中で発現される新規な セリンプロテアーゼ抑制物質をコードする。その発現は良好分化一次癌腫から不 良分化一次癌腫への進行の間に減少し、多くのリンパ節および遠隔の転移病巣に は存在しない。このタンパク質の推定構造はセリンプロテアーゼ抑制物質活性と 一致する。機能的研究の結果、このタンパク質は腫瘍抑制および浸潤抑制活性を 有することが示された。 従って、本発明はマスピン（即ち、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一 性を有し、アミノ酸置換はすべて好適には保存的である）または配列番号１の対 立変異体またはヒト以外の種からのマスピンの同族体と実質的に同一であるポリ ペプチドをコードする単離ＤＮＡを包含する。単離ＤＮＡは好適には配列番号２ のＤＮＡ配列と緊縮条件（ストリージェントな条件；以下に記載）でハイブリッ ド形成するＤＮＡ配列またはその相補配列を含有し、また配列番号２の配列を含 有することができる。それは好適にはベクター（ウイルス、ファージ、またはプ ラスミド）中に取り込まれ、そのベクターは細胞中に形質移入または感染によっ て導入され得る。ベクターは好適には一つまたはそれ以上の発現制御配列を含み 、その場合そのベクターによって形質移入された細胞はそのポリペプチドを発現 することができる。“単離ＤＮＡ”とは、単離ＤＮＡが取り出された動物の天然 産ゲノム中でマスピン遺伝子と隣合う遺伝子を含まない一本鎖または二本鎖ＤＮ Ａのことである。それ故、この用語は例えばマスピンをコードするｃＤＮＡある いはその対立変異体のいずれかあるいは両方の鎖、ベクター中または自家複製プ ラスミドあるいはウイルス中、または原核あるいは真核細胞のゲノムＤＮＡ中に 取り込まれた組換えＤＮＡ；またはゲノムＤＮＡ断片（例えば、ヒトまたは他の ゲノムＤＮＡのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または制限エンドヌクレアーゼ 処理によって生産される）を含む。それはまた追加のポリペプチド配列をコード するハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。 ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形成検定法の緊縮条件はＳ ａｍｂｒｏｏｋ等、分子クローニング、実験操作法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版、Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ．Ｈａｒｂｏｒ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９年に記載されている通りであり、こ こに参考として取り込まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の第７．５２頁を参 照。 （ａ）配列番号２の配列を有するＤＮＡと緊縮条件でハイブリッド形成する鎖 、（ｂ）その相補体、または、（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方を含む二本鎖ＤＮＡ 、を含み、全長が少なくとも１５個のヌクレオチドの単離ＤＮＡ（好適には少な くとも３０、さらに好適には少なくとも１００、最も好適には５００）もまた本 発明の範囲内にある。この単離ＤＮＡの多重コピー（例えば、ハイブリッド形成 プローブまたはＰＣＲプライマーとして有用）は、組換え方法によって、このＤ ＮＡを含有するベクターで細胞を形質導入することによって生産することができ る。 本発明はまた、マスピンタンパク質（配列番号１）の精製調製物、またはマス ピンの１０−３７４のアミノ酸残基（好適には少なくとも１２、さらに好適には 少なくとも１４、最も好適には少なくとも１８（例えば、２０またはそれ以上） ）を含有する抗原性ポリペプチドであるマスピンの断片を含む。そのポリペプチ ド断片は、断片に対して（ポリペプチドとスカシ貝ヘモシアニンとの抱合体に対 して）生成した抗体がマスピン自体と免疫複合体を形成するようなマスピンの抗 原決定基を含有する。この種の抗体はポリクロナールまたはモノクロナールのい ずれかであることができ、マスピンの抗原性部分を含有する抗原で動物を免疫感 作する工程を含む標準方法によって生産される。また、（２）第２ポリペプチド に共有結合している（１）マスピンまたはその抗原性断片を含有するハイブリッ ドポリペプチドも本発明の範囲内にある。この種のハイブリッドポリペプチドは 、共有結合がペプチド結合、または、ジスルフィドのような他の共有結合である 化学的共役の置換法を含む、当業者に公知の多くの標準方法によって作成するこ とができる。第２ポリペプチドへの結合マスピンまたはその抗原性断片は、第２ ポリペプチド（例えばグルタチオントランスフェラーゼ）が直接結合するアフィ ニティ−カラムの使用によって、タンパク質混合物からハイブリッドを容易に単 離する手段を提供する。この種のハイブリッドポリペプチドはまたマスピンまた はマスピン断片と比較して免疫原性が増加している利点を有するので、抗体がさ らに容易に得られる。 本発明の単離ＤＮＡおよび本発明の抗体の両者は癌腫を検出する診断方法、ま たは容疑癌腫が通常マスピン遺伝子を顕著かつ容易に検出可能な程度に発現する 細胞型から誘導される場合（例えば、乳房上皮細胞）癌腫をステージするのに有 用である。この種の診断方法には、所与型の上皮組織からの試験細胞（例えば、 組織切片または細胞調製物の形態で）を用意する工程；試験細胞のｍＲＮＡを配 列番号２の分節に対してアンチセンスである（即ち、センス鎖に対し相補的であ る）配列を含有する核酸プローブと接触させ、その分節が全長少なくとも１５個 （好適には少なくとも２０、さらに好適には少なくとも３０、一層さらに好適に は４０、最も好適には１００）のヌクレオチドである工程；および（１）プロー ブの試験細胞のｍＲＮＡとのハイブリッド形成量を（２）同型の上皮組織からの 正常制御（非癌性）細胞のｍＲＮＡとプローブとのハイブリッド形成量と比較し 、 試験細胞のｍＲＮＡとのハイブリッド形成量が正常制御細胞のｍＲＮＡで得られ る量より実質的に少量であることを、試験細胞が癌性であるということの指標と する工程が含まれる。試験細胞のｍＲＮＡとのハイブリッド形成がないことは試 験細胞が進行性で多分転移性である腫瘍からのものであるということの指標であ り、一方、検出可能であるが同一組織型の正常細胞中で測定される量より実質的 に少量である（例えば、３分の１またはそれ以下）ハイブリッド形成量は試験細 胞が多分未だ転移性でない初期の癌腫からのものであるという指標である。検定 法はインサイチュ・ハイブリッド形成法またはノーザン分析の標準技法を使用し て便宜的に行うことができる。 本発明の抗体に基づく検定法は上記のものと類似している。試験細胞のまたは 試験細胞を浸した液体からのタンパク質をマスピンに特異的な抗体（ポリクロナ ールまたはモノクロナール）と接触させ、この種のタンパク質で生成した免疫複 合体の量を試験細胞と同型の上皮組織からの正常対照細胞の（正常対照細胞を浸 した液体からの）タンパク質で同一抗体によって生成した量を比較する。試験細 胞のタンパク質で観察された免疫複合体量が正常対照細胞のタンパク質で観察さ れた量より実質的に少量であることは（例えば、約２分の１より少ない、好適に は約３分の１より少ない、およびさらに好適には約１０分の１より少ない）試験 細胞が癌性であることの指標である。試験細胞のタンパク質で生成する一貫して 検出可能な免疫複合体が存在しないことは、進行性で多分転移性である腫瘍から のものであるという指標であり、一方、免疫複合体量が一貫して検出可能である が同一組織型の正常細胞中で測定されたものより少量であることは（例えば、３ 分の１またはそれ以下）試験細胞が多分未だ転移性ではない初期段階の癌腫から のものであるという指標である。（一貫して検出可能とは、反復試行のすべてま たは殆どすべてにおいて、かなりなバックグラウンド水準よりも大きい量が観察 されることを意味する。） その他、マスピンタンパク質は通常乳房組織のような上皮組織によって分泌さ れるから、本発明の免疫検定法は生物学的液体について行うことができる。この 種の検定法では、その生物学的液体が対照量のマスピンを含有しかつ癌腫を持た ない個体から生物学的液体（例えば、血液、血清、尿、唾液、腺管液、涙、また は精液）の試料を得ることが必要である。試料またはその試料から誘導されるタ ンパク質をアンチ−マスピン抗体と接触させ、生成する免疫複合体量を決定する 。この量は生物学的液体中のマスピン濃度または量を示す。同一個体から予めま たはその後得た試料と比較した場合、この方法は癌腫の出現、進行、または治療 を監視する方法を提供する。 