CN101638682A

CN101638682A - 一种降压肽活性的体外检测方法

Info

Publication number: CN101638682A
Application number: CN200910067481A
Authority: CN
Inventors: 刘静波; 刘博群
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2009-09-02
Publication date: 2010-02-03

Abstract

本发明属于功能食品的检测方法领域，涉及降压肽活性检测的方法，尤其涉及利用高效液相色谱与荧光检测器联用对蛋清降压肽的检测。采用高效液相色谱与荧光分光光度计联用技术，通过生成的荧光物质来检测血管紧张素转化酶(ACE)的活性，进而确定降压肽的体外活性。本发明主要步骤包括组氨酰亮氨酸(HL)生成，组氨酰亮氨酸(HL)生成反应终止，荧光物质生成，荧光物质生成反应终止，荧光物质的检测五部分。经方法学验证该方法线性关系良好，回收率为99.26％～103.98％，反应的灵敏度较高，重现性较好。本发明操作简单易行，药品用量少，更加经济节约。

Description

一种降压肽活性的体外检测方法

技术领域

本发明属功能食品的检测方法领域，涉及降压肽活性检测的方法，尤其涉及利用高效液相色谱与荧光检测器联用对蛋清降压肽的检测。

背景技术

世界卫生组织(WHO)规定成人血压≥160/95mmHg为高血压，据统计，世界上约有10亿人患有高血压，每年约有4百万人死于高血压，平均每8个死亡个体中有1个死于高血压，目前，高血压已经严重威胁着人类的健康。研究表明某些肽类化合物具有降低血压的功能，称之为降压肽。目前，针对降压肽较为普遍应用的体外检测方法是紫外分光光度计检测，在血管紧张素转化酶(ACE)的作用下水解马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)，经过萃取分离等操作将产物马尿酸(Hip)分离出，通过对比完全反应(ACE催化HHL水解)、存在抑制剂的反应(ACE在抑制剂存在条件下催化HHL水解)、空白反应(将ACE灭活后在抑制剂存在条件下催化HHL水解)三个反应来确定血管紧张素转化酶(ACE)的活性，进而确定降压肽的活性。因此，体外降血压活性也用血管紧张素转化酶抑制率来表示。

但是，采用紫外分光光度计检测方法存在操作步骤复杂、使用有毒有害有机溶剂、检测药品费用高等缺点；近年有报道高效液相色谱与紫外分光光度计联用来检测水解产物马尿酸(Hip)，但也存在成本高等弊端；而传统的荧光分光光度计检测法由于存在肽与邻苯二甲醛(OPA)反应的干扰使得检测不稳定，同时也存在药品用量大的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有的检测方法操作步骤复杂、操作人员直接接触有害溶剂、检测药品用量高等技术缺点。本发明提供了一种运用邻苯二甲醛(OPA)与组胺酰亮氨酸(HL)反应生成荧光物质，经高效液相色谱分离，通过荧光检测器进行定量的检测方法。本方法方便，灵敏，药品用量少。

本方法的技术方案如下：

本方法需要对比两组反应，要求这两组反应在同样外界条件下单独进行，其中，有一组中存在抑制剂(用B表示)，另一组不存在抑制剂(用A表示)。两组反应按如下步骤进行：

1、组胺酰亮氨酸(HL)生成反应：首先在30℃～40℃条件下将反应容器预热5～15min，A、B反应分别加入相同剂量(10～50μL 0.05U/ml～0.5U/ml)的血管紧张素转化酶(ACE)，A反应中加入10μL的硼酸盐缓冲溶液(0.1mol/L pH＝8.3含0.3mol/L NaCl)，B反应中加入与A相同体积一定浓度的降压肽硼酸盐缓冲溶液。两组反应同时加入10～30μL 3～5mmol/L的马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)，在30℃～40℃条件下反应20～50mm，反应过程中要保持温度恒定。

2、组胺酰亮氨酸(HL)生成反应的终止及碱性条件的建立：通过改变pH值，使酶的活性降低至几乎不再催化水解反应。加入300～400μL 0.2～0.4mol/L NaOH溶液终止反应。保证pH值为10.5～14.0

3、荧光物质生成：在30℃～40℃条件下加入邻苯二甲醛(OPA)反应5～15min。此反应要求在碱性条件下进行，在稀酸性或中性条件下逆反应反应速率较快，影响检测准确性。

4、荧光物质生成反应的终止：通过调节pH值来终止反应，加入30～40μL 2～4mol/L的HCl来终止反应。最终整个反应体系为中性或偏酸性。注：本反应终止后应尽快稀释检测。

5、液相色谱的分离：采用高效液相色谱法来分离荧光物质，将反应液稀释10～200倍，在流动相水与乙腈比例在3∶1～5∶1，流速在0.5～0.8ml/min条件下进样1～10μL，通过高效液相色谱法将组胺酰亮氨酸(HL)与邻苯二甲醛(OPA)反应产物充分分离，避免因肽与邻苯二甲醛(OPA)反应以及肽本身在该条件下发射荧光干扰。使得检测准确。

通过如下公式计算血管紧张素转化酶(ACE)抑制率：

注：A为抑制剂不存在条件下的峰面积；B为抑制剂存在条件下的峰面积。

荧光检测方法学验证：本发明的检测方法在0.0016nmol～0.128nmol线性范围时其线性关系良好，反应的回收率为99.26％～103.98％，反应的灵敏度较高，反应的重现性较好。

