ES2286539T3 - Metodos para el diagnostico y el tratamiento de metastasis y una composicion util para ese fin. - Google Patents
Metodos para el diagnostico y el tratamiento de metastasis y una composicion util para ese fin. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para determinar de la presencia de glucoproteína pequeña de adhesión celular (SMAGP) en un paciente, que comprende: (i) la detección en una muestra biológica de un paciente, sospechosa de contener células tumorales o parte de ellas, de una cantidad de ácido nucleico que codifica SMAGP o una cantidad de polipéptido SMAGP; y (ii) la comparación de la cantidad de dicho ácido nucleico o polipéptido con una valor estándar predeterminado que indicará la línea de decisión referente a la expresión o presencia de SMAGP relacionada con la metástasis en dichas células y, de esta forma, permitirá determinar la expresión o presencia relacionadas con la metástasis de SMAGP en dicho paciente.
Description
Métodos para el diagnóstico y el tratamiento de
metástasis y una composición útil para ese fin.
La invención está relacionada con el diagnóstico
de metástasis, composiciones para ese fin y métodos terapéuticos
para el tratamiento de las metástasis.
El cáncer es la segunda causa mayor de muerte en
Europa y los Estados Unidos, después de las cardiopatías. El cáncer
conlleva un crecimiento celular descontrolado que desemboca en la
invasión local de tejido normal, o bien en la diseminación
sistémica del crecimiento anómalo. Un tipo concreto de cáncer o un
estadio concreto de la evolución del cáncer pueden implicar los dos
elementos.
La división o el crecimiento de las células de
los diversos tejidos que se encuentran en el organismo normalmente
sucede de un modo ordenado y controlado. Esto es posible gracias a
un delicado mecanismo de control del crecimiento que implica, entre
otras cosas, el contacto, las vías de señalización y otros tipos de
comunicación entre células vecinas. En un tejido funcional las
células intercambian de forma habitual señales de crecimiento
estimuladoras o inhibidoras. Las células no se dividen normalmente
en ausencia de señales estimuladoras, e interrumpen su división
cuando dominan las señales inhibidoras. Sin embargo, esta
señalización o comunicación se vuelve defectuosa o está totalmente
dañada en las células cancerosas. Por esta razón, las células
continúan dividiéndose; invaden estructuras adyacentes, salen de la
masa tumoral original y establecen un nuevo crecimiento en otras
partes del organismo. Esta última progresión de la enfermedad
cancerosa es lo que se denomina metástasis.
El término cáncer generalmente se refiere a
tumores malignos y no a tumores benignos. Las células de tumores
benignos son similares a las células normales que las rodean. Estos
tipos de tumores casi siempre se encuentran encapsulados en una
cápsula fibrosa y no poseen la capacidad de metastatizarse a otras
partes del organismo. Estos tumores afectan a órganos locales pero
no los destruyen; normalmente mantienen su pequeño tamaño sin
producir síntomas durante muchos años. Solamente es necesario
aplicar un tratamiento cuando los tumores adquieren un tamaño lo
suficientemente grande como para interferir con otros órganos. Por
el contrario, los tumores malignos crecen más rápidamente que los
benignos; infiltran y destruyen tejidos locales. Algunos tumores
malignos pueden diseminarse por el organismo a través de los
sistemas circulatorio y linfático. Este crecimiento incontrolado e
impredecible es la causa de que los cánceres malignos sean
peligrosos y, en muchos casos, mortales. Estos tumores no son
morfológicamente característicos del tejido original y no se
encuentran encapsulados. Los tumores malignos con frecuencia
recurren tras la extracción quirúrgica.
En consecuencia, los tratamientos habitualmente
están dirigidos a cánceres o tumores malignos y en ellos es
extremadamente importante descubrir marcadores sensibles de signos
tempranos de formación de cáncer e identificar agentes potentes
supresores del crecimiento asociados a estos signos.
El proceso metastásico es una cascada de pasos
secuenciales de los cuales todos ellos deben completarse con éxito.
El primer paso consiste en la separación de células cancerosas del
tumor primario, seguido de la degradación e invasión de la matriz
extracelular (MEC) y de los tejidos adyacentes. Una vez las células
tumorales han conseguido penetrar en el sistema linfático o en el
vascular y sobrevivir, pueden verse retenidas en un lugar
secundario debido a limitaciones físicas (p. ej. el tamaño del
capilar) donde su capacidad de crecimiento estará dictada por
interacciones moleculares entre las células y el entorno del el
órgano (p. ej. activación de quimiocinas). Finalmente, para formar
metástasis macroscópicas es necesaria la generación de una nueva
red de vascularización (Chambers, A.F., et al., Nat. Rev.
Cancer 2 (2002) 563-572; Welch, D.R., Clin. Exp.
Metastasis 15 (1997) 272-306).
De acuerdo con el gran número de procesos
moleculares y celulares diferentes implicados en las metástasis,
las células metastásicas con frecuencia muestran una gran variedad
de alteraciones génicas que contribuyen a su potencial metastásico.
Entre ellos se incluye la activación de oncogenes, el reclutamiento
de metaloproteasas y factores de motilidad, así como cambios en la
expresión o la funcionalidad de múltiples moléculas de adhesión
(Hunter, K.W., et al., Cancer Res. 61 (2001)
8866-8872; Skubitz, A.P., Cancer Treat. Res. 107
(2002) 305-329). Asimismo, se han descrito ocho
genes conocidos como supresores de metástasis (Steeg, P.S., Nat.
Rev. Cancer 3 (2003) 55-63). A pesar del
conocimiento cada vez mayor adquirido en este campo, todavía quedan
por determinar gran cantidad de sucesos genéticos y bioquímicos
clave implicados en el proceso metastásico.
La patente WO 02/08288 describe polipéptidos
secretados y transmembrana y ácidos nucleicos que los codifican.
TARBE NESRINE et al: "Identification of
rat pancreatic carcinoma genes associated with lymphogenous
metástasis" ANTICANCER RESEARCH, vol. 22, núm. 4, julio 2002
(2002-07), páginas 2015-2028, ISSN:
0250-7005 identificaron 210 genes que estaban bajo
regulación positiva y 247 genes que estaban bajo regulación negativa
en una línea celular metastásica.
Se encontró de forma sorprendente que los ácidos
nucleicos que codifican el polipéptido SMAGP (siglas en inglés de
glucoproteína pequeña de adhesión celular) están sobrexpresados en
células tumorales y especialmente en células tumorales
metastásicas, mientras que la expresión es considerablemente menor
en células normales. Por lo tanto, SMAGP es una nueva diana de gran
valor para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer,
preferiblemente el cáncer de colon, pulmón, páncreas o mama, así
como las metástasis, en especial la metástasis hepática. Además,
SMAGP posee una localización diferente en los estadios iniciales y
tardíos del desarrollo tumoral y por lo tanto supone una
herramienta valiosa para diferenciar los estadios tumorales.
Las reivindicaciones anexas definen la
invención. Se proporciona un método para la determinación de la
existencia de SMAGP en un paciente, que comprende:
(i) la obtención de una muestra biológica de un
paciente sospechosa de contener células tumorales o una parte de las
mismas;
(ii) la detección en la muestra de una cantidad
de ácido nucleico que codifica SMAGP o una cantidad de polipéptido
SMAGP; y
(iii) la comparación de la cantidad de dicho
ácido nucleico o polipéptido con un valor estándar predeterminado
que indicará la línea de decisión referente a la expresión o la
presencia de SMAGP relacionada con el cáncer en dichas células y,
de esta forma, permitirá determinar la expresión o la presencia de
SMAGP relacionada con el cáncer en dicho paciente.
Se proporciona un método para determinar la
presencia o ausencia de cáncer en un paciente, que comprende el
método antes descrito.
Se proporciona un procedimiento para la
determinación del contenido o no de células tumorales en una muestra
de tejido o de líquido de un paciente o si proviene de células
tumorales. En él se emplea esta muestra y una segunda muestra
proveniente de células no tumorales del mismo individuo o de otro
diferente de la misma especie, y se siguen los siguientes pasos:
(a) la incubación de cada muestra respectiva en
condiciones de hibridación rigurosas con una sonda de ácido nucleico
seleccionada del grupo formado por:
- (i)
- una secuencia de ácidos nucleicos con ID. de SEC. núm.: 1, o un fragmento de la misma;
- (ii)
- una secuencia de ácidos nucleicos que sea complementaria a cualquier secuencia de ácidos nucleicos de (i);
- (iii)
- una secuencia de ácidos nucleicos que hibride en condiciones rigurosas con la secuencia de (i); y
- (iv)
- una secuencia de ácidos nucleicos que hibride en condiciones rigurosas con la secuencia de (ii); y
(b) la determinación de la cantidad aproximada
de hibridación de cada muestra respectiva con dicha sonda, y
(c) la comparación de la cantidad aproximada de
hibridación de la muestra de análisis con una cantidad aproximada
de hibridación de dicha segunda muestra para identificar si la
muestra a analizar contiene una cantidad del ácido nucleico
específico o de la muestra específica de ácidos nucleicos mayor que
la que contiene dicha segunda
muestra.
muestra.