他の観点では、本発明は、マスピン遺伝子が無傷であるが下方調節されている 、即ちその癌腫中でのマスピンの発現水準がその型の組織からの正常上皮細胞中 での発現水準よりかなり低い（３分の１より少ない）所与の組織型から誘導され た癌腫からの細胞（原発細胞または樹立細胞株）をスクリーニング道具として使 用して、候補抗癌化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。その組織はヒ トまたは他の動物からのものであり、好適には乳房上皮である。スクリーニング で使用される細胞中では検出可能なマスピンの発現はないことが好適である。即 ち、マスピン遺伝子は完全に閉鎖している。スクリーニング法には、スクリーニ ング細胞の二つの試料を用意する工程が含まれ、その一つは候補抗癌化合物で処 理し、他方は対照として働く。処理試料中でのマスピンの発現水準と第２試料中 での水準を比較し、第１試料中での水準が高いことを候補化合物が潜在的抗癌剤 であるという指標とする。発現水準はここに記載したようにハイブリッド形成法 または免疫検定法を使用して決定することができる。 潜在的抗癌剤をスクリーニングする他の方法として、その中ではマスピンの発 現は検出されないが無傷のマスピン遺伝子を含有する細胞を使用することができ る。この細胞が候補抗癌化合物で処理され、それによってマスピン発現が細胞中 で増加したかどうかが決定される。この種のマスピン発現の増加は候補化合物が 潜在的抗癌剤であるという指標である。上記のように、発現の水準はハイブリッ ド形成または免疫検定法によって決定することができる。 癌腫細胞が誘導された組織型の正常細胞に比べマスピンの発現が減少している 癌腫を治療する方法も本発明の範囲内にある。これらの方法では、患者はその癌 腫細胞の中またはすぐ近辺でマスピン量を増加させる有効量の化合物で治療され る。例えば、この化合物はマスピンまたはその生物学的活性断片；マスピンをコ ードしかつ癌腫細胞中で発現を可能にする発現制御要素を有する核酸；または癌 腫細胞に内在性のマスピン遺伝子の発現水準を増加させる薬剤（即ち、マスピン 遺伝子の発現を上方調節するもの）である。 本発明は、候補抗癌剤を生体内でスクリーニングする方法またはマスピン発現 が同一組織型の正常細胞と比較して下方調節されている特殊な癌腫がマスピンの 発現を増加させる所与の化合物で治療しうるかどうかを決定する方法を特徴とす る。この種の方法には、（１）細胞中でのマスピン（配列番号１）の発現がその 癌腫細胞と同型の組織の正常細胞中でのものと比較して下方調節されている癌腫 細胞（例えば、乳房癌腫）を強度に免疫不全の動物（例えばヌードマウス）中に 導入する工程；（２）動物を癌腫細胞中または周辺で（即ち、直ぐ近辺で）マス ピンの濃度を増加させる化合物で治療する工程；（３）この治療が動物中の癌腫 細胞の増殖または転移速度に影響するかどうかを決定し、化合物の存在での増殖 または転移速度の減少を（ａ）化合物が癌腫治療に潜在的に有用でありかつ（ｂ ）その細胞が誘導された癌腫がその化合物で潜在的に治療しうるという指標とす る工程の諸工程が含まれる。 上記の生体内検定法の他に、以下詳細に記載する検定法に基づく癌腫細胞浸潤 能力の生体外検定法を利用することができる。この種の検定法には、（１）第一 および第二癌腫細胞を用意し、その細胞は前記癌腫細胞と同型の組織からの正常 細胞のそれより実質的に低い程度に（即ち、３分の１より少ない、細胞ｍＲＮＡ とのハイブリッド形成によって測定した場合）マスピン（配列番号１）を発現す る工程；（２）第一細胞を第一細胞中または周辺でマスピン（配列番号１）の濃 度を増加させる化合物で処理する工程；（３）以下に記載するような生体外検定 法で第一および第二細胞の各々の浸潤能力を比較し、第二（未処理）細胞と比較 して第一細胞の浸潤能力が減少することを（ａ）その化合物が癌腫の治療に潜在 的に有用でありかつ（ｂ）細胞が誘導された癌腫がこの化合物で潜在的に治療し うるという指標とする工程の諸工程が含まれる。この検定法はまた生物学的試料 中のマスピン活性を検出するのに有用であり（例えば、マスピンの精製工程の間 の、またはマスピン断片あるいは誘導体の生物学的活性を試験するために、また は血液、ミルク、あるいはその他生物学的液体の試料中のマスピンの存在を決定 するために）、第二（未処理）細胞のそれと比較して第一（処理）細胞の浸潤能 力が減少することをマスピンまたはマスピン生物学的活性が試料中に存在すると いう指標とする。 本発明の他の特徴および利点は次の詳細な説明および特許請求の範囲から明ら かである。 図面の簡単な説明 第１図は正常および腫瘍細胞中のマスピンの発現のノーザンブロット分析であ る。全細胞ＲＮＡはＤＦＣＩ−１培地で培養した対数増殖した細胞から単離した （Ｂａｎｄ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、第８６巻、 第１２４９頁、１９８９年）。２０μｇのＲＮＡを１％ホルムアルデヒドアガロ ーズゲル上で電気泳動して、ナイロン膜に移し、³²Ｐ標識マスピンプローブでハ イブリッド形成した。レーン１−３、正常乳房上皮細胞 ７０Ｎ、７６Ｎ、８１ Ｎ；レーン４−１１、乳房腫瘍細胞 ２１ＭＴ１、２１ＭＴ２、２１ＮＴ、２１ ＰＴ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｔ４７Ｄ、およびＺＲ７５−１。 第２図はマスピン遺伝子のサザンブロット分析である。ＤＮＡ（２０ｍｇ）を Ｘｂａｌで消化し、１％アガローズゲル上で分画し、ナイロン膜に移した。その ブロットを^３２Ｐ標識全長マスピンｃＤＮＡでハイブリッド形成した。レーン１ −２、正常乳房細胞 ７０Ｎおよび７６Ｎ；レーン３−１０、乳房腫瘍細胞株 ２ＩＭＴ１、２１ＭＴ２、２１ＮＴ、２１ＰＴ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ −ＭＢ−４３５、ＭＣＦ７、ＺＲ７５−１。 第３図はマスピンの完全ｃＤＮＡと予測アミノ酸配列を表示したものである（ 配列番号２）。ｃＤＮＡ配列決定はＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ ＣａｎｃｅｒＩｎ ｓｔｉｔｕｔｅのコア施設でＡＢＩ３７３Ａ自動ＤＮＡ配列分析器を使用して行 った。ポリアデニル化信号は強調してある。 第４図はマスピンのアミノ酸配列（配列番号１）と他のセルピンのアミノ酸配 列との比較である。同一残基は枠内に囲ってある。抗体生産に使用される３つの 領域は強調してある。矢印はマスピンの提案反応中心を示す。ａｔ、α１−アン チトリプシン（配列番号３）；ｅｉ、ヒト・単球／好中球エラスターゼ抑制物質 （配列番号４）；ｏｖａｌｂｕ、卵アルブミン（配列番号５）；ｐａｉｌ、ヒト ・プラスミノーゲン活性化因子抑制物質１型（配列番号６）；ｐａｉ２、ヒト・ プラスミノーゲン活性化因子２型（配列番号７）；ｓｅｒａｐｉｎ、ウマ・セラ ピン（配列番号８）。 第５Ａ図は正常および腫瘍細胞からのマスピンタンパク質のウェスタンブロッ ト分析である。細胞をＳＤＳ−負荷緩衝液中で溶解し、抽出液を１０％ＳＤＳゲ ル上で電気泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜に移した。マスピンをＥＣＬ系を使用 して抗血清Ａｂｓ１Ａによって検出した。レーン１、７６、；レーン２−５、腫 瘍細胞 ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＺＲ７５−１；レーン６、ＭＤＡ− ＭＢ−４３５ネオ形質移入体；レーン７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５マスピン形質移 入体。 第５Ｂ図は免疫沈降法を使用した正常細胞中のマスピンタンパク質の検出を示 すウエスタンブロットである。増殖正常細胞（７０Ｎ）はメチオニンおよびシス テインの^３５Ｓ標識混合物で標識し、４種のアンチーマスピン抗体の一つで免疫 沈殿させた（レーン１、免疫前血清；レーン２、ＡｂＳ３Ａ；レーン３、ＡｂＳ ４Ａ；レーン４、ＡｂＳ１Ａ）。 第６Ａ−Ｆ図は、アセトン固定正常乳房上皮細胞培養体中（第６Ａ図）、およ び良性乳房組織（第６Ｂ図）と癌腫性乳房組織（第６Ｃ図、腺管癌腫インサイチ ュ；第６Ｄ図および第６Ｅ図、浸潤性腺管癌腫；第６Ｆ図、転移性乳房癌を含有 する肋膜浸出液）のホルマリン固定パラフィン包埋切片中のマスピンタンパク質 発現を示す、イムノペルオキシダーゼによる染色組織切片の写真である。マスピ ン免疫活性部位は、その切片を１０％ショ糖中８０℃２時間前処理することによ ってホルマリン固定切片中で露出された。培養細胞および組織切片の両方を５μ ｇ／ｍｌのＡｂＳ４Ａと培養し、次いでビオチン化チラミンを使用してイムノペ ルオキシダーゼ検出を行った（Ａｄａｍｓ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏ ｃｈｅｍ、第４０巻、第１４５７頁、１９９２年）。