CN101649318B - 一种临床标本中病原菌基因鉴定前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种临床标本中病原菌基因鉴定前处理方法。本发明的临床标本中病原菌基因鉴定前处理方法采用两步裂解法，包括胰蛋白酶裂解和碱裂解。采用本发明的方法处理的标本，可以快速的检测出临床标本中的病原微生物，具有灵敏度高、操作简单的特点，能够合理地指导临床用药。
Description
技术领域
本发明涉及临床标本病原微生物基因检测，属于分子生物学领域。
背景技术
国内外报道的标本前处理方法比较少，没有专门针对各种不同临床原始标本的前处理方法。目前主要应用到临床的标本前处理有：碱裂解法、免疫磁珠法。碱裂解法利用碱液使标本中蛋白质发生变性溶解于碱液中，通过洗脱碱液达到分离病原微生物基因的目的。免疫磁珠法通过磁珠吸附蛋白质与其它干扰因子达到分离病原微生物基因的目的。
临床利用基因直接鉴定临床体液标本中病原菌实际应用很少，存在的最大技术难点在于临床体液标本中含有蛋白质、细胞因子等干扰因素，而研究证明蛋白质和细胞中的人类基因组DNA都会干扰抑制病原菌的核酸扩增反应。这种抑制作用在脓性的标本尤为突出。免疫磁珠法是目前国内最流行的处理方法，但其抗干扰能力弱，对纯培养的细菌效果好，不适合直接用于临床标本。传统的碱裂解法裂解不彻底，很难裂解脓性标本。同时碱裂解时间长，容易破坏细菌基因，降低提取效率。
荧光定量PCR是1995年美国PE公司发明一种核酸定量技术，在普通PCR的基础上使用荧光探针达到核酸定量的目的。具有灵敏度高、结果准确、操作简单的特点，目前临床广泛应用于血清病毒定量检查。
虽然荧光定量PCR直接鉴定临床标本中病毒在临床应用较多，但应用于其它病原微生物如细菌和真菌检测的却很少。而临床感染性标本很常见，检测方法主要为传统培养鉴定。由于培养鉴耗时长，临床往往在未接到实验室培养报告时就已经开始经验用药进行到治疗，造成了抗生素的不合理使用，不但加重患者的经济负担，而且还会产生对抗生素的耐药问题，对后面的治疗带来负面的影响。同时有相当的病原微生物体外培养困难，易产生漏诊。真菌生长缓慢，报告时间长和易漏诊的矛盾更加突出。因此，提供一种能够在短时间内迅速检测出临床标本中病原微生物的方法，从而指导临床用药，已经成为检验医学领域急需解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种临床标本直接病原菌基因鉴定前处理方法。
本发明所涉及的临床标本直接病原菌鉴定前处理方法是采用两步裂解法。所述的两步裂解法是在单纯碱裂解法基础上改进而成的，在碱裂解前加一步胰酶裂解步骤。有效的标本前处理方法是基因鉴定技术的关键，只有在标本前处理中提取到了足量的病原菌核酸，才能进行直接鉴定。两步裂解法解决了这一技术难点，为直接鉴定提供了可靠的技术保障。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
(1)胰蛋白酶裂解
1ml标本加入等量20mg/l的胰蛋白酶37℃2-4h至标本基本液化，抽吸顺畅。
(2)碱裂解
再加入2ml 4％NaOH 42℃1h，12000rpm离心15min，去上清，生理盐水12000rpm洗涤两遍取沉淀。向沉淀中加入25μl双蒸水与少量磁珠。再用反复冻融法，95℃10min，迅速置于-80℃10min，再95℃10min，12000rpm 5min取上清即可。
适合浓度的胰酶既可以对蛋白质进行裂解，又不会破坏微生物的细胞膜，不会影响微生物基因的提取。而且经胰酶碱裂解后的标本，再进行碱裂解更容易的彻底充分，对脓性标本效果也很理想。同时碱裂解时间也大幅缩短，减少了对病原微生物的破坏。最后提取部分结合了磁珠法的优势，在除去标本干扰因素后，结合磁珠法进行核酸提取。
本发明可以针对原核病原微生物与真核病原微生物的双重荧光定量PCR的应用于临床病原微生物检测。具有快速、灵敏度高、操作简单的特点，并且可以同时检测细菌和真菌，能够快速报告临床，指导临床用药。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
1、标本鉴定前的处理：
(1)1ml标本加入等量20mg/l的胰蛋白酶37℃2-4h至标本基本液化，抽吸顺畅。
(2)再加入2ml 4％NaOH 42℃1h，12000rpm离心15min，去上清，生理盐水12000rpm洗涤两遍取沉淀。向沉淀中加入25μl双蒸水与少量磁珠。再用反复冻融法，95℃10min，迅速置于-80℃10min，再95℃10min。12000rpm5min取5μl上清备用。
2、荧光定量PCR扩增：选取原核生物16S rRNA基因通用引物上游5’-AGT TTG ATC TGG CTC AG-3’和下游5’-GGA CTA CTA CAG GGT ATC TAAT-3’；真核生物18S rRNA基因间隔区通用引物上游5’-TCC GTA GGT GAACCT GCG G-3’和下游5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’(均由北京万泰生物药业有限公司提供)。两对引物的的探针5’端标记的荧光报告基团分别是ROX、HEX，3’端标记的荧光淬灭基团均为ECL IPSE。反应体系为25μl组分如下：dNTPs 2.0μl、10×PCR Buffer 2.5μl、MgCl21.4μl、Taq DNA聚合酶0.4μl、原核微生物探针0.4μl、真核微生物探针0.4μl、MRP21 1.0μl、MRP221.0μl、MRPp 0.3μl、ddH2O 8.0μl。最后，加入5μl模板。盖上塑料盖，瞬时离心后，放入荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：95℃预变性5min，94℃30s、55℃15s、72℃40s扩增40个循环，观察结果。