Se proporciona un método para la detección de un
tumor, que comprende:
a) la incubación de una muestra de un paciente
sospechoso de padecer cáncer seleccionada del grupo formado por
líquidos corporales, células, un extracto celular o sobrenadantes de
cultivos celulares de dichas células, conteniendo dicha muestra
ácidos nucleicos con una sonda de ácido nucleico seleccionada del
grupo formado por:
- (i)
- el ácido nucleico mostrado con el ID. de SEC. núm.: 1 o un ácido nucleico que sea complementario a dicha secuencia, y
- (ii)
- ácidos nucleicos que hibridan con uno de los ácidos nucleicos de (i); y
b) la detección de la hibridación,
preferiblemente mediante otra pareja de unión al ácido nucleico de
la muestra o de la sonda de ácido nucleico o bien mediante
radiografía por rayos X
c) la comparación de la cantidad de dicha
hibridación de ácido nucleico con un valor estándar predeterminado
que indicará la línea de decisión referente a la expresión de SMAGP
relacionada con el cáncer en dicha muestra y, de esta forma,
permitirá determinar si dicho paciente padece cáncer.
El cáncer mencionado es preferiblemente de
colon, pulmón, páncreas o mama.
Preferiblemente, la detección se lleva a cabo
empleando un agente de unión al ácido nucleico de SMAGP o al
polipéptido. De un modo más preferible el agente de unión es una
sonda que se hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico
de SMAGP o bien un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo
monoclonal de unión al polipéptido SMAGP, y en especial al dominio
extracelular.
Todos estos métodos también pueden realizarse
empleando anticuerpos, mediante los que se detecta el polipéptido
SMAGP por interacción entre el anticuerpo y el polipéptido.
Se proporciona un método para realizar un
control de la progresión del cáncer, en especial del estado
canceroso metastásico en el paciente. En un método de este tipo, la
cantidad de ácido nucleico de SMAGP o de polipéptido en una muestra
biológica (p. ej., líquidos corporales como sangre, lisados
celulares o una muestra de RNA sometida a transcripción inversa) de
un paciente que padece cáncer se determina en al menos dos momentos
diferentes y se compara. Es posible deducir información sobre la
progresión de dicho cáncer a partir del cambio de dicha cantidad.
En especial, la formación de metástasis da como resultado una mayor
aparición de SMAGP, p. ej. en forma de expresión de mRNA.
Se proporcionan equipos de diagnóstico que
contienen una o varias sondas oligonucleotídicas o cebadores para
la hibridación con el ácido nucleico de SMAGP, o bien anticuerpo, en
un ensayo diagnóstico con una muestra obtenida de un paciente que
padece cáncer o del que se sospecha que lo padece.
La invención comprende también la utilización de
anticuerpos frente al polipéptido SMAGP en una cantidad
terapéuticamente efectiva en el tratamiento del cáncer metastásico.
De forma preferible, el anticuerpo se administra de forma local en
el tumor pancreático.
Para la fabricación de una composición destinada
a inhibir la proliferación o la capacidad invasiva de las células
tumorales se proporciona el empleo de un anticuerpo que se une al
polipéptido SMAGP. Se proporciona también la utilización de un
anticuerpo, de modo que la composición se administra a cultivos
celulares in vitro.
Se proporciona la utilización de un anticuerpo,
de modo que la composición es una composición farmacéutica y de
modo que esta se administra a un mamífero que padece un tumor, en
especial un tumor metastásico.
El anticuerpo frente al polipéptido SMAGP se
administra al paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva
para el tratamiento de enfermedades cancerosas o la prevención o
inhibición de metástasis causadas por enfermedades cancerosas.
El gen SMAGP muestra una clara asociación con el
potencial metastásico de las líneas celulares tumorales humanas y
con las células tumorales, especialmente del cáncer de colon, mama y
páncreas. La proteína codificada es una glucoproteína transmembrana
pequeña altamente conservada a lo largo de la evolución. Los
análisis inmunohistoquímicos con anticuerpos específicos frente a
SMAGP indicaron que esta proteína se encuentra situada en la
membrana plasmática de las zonas laterales de las estructuras
epiteliales normales. Durante la progresión tumoral, el nivel de
expresión de SMAGP y su localización pueden conservarse, o bien
alterarse asociados a una desorganización de la estructura
epitelial. Se prevé que SMAGP desempeña un papel en la adhesión
célula-célula mediante su interacción a través de
su cola carboxiterminal con la proteína 4.1 y las proteínas MAGUK
para controlar la organización del citoesqueleto y las vías de
señalización.
Tal como se emplea en este documento, el término
"SMAGP" significa un ácido nucleico que codifica un
polipéptido de ID. de SEC. núm.: 2, preferiblemente la secuencia de
DNA y la secuencia de mRNA relacionada de ID. de SEC. núm.:1, así
como el polipéptido que codifican de ID. de SEC. núm.: 2. Dado que
SMAGP es un receptor proteico transmembrana, este polipéptido posee
un interés diagnóstico excepcional y se prefiere como epítopo para
anticuerpos de unión al dominio extracelular del polipéptido SMAGP.
En consecuencia, es preferible que la muestra de ácidos nucleicos y
las sondas se centren hacia esta región y especialmente a las partes
de la misma que presentan una homología baja con otros genes o
polipéptidos.
SMAGP es una proteína transmembrana compuesta
por 97 aminoácidos con una secuencia de anclaje de tipo III. El
polipéptido SMAGP contiene un dominio extracelular de 34 aminoácidos
(aa 1-34), un dominio transmembrana (aa
35-55) y un dominio intracelular (aa
56-97) (véase la fig. 7).
La frase "ácido nucleico o polipéptido"
como se emplea a lo largo de esta solicitud hace referencia a un
ácido nucleico o polipéptido que presenta una actividad SMAGP que se
encuentra sustancialmente libre de material celular o medio de
cultivo cuando es producida mediante técnicas de DNA recombinante, o
sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias
químicas cuando es sintetizada por métodos químicos. Un ácido
nucleico de este tipo debe estar preferiblemente libre de las
secuencias que flanquean de forma natural al ácido nucleico (es
decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido
nucleico) en el organismo del cual se obtiene el ácido nucleico.
La expresión "sondas de ácidos nucleicos y
cebadores para SMAGP", tal como aquí se emplea, significa
fragmentos de ácido nucleico que sirven para detectar ácidos
nucleicos de SMAGP mediante métodos de hibridación. Los expertos en
la materia conocen en detalle las técnicas de hibridación y sus
condiciones. Estas condiciones de hibridación son, por ejemplo,
unas condiciones moderadamente rigurosas que incluyen el lavado con
una solución de 5 x SSC, SDS 0,5%, EDTA 1,0 mmol/l, pH 8,0, seguido
de hibridación a 50-60ºC 5 x SSC durante toda la
noche, lavado a temperatura ambiente durante 40 minutos con 2 x SSC
que contenga SDS 0,1% y posteriormente lavado con 0,1 x SSC, SDS
0,1% a 50ºC durante 40 min con un cambio de la solución para
renovarla. También es posible utilizar temperaturas más elevadas
para la hibridación (p. ej., 65-70ºC) como son
condiciones de hibridación altamente rigurosas. Las sondas de
ácidos nucleicos y los cebadores normalmente consisten en un
segmento de ácido nucleico de SMAGP de al menos unas 50 posiciones
contiguas, más preferiblemente de 200 a 300 nucleótidos. La
optimización de las sondas y los cebadores se puede realizar según
la tecnología de vanguardia. Estas sondas y estos cebadores pueden
diseñarse empleando por ejemplo las aplicaciones informáticas
disponibles en
(http://www-genome.wi.mit.edu/genome-software/lwww-genome.wi.mit.edu/genome-sohware/other/primer3.html).
Para conseguir una selectividad elevada es
preferible utilizar unas condiciones relativamente bajas en sal o
de temperatura elevada, por ejemplo una concentración salina de
aproximadamente entre 0,02 mol/l y 0,15 mol/l y temperaturas
aproximadas de 50ºC a 70ºC.
Los polipéptidos SMAGP se pueden identificar en
pruebas diagnósticas empleando sondas y cebadores específicos.
Normalmente estos métodos incluyen la amplificación de la secuencia
diana de la muestra mediante métodos de amplificación como el
método de la PCR. La detección cuantitativa se puede llevar a cabo
mediante técnicas de PCR, preferiblemente la RT-PCR
cuantitativa empleando, p. ej., el LightCycler® de Roche Diagnostics
GmbH, Alemania.