３−アミノ−９−エチルカ ルバゾールをクロマゲンとして使用し、核をマイヤーのヘマトキシリンで対比染 色した。一次抗体ＡｂＳ４Ａの免疫化ペプチドによるプレソーブションによって 特異的なマスピン染色がすべて除去された。キー：ｓｍ、分泌マスピン；Ｌ、管 腔細胞；ｍｙｏ、筋上皮細胞；ｆ、線維芽細胞；ｄｃｉｓ、腺管癌腫インサイチ ュ；ｉｄｃ、浸潤性腺管癌腫；ｎｄ、正常良性乳房腺；ｐｅ、肋膜浸出液。 第７図はＭＤＡ−ＭＢ−４３５形質移入体中のマスピンのウエスタン分析であ る。マスピンをアフィニティー精製抗体ＡｂＳ１Ａによって検出した。レーン１ −５、新形質移入体；レーン６−１２、夫々、マスピン形質移入体クローンＴ１ 、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ２、およびＴ３。 第８図はマスピンに対する抗体の存在または不在での生体外の浸潤潜在力に対 するＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞中のマスピン形質移入の効果を示した棒グラフで ある。マスピン形質移入クローン（Ｔ１−Ｔ７）の再構成基底膜被膜（Ｍａｔｒ ｉｇｅｌ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）ポリカー ボネートフィルター（１０ｍｍ細孔を含有する）を貫通する浸潤能力を膜浸潤培 養システム（ＭＩＣＳ）を使用して７２時間に亘って測定した。１×１０^５細胞 を、１０％ＮｕＳｅｒｕｍ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含有するＤ ＭＥＭ中のＭａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルター上のＭＩＣＳ室の上部ウエル中に接 種した。３７℃一定酸素および二酸化炭素交換で７２時間培養した後、フィルタ ーに侵入した細胞を収集し、染色して光学顕微鏡で計数した。非形質移入ＭＤＡ −ＭＢ−４３５細胞の浸潤データを１００％に正規化し、実験および対照形質移 入体の浸潤データをこの対照のパーセントとして表現した。データは２回の実験 の平均である。誤差バーは平均値の標準誤差を表し、各実験でｎ＝６に基づく。 分泌マスピンの活性を中和するために、選択されたクローンを、別記しない限り １．０ ｍｇ／ｍｌの濃の浸潤検定の過程の間連続してＡｂＳ４Ａマスピン抗体 で前処理した。選択された実験において、追加の濃度の抗体を試験した。^*０． １および^**３．０ ｍｇ・ｍｌ。未処理クローンの浸潤潜在力を１００％に正規 化した。処理クローンの浸潤潜在力を未処理の各クローンのパーセントとして示 す。 第９図はＡｂＳ４Ａ抗血清の多くの乳房癌腫試料との反応性を示す図である。 アフィニティー精製ＡｂＳ４Ａ（５μｇ／ｍｌで）を、１０％スクロース中で８ ０℃１時間前処理したホルマリン固定５μｍパラフィン包埋切片と反応させた。 抗体−抗原複合体はビオチン化チラミンを使用する改良イムノペルオキシダーゼ によって視覚化された（Ａｄａｍｓ、Ｊ．Ｈｉｓｔｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ．、第４０巻、第１４５７頁、１９９２年）。陽性細胞％は、ＡｂＳ４Ａに反応 性 である癌腫細胞数を（Ａ）一次乳房癌腫および（Ｂ）乳房リンパ節転移体と肋膜 浸出液中の腫瘍細胞（○）の全数で除し１００をかけたものである。各記号は種 々の個体からの検体を示す。腺管性癌腫インサイチュ（■）中の多くの腫瘍細胞 はマスピンを発現した。浸潤性乳房癌腫（▲）の分化成分はいくらかのマスピン を発現した。貧分化新生物（●）はマスピン免疫反応性を示さなかった。 詳細な説明 マスピンの同定 減法ハイブリッド形成（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／８４４，２９６に記載）を使 用して、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）系統群の新しい成員を単離し、クローン化し 、配列決定し、部分的に特性を決定していた。この遺伝子の他のセルピン類との 配列類似性および乳房上皮細胞中での最初の同定から、マスピンと命名した。第 １図に示すように、マスピン遺伝子は３種の正常乳房上皮細胞株中で単一３．０ ｋｂ ｍＲＮＡを発現するが（Ｂａｎｄ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ、第８６巻、第１２４９頁、１９８９年）、第１図に示されている もの並びにＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３ ６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ５４９、およびＨＳ５７８Ｔ（示されていない ）を含む一連の腫瘍細胞株中ではない。単独患者の原発腫瘍からの２種の細胞株 （２１ＰＴおよび２１ＮＴ）（Ｂａｎｄ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５０巻 、第７３５１頁、１９８９年）はマスピンｍＲＮＡを発現するが、正常細胞と比 較して極めて低い水準である。包皮線維芽細胞も乳房由来線維芽細胞もマスピン ｍＲＮＡを発現しない。制限酵素ＸｂＩ使用した正常および腫瘍細胞からのＤＮ Ａのサザン分析（第２図）は、マスピンプローブとハイブリッド形成する５種の 断片を生成するが、それらの間にパターンの差がないことを示した。したがって 、この遺伝子は２１Ｔ系列を含む腫瘍細胞株中に存在しこの水準の分解で未変化 であり、その中で原発物（２１ＰＴ、２１ＮＴ）はｍＲＮＡを発現し、転移性起 源の細胞は発現しない。この証拠は、マスピンがクラスＩＩ候補腫瘍抑制遺伝子 であり癌細胞では下方制御されることを示唆する（Ｌｅｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻、第２８２５頁、１９９１年；Ｓａｇ ｅｒ 等、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、第７巻、第９６４頁−第９７０頁、１９９３年）。 マスピンｃＤＮＡ（配列番号２）をＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／８４４，２９６に 記載のように正常ヒト乳房上皮細胞ライブラリー（７６Ｎ）から単離した。第３ 図に示すように、ｃＤＮＡ配列は２５８４ヌクレオチドを含有し、ポリアデニル 化信号が配列の３′末端から１６ヌクレオチドに位置する。全長配列には５′非 翻訳領域の７５ヌクレオチドおよび３′非翻訳の１３８１ヌクレオチドが含まれ る。開始コドンおよび周辺ヌクレオチドはＫｏｚａｋ共通塩基配列に適合する（ Ｋｏｚａｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第１２巻、第８５７頁、１ ９８４年）。ｃＤＮＡはＮ末端メチオニンおよびＣ末端バリンを持つ３７５アミ ノ酸のタンパク質をコードする。またマスピンは８システイン残基を含有し、２ つまたはそれ以上のジスルフィド結合を利用してその３次構造を安定化すること ができる。 バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴを利用したデータベース検索に 基づき、かつＧＣＧパイルアッププログラムによって分析した多重線列研究から 、セリンプロテイナーゼ抑制物質のセルピン超系統群との密接な相同性が明らか である（第４図）。セルピン類は、各分子の全長に亘り、アミノ酸水準で１５− ５０％に変化しＤＮＡ水準でより高い一次配列の相同性によって関連付けられた 別種の系統群のタンパク質である。マスピンはタンパク質水準においてウマ（４ ３％）とヒト好中球−単球エラスターゼ抑制物質（３９％）、ヒトＰＡ−２（３ １％）、ヒト偏平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ、３４％）、およびニワトリ卵アルブミ ン（３１％）に最も密接な相同性を示す。 セルピン系統群 セルピン分子はプロテイナーゼ阻害（補体活性化、凝固、キニン形成、および 線維素溶解の阻害剤）、ホルモン輸送（チロキシン結合グロブリン、コルチゾー ル結合グロブリン）、血管に作用する活性をもつペプチド供与体（アンギオテン シノゲン）、および未知の機能（オバルミン）を含む重要な生理学的機能を有す る（総説については、Ｔｒａｖｉｓ等、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅ ｙｌｅｒ、第３７１巻、第３頁、１９９０年；Ｈｕｂｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． 