临床实验室可利用此方法直接提取标本中的核酸，利用荧光定量PCR仪进行检测。无荧光定量PCR仪的临床医院也可将扩增产物通过凝胶电泳判断阴阳性，从而判别临床标本中是否存在病原微生物感染。有条件的实验室还可以进一步进行核酸测序判定病原菌的种类。
通过本发明所述的检测方法，临床医院能在第一时间内直接提取传染性疾病的各种原始标本中的病原微生物基因，通过荧光定量PCR进行临床标本病原微生物的快速定量诊断，对于病人抗生素的使用具有重要意义。抗生素的合理使用减少耐药率关系到国家卫生事业的发展和人民群众的切身利益。由于真菌的用药谱较窄，及时诊断出是否存在真菌感染可以有效的提示临床及早治疗。
附图说明
图1-1为两步裂解法处理后标本PCR产物凝胶电泳结果；
图1-2为磁珠法结果；
图1-3为碱裂解结果；
图1-4为Maker；
图2为荧光定量PCR检测荧光曲线；
曲线1为原核生物ATCC25922大肠埃希氏菌荧光曲线；
曲线2为真核生物ATCC6528克柔假丝酵母菌荧光曲线；
图3为检测出的微生物电泳条带；
图3-1上端为原核病原微生物ATCC25922大肠埃希氏菌扩增产物电泳条带，下端为真核病原微生物ATCC6528克柔假丝酵母菌电泳条带；
图3-2为1000bp-100bp maker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1
试剂的准备
选用下列试剂进行本发明所述的微生物检测：4％NaOH碱裂解液，20mg/L的胰酶，原核生物16S rRNA基因通用上下游探针5’-AGT TTG ATC TGG CTCAG-3’和5’-GGA CTA CTA CAG GGT ATC TAA T-3’，真核生物18S rRNA基因间隔区通用上下游探针5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’和5’-GCTGCG TTC TTC ATC GAT GC-3’，磁珠一管(以上均从北京万泰生物药业有限公司购得)，标准品104、105、106、107拷贝的指控品各一管(由中国药品生物制品检定所生产)。
实施例2
临床标本鉴定前的处理
(1)选取含有ATCC25922大肠埃希氏菌和ATCC6528克柔假丝酵母菌的标本1ml加入等量20mg/l的胰蛋白酶37℃2h(3h或4h)至标本基本液化，抽吸顺畅。
(2)再加入2ml 4％NaOH 42℃1h，12000rpm离心15min，去上清，生理盐水12000rpm洗涤两遍取沉淀。向沉淀中加入25μl双蒸水与少量磁珠。再用反复冻融法，95℃10min，迅速置于-80℃10min，再95℃10min。12000rpm5min取5μl上清备用。
实施例3
临床标本中病原微生物的检测
1、实施例2中的标本鉴定前的处理
2、荧光定量扩增：选取ATCC25922大肠埃希氏菌16S rRNA基因通用引物上游5’-AGT TTG ATC TGG CTC AG-3’，下游5’-GGA CTA CTA CAGGGT ATC TAA T-3’。ATCC6528克柔假丝酵母菌18S rRNA基因间隔区通用引物上游5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’，下游5’-GCT GCG TTCTTC ATC GAT GC-3’。两对引物的的探针5’端标记的荧光报告基团分别是ROX、HEX，3’端标记的荧光淬灭基团均为ECL IPSE(由北京万泰生物药业有限公司提供)。反应体系为25μl组分如下：dNTPs 2.0μl、10×PCR Buffer2.5μl、MgCl2 1.4μl、Taq DNA聚合酶0.4μl、ATCC25922大肠埃希氏菌探针0.4μl、ATCC6528克柔假丝酵母菌探针0.4μl、MRP211.0μl、MRP221.0μl、MRPp0.3μl、ddH2O 8.0μl。最后，加入5μl模板。盖上塑料盖，瞬时离心后，放入荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：95℃预变性5min，94℃30s、55℃15s、72℃40s扩增40个循环，观察结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种临床标本中病原菌基因鉴定前处理方法，包括以下步骤：
(1)胰蛋白酶裂解：在标本中加入等量20mg/l的胰蛋白酶37℃2-4h至标本基本液化，抽吸顺畅；
(2)碱裂解：在胰蛋白酶裂解的基础上再4％NaOH 42℃1h，离心，去上清，生理盐水洗涤、离心，2次取沉淀，向沉淀中加入双蒸水与少量磁珠，再用反复冻融法，95℃10min，迅速置于-80℃10min，再95℃10min，离心，取上清即可。
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