En una realización preferida de la invención, el
ácido nucleico codificante de la muestra se amplifica antes de la
prueba, por ejemplo mediante la conocida técnica de la PCR. En el
ámbito del diagnóstico mediante ácidos nucleicos habitualmente se
emplea una sonda de ácidos nucleicos modificada (marcada). Esta
sonda se pone en contacto con un DNA, RNA o RT-DNA
desnaturalizados de la muestra que se encuentra unido a un
transportador y, en este proceso, la temperatura, fuerza iónica, pH
y otras condiciones amortiguadoras son seleccionadas (en función de
la longitud y la composición de la sonda de ácidos nucleicos y de la
temperatura de fusión resultante del híbrido esperado) de modo que
el DNA o RNA marcado pueda unirse a DNA o RNA homólogo (en cuanto a
la hibridación véase también Wahl, G.M., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683-3687). Las membranas
adecuadas son membranas o materiales transportadores que contienen
nitrocelulosa (p. ej., Schleicher y Schull, BA 85, Amersham Hybond,
C.), nitrocelulosa en polvo unida o reforzada o bien membranas de
nailon modificadas con grupos funcionales diversos (p. ej., grupos
nitro) (p. ej., Schleicher and Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen;
Amersham Hybond M.; Pall Biodyne).
Con el fin de determinar si una muestra contiene
células tumorales, se debe determinar la cantidad aproximada de
hibridación que se produce entre el ácido nucleico y el ácido
nucleico o ácidos nucleicos diana. No es necesario que la
determinación de la cantidad aproximada de hibridación se realice de
forma cuantitativa, a pesar de que en la presente invención se
recoge una determinación de tipo cuantitativo. Normalmente la
cantidad aproximada de hibridación se determina de forma
cualitativa, por ejemplo mediante una inspección visual al detectar
la hibridación. Por ejemplo, si se emplea un gel para separar un
ácido nucleico marcado que hibrida con un ácido nucleico diana de
la muestra, se puede realizar una inspección visual de la banda
obtenida. Cuando se lleva a cabo la hibridación de un aislado de
ácido nucleico que carece de células tumorales de un individuo de
la misma especie, se sigue el mismo protocolo. Se puede comparar la
cantidad aproximada de hibridación de la muestra de análisis con la
cantidad aproximada de hibridación de la muestra carente de células
tumorales para identificar si la muestra a analizar contiene una
cantidad del ácido nucleico o ácidos nucleicos diana mayor que la
que contiene la muestra que carece de células tumorales.
En otro método de acuerdo con la invención no se
emplea ninguna segunda muestra. Para detectar si la expresión del
gen de SMAGP está bajo regulación positiva, se compara la cantidad
de mRNA de SMAGP con la cantidad de mRNA de un gen estándar [el gen
de control interno (véase p. ej., Shaper, N.L., et al., J.
Mammary Gland Biol. Neoplasia 3 (1998) 315-324; Wu,
Y.Y., y Rees, J.L., Acta Derm. Venereol. 80 (2000)
2-3)] de la célula, preferiblemente mediante
RT-PCR.
Tal como se muestra según la presente invención,
el ácido nucleico de SMAGP se expresa en una cantidad más elevada
en una muestra tumoral que en una muestra carente de células
tumorales. Una muestra de análisis que contenga células tumorales
poseerá una cantidad del ácido nucleico de SMAGP mayor que la de una
muestra que carece de células tumorales. Para identificar que una
muestra de prueba contiene ácido nucleico de SMAGP bajo regulación
positiva (es decir, que la muestra contiene células tumorales o más
concretamente células tumorales de carcinoma mamario) es preferible
que la muestra posea de un modo apreciable una cantidad aproximada
de ácido nucleico de SMAGP mayor que la de una muestra carente de
células tumorales. Por ejemplo, una muestra que presenta un gen de
SMAGP bajo regulación positiva puede contener una cantidad de gen de
SMAGP aproximadamente de 5 a 60 veces mayor que una muestra carente
de células tumorales.
Los métodos de hibridación de una sonda con una
ácido nucleico les resultarán familiares a los expertos en la
materia y están descritos, por ejemplo, en las patentes WO 89/06698,
EP-A 0 200 362, US 2 915 082, EP-A 0
063 879, EP-A 0 173 251 y EP-A 0 128
018.
A continuación, el DNA o RNA hibridado se
detecta incubando el transportador con un anticuerpo o un fragmento
de anticuerpo tras un lavado y saturación exhaustivos para evitar
uniones inespecíficas. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se
dirige frente a la sustancia incorporada durante la hibridación con
la sonda de ácidos nucleicos. A su vez, el anticuerpo se encuentra
marcado. Sin embargo, también cabe la posibilidad de emplear un DNA
marcado directamente. Tras la incubación con los anticuerpos, se
lava de nuevo para detectar exclusivamente los conjugados de
anticuerpos unidos de forma específica. Seguidamente, la
determinación se lleva a cabo siguiendo métodos conocidos empleando
el marcador unido al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo.
La detección de la expresión se puede realizar,
por ejemplo, del siguiente modo:
- hibridación in situ con células
fijadas, con frotis de tejido fijados,
- hibridación de colonias (células) e
hibridación de halos de lisis (fagos y virus),
- hibridación Southern (detección de DNA),
- hibridación Northern (detección de RNA),
- análisis de suero (p. ej., análisis de los
tipos celulares séricos mediante análisis
slot-blot),
- tras amplificación (p. ej. técnica PCR).
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención
son por tanto marcadores de gran valor para el diagnóstico y la
caracterización de tumores.
Según la invención, se pueden emplear
inhibidores para la expresión de SMAGP (p. ej., anticuerpos o
nucleótidos antisentido) para inhibir la progresión del tumor in
vivo.
Se proporcionan métodos para identificar y
aislar antagonistas de SMAGP o inhibidores de la expresión de SMAGP
(p. ej., anticuerpos y nucleótidos antisentido). Estos antagonistas
o inhibidores se pueden emplear para inhibir la progresión del
tumor y causar una apoptosis masiva de células tumorales in
vivo.
Se proporcionan métodos para identificar y
aislar antagonistas de SMAGP que sean útiles en el tratamiento del
cáncer. Estos métodos incluyen métodos para modular la expresión de
los polipéptidos de acuerdo con la invención, métodos para
identificar antagonistas de SMAGP que puedan unirse de forma
selectiva a las proteínas según la invención y métodos para
identificar antagonistas de SMAGP que permitan modular la actividad
de dichos polipéptidos. Los métodos incluyen además métodos de
modulación, preferiblemente de inhibición, de la transcripción del
gen de SMAGP a mRNA. Estos métodos pueden realizarse in vitro
o in vivo y pueden utilizar y establecer líneas celulares o
modelos de animales transgénicos de la invención.
Un antagonista de SMAGP se define como una
sustancia o compuesto que disminuye o inhibe la actividad biológica
de SMAGP, un polipéptido, o inhibe la transcripción o traducción del
gen de SMAGP. En general, los procedimientos de cribado de
antagonistas de SMAGP implican la puesta en contacto de sustancias
candidatas con células huésped en las que la invasión se ve
modulada por la expresión de SMAGP en condiciones favorables para
medir la actividad de SMAGP.
La actividad de SMAGP se puede medir de varios
modos. Habitualmente, la activación se hace evidente mediante un
cambio en la fisiología de la célula, como una mayor movilidad e
invasión in vitro, por un cambio en el estado de
diferenciación, o por un cambio en el metabolismo celular que
conduce a un aumento de la proliferación.
Los polipéptidos SMAGP pueden producirse
utilizando métodos recombinantes o bien mediante síntesis. El
polipéptido SMAGP no glucosilado se obtiene de la producción
recombinante en procariotas. Con la ayuda de las secuencias de
ácido nucleico proporcionadas por la invención es posible buscar el
gen SMAGP o sus variantes en genomas de cualquier tipo de célula
que se desee (p. ej., aparte de células humanas, también en células
de otros mamíferos), para identificarlos y aislar el gen deseado
que codifica las proteínas SMAGP. Estos procesos y las condiciones
adecuadas de hibridación son muy conocidas por los expertos en la
materia y están descritos, por ejemplo, en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York, EE. UU. y Hames, B.D., Higgins, S.G.,
Nucleic Acid Hybridisation - A Practical Approach (1985) IRL Press,
Oxford, Inglaterra. En este caso, para los experimentos se emplean
de forma habitual los protocolos estándar descritos en estas
publicaciones.
Con la ayuda de estos ácidos nucleicos que
codifican un polipéptido SMAGP, es posible obtener el polipéptido
según la invención de un modo reproducible y en grandes cantidades.
Para la expresión en organismos procariotas y eucariotas, como
células huésped procariotas y eucariotas, el ácido nucleico se
integra en vectores de expresión adecuados, siguiendo los métodos
conocidos por los expertos en la materia. Un vector de expresión de
este tipo contiene de forma preferible un promotor
regulable/inducible. A continuación se introducen estos vectores
recombinantes en células huésped adecuadas para su expresión, como
son p. ej. E. coli como célula huésped procariota o
Saccharomyces cerevisiae, la línea celular de Teratocarcinoma
PA-1, sc 9117 (Büttner, R., et al., Mol.
Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3583), células de insecto
o células CHO o COS como células huésped eucariotas, y las células
huésped transformadas o transducidas se cultivan en condiciones que
permitan la expresión del gen heterólogo. El aislamiento de la
proteína puede llevarse a cabo siguiendo métodos conocidos a partir
de la célula huésped o del sobrenadante del cultivo de la célula
huésped. Estos métodos aparecen descritos, por ejemplo, en Ausubel
I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley
and Sons, New York. También puede ser necesaria la reactivación
in vitro de la proteína si no se encuentra en forma soluble
en el cultivo celular.
El polipéptido SMAGP o fragmentos de este se
pueden purificar tras la producción recombinante mediante
cromatografía de afinidad empleando técnicas conocidas de
purificación de proteínas como son la inmunoprecipitación, la
filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico, el
cromatoenfoque, el isoelectroenfoque, la precipitación selectiva,
la electroforesis o similares, y pueden utilizarse para generar
anticuerpos frente a SMAGP.
Se proporcionan los vectores de expresión
recombinantes adecuados para la expresión de SMAGP, células huésped
recombinantes transfectadas con estos vectores de expresión y un
procedimiento para la producción recombinante de una proteína que
está codificada por el gen de SMAGP.
La producción de anticuerpos frente a SMAGP
puede realizarse siguiendo los métodos conocidos de la tecnología
de vanguardia. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos
monoclonales o policlonales utilizando un polipéptido que
constituya el polipéptido completo o un fragmento del mismo. Los
polipéptidos adecuados derivados de SMAGP incluyen, por ejemplo, los
aminoácidos 83-97.
Puede realizarse un cribado de los anticuerpos
obtenidos respecto a su capacidad de unirse a SMAGP empleando
técnicas estándar como los ensayos inmunoenzimáticos sobre fase
sólida. Podemos encontrar la descripción de métodos para la
identificación de epítopos antigénicos y para la producción de
anticuerpos en, por ejemplo, Mole, "Epitope Mapping", en:
Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pp.
105-116, The Humana Press, Inc., 1992; Price,
"Production and Characterization of Synthetic
Peptide-Derived Antibodies", en: Monoclonal
Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application,
Ritter and Ladyman (eds.), pp. 60-84, Cambridge
University Press, 1995; Morris (ed.), Epitope Mapping Protocols 25,
Humane Press, Inc., 1996; y Coligan et al. (eds.), Current
Protocols in Immunology, pp. 9.3.1-9.3.5 y pp.
9.4.1-9.4.11, John Wiley & Sons, 1997.
Los anticuerpos que pueden ser de utilidad de
acuerdo con la invención, en especial con fines terapéuticos,
pueden identificarse reduciendo el potencial invasivo y de
proliferación de las células tumorales. Con esta finalidad, se
tratan células tumorales o una línea de células tumorales,
preferiblemente la línea celular SUIT-2 007, con un
anticuerpo frente a SMAGP y se mide el potencial invasivo y de
proliferación con el reactivo de proliferación celular Cell
Proliferation Reagent WST-1 (un reactivo de sal de
tetrazolio, Roche Diagnostics GmbH, Alemania) y el ensayo de
invasión Matrigel (BDS Biosciences, www.bdbiosciences.com).
Los anticuerpos frente a SMAGP se pueden obtener
a partir de cualquier especie animal o bien pueden ser anticuerpos
quiméricos o humanizados. Los anticuerpos de elección son en
especial los anticuerpos humanos. La obtención de anticuerpos
monoclonales humanos se realiza, por ejemplo, a partir de ratones
transgénicos que se han generado mediante ingeniería genética para
producir anticuerpos humanos específicos como respuesta a una
provocación antigénica. En esta técnica se introducen elementos del
locus de las cadenas ligera y pesada humanas en cepas de ratón
procedentes de líneas de células madre embrionarias que contienen
interrupciones dirigidas de los loci endógenos de las cadenas
ligera y pesada. Los ratones transgénicos pueden sintetizar
anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los
ratones pueden utilizarse para producir hibridomas que secreten
anticuerpos humanos. En Green, L.L., et al., Nat. Genet. 7
(1994) 13-21; Lonberg, N., et al., Nature 368
(1994) 856-859; y Taylor, L.D., et al., Int.
Immun. 6 (1994) 579-591, por ejemplo, se describen
métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones
transgénicos.
Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y
purificar de cultivos de hibridomas mediante una diversidad de
técnicas completamente establecidas. Estas técnicas de aislamiento
incluyen la cromatografía de afinidad con
Proteína-A Sefarosa, la cromatografía por exclusión
de tamaño y la cromatografía de intercambio iónico (véase, por
ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las
páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al.,
"Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en: Methods in
Molecular Biology, Vol. 10, pp. 79-104, The Humana
Press, Inc., 1992).
Los anticuerpos se pueden emplear en
inmunoensayos de acuerdo con la invención. La detección se puede
llevar a acabo mediante la puesta en contacto de una muestra
biológica con un anticuerpo y, a continuación, la muestra biológica
con una molécula marcada detectable que se une al anticuerpo. El
anticuerpo se puede conjugar con avidina/estreptavidina (o biotina)
y la molécula que lleva un marcador detectable puede contener
biotina (o avidina/estreptavidina). Los expertos en la materia
conocen bien las numerosas variaciones que existen de esta técnica
básica. Como alternativa, un anticuerpo se puede conjugar con un
marcador detectable para formar un inmunoconjugado. Entre los
marcadores detectables adecuados se encuentran los siguientes: un
radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador
quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador
bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos para realizar y
detectar estos inmunoconjugados marcados de forma detectable son
muy conocidos por los expertos en la materia y más adelante se
describen con más detalle.
Preferiblemente, los anticuerpos según la
invención pueden emplearse para el tratamiento de un paciente que
padezca de un tumor, en especial un tumor metastásico. La ventaja
que supone este tipo de tratamiento respecto a una composición
farmacéutica que contenga un anticuerpo frente a SMAGP es
demostrable en un modelo in vivo de tumor pancreático.
Alves, F., et al., Pancreas 23 (2001) 227-235
describen un modelo de este tipo. Este modelo in vivo
comprende un modelo de trasplante ortotópico de adenocarcinoma
ductal en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
Morikawa, K., et al., Cancer Res. 48 (1988)
6863-6871 describen un modelo adecuado de
adenocarcinoma de colon humano KM12. El trasplante ortotópico de las
líneas celulares metastásicas KM12SM y KM12L4A en ratones SCID da
lugar a la formación de tumores y metástasis. Un modelo de tumor
pulmonar humano basado en la inyección s.c. de la línea celular
NIH-H460 está descrito por Corti, C., et
al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122 (1996)
154-160. La línea celular NIH-H460
se obtuvo de una carcinoma pulmonar de células grandes y da lugar a
metástasis en los pulmones tras la inyección s.c. en ratones
atímicos. Un modelo adecuado de cáncer de mama está basado en
tumores implantados de forma ortotópica (en el ratón nude)
procedentes de la línea celular de cáncer de mama line
MDA-MB-435 que conduce a la
formación de tumores y metástasis (John, C.M., et al., Clin.
Cancer Res. 9 (2003) 2374-2383).
En general, la dosis administrada de anticuerpos
frente a SMAGP variará en función de factores como la edad, el
peso, la estatura, el sexo, el estado general de salud y los
antecedentes médicos del sujeto. A modo de ejemplo, las
composiciones de anticuerpos frente a SMAGP se pueden administrar a
dosis bajas de proteínas, como de 20 a 100 miligramos de proteína
por dosis, de una vez o de forma repetida. Por otro lado, los
anticuerpos también se pueden administrar en dosis de 30 a 90
miligramos de proteína por dosis, de 40 a 80 miligramos de proteína
por dosis o de 50 a 70 miligramos de proteína por dosis.
Las vías de administración elegidas de
componentes de anticuerpos a un sujeto son la intravenosa, la
intramuscular o por perfusión mediante catéter local,
preferiblemente de forma directa en el órgano pancreático o en su
proximidad. La administración puede ser por infusión continua o
mediante bolos individuales o múltiples.
Una composición farmacéutica que contiene un
anticuerpo frente a SMAGP puede formularse siguiendo los métodos
conocidos para la preparación de composiciones de utilidad
farmacéutica, según los cuales se combinan las proteínas
terapéuticas en una mezcla con un transportador farmacéuticamente
aceptable. Una composición se considera un "transportador
farmacéuticamente aceptable" si un paciente puede tolerar su
administración. La solución salina estéril tamponada con fosfato
constituye un ejemplo de transportador farmacéuticamente aceptable.
Otros transportadores adecuados son muy conocidos en el ámbito.
Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical
Sciences, 19 edición, Mack Publishing Company, 1995.
Como forma de tratamiento se administran
anticuerpos frente a SMAGP y un transportador farmacéuticamente
aceptable a un paciente en una cantidad de efectividad terapéutica.
Se dice que se administra una combinación del anticuerpo y un
transportador farmacéuticamente aceptable "en una cantidad de
efectividad terapéutica" si la cantidad administrada tiene
importancia fisiológica.
Una composición farmacéutica que contenga
anticuerpos frente a SMAGP se debe facilitar preferiblemente en
forma líquida inyectable o para infusión.