、第２８巻、第１頁、１９８９年を参照）。 天然および開裂オバルミン、開裂α１−アンチトリプシン、開裂α１−アンチ キモトリプシン、および潜在プラスミノーゲン活性因子抑制物質−１についての 結晶構造は解明されている。（Ｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、第３４７巻、第１ ９９０頁、年；Ｗｒｉｇｈｔ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１３巻、第５１ ３頁、１９９０年；Ｌｏｅｂｅｒｍａｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１７７ 巻、第５３１頁、１９８４年；Ｂａｕｍａｎｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第 ２１８巻、第５９５頁、１９９１年；Ｍｏｔｔｏｎｅｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、第３ ５５巻、第２７０頁１９９２、年）。いずれの場合も構造は保存された分子フレ ーム枠を示し、極めて類似していることが分かった。これらの研究から、他のセ ルピンの未解明構造に関し予想を与える分子モデリングの有用性が確認された。 活性型の抑制性セルピン（Ｓ−形態）はその標的プロテアーゼと１：１化学量 論的に相互反応して、その中ではプロテアーゼが不活性である安定な変性耐性複 合体を生成する。標的プロテアーゼの特異性を決定する際に、反応中心の_Ｐ１の 性質が最も重要である。_Ｐ１位置にアラニン、バリン、またはメチオニンを持つ セルピンはエラスターゼ様プロテイナーゼの阻害因子であり、一方_Ｐ１位置にア ルギニンを持つセルピンはトリプシン様プロテアーゼを阻害する。 他のセルピンを持つマスピンの線列（第４図）はマスピンがプロテイナーゼ阻 害因子として作用することもできるという予備証拠を提供する。相同性線列から マスピン中の推定_ｐ１残基としてアルギニンが同定され、それがプラスミン、ｕ ＰＡ、およびｔＰＡのようなトリプシン様プロテアーゼを抑制することができる ことを示している。反応性部位ペプチド結合に先行するギャップのために、他の 線列が可能であるが、見込みのある線列は抑制性活性を生成する潜在力をもつｐ 残基を与える。 アンチ−マスピン抗体を使用したマスピンタンパク質の同定 ３種の保存性の低い配列は（第４図中にＳＩＡ、Ｓ３Ａ、およびＳ４Ａとして 強調されている）、スカシ貝ヘモシアニンとの抱合を利用して多クローン抗体生 産のための合成オリゴペプチドを設計する基礎として選択した。（Ｈａｒｌｏｗ 等、抗体、実験操作法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年、第８章）。抗血清を各々ＡｓＳ１Ａ、ＡｓＳ ３Ａ、およびＡｓＳ４Ａと表記した。ＡｓＳ４Ａは推定ｐ１−ｐ１′残基を取囲 む反応中心ロープを認識する。第５Ａ図に示すように、４２ｋＤａバンド正常細 胞中（７０Ｎ；レーン１）およびマスピンｃＤＮＡ（レーン７）で形質移入され た腫瘍細胞中（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）の両方に還元ＳＤＳゲル上で検出された 。この分子量は一次配列に基づく推定値と一致する。３種のすべての抗体調製物 はこの４２ｋＤａタンパク質と反応した。乳房腫瘍細胞株ＭＣＦ７、ＭＤＡ−Ｍ Ｂ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＺＲ７５−１中、または対照ベクタ ーで形質移入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５（レーン２−６）中にはタンパク質は 全く検出されなかった。３種のすべての抗血清は正常細胞抽出物からの４２ｋＤ ａバンドを沈殿した（第５Ｂ図）。これらの結果から、マスピン遺伝子は、正常 乳房上皮細胞中に存在するがｍＲＮＡを発現しない腫瘍細胞株中には存在しない ４２ｋＤａタンパク質をコードすることが示されている。 良性および悪性乳房中でのマスピン発現 正常ヒト乳房上皮細胞株（７６Ｎ）の間接免疫蛍光鏡検法の結果は、マスピン タンパク質が細胞質中で弱く着色して主として細胞周囲空間に局在することを示 した（第６Ａ図）。これらの結果から、マスピンはＥＣＭ中に分泌され、ＥＣＭ および／または血しょう膜上の標的プロテアーゼと反応することが分かる。培養 中に増殖した一次乳房腫瘍細胞（２１ＰＴ）は正常細胞と同様なパターンをもつ 弱い染色を示し、これはマスピンｍＲＮＡの低水準の発現と一致していた（第１ 図）。一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は陰性であった。マスピン抗血清ＡｂＳ １Ａ、ＡｂＳ３Ａ、およびＡｂＳ１Ａは各々、対応する免疫ペプチドによって予 備吸収される同様の染色パターンを示した。 第６Ａ図および第６Ｂ図に示すように、良性乳房組織（ｎ＝６）および浸潤性 癌腫に隣接する良性上皮のアセトン固定凍結切片およびホルマリン固定、パラフ ィン包埋切片は、ＡｂＳ４Ａで免疫染色した場合、マスピン陽性であった。マス ピン発現は筋上皮細胞中、大腺管および末端腺管小葉単位体内（ＴＤＬＵ）で特 に強かった。管腔上皮細胞は不均質状に陽性であり（しばしば、いくらかの細胞 の弱い顆粒細胞質免疫陽性を示す）、管腔内分泌物質にさらに強い反応性および いくらかの陽性があった。炎症および間質細胞は常に陰性であった。 乳房の１２の浸潤性癌腫、１１の局部リンパ節転移体、転移性乳房癌を含有す る２の肋膜浸出液、および隣接インサイチュ上皮要素もマスピン発現について評 価した（第９図）。癌腫インサイチュは弱い免疫陽性であり、重要な発現が時々 記録された。マスピン発現は筋上皮細胞（基底膜に隣接）内で最高であった。分 泌マスピンは時々、良性乳房の管腔スペース（第６Ｂ図）および腺管癌腫インサ イチュ（第６Ｃ図）中に観察され、まれに浸潤性腺管癌腫中、例えば良好分化管 状変異体（第６Ｄ図）中に観察された。浸潤性癌腫中の多くの悪性細胞はマスピ ンを発現しないが（第６Ｅ図）、良好分化腫瘍中の少数の細胞は集中的にマスピ ンを発現する（第９図）。マスピンは試験したすべてのリンパ節転移体および肋 膜浸出液中に検出されないかまたは極めて弱く発現した（第６Ｆ図）。これらの 知見は、良性乳房中でのマスピンの生物学的役割および乳房癌の進行中でのマス ピン発現の潜在的に重要な変化を示唆している。 マスピンを発現する腫瘍形質移入体のヌードマウス中での増殖の減少 腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５はヌードマウス中で正常位注射部位で腫瘍を 形成し、転移する（Ｐｒｉｃｅ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５０巻、第７１ ７頁、１９９０年）。マスピンがヌードマウス中の腫瘍形成に抑制効果を有する かどうかを研究するために、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株をＣＭＶプロモータの 制御の下にマスピンをコードする発現ベクターで形質移入した（Ｔｏｍａｓｅｔ ｔｏ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第１２２巻、第１５７頁、１９９３年）。 外因性遺伝子は正常細胞と同様の水準で３．０ｋｂ ｍＲＮＡおよび４２ｋＤａ タンパク質を発現し、他方ネオ対照はマスピンを発現しなかった（第７図）。形 質移入クローンＴ２およびＴ４中のマスピンの低い水準はマスピン形質移入体中 での不安定性が原因である。細胞培養体、マスピン形質移入体、ネオ対照、およ びＭＤＡ−ＭＢ−４３５親細胞はすべて５％胎児ウシ血清を含有するα−ＭＥＭ 培地中で同一速度で成育した（データは示していない）。 ４つのマスピン形質移入体および２つのベクター対照形質移人体をヌードマウ スで記載通り試験した（Ｐｒｉｃｅ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５０巻、第 ７１７頁、１９９０年）。第１表は２回重複実験から得た結果をまとめたもので ある。接種後１０週で、全マウスを犠牲にして、その腫瘍を摘出し秤量した。６ −１０週の間、腫瘍の負担および疾病のために死亡したマウスがあった。４つの マスピン形質移入体クローンのうち３つはベクター対照クローンより極めて小さ い腫瘍を形成し、他方１つのクローン（Ｔ１）はＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびネ オ対照と同一の速度で成長した。スチューデントｔ検定を使用して、Ｔ１を計算 に含めるかどうかに拘らずマスピン形質移入とネオ対照との間の差は有意であっ た。 