本发明的有益效果在于：简化操作的整体步骤，尤其是分离操作的步骤；采用高效液相色谱法提高分离效率，分离效果好；减少药品的使用量，使检测成本降低；避免与有害溶剂的接触，保证操作人员的身体健康。

具体实施方式

实施例1

在30℃条件下，将反应容器预热15min，A、B反应同时加入50μL 0.05U/ml血管紧张素转化酶(ACE)，A反应中加入10μL的硼酸盐缓冲体系(0.1mol/LpH＝8.3含0.3mol/LNaCl)，B反应中加入与A相同体积一定浓度的降压肽硼酸盐缓冲溶液。A、B反应同时加入40μL 4mmol/L的HHL，在30℃条件下反应50min，加入400μL 0.2mol/L的NaOH溶液终止反应，加入20μL的邻苯二甲醛(OPA)反应15min，加入40μL 2mol/L的HCl，终止反应，将反应液稀释200倍，流动相水与乙腈比例在3∶1流速0.5ml/min条件下进样5μL，记录出峰面积，出峰时间为5～15min。

实施例2

在37℃条件下将反应容器预热10min，A、B反应同时加入20μL0.2U/ml血管紧张素转化酶(ACE)，A反应中加入10μL的硼酸盐缓冲体系(0.1mol/LpH＝8.3含0.3mol/L NaCl)，B反应中加入与A相同体积一定浓度的降压肽硼酸盐缓冲溶液。A、B反应同时加入30μL底物5mmol/L的HHL，在37℃条件下反应30min，加入360μL 0.3mol/L的NaOH溶液终止反应，加入10μL的邻苯二甲醛(OPA)反应10min，加入36μL3mol/L的HCl，终止反应，将反应液稀释10倍，在流动相水与乙腈比例在4∶1，流速08ml/min条件下进样1μL，记录出峰面积。

实施例3

在40℃条件下将反应容器预热15min，A、B反应同时加入10μL 0.5U/ml血管紧张素转化酶(ACE)，A反应中加入10μL的硼酸盐缓冲体系(0.1mol/L pH＝8.3含0.3mol/L NaCl)B反应中加入与A相同体积一定浓度的降压肽硼酸盐缓冲溶液。A、B反应同时加入10μL底物5mmol/L的HHL，在40℃条件下反应20min，加入300μL 0.4mol/L的NaOH溶液终止反应，加入50μL的邻苯二甲醛(OPA)反应5min，加入30μL 4mol/L的HCl，终止反应，将反应液稀释100倍，在流动相水与乙腈比例在5∶1，流速在0.6ml/min条件下进样10μL，记录出峰面积。

Claims

1、一种检测降压肽体外活性，即检测血管紧张素转化酶(ACE)抑制率的方法，采用高效液相色谱与荧光检测器联用的方法对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制率进行测定；其特征在于检测过程主要包括组氨酰亮氨酸(HL)生成、组胺酰亮氨酸(HL)生成反应的终止及碱性条件的建立、荧光物质生成、荧光物质生成反应的终止、荧光物质的检测五部分。

2、根据权利1所述的检测降压肽体外活性的方法，其特征在于所述的组氨酰亮氨酸(HL)生成过程包括：对比两组独立的反应A、B，其中A为没有降压肽存在下马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)水解生成组胺酰亮氨酸(HL)，B为有降压肽存在条件下马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)水解生成组胺酰亮氨酸(HL)。具体步骤为：在30℃～40℃条件下将反应容器预热5～15min，A、B反应分别加入相同剂量(10～50μL0.05U/ml～0.5U/ml)的血管紧张素转化酶(ACE)，A反应中加入10μL的硼酸盐缓冲溶液(0.1mol/L pH＝8.3含0.3mol/L NaCl)，B反应中加入与A相同体积一定浓度的降压肽硼酸盐缓冲溶液；A、B反应同时加入10～30μL底物3～5mmol/L的马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)，在30℃～40℃条件下反应20～50min。

3、根据权利1所述的降压肽体外活性的方法，其特征在于所述的组胺酰亮氨酸(HL)生成反应的终止及碱性条件的建立过程为：加入300～400μL 0.2～0.4mol/L的NaOH溶液终止组胺酰亮氨酸(HL)生成反应，同时提供碱性反应条件(pH值10.5～14.0)。

4、根据权利1所述的检测降压肽体外活性的方法，其特征在于所述的荧光物质生成过程为：在30℃～40℃条件下加入10～50μL的邻苯二甲醛(OPA)反应5～15min。

5、根据权利1所述的检测降压肽体外活性的方法，其特征在于所述的荧光物质生成反应的终止过程为：加入30～40μL 2～4mol/L的HCl。

6根据权利1所述的检测降压肽体外活性的方法，其特征在于所述的荧光物质检测为：将反应液稀释10～200倍，在流动相水与乙腈比例在3∶1～5∶1，流速在0.5～0.8ml/min条件下进样1～10μL，通过荧光检测器检测，记录出峰面积。

7、根据权利1所述的检测降压肽体外活性的方法，通过方法学检验得到本发明的检测方法线性范围在0.0016nmol～0.128nmol时其线性关系良好，回收率为99.26％～103.98％，反应的灵敏度较高，反应的重现性较好。