Se presentan los siguientes ejemplos,
referencias, listado de secuencias, tablas y figuras para ayudar a
la comprensión de la presente invención cuyo auténtico ámbito de
aplicación se expone en las reivindicaciones anexas.
Fig. 1 Análisis de transferencia Northern de la
expresión de mRNA de SMAGP en sistemas de líneas celulares de
adenocarcinoma isogénico de rata o humano con diferente potencial
metastásico. Se cargaron geles de agarosa formaldehído con 10 \mug
de RNA total por carril. Se valoró que la carga igual de RNA total
fuese igual mediante tinción con bromuro de etidio de los RNA
ribosómicos de 28S y 18S. El potencial no metastásico (-),
metastásico bajo (\pm) o metastásico elevado se indica para cada
línea celular. (A) líneas celulares isogénicas de adenocarcinoma
pancreático de rata: BSp73-AS y
BSp73-ASML. (B) líneas celulares isogénicas de
adenocarcinoma prostático de rata: G, AT-1,
AT-3, AT-6, MAT-Lu y
MAT-LyLu. (C) líneas celulares isogénicas de
adenocarcinoma mamario de rata: MTPa, MTC, MTLn2 y MTLn3. (D) líneas
celulares isogénicas de adenocarcinoma pancreático humano:
S2-028 y S2-007. (E) líneas
celulares isogénicas de adenocarcinoma de colon humano: KM12C,
KM12SM y KM12L4. (F) líneas celulares isogénicas de adenocarcinoma
de colon humano: HCT116 y HCT116-C15.5. En todos los
sistemas, los mayores niveles de expresión de mRNA de SMAGP estaban
asociados a células neoplásicas con potencial
metastásico.
metastásico.
Fig. 2 Caracterización inmunológica de SMAGP.
Análisis por transferencia Western de SMAGP con extractos de
proteínas de células MTLn3 (carriles c-f) y
HCT116-c15.5 (carriles g-k), antes y
después de las reacciones de desglucosilación enzimática con
N-glucosidasa F (PNGasa F), sialidasa y
O-glucosidasa. Se utilizaron las glucoproteínas
transferrina N-glucosilada, alfa 1 glucoproteína
ácida y ribonucleasa B como controles positivos para el tratamiento
con N-glucosidasa F (carriles a-b).
SMAGP se modifica de forma postranscripcional mediante la adición de
ácido siálico y O-glucosilación.
Fig. 3 Análisis por transferencia Northern de la
expresión de mRNA de SMAGP en tejidos humanos normales. Cada carril
se cargó con 20 \mug de RNA total. Se utilizó como control de
carga la hibridación de la membrana con una sonda de RNA de 18S. Se
observó expresión baja y alta de SMAGP en prácticamente todos los
tejidos
estudiados.
estudiados.
Fig. 4 Análisis inmunohistoquímico de la
expresión de SMAGP en tejidos humanos normales y neoplásicos.
A-D: tejidos normales de mama, endometrio, colon e
hígado (conducto biliar). SMAGP se encuentra localizado
principalmente en la membrana plasmática de las zonas laterales de
las células epiteliales. E-H: muestras de tumor de
un paciente con cáncer de colon. E y G: tumores primarios, F y H:
metástasis hepáticas. C: tejido de colon normal del mismo paciente.
Los tumores bien diferenciados (E y F) muestran una fuerte expresión
de SMAGP y la localización de las proteínas en la membrana
plasmática se conserva bastante. Por el contrario, los tumores
indiferenciados estaban asociados con una localización
citoplasmática de la proteína (G y H) y una menor expresión de SMAGP
(H). Aumentos: A-D, X200; E-H,
X100.
Fig. 5 Detección de la expresión del mRNA de
hSMAGP en tejidos pancreáticos humanos.
Fig. 6 Expresión del mRNA de hSMAGP en tejidos
de colon humano medida mediante RT-PCR cuantitativa
a tiempo real. Los resultados se expresan en forma de niveles de
expresión normalizados del mRNA de hSMAGP. Las muestras normales,
los tumores primarios y las muestras de metástasis se indican en
barras blancas, ralladas y punteadas, respectivamente. Las muestras
procedentes del mismo paciente están emparejadas. N, colon normal;
Ta, tumor de colon en estadio A de Duke; Tb, tumor de colon en
estadio B de Duke; Tc, tumor de colon en estadio C de Duke; Td,
tumor de colon en estadio D de Duke; M, metástasis hepática; NL,
hígado normal.
Fig. 7 Organización de los dominios de
SMAGP.
\vskip1.000000\baselineskip
La disponibilidad de líneas celulares tumorales
isogénicas con diferencias marcadas en su comportamiento metastásico
ofrece un modelo adecuado para estudiar el proceso metastásico. Con
este fin se empleó el sistema celular tumoral de rata BSp73 que
contenía dos variantes estables obtenidas mediante trasplante en
serie de un tumor pancreático espontáneo de rata: la variante no
metastásica BSp73-AS y la variante metastásica
BSp73-ASML (Matzku, S., et al., Invasion
Metastasis 3 (1983) 109-123). Existen estudios
previos que han demostrado que este constituye un modelo adecuado
para la identificación de genes asociados a metástasis. Se generaron
anticuerpos monoclonales frente a proteínas de membrana de la línea
celular metastásica BSp73-ASML con objeto de
identificar moléculas de superficie asociadas con el fenotipo
metastásico y se identificaron cuatro proteínas (CD44v, D6.1A, C4.4A
y EGP314) que solo están presentes sobre la superficie de la
variante metastásica. Su implicación en el proceso de metástasis se
demostró utilizando transfectantes estables de varias células
tumorales no metastasizantes. La expresión génica era suficiente
para conceder un potencial metastásico o promover pasos diferentes
de la cascada metastásica (Claas, C., et al., J. Cell. Biol.
141 (1998) 267-280; Gunthert, U., et al.,
Cell 65 (1991) 13-24; Rosel, M., et al.,
Oncogene 17 (1998) 1989-2002; y Wurfel, J., et
al., Oncogene 18 (1999) 2323-2334). Asimismo,
la expresión desregulada de CD44v se ha correlacionado con un mal
pronóstico en muchos tipos de cáncer en humanos.
Las líneas celulares de adenocarcinoma
pancreático de rata BSp73-AS y
BSp73-ASML están descritas por Matzku, S., et
al., Invasion Metastasis 3 (1983) 109-123. Las
líneas celulares de adenocarcinoma prostático de rata G,
AT-1, AT-3, AT-6,
MAT-Lu y MATLyLu (Isaacs, J.T., et al.,
Prostate 9 (1986) 261-281) se adquirieron de la
Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, Salisbury, UK). Las
líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano KM12C, KM12SM y
KM12L4 están descritas por Morikawa, K., et al., Cancer Res.
48 (1988) 6863-6871. La línea celular de
adenocarcinoma de colon humano HCT116 está descrita por a Brattain,
M.G., et al., Cancer Res. 41 (1981)
1751-1756. HCT116-cl5.5 se aisló
in vivo de metástasis pulmonar derivada de HCT116 y se
identificó como altamente metastásica. Las líneas celulares antes
mencionadas se cultivaron sin antibióticos en RPMI 1640
complementado con suero fetal bovino al 10% y
L-glutamina 2 mM. Las líneas celulares de
adenocarcinoma mamario de rata MTPa, MTC, MTLn2 y MTLn3, descritas
por Neri, A., et al., J. Natl. Cancer Inst. 68 (1982), se
cultivaron en MEM-\alpha complementado con suero
fetal bovino al 10%. Las líneas celulares de adenocarcinoma
pancreático humano S2-028 y S2-007,
descritas por Taniguchi, S., et al., Clin. Exp. Metastasis 10
(1992) 259-266, se cultivaron en
D-MEM complementado con suero fetal bovino al 10% y
L-glutamina 2 mM. Todas las líneas celulares estaban
libres de contaminación por micoplasmas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló el RNA total de pellets de células
congeladas con el equipo RNeasy midi (Qiagen, Hilden, Alemania). Se
separaron por tamaño 10 \mug de RNA total en un gel
desnaturalizante de agarosa formaldehído al 1% y se transfirieron
(NorthernMax^{TM} blotting kits, Ambion) a una membrana de nailon
(BrightStar-Plus^{TM}, Ambion, Austin, EE. UU.).
Tras el entrecruzamiento mediante radiación UV (UV Stratalinker
2400, Stratagene, La Jolla, USA), se hibridaron las transferencias
con cDNA marcado con [a-^{32}P]dATP (Tarbé,
N., et al., Anticancer Res. 22 (2002)
2015-2027). La carga igual de RNA total sobre gel de
agarosa-formaldehído se verificó mediante tinción
con bromuro de etidio del RNA ribosómico. La expresión de mRNA de
SMAGP en tejidos normales humanos se determinó utilizando sistemas
comerciales de transferencia de RNA total humano (Northern
Territory^{TM}, Invitrogen, Huntsville, EE. UU.). Cada carril se
cargó con 20 \mug de RNA total y la carga igual se comprobó
mediante cuantificación de RNA de 18S. Las transferencias se
procesaron del modo antes mencionado. Las sondas de cDNA para el
mRNA humano y de rata de SMAGP se obtuvieron con
RT-PCR empleando los siguientes pares de
cebadores:
\newpage
| B1 | (TTGTGGTATCGAGCCTCCA) | (ID. de SEC. núm.: 3)/ |
| B2 | (GGCTCCAACACTGAGACACTG) | (ID. de SEC. núm.: 4) y |
| H105 | (ACAAAGGCAGCTACGTCACC) | (ID. de SEC. núm.: 5)/ |
| 106 | (CTTTCTCCATGTCCCTGGTC) | (ID. de SEC. núm.: 6), |
respectivamente.