これらの結果から、マスピン発現が対照と比較して注入形質移入体の増殖を抑 制する結果となることは明らかである。Ｔ１は抑制されず、一方他の３つの形質 移入体は強力に抑制されたことは明らかである。他の研究室では増殖因子発現を 間接的に多分ＥＣＭの開烈成分によって誘発するプロテアーゼの効果を報告して いたから、腫瘍増殖に対するマスピンの抑制効果は予期できなかったのかもしれ ない（Ｔｅｓｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．９：３５ ３，１９９０）。 マスピン形質移入体の浸潤能力の減少 マスピンの機能的活性を評価するために、再構成基底膜マトリックス（Ｍａｔ ｒｉｇｅｌ）への腫瘍細胞の侵入の生体外検定法を使用した（Ｈｅｎｄｒｉｘ等 、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３８巻、第１３７頁、１９８７年）。７つ のマスピン形質移入体クローンと５つのネオベクター形質移入体クローンを親Ｍ ＤＡ−ＭＢ−４３５細胞と比較した。７つのマスピン形質移入体クローンの内６ つ（Ｔ２−Ｔ７）が減少した浸潤能力を示した。第８図に示すように、この差は ペプチドアフィニティー精製抗体ＡｂＳ４Ａにより投与量依存的に中和された。 この抗体は形質移入細胞によって生産された組換えマスピンの抑制効果を遮断し 、その結果浸潤活性は上昇した。ＡｂＳ４Ａはこのタンパク質の反応中心を認識 するから、標的プロテアーゼとの反応部位が遮断されたようである。 免疫蛍光鏡検法によって、マスピン発現は前浸潤細胞中で不均質であることを 認めた。しかし、後浸潤細胞中では染色の結果９５％以上がマスピン陰性である ことが分かった。従って、浸潤を抑制するマスピンの有効性は、形質移入体集団 中の発現の不均質性のために、これらの実験でいくらか過少評価されている。さ らに、マスピン陰性細胞のみがＭａｔｒｉｇｅｌ隔壁を通過するという発明者の 証拠は、マスピンを発現する細胞が侵入能力を抑制されていることをさらに示し ている。 さらに、５つのネオ対照形質移入体を浸潤能力について試験した（データは示 していない）。これらの内、２つが親細胞に匹敵する浸潤能力を示し、一方それ らの内３つが浸潤能力の減少を示した。しかし、５つのネオ対照の内ＡｂＳ４Ａ 抗体に反応するものはなく、このことはマスピンが対照の浸潤性減少の原因では ないことを示している。この結果は第５Ａ図に示すようにネオ対照のマスピンタ ンパク質の不在と一致する。Ｌｉｏｔｔａの３工程浸潤モデル（Ｌｉｏｔｔａ等 、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第５１巻、第５０５４頁、１９９１年）（即ち、付 着、崩壊、および運動性）の観点から、１２すべての形質移入体（マスピンを含 有する７つおよび５つの対照）のＭａｔｒｉｇｅｌマトリックスへの付着を検討 した。それらの間には差はなかった（データは示されていない）。 これらのデータはマスピンの活性が腫瘍細胞浸潤潜在能力の抑制に関与してい るという仮説を支持している。浸潤検定において浸潤潜在能力の抑制を示す同一 形質移入体（Ｔ１）が、ヌードマウス検定法で試験した場合、腫瘍の減少を示さ なかったことは注目すべきことである。親細胞よりさらに浸潤性であるこのクロ ーンは新規のプロテアーゼを過剰発現することができ、さらに検討の価値がある 。 マスピンの染色体位置 ２４のヒト−げっし歯類体細胞ハイブリッドのパネルを使用して、マスピン遺 伝子の染色体位置の地図作成を行った。全ハイブリッドは染色体２０と染色体４ の低パーセントの両方を含有する１株および染色体１と染色体Ｘの両方を含有す る１株を除いて単一ヒト染色体を保有した。ヒトＤＮＡでは、マスピンプローブ は主要５．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を検出した。これは明らかに約２０ｋｂ の弱くハイブリッド化するチャイニーズハムスター断片から分解したものである 。ハイブリッドクローン中の５．４ｋｂヒト・マスピン配列の存在はヒト染色体 １８の存在のみと関係していた（第２表）。分析した２４のハイブリッドの内１ つのみがマスピンについて陽性であった。このハイブリッドは唯一のヒトＤＮＡ として染色体１８を含有した。染色体１８への局在についての不一致は認められ ず、一方他の染色体への局在について少なくとも２つの不一致があった。マスピ ン遺伝子は、プラスミノーゲン活性化体抑制物質−２（ＰＡＩ−２）をコードす る密接に関連する遺伝子ＰＬＡＮＨ２と同一染色体領域である１８ｑ２１．３に 局在していた（ＬｅＢｅａｕ等、（ヒト遺伝子地図作製）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍａｐｐｉｎｇ １１、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．、第５ ８巻、第７３９頁、１９９１年）。 実施例 １：組換えマスピン 上記の情報を利用して、通常の当業者はマスピンｃＤＮＡ配列（配列番号２） の２０個−ヌクレオチド切片からなる合成ＤＮＡプローブを生産することができ 、またそのプローブ使用して適切な上皮細胞株例えばＭＣＦ７から高い緊縮条件 でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。その他、開示され たｃＤＮＡ配列に基づいて適切な２種のＰＣＲプライマーを設計し、いづれか同 一ライブラリーからかまたはその細胞株のｍＲＮＡから直接にマスピンｃＤＮＡ を生産することができる。これらの手順は両方とも当業者によって容易に実施さ れる標準方法である。そのように得られたｃＤＮＡの配列決定すると、それがこ こに開示されたマスピンｃＤＮＡであることが確認される。このｃＤＮＡの多重 コピーは、ｃＤＮＡを組換えベクター中に挿入しそのベクターを使用して原核宿 主例えば大腸菌に形質移入することによって容易に生産される。このｃＤＮＡお よびその断片は、このような他の種の中のマスピン同族体を同定するために、ヒ ト以外の種（例えば、哺乳類例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、 ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、サル、類人猿；および非哺乳動物例えば鳥 ）または昆虫（例えばショウジョウバエ）；または微生物（例えば酵母）から上 皮細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。 ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーは、ヒトｃＤＮＡと完全な配列同一 性 が多分欠けていることを考慮に入れて調整しなければならないようである。 所望のマスピンｃＤＮＡが手に入ると、それを発現ベクター中に挿入し、組換 えマスピンタンパク質を生産するために適切な発現系中で使用することができる 。発現系は、原核（例えば大腸菌）、真核（例えば酵母、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細 胞、または昆虫のバキュロウイルス）、または無細胞系を含むいずれの標準系に もすることができる。そのタンバク質は分泌されるようであるので、大腸菌の培 養濾過液から、または形質移入された昆虫あるいは他の真核細胞を浸した培地か ら収集することができる。任意的にイムノアフィニティーカラム上の通過を含む タンパク質精製の標準法を使用して組換えタンパク質を単離することができる。 実施例 ２：ハイブリッド形成プローブを使用する診断法 上記のように、本発明のマスピンーコード配列（配列番号２）のいくつかまた はすべてを含有する核酸プローブを使用して、癌性の疑いのある上皮細胞（例え ば組織肋片）の試料中のマスピンｍＲＮＡを検出することができる。使用するプ ローブは単鎖ＤＮＡまたは第３図に示したコード配列にアンチセンスであるＲＮ Ａ（好適にはＤＮＡ）である。それは合成または組換えＤＮＡ方法によって生産 し、放射性トレーサまたは他の標準検出手段で標識することができる。プローブ は１５個−全１１２５個のヌクレオチドのコード配列を含むことができ、好適に は全長少なくとも３０個のヌクレオチドである。この検定法は、ストリンゲント なハイブリッド形成条件を使用したそのハイブリッド形成またはノーザン分析の 標準方法によって実施することができる。対照ハイブリッド形成検定法は、試験 試料と同一型の組織からの正常上皮細胞または組織切片および／または既知癌腫 あるいは癌腫誘導細胞株からの細胞または癌含有組織切片を使用して平行して実 施することができる。プローブに対するハイブリッド形成が正常上皮細胞で見ら れた水準と比較して実質的に減少した水準または不在を示す細胞は癌性であるよ うである。