Las sondas resultantes corresponden a una región
de 290 pb y 295 pb del 3'UTR del mRNA de SMAGP de rata y humano,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo la secuencia completa del cDNA de
rSMAGP con RACE-PCR empleando un equipo de
amplificación de cDNA SMART^{TM} RACE (Clontech, Palo Alto, EE.
UU.). Se sometió 1 \mug de RNA total de la línea celular
BSp73-ASML a transcripción inversa según las
instrucciones del fabricante. Las regiones 5' y 3' no traducidas se
amplificaron mediante PCR con cebadores Clontech Universal y los
cebadores específicos de la secuencia de rSMAGP B140
(5'-GAT GAA GTA CTC TTC CTT CTC TTT GC- 3') (ID. de
SEC. núm.: 7) y B139 (5'-AAG GGG AGC CCA GCG CCA
TCC TCC AG-3') (ID. de SEC. núm.: 8),
respectivamente. Los productos de PCR se clonaron en el vector pCR®
4-TOPO y se secuenciación con el analizador ABI
Prism® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, EE.
UU.).
\vskip1.000000\baselineskip
Eurogentech S.A. (Herstal, Bélgica) fue la
encargada de generar anticuerpos policlonales de conejo frente a
SMAGP. El péptido sintético ESDLAKGSEKEEYFI, que corresponde a los
residuos 83 a 97 de hSMAGP (ID. de SEC. núm.: 2), se acopló a KLH
(hemocianina de lapa californiana) y se inyectó en conejos. Los
sueros inmunorreactivos frente al péptido sintético se purificaron
por afinidad. Es posible generar anticuerpos monoclonales de conejo
siguiendo las indicaciones de Spieker-Polet, H.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995)
9348-9352.
Para la realización de la transferencia Western,
se extrajeron proteínas con tampón RIPA (Tris-Cl 50
mM pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 1%, desoxicolato
sódico 0,5%, SDS 0,1%) que contiene una mezcla inhibidora de
proteasas (Inhibidores de proteasas totalmente libres de EDTA,
Complete EDTA free protease Inhibitors, Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemania). Se llevó a cabo una electroforesis en gel de
poliacrilamida en condiciones reductoras empleando gel NuPAGE®
Bis-Tris al 12% (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.) y
tampón NuPAGE® MES SDS (Invitrogen). Los geles se sometieron a
transferencia semiseca sobre una membrana de nitrocelulosa y se
bloquearon en tampón TBS (Tris-Cl 100 mM pH7,5,
NaCl 150 mM) más leche en polvo desnatada al 5% (Merck, Darmstadt,
Alemania). Tras la incubación con anticuerpo de conejo frente a
SMAGP diluido a 1:5000 como anticuerpo primario, las membranas se
lavaron en tampón TBS con Tween20 al 0,1%, se incubaron con
anticuerpo anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante
(Roche Diagnostics) como anticuerpo secundario y se realizó un nuevo
lavado. La detección de anticuerpos se llevó a cabo utilizando
quimioluminiscencia mejorada (sustrato para transferencias Western
Lumi-lightPLUS, Roche Diagnostics GmbH,
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo experimentos de
desglucosilación enzimática con 100 \mug o menos de lisado celular
total desnaturalizado a 100ºC durante 5 min en tampón de reacción
(fosfato sódico 0,05 mM, pH 7) y tampón de desnaturalización (SDS
2%, beta-mercaptoetanol 1 M). Seguidamente se añadió
Triton X-100 a la solución a una concentración
final del 10%. Las enzimas N-glucosidasa F (PNGasa
F), Sialidasa y O-glucosidasa (Sigma, Steinheim,
Alemania) se añadieron a una concentración final de 100 U/ml, 100
mU/ml y 25 mU/ml, respectivamente, en un volumen total de 50
\mul. Las muestras se incubaron durante 3 h a 37ºC. Se utilizaron
las glucoproteínas humanas transferrina, alfa 1 glucoproteína ácida
y ribonucleasa B como controles positivos de la actividad de la
PNGasa F, analizada mediante SDS-PAGE en
condiciones reductoras, y visualizada mediante tinción con coomassie
blue. Tras las reacciones de desglucosilación, se analizó SMAGP
mediante transferencia Western con anticuerpos de conejo frente a
SMAGP.
Los tejidos se fijaron en formalina tamponada
con fosfato (4%). El análisis inmunohistoquímico se realizó en
secciones de tejido incluidas en parafina empleando un sistema
peroxidasa-antiperoxidasa (DAKO, Carpinteria, CA)
para el proceso de revelado descrito previamente (Régnier, C.H.,
et al., J. Biol. Chem. 270 (1995)
25715-25721). Se empleó el anticuerpo frente a
SMAGP a una dilución de 1:1000.
Se analizó la expresión del mRNA de SMAGP en una
serie de líneas celulares tumorales isogénicas con diferente
potencial metastásico. La expresión se evaluó en primer lugar en
sistemas de líneas celulares de tumor mamario, prostático y
pancreático de rata (Fig. 1 A-C). El mRNA de rSMAGP,
o bien no era detectable, o bien solamente lo era en niveles bajos
en las líneas celulares no metastásicas BSp73-AS, G
y MTPa. Por el contrario, se halló una fuerte expresión en todas
las líneas celulares metastásicas (BSp73-ASML,
AT-1, AT-3, AT-6,
MAT-Lu, MAT-LyLu, MTLn2 y MTLn3),
excepto en la línea celular MTC de bajo potencial metastásico. En la
Fig. 1 D-F se muestra la expresión del mRNA de
hSMAGP en sistemas de células tumorales isogénicas humanas, uno de
páncreas y dos de colon. Se observó una sobreexpresión de mRNA de
hSMAGP en las células con gran potencial metastásico
(S2-007, KM12SM, KM12L4 y
HCT116-Cl5.5) en comparación con las células de
potencial metastásico bajo o nulo (S2-028, KM12C y
HCT116). Por esta razón, la expresión del SMAGP en sistemas de
líneas celulares de rata y humanas está correlacionada con su
potencial metastásico.
Para seguir caracterizando la proteína SMAGP se
generaron anticuerpos policlonales frente a un péptido sintético
que corresponde a los 15 últimos residuos de la región
carboxiterminal de hSMAGP, que tienen un grado de conservación
entre la SMAGP de rata y de humano del 80%. Con la finalidad de
demostrar la traducción de la proteína SMAGP predicha, se llevó a
cabo un análisis por transferencia Western de extractos de proteínas
de células tumorales de rata (MTLn3) y humanas
(HCT116-cl5.5) en condiciones reductoras. Para ambos
tipos se observó una banda que correspondía a SMAGP de 23 y 25 kDa,
respectivamente (Figura 2, carriles c y g). Este hecho indicó que
el tamaño de las proteínas expresadas se aumentó en dos veces
respecto del peso molecular predicho. Dado que la secuencia
primaria de SAMGP contenía varios sitios de glucosilación putativos,
se llevó a cabo un análisis similar por transferencia Western de
extractos de proteínas tras la desglucosilación con
N-glucosidasa F (PNGasa F), sialidasa y
O-glucosidasa para determinar si SMAGP se modifica
postraduccionalmente. El tratamiento con PNGasa F (Figura 2,
carriles d y h) no tuvo ningún efecto sobre el peso molecular
aparente (PM), lo que indicó que SMAGP no sufre
N-glucosilación.
El tratamiento con sialidasa (Figura 1, carriles
e e i) condujo a un ligero cambio de bandas que sugiere que SMAGP
está modificada por los ácidos siálicos. El tratamiento adicional
con O-glucosidasa (Figura 2, carriles f y j)
provocó un cambio pronunciado del PM aparente, lo cual es coherente
con la presencia de sitios de O-glucosilación.
Finalmente, el tratamiento individual con
O-glucosidasa (Figura 2, carril k) no tuvo ningún
efecto sobre el PM de SMAGP, confirmando la presencia de ácidos
siálicos anexionados a oligosacáridos unidos por enlaces tipo O,
hecho del que se sabe que inhibe la acción de la
O-glucosidasa (Fukuda, M., et al., J. Biol.
Chem. 262 (1987) 11952-11957). Se utilizaron las
glucoproteínas transferrina N-glucosilada, alfa 1
glucoproteína ácida y ribonucleasa B como controles positivos para
el tratamiento con PNGasa F (Figura 2, carriles a y b).
La distribución de SMAGP en un panel de tejidos
humanos normales se evaluó mediante análisis por transferencia
Northern (Fig. 3). La expresión de mRNA de SMAGP es relativamente
ubicua y el nivel de expresión más elevado se detectó en placenta.
También se detectó una gran expresión en tejido adiposo, de esófago
y de colon.
Por lo tanto, los experimentos
inmunohistoquímicos que emplean el anticuerpo frente a SMAGP en
tejidos normales de colon, mama, pulmón y conducto biliar mostraron
que la proteína SMAGP se encuentra altamente expresada en todos los
órganos (figura 4, A-D). La expresión de SMAGP se
encuentra restringida a las estructuras epiteliales polarizadas
caracterizadas por la adhesión célula-célula que
confiere la morfología celular cuboide. En las células, la proteína
se encuentra localizada principalmente en las membranas plasmáticas.
Además, no se observa SMAGP a lo largo de toda la membrana
plasmática, sino solamente en los dominios de membrana laterales
situados en las uniones epiteliales célula a célula. Las zonas
basal y apical de la membrana carecían de SMAGP. También se observó
un pequeño grado de tinción en el citoplasma celular.
Se examinó SMAGP en tumores primarios y
metástasis procedentes de pacientes con cáncer de colon. En la Fig.
4 se presenta un ejemplo de tinción inmunohistológica obtenida en
pacientes procedentes del mismo paciente (C, colon normal; E y G,
tumores primarios; F y H, metástasis hepáticas). En los tumores
primarios la expresión de SMAGP puede mantenerse bastante elevada
(E) o mostrarse disminuida (G).
Asimismo, en algunos casos la localización
subcelular se conserva de forma parcial (E) mientras en otros no se
recluta más hacia la membrana plasmática y pasa a ser más o menos
citoplasmática (G). En las metástasis hepáticas se obtuvieron
resultados similares (F y H). Así, en un paciente dado se pueden
observar diversos fenotipos de SMAGP en tumores primarios y
metástasis, y pueden incluso coexistir dentro de los mismos tumores
en función de las áreas (F). Es interesante destacar que en todos
los tumores primarios y metástasis estudiados, un nivel elevado de
expresión de proteína SMAGP y su localización en la membrana celular
estaban asociados con una estructura epitelial conservada (E y F
comparados con G y H). Se realizaron observaciones similares en
tumores primarios y metástasis procedentes de pacientes con cáncer
de mama y pulmón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la expresión del mRNA de SMAGP
mediante RT-PCR cuantitativa (tecnología Taqman) en
10 carcinomas de páncreas humano (Fig. 5, barras azules) y en 5
tejidos normales de páncreas humanos (Fig. 5, barras blancas). La
expresión de hSMAGP también se mide en la línea celular de tumor
pancreático humano Capan I. En 5 muestras de carcinoma se observa
una sobreexpresión en comparación con el mayor valor de expresión de
hSMAGP alcanzado en tejidos pancreáticos normales, y en paréntesis
sobre las barras correspondientes se indica la proporción de los
cambios.
Para llevar a cabo la PCR se utilizaron
reactivos de ficoeritrina (PE):
4 \mul de tampón SybrGreen, 4,8 \mul de
MgCl_{2}, 3,2 \mul de dNTD, 0,2 \mul de UNG, 0,2 \mul de
Amplitaq Gold, 4 \mul de Primermix, 1 \mul de cDNA y 22,6 \mul
de H_{2}O.
Se aplicaron las siguientes condiciones de
PCR:
Fases iniciales: 2 min 50ºC, 10 min 95ºC, 40
ciclos: 15 s 95ºC, 1 min 60ºC.
Se realizaron dos PCR (determinación doble) para
examinar la expresión del gen respectivo de cada cDNA. A la vez se
realizó una PCR de xs13 empleando el mismo cDNA. El programa
detector de secuencias ABI indica un valor de ciclo umbral (CT)
para cada PCR. Se calculó la media de los valores CT de cada cDNA
(es decir, el valor medio de la doble determinación; para xs13
solamente existe un valor por cada cDNA). A continuación se resta
el valor de xs13 a cada cDNA respectivo a partir de los valores
promedio antes mencionados. Se calcula un valor medio solo con las
diferencias obtenidas de los cDNA sanos. Las diferencias de los cDNA
de pancreatitis crónica, carcinoma pancreático y páncreas sano se
dividen por este valor medio. Posteriormente, estos cocientes se
expresan como potencia en base 2 (porque durante la PCR los
productos se duplican en cada reacción). Los números recíprocos de
estos valores representan la expresión de los respectivos cDNA
comparada con el cDNA sano.
\vskip1.000000\baselineskip
La importancia clinicopatológica de la expresión
de hSMAGP respecto a la diseminación tumoral se examinó por primera
vez en muestras de tejidos humanos de pacientes con cáncer de colon.
La expresión de mRNA se evaluó mediante RT-PCR
cuantitativa (tecnología Light-Cycler) en nueve
muestras de colon normal, nueve muestras de tumor primario de colon
(con estadio de Duke conocido) y nueve muestras de metástasis
hepáticas (Fig. 6). Las muestras normales y de tumores primarios
procedían del mismo paciente, mientras que las de metástasis
hepáticas no. Se observó una sobreexpresión elevada en todos los
tumores emparejados, independientemente del estadio de Duke,
comparada con el colon normal. Asimismo, los niveles de mRNA de
SMAGP en metástasis eran mayores que los valores alcanzados en 6 de
las 9 muestras de tumor primario (75% de los casos). Se emplearon
cuatro muestras de tejido hepático normal como control de la
expresión de hSMAGP en el hígado, lo que confirmó que el elevado
nivel de expresión de hSMAGP en metástasis no proviene del entorno
del órgano. Estos resultados demuestran la existencia de
sobreexpresión del mRNA del hSMAGP en tumores de colon humano en
comparación con la mucosa normal del colon, y muestran en un 75% de
los casos una mayor expresión en metástasis hepáticas que en tumores
primarios.
El RNA total extraído con el equipo RNeasy
(Qiagen) se sometió a tratamiento con desoxirribonucleasa I (Qiagen)
antes de realizar la síntesis de la primera cadena de cDNA con
oligo-dT y transcriptasa inversa AMV (Roche
Diagnostics). A continuación se realizó una reacción en cadena de la
polimerasa con una mezcla única de enzimas que contiene DNA
polimerasa Taq y DNA polimerasa Tgo (Roche
Diagnostics).
Para la RT-PCR cuantitativa se
empleó RNA total de muestras de tejido de colon congeladas. Después
del tratamiento con desoxirribonucleasa I se sometió el RNA total
(1 \mug) a transcripción inversa empleando hexámeros aleatorios y
transcriptasa inversa AMV (Roche Diagnostics). Se diseñaron dos
cebadores específicos para el gen basándose en la secuencia de
hSMAGP [H103: 5'-AGA AGA TGG AGC CAG CAC
AG-3' (ID. de SEC. núm.: 9) y H104:
5'-ATC TGG ACG ATG GCA CTG G-3'
(ID. de SEC. núm.: 10)]. Estos cebadores están situados en dos
exones diferentes para evitar la contaminación por DNA genómico. El
control a tiempo real de las reacciones de PCR se llevó a cabo
mediante el sistema LightCycler y el equipo DNA Master SYBR® Green I
(Roche Diagnostics). Tras la optimización, las mezclas de reacción
de PCR contenían MgCl_{2} 4 mM, 0,4 \muM de cada cebador, 2
\mul de solución de cDNA y 2 \mul de SYBR Green I en un volumen
final de 20 \mul. Cada experimento se realizó por duplicado. Las
curvas de calibración, tanto para el gen diana hSMAGP como para el
RNA de 18S como referencia endógena, se generaron con diluciones
seriadas (1:10, 1:50 y 1:80) de cDNA de la línea celular de
adenocarcinoma de colon humano KM12SM. Para cada muestra, la
cantidad relativa de gen diana y de los RNA de referencia endógenos
se determinó a partir de la curva de calibración. El nivel de
expresión de mRNA de hSMAGP en las muestras se normalizó dividiendo
la cantidad de mRNA de hSMAGP por la cantidad de RNA de 18S para
cada muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron células BSp73AS, la variante de
un adenocarcinoma pancreático de rata con un potencial metastásico
bajo, con SMAGP o solamente el vector (transfectantes simulados). Se
seleccionaron dos clones transfectados simulados y cuatro clones
que diferían ligeramente en la intensidad de la expresión de SMAGP.
Estos clones, así como las células BSP73ASML y BSp73AS no
transfectadas, se inyectaron por vía intraperitoneal o a través de
la almohadilla plantar a ratas BDX (cepa de origen) para comprobar
si se producía un incremento potencial de la capacidad metastásica
en las células BSp73AS transfectadas. Dado que el comportamiento de
crecimiento de los dos clones transfectados simulados y de los
cuatro clones transfectados con SMAGP no difería de forma
significativa, los datos procedentes de estos dos clones simulados y
cuatro clones transfectados con SMAGP se combinaron (Tabla 1).