ハイブリッド形成量は標準方法例えば生検スライドのインサイチュ・ ハイブリッド形成検定上の放射能暴露されたエマルジョンの粒子を計数する方法 、またはノーザンブロットＸ線フィルムを自記濃度計で走査する方法によって定 量することができる。その他、対照検定の結果と試験桧定の結果との比較は、特 に ハイブリッド形成の水準が大きい場合には、定量的よりもむしろ相対的である。 この検定法は乳房上皮組織中またはマスピンが正常に発現する他の型の組織中の 癌細胞を検出するのに有用である。 実施例 ３：抗体プローブを使用する診断法 マスピンに特異的である抗体は、免疫抗原として天然由来精製マスピン、組換 えマスピン、または天然由来マスピンと反応する抗体を誘発するマスピンの抗原 性断片を使用して標準多クローンまたは単クローン法によって生産することがで きる。後者の断片は合成法または組換え法または完全マスピンのタンパク質分解 的消化によって生産することができる（抗体生産に有用な断片の３つの実例は上 記してある）。所望に応じて、抗原性断片は、その断片の免疫抗原性を増加させ る分子例えばスカシ貝ヘモシアニン（上に記載）に標準方法によって結合させる ことができる。そのように生産された多クローンまたは単クローン抗体は、組換 えまたは天然産精製マスピンを使用してスクリーニングして、上記のようにマス ピンと特異的に免疫複合体を形成するものを選択ことができる。 そのように生産された抗体は、正常細胞に比較してマスピンの存在が減少して いる細胞、組織、または生物学的液体、即ち患者が癌腫を持っているという指標 を検出する診断方法に使用される。試験試料は生体組織検査の固定切片、容疑組 織から得られた細胞試料、または生物学的液体例えば血液、血清、尿、汗、涙、 脳脊髄液、腺管液、または精液である。上記の方法並びにサンドウィッチＥＬＩ ＳＡを含む免疫検定法の標準方法が使用することができる。同一組織型の正常細 胞が検出可能水準のマスピンを発現するが、試験細胞がこの方法で検出可能なマ スピンタンパク質を発現しない場合、その試験細胞は進行性転移性癌腫であるよ うである。試験細胞が減少しているが一致して検出可能な水準のマスピンを発現 する場合、試験細胞は多分未だ転移性でない初期の癌腫からのものである。試験 試料がマスピンが通常分泌される生物学的液体である場合、その液体を直接アン チ−マスピン抗体と接触させることがでぎ、またはアンチ−マスピン抗体を使用 する前に最初に部分的に処理することができる（例えば遠心分離、他の抗体によ る予備清澄、透析、あるいはカラムへに通す）。次いで、試料のタンパク質とア ンチ−マスピン抗体との間に生成した免疫複合体量を決定し、平行して実施した 正常な対照または予め決定した標準値と比較することができる。 実施例 ４：生体内および生体外検定法 腫瘍増殖を強度の免疫不全マウス（例えばヌードマウス）中で測定する上記の 生体内検定法は、本発明に関する多くの用途に有用である。例えば、この検定法 は（１）ある所与の癌腫の増殖がマスピンまたは癌腫細胞中のマスピン濃度を増 加させる薬剤のいずれかによる処理によって抑制されるかどうか、（２）マスピ ン発現が下方調節されている癌腫中でマスピン発現を増加することが知られてい るある所与の候補化合物は事実この種の癌腫の増殖を抑制することができるかど うかを決定するのに使用することができる。ヌードマウス（または他に強度の免 疫不全動物例えばラット、ウサギ、または他の動物）もまた、転移の生体内分析 の標準法を使用して、腫瘍の転移速度に対する所与の治療法の効果を研究するの に適している。上記の検定法の第二型、即ち再構成基底膜マトリックス（例 Ｍ ＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））への腫瘍細胞の侵入の生体外検定法もまた本発明 に関して一般的に有用である。この検定法を使用して、ある所与の癌腫のある期 間にわたってのまたは種々の患者からの一連の癌腫の浸潤能力の増加を各癌腫試 料中でのマスピン発現の抑制の度合と関係ずけることができる。この検定法は使 用して、ある所与のマスピン増加のプロトコールがある所与の癌腫中で浸潤能力 を減少させるのに有効かどうかを決定するために種々の治療プロトコールをスク リーニングすることができる。 実施例 ５：無傷遺伝子の存在の検定法 マスピン腫瘍抑制遺伝子の発現がある所与の癌腫細胞中で下方調節されている がその遺伝子はその細胞中で無傷で存在しているとき、その遺伝子が再発現を刺 激して、それによって癌腫の進行を反転させるかまたは少なくとも停止させる方 法でその細胞を処理することが可能である。 この戦略にはその遺伝子が無傷でありそれ故処理される特殊な癌細胞中で上方 調節されるという確認が必要である。上記のような癌細胞および正常細胞からの ゲノムＤＮＡのサザン分析から、癌細胞中のマスピン遺伝子大部分無傷である証 拠が得られる。一組の制限酵素を使用すれば、遺伝子配列の変化が癌細胞中で起 こったかどうかについてさらに厳密に分析できる。ハイブリッド形成プローブと して、マスピンｃＤＮＡ（配列番号２）、マスピンゲノムＤＮＡ、またはそのい ずれかの断片を使用することができる。マスピンゲノムＤＮＡを得るために、Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ等、分子クローニング：実験操作法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、ＣｏｌｄＳ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ ａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９年（参考としてここに取り込まれる）のような標準 法を使用して、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーをマスピンｃＤＮＡ（配列番号２ ）でプローブする。転写の下方調節が腫瘍の進行に関係しているから、天然産マ スピン遺伝子の発現制御要素（例えば、通常は転写開始部位へ５′に位置するま たは一つあるいはそれ以上のイントロン内で多分３′非翻訳領域中にあるプロモ ータおよびエンハンサー）は特に興味深い。 実施例 ６：治療薬のスクリーニングと利用 内在性マスピン遺伝子が存在するが下方調節されている癌腫細胞または他の細 胞をスクリーニングの道具として使用して、マスピン遺伝子の再発現を誘発する 化合物または治療戦略を決定することができる。他の下方調節された候補腫瘍抑 制遺伝子の再発現については記載されている、即ちＰＭＡによるギャップ連結タ ンパク質をコードするコネキシン２６（Ｌｅｅ等、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、第 １１８巻、第１２１３頁、１９９２年）、およびデオキシアザシチジンによる小 分子のカルシウム結合タンパク質ＣａＮ１９の再発現（Ｌｅｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、第２５０４頁、１９９２年）。 この種のスクリーニングには適切な癌腫から誘導された細胞株が特に有用であり 、上記のように、ｃＤＮＡの構成性発現を可能にする発現制御要素（例えばＣＭ Ｖプロモータ）に連鎖したマスピンｃＤＮＡをコードベクターで形質移入された 同一細胞を対照とする。しかし、無傷であるが非発現のマスピン遺伝子を持つ他 の細胞型もまたこのスクリーニングに潜在的に有用である。その細胞を候補化合 物 で生体外で処理し、マスピンの発現量をハイブリッド形成検定法（例えば、ノー ザン分析）または免疫検定法のいずれかを使用して決定する。後者は細胞内マス ピンあるいは分泌マスピン、またはその両者を検出するように設計する。ある所 与の化合物が癌腫細胞中のマスピン発現を刺激することが分かっている場合、そ の化合物による治療が上記のヌードマウスモデル中の癌腫増殖を防止するどうか を調べるためにさらに試験する。マスピン発現を刺激することおよび癌腫増殖を 防止することの両方に有効である化合物は、マスピン発現で下方調節された癌腫 の治療に有用な潜在的治療薬である。この種の化合物の臨床的有用性をさらに評 価した後、次いで抗癌剤の毒性および臨床的有効性を評価する標準方法を行う。 実施例 ７：マスピンによる治療法 上記のように、癌腫細胞中のマスピン量の増加は腫瘍の増殖および浸潤能力の 減少と関連するようである。従って、患者をマスピンまたはマスピンの生物学的 活性（即ち、プロテアーゼ抑制性）断片で治療することは、患者の癌腫細胞中で マスピン遺伝子の下方調節の効果を打消すのに役立つことが期待される。マスピ ンは分泌タンパク質であるから、それは多分細胞外でその腫瘍増殖抑制効果を奏 する。それ故有用なプロトコールは日常の薬理学的方法を使用して決定される最 も有益な範囲である０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で製剤上許容で きる溶液でこのタンパク質を静脈注射するような簡単な方法である。