Tras la aplicación intraperitoneal, las células
BSp73AS y BSp73AS simuladas crecieron en grandes nódulos
exclusivamente en la cavidad peritoneal, con un tiempo de
supervivencia medio de las ratas trasplantadas con estas células de
20 días. Las ratas trasplantadas con células BSp73ASML presentaban
un tiempo de supervivencia de 40 días. El tumor se desarrolló en
forma miliar en la cavidad peritoneal y todas las ratas sucumbieron
con formación de metástasis miliar en los pulmones. De 12 ratas que
recibieron células BSp73AS transfectadas con SMAGP, 6 desarrollaron
nódulos grandes en la cavidad peritoneal (similar a lo sucedido en
las ratas a las que se había inyectado células BSp73AS), pero 6
mostraron un desarrollo de tumores miliares en la cavidad
peritoneal. Cuatro ratas presentaron metástasis hepática y hubo 2
que desarrollaron, respectivamente, metástasis en riñón y ovario.
Dos ratas presentaron una abundante infiltración tumoral del
diafragma. Ninguna de las ratas mostró metástasis pulmonar. Estos
resultados demuestran un aumento del potencial metastásico (Tabla
1A).
Para confirmar los resultados, se inyectaron las
células tumorales en la almohadilla plantar, donde se puede seguir
más fácilmente la progresión metastásica. En los casos en los que no
se extirparon los tumores tras la aplicación en la almohadilla
plantar todas las ratas desarrollaron metástasis en el ganglio
linfático poplíteo de drenaje, pero solamente las ratas que
recibieron BSp73ASML (5/5) y las que recibieron células BSp73AS
transfectadas con SMAGP (4/5) desarrollaron metástasis en nódulos
linfáticos distantes del lugar de implantación (paraaórtico,
inguinal y axilar). Asimismo, solamente aquellas ratas que
recibieron BSp73ASML (5/5) y células BSp73AS transfectadas con
SMAGP (4/5) desarrollaron metástasis pulmonar. Las células BSp73ASML
desarrollaron metástasis miliares, mientras que las célula BSp73AS
transfectadas con SMAGP desarrollaron nódulos grandes. Estos
resultados confirman de forma inequívoca la mayor capacidad
metastásica de las células tumorales que expresan SMAGP (Tabla
1B).
Con el fin de estimar el tiempo necesario para
el establecimiento metastásico, se inyectaron células tumorales en
la almohadilla plantar de las ratas y 28 días después se extirpó el
tumor junto con el ganglio linfático de drenaje. Los datos
presentados en la tabla 1C hacen referencia solamente a aquellos
animales que no desarrollaron una recurrencia local debido a la
eliminación incompleta del ganglio linfático de drenaje (2 ratas con
BSp73AS, 4 ratas con células BSp73AS transfectadas simuladas y 1
rata con células BSp73AS transfectadas con SMAGP). De las ratas
sometidas a extirpación curativa sobrevivieron las siguientes: 0/5
ratas con BSp73ASML, 3/3 ratas con BSp73A, 6/6 ratas con BSp73AS
transfectadas simuladas y 9/14 ratas con BSp73AS transfectadas con
SMAGP. Por lo tanto, la colonización metastásica en las células
BSp73AS transfectadas con SMAGP progresa de forma muchísimo más
lenta que en las células BSp73ASML, pero de forma diferente que en
las células BSp73AS no transfectadas o transfectadas simuladas; en
el 36% de las ratas las células BSp73AS transfectadas con SMAGP
habían migrado más allá del ganglio linfático de drenaje a los 28
días de la aplicación de las células tumorales.
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Se obtuvieron ratas BDX de Jackson Laboratories,
Sulzfeld, Alemania. Para los experimentos se utilizaron ratas
hembra de 8 a 12 semanas de edad. Recibieron una inyección única de
5x10^{5} células tumorales, bien por vía intraperitoneal (i.p.),
bien por vía subcutánea en la almohadilla plantar trasera. Allí
donde se indica, tras la aplicación de la inyección en la
almohadilla plantar los tumores se extirparon por amputación de la
pata posterior. En resumen, las ratas se anestesiaron con
Rompun/Ketanest. La piel se eliminó mediante incisión circular con
un escalpelo a unos 0,5 cm por debajo la articulación. Después de
suturar la arteria y eliminar el ganglio linfático de drenaje se
cortaron los tendones y se eliminó la pata trasera por
exarticulación. La herida se cubrió con piel y se cosió. El
desarrollo del tumor se controló dos veces a la semana, bien por
palpación del abdomen tras la aplicación i.p., bien midiendo el
diámetro tumoral y el diámetro del ganglio de drenaje tras la
aplicación en la almohadilla plantar. Cuando la masa tumoral
palpable alcanzó un diámetro medio de 2,5 cm o cuando las ratas
presentaban caquexia o anemia (que se puede estimar por el color de
los ojos y las orejas) o disnea, se las anestesió y sacrificó. Se
realizó la autopsia de las ratas y de todos los órganos se analizó
la presencia de metástasis.
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(291)
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<400> 1
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<223> cebador B140
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\vskip0.400000\baselineskip
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<223> cebador B139
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\hfill26
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<210> 9
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador H103
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador H104
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<400> 10
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\hfill19
Claims (7)
1. Un método para determinar de la presencia de
glucoproteína pequeña de adhesión celular (SMAGP) en un paciente,
que comprende:
(i) la detección en una muestra biológica de un
paciente, sospechosa de contener células tumorales o parte de ellas,
de una cantidad de ácido nucleico que codifica SMAGP o una cantidad
de polipéptido SMAGP; y
(ii) la comparación de la cantidad de dicho
ácido nucleico o polipéptido con una valor estándar predeterminado
que indicará la línea de decisión referente a la expresión o
presencia de SMAGP relacionada con la metástasis en dichas células
y, de esta forma, permitirá determinar la expresión o presencia
relacionadas con la metástasis de SMAGP en dicho paciente.
2. Un procedimiento para la determinación del
contenido o no de células tumorales con potencial metastásico en una
muestra de tejido o de líquido de un paciente o de si proviene de
células tumorales metastásicas. En él se emplea esta muestra y una
segunda muestra proveniente de células no tumorales del mismo
individuo o de otro diferente de la misma especie, y se siguen los
siguientes pasos:
(a) la incubación de cada muestra respectiva en
condiciones de hibridación rigurosas con una sonda de ácido nucleico
seleccionada del grupo formado por:
- (i)
- una secuencia de ácido nucleico con ID. de SEC. núm.: 1, o un fragmento de la misma;
- (ii)
- una secuencia de ácidos nucleicos que sea complementaria a cualquier secuencia de ácidos nucleicos de (i);
- (iii)
- una secuencia de ácidos nucleicos que hibride en condiciones rigurosas con la secuencia de (i); y (iv) una secuencia de ácidos nucleicos que hibride en condiciones rigurosas con la secuencia de (ii); y
(b) la determinación de la cantidad aproximada
de hibridación de cada muestra respectiva con dicha sonda, y
(c) la comparación de la cantidad aproximada de
hibridación de la muestra de análisis con una cantidad aproximada de
hibridación de dicha segunda muestra para identificar si la muestra
a analizar contiene una cantidad del ácido nucleico específico o de
la muestra específica de ácidos nucleicos mayor que la que contiene
dicha segunda muestra.
3. Método para la detección de metástasis, que
comprende:
(a) la incubación de una muestra de un paciente
sospechoso de padecer metástasis seleccionada del grupo formado por
líquidos corporales, células, un extracto celular o sobrenadantes de
cultivos celulares de dichas células, conteniendo dicha muestra
ácidos nucleicos con una sonda de ácido nucleico seleccionada del
grupo formado por:
- (i)
- el ácido nucleico mostrado en el ID. de SEC. núm.: 1 o un ácido nucleico que sea complementario a dicha secuencia, y
- (ii)
- ácidos nucleicos que hibriden con uno de los ácidos nucleicos de (i) y
b) la detección de la hibridación,
preferiblemente mediante otra pareja de unión al ácido nucleico de
la muestra o de la sonda de ácido nucleico o bien mediante
radiografía por rayos X
c) la comparación de la cantidad de dicha
hibridación de ácido nucleico con un valor estándar predeterminado
que indicará la línea de decisión referente a la expresión de SMAGP
relacionada con la metástasis en dicha muestra y, de esta forma,
permitirá determinar si dicho paciente padece metástasis.
4. El empleo de un anticuerpo que se une al
polipéptido SMAGP de ID. de SEC. núm.: 2 para la fabricación de una
composición destinada a la inhibición de la metástasis en células
tumorales.
5. Una utilización de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que la composición se administra a cultivos
celulares in vitro.
6. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que la composición es una composición
farmacéutica y en la que esta se debe administrar a un mamífero que
padezca un tumor.
7. Una composición farmacéutica que contiene un
anticuerpo frente a SMAGP con la secuencia polipeptídica de ID. de
SEC. núm.: 2 junto con un transportador farmacéuticamente
aceptable.
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