このプロト コールは腫瘍のすべての転移に潜在的に達する利点を有する。投与の他の経路例 えば筋肉内または皮下注射、腫瘍部位への直接的な注射、または除放調合物を含 有する調製物の移植もまた容認できるものである。外因性のマスピンタンパク質 が癌腫細胞自体中に確実に取り込まれることが望まれる場合、リポソームまたは そのタンパク質の実質的な量を細胞膜を通過させる担体の他の形態中にそのタン パク質を取り込ませることができる。リポソームもまた血流中でのタンパク質分 解的崩壊からタンパク質を保護するのに役立つ。 実施例 ８：遺伝子治療 上記のように、マスピンをコードする発現ベクターは癌腫細胞中に導入し、そ れによって形質移入細胞中のマスピン生産を増加させ、これらの細胞から誘導さ れる腫瘍の生体内増殖速度を減少させることができる。形質移入細胞は上記のよ うに非形質移入対照と比較して浸潤性が減少している。この証拠から、本発明の マスピンＤＮＡ、マスピン発現が下方調節されている特徴をもつ癌腫を制御する のに役に立つ、またはマスピンを生産する能力を未だ失っていない初期癌腫が漸 進的に下方調節される段階に進行しないことを確保する遺伝治療に有用であるこ とが分る。遺伝子治療の標準方法を使用することができる。例えば、Ｆｒｉｅｄ ｍａｎｎ、遺伝病の治療法（Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓ ｅａｓｅ）、、Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓ ｓ、１９９１年、第１０５頁−第１２１頁。癌腫細胞中での発現を可能にする発 現制御配列に連結しているマスピンｃＤＮＡのコピーを含有するベクターまたは プラスミドは腫瘍の部位に局所的にまたは全身的に（他の部位に転移した腫瘍細 胞を到着するために）患者に導入される。マスピンをコードする形質移入ＤＮＡ が標的癌腫細胞のゲノム中に安定的には導入されない場合、治療を定期的に反復 しなければならない。 第１表 マスピン形質移入ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞の腫瘍増殖 細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ、５×１０⁵細胞をヌードマウス（第１回の実験 では８−１０週令、第２回の実験では４−６週令）の乳房脂肪パッド中に注射し た。各マウスの２部位に注射した。腫瘍発生を毎週監視した。括弧内の数字は１ ０週目の腫瘍の数である。 第２表 マスピン配列とヒト−げっし歯類細胞ハイブリッド中のヒト染色体との 相関関係 親細胞株およびハイブリッド細胞株（マッピングパネル２としてＮＩＧＭら得 た）から単離した高分子染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｕｎｄＩＩＩで処理 し、０．８アガローズゲル中で分別し、ナイロンフィルタに移ポリした。ヌクレ チオド標識法によって³²Ｐ標識マスピンｃＤＮＡプローブを調整し、文献に記載 の通り、フィタ中でハイブリッド形成させた（Ｈａｇｉｗａｒａ等、Ｍｏｌ．ｃ ｅｌｌ Ｂｉｏ．、第１１巻、第２１２５頁、１９９１年）。 配列リスト (1)一般情報： (i)出願人 ： サガー ラス (ii)発明の名称 ： マスピン、腫瘍抑制活性を有する新規なセルピン (iii)配列の数 ： ８ (iv)対応アドレス： (A)名宛人 ：フィシュ アンド リチャードソン (B)通り ：225フランクリンストリート (C)市 ：ボストン (D)州 ：マサチューセッツ (E)国 ：アメリカ合衆国 (F)郵便番号 ：02110-2804 (V) コンピュータ読み出し形態： (A)媒体形式 ： 3.5″ディスク，1.44 Mb (B)コンピュータ ： IBM PS/2 モデル50Z または55SX (C)作動システム ： MS-DOS（バージョン5.0） (D)ソフトウェア ： ワードパーフェクト（バージョン5.1） (VI) 現出願データ： (A)出願番号： (B)出願日： (C)分類： (vii) 優先出願データ： (A)出願番号： 07/938,823 (B)出願日： １９９２年２月２８日 (A)出願番号： 07/844,296 (B)出願日： １９９２年２月２８日 (A)出願番号： 07/662,216 (B)出願日： １９９２年２月２８日 (viii)代理人情報： (A) 氏名： フラサー ジャニス ケイ (B)登録番号： 34,819 (C)整理番号： 00530/072001 (ix)遠隔通信情報： (A)電話番号： （617）542-5070 (B)ファックス番号： （617）542-8906 (C)テレックス番号： 200154 (2)配列番号1の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 2584 (B)配列の型： 核酸 (C)鎖の数： 二本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号1の記載： (2)配列番号2の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 375 (B)配列の型： アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号2の記載： (2)配列番号3の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 418 (B)配列の型： アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号2の記載： (2)配列番号4の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 379 (B)配列の型： アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号4の記載： (2)配列番号5の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 379 (B)配列の型： アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号5の記載： (2)配列番号6の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 390 (B)配列の型： アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号6の記載： (2)配列番号7の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 405 (B)配列の型： アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号7の記載： (2)配列番号8の情報： (i)配列の特徴： (A)配列の長さ： 375 (B)配列の型： アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー： 直鎖状 (xi)配列番号8の記載：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ 16/18 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 9284−4Ｃ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．マスピン（配列番号１）と実質的に同一であるポリペプチドをコードする単 離ＤＮＡ。 ２．前記ＤＮＡが配列番号２のＤＮＡ配列とストリンジェント条件でハイブリッ ド形成する配列またはその相補鎖からなる請求項１に記載の単離ＤＮＡ。 ３．前記ＤＮＡが配列番号２の配列またはその相補鎖からなる請求項１に記載の 単離ＤＮＡ。 ４．前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項１に記載の単離ＤＮＡ。 ５．前記ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項１に記載の単離ＤＮＡ。 ６．（ａ）配列番号２の配列を有するＤＮＡとストリンジェント条件でハイブリ ッド形成する一本鎖、（ｂ）その相補鎖、または、（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両者 からなる二本鎖ＤＮＡ、を含む全長少なくとも１５個のヌクレオチドの単離ＤＮ Ａ。 ７．請求項１に記載の単離ＤＮＡを含むベクター。 ８．前記単離ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項７に記載のベクター。 ９．前記ベクターが発現制御配列を包含する請求項７に記載のベクター。 １０．請求項７に記載のベクターで形質導入された細胞。 １１．前記細胞が前記ポリペプチドを発現する請求項１０に記載の細胞。 １２．請求項６に記載の単離ＤＮＡからなるベクターで形質導入された細胞。 １３．マスピン（配列番号１）の精製調製物。 １４．マスピン（配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質）の１０−３７ ４のアミノ酸残基からなる抗原性ポリペプチドであって、しかも前記ポリペプチ ドが前記ポリペプチドとスカシ貝ヘモシアニンとの抱合体に対して生成した抗体 がマスピンと免疫複合体を形成するようなマスピンの抗原決定基からなることを 特徴とする抗原性ポリペプチド。 １５．マスピン（配列番号１）と免疫複合体を形成する抗体。 １６．マスピン（配列番号１）の抗原性部分からなる抗原で動物を免疫感作する 工程からなる抗体を生産する方法。 １７．ある所与型の上皮組織から癌性であると疑われている試験細胞を用意する 工程、 前記試験細胞のｍＲＮＡを請求項６の単離ＤＮＡを含む一本鎖核酸プローブと 接触させ、前記ＤＮＡが配列番号２の分節に対しアンチセンスとする工程、 （１）前記試験細胞の前記ｍＲＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成量と、 （２）前記型の上皮組織からの正常制御細胞のｍＲＮＡと前記プローブとのハイ ブリッド形成量と、を比較し、 前記試験細胞のｍＲＮＡとのハイブリッド形成量が前記正常制御細胞のｍＲＮ Ａで得られる量より実質的に少量であることを前記試験細胞が癌性であるという ことの指標とする工程、 の諸工程を含む診断方法。 １８．前記分節が全長少なくとも３０個のヌクレオチドである請求項１７に記載 の方法。 １９．前記ハイブリッド形成が前記上皮組織の固定試料を使用してｉｎ ｓｉｔ ｕで行われる請求項１７に記載の方法。 ２０．前記ハイブリッド形成がノーザン分析として行われる請求項１７に記載の 方法。 ２１．前記上皮組織が乳房上皮組織である請求項１７に記載の方法。 ２２．ある所与型の上皮組織から癌性と疑われた試験細胞を用意し、前記試験細 胞が癌性であると疑われる工程、 試験細胞のタンパク質を請求項１５に記載の抗体と接触させる工程、（１）前 記抗体と前記タンパク質とによる免疫複合体の形成量と、（２）前記抗体と前記 型の上皮組織からの正常制御細胞のタンパク質とによる免疫複合体の形成量と、 を比較し、 前記試験細胞のタンパク質による免疫複合体の形成量が前記正常制御細胞のタ ンパク質で得られる量より実質的に少量であることを前記試験細胞が癌性である ということの指標とする工程、 の諸工程を含む診断方法。 ２３．前記上皮組織が乳房上皮組織である請求項２２に記載の方法。 ２４．ある所与の組織型からの癌腫から細胞の第一および第二試料を用意し、前 記癌腫中でのマスピン（配列番号１）の発現水準が前記型の組織からの正常上皮 細胞中での発現水準より実質的に少量である工程、 前記第一試料を候補化合物で処理する工程、 前記第一試料中でのマスピンの発現水準と前記第第二試料の水準とを比較して 、前記第一試料中での発現水準がより高いことを前記候補化合物が潜在的抗がん 剤 であるということの指標とする工程、 の諸工程を含む候補抗癌性化合物をスクリーニングする方法。 ２５．ある所与型の組織から誘導された癌腫を有する患者を同定して、前記癌腫 が前記型の組織からの正常上皮細胞中でのマスピンの発現水準と比較してマスピ ン（配列番号１）の発現水準が減少していることを特徴とする細胞を有する工程 、 前記患者を前記癌腫細胞中または直ぐ近辺でマスピンの量を増加させる化合物 で処理する工程、 の工程を含む癌腫の治療方法。 ２６．前記化合物がマスピンまたはその生物学的活性断片である請求項２５に記 載の方法。 ２７．前記化合物がマスピンをコードしかつ前記癌腫細胞中で発現を可能にする 発現制御要素を有する核酸である請求項２５に記載の方法。 ２８．前記化合物が前記癌腫細胞に内在生のマスピン遺伝子の発現水準を増加さ せる薬剤である請求項２５に記載の方法。 ２９．試験癌腫細胞が（ａ）初期段階癌腫または（ｂ）進行性転移性癌腫に相当 するどうかを決定する方法であって、前記癌腫が、その正常細胞中でマスピン（ 配列番号１の配列を有するタンパク質）のｍＲＮＡが検出可能的に発現する型の 上皮組織から誘導され、 試験癌腫細胞のｍＲＮＡを請求項６に記載の単離ＤＮＡからなる一本鎖核酸プ ローブと接触させ、前記ＤＮＡが配列番号２の分節にアンチセンスである工程、 前記試験細胞の前記ｍＲＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成量を決定し 、一致して検出可能なハイブリッド形成がないことを前記試験細胞が進行性転移 性腫瘍からのものであるということの指標とする工程、 の諸工程を含む方法。 ３０．前記試験細胞のｍＲＮＡとのハイブリッド形成量が一致して検出可能であ るが前記型の組織の正常細胞中で測定されるもの以下であることを前記癌腫が初 期段階の癌腫であるという指標とする請求項２９に記載の方法。 ３１．試験癌腫細胞が（ａ）初期段階癌腫または（ｂ）進行性転移性癌腫に相当 するかどうかを決定する方法であって、前記癌腫が、その正常細胞中でマスピン （配列番号１の配列を有するタンパク質）のｍＲＮＡが検出可能的に発現する型 の上皮組織から誘導され、 試験癌腫細胞のタンパク質を請求項１５に記載の抗体と接触させる工程、 前記抗体および前記タンパク質によって形成される免疫複合体量を決定して、 一致して検出可能な免疫複合体がないことを前記試験細胞が進行性転移性腫瘍か らのものであるということの指標とする工程、 の諸工程を含む方法。 ３２．免疫複合体量が一致して検出可能であるが前記型の組織の正常細胞申で測 定されるものより少量であることを前記癌腫が初期段階の癌腫であるということ の指標とする請求項３１に記載の方法。 ３３．生物学的液体中のマスピン（配列番号１の配列を有するタンパク質）の水 準を決定する方法であって、 個体から生物学的液体の試料を得る工程、 前記試料中のタンパク質を請求項１５に記載の抗体と接触させる工程、および 前記抗体による免疫複合体生成量を決定して、前記量が前記試料中のマスピン水 準を示している工程、 の諸工程を含む方法。 ３４．前記生物学的液体が血液、血清、尿、唾液、乳汁、腺管液、涙、または精 液である請求項３３に記載の方法。 ３５．前記量が前記個体から予めまたはその後得られた試料中の前記抗体による 免疫複合体生成量と比較する請求項３３に記載の方法。 ３６．（２）第二ポリペプチドに共有結合した（１）マスピン（配列番号１）ま たはその抗原性断片を含むハイブリッドポリペプチド。 ３７．癌腫細胞を免疫不全動物中に導入し、前記癌腫細胞と同一型の組織の正常 細胞中とを比較して前記細胞中でのマスピン（配列番号１）の発現が下方調節さ れている工程、 前記動物を癌腫細胞中またはまたはその周辺でマスピン（配列番号１）の濃度 を増加させる化合物で処理する工程、 前記処理が前記動物中の前記癌腫細胞の増殖または転移速度に影響するかどう かを決定し、前記化合物の存在中での前記増殖または転移速度の減少を前記化合 物が癌腫の治療に潜在的に有用であるということの指標とする工程、 の諸工程からなる方法。 ３８．第一および第二癌腫を用意し、前記細胞が前記癌腫細胞と同一型の組織か らの正常細胞より実質的に低い程度でマスピン（配列番号１）を発現する工程、 前記第一細胞を前記第一細胞中またはその周辺でマスピン（配列番号１）の濃 度を増加させる化合物で処理する工程、 生体外検定法で前記第一および第二細胞の各々の浸潤能力を比較し、前記第二 細胞の浸潤能力に対する前記第一細胞の浸潤能力の減少を前記化合物が癌腫の潜 在的治療剤であるという指標とする工程、 の諸工程からなる方法。 ３９．第一および第二癌腫を用意し、前記細胞が前記癌腫細胞と同一型の組織か らの正常細胞より実質的に低い程度でマスピン（配列番号１）を発現する工程、 前記第一細胞をマスピン生物学的活性を含有すると疑われる試料と接触させる 工程、 浸潤能力の生体外検定法で前記第一および第二細胞の各々の浸潤能力を比較し 、前記第二細胞の浸潤能力に対する前記第一細胞の浸潤能力の減少を前記試料が マスピン生物学的活性を含有するということの指標とする工程、 の諸工程からなる試料中のマスピンの生物学的活性を検出する方法。 ４０．その中でマスピン（配列番号１）の発現が実質的に検出できないが無傷の マスピン遺伝子を含有する細胞を用意する工程、 前記細胞を候補抗癌化合物で処理する工程、および マスピンの発現が前記細胞中で増加するかどうかを決定し、前記発現の増加を 前記候補化合物が潜在的抗癌剤であるということの指標とする工程、 の諸工程からなる候補抗癌化合物をスクリーニングする方法。