CN102994489A - 生物素-亲和素系统固定化糖化酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物-素亲和素系统固定化糖化酶及其制备方法。本发明提供生物素-亲和素系统固定化糖化酶，由以下方法制得：1.磁性琼脂糖微球的制备：①Fe3O4磁性微球的制备，②磁性琼脂糖微球的制备，2.亲和素-磁性琼脂糖微球的制备，3.生物素标记糖化酶的制备：称取1mg生物素溶于2mL、pH4.6醋酸缓冲液中，然后取浓度为4mg/mL糖化酶液2.0ml加入到溶液中，20℃时搅拌2.5h后静置24h。用透析袋进行透析，除去未反应的生物素，得到生物素标记糖化酶。4.生物素-亲和素系统固定化糖化酶。该产品稳定性好、可反复使用、适应连续化、自动化的工业生产、酶的使用效率高。

Description

生物素-亲和素系统固定化糖化酶及其制备方法

技术领域

本发明属于酶制剂领域，特别涉及种固定化酶。

背景技术

酶的固定化是指采用有机或无机固体材料作为载体，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并且可以回收和重复使用酶的一种化学方法与技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效性、专一性、温和性以及可调节控制性等催化反应特性以外，还有其稳定性高、分离回收容易、可重复多次使用、操作连续可控、工艺简便、成本低等一系列优点。近年来，固定化酶在食品、制药、化学分析、环境保护等方面的应用越来越广泛，而且因为具有节省能源与资源，减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

传统酶固定化方法存在酶在任意位点与载体进行连接使酶活性位点不能充分暴露；固定化酶经过重复使用后酶活力慢慢下降，而且酶的固定化量降低等问题。酶的定向固定就是通过不同的方法，把酶和载体在酶的特定位点上连接起来，使酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝固体表面的外侧排列，有利于底物进入到酶的活性位点里去，能够显著提高固定化酶的活性。与传统的固定化方法相比，定点固定化技术制备的固定化酶具有更出色的催化活性。目前，定向固定的方法有以下几种：共价固定法；氨基酸置换法；抗体耦联法；生物素-亲和素亲和法；酶与金属离子连接和疏水定向固定法。

亲和素是一种糖蛋白，分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。亲合素分子与生物素分子结合常数(Ka)高达1015mol/L。生物素-亲和素(biotin-avidin)系统的应用开辟了一类新的酶固定化技术。生物素-亲和素亲和法是从蛋白融合法中派生出来的一种高效的定点固定化方法。生物素-亲和素的分子识别特性在酶的固定化研究中有重要价值，日益受到大家的关注。

生物素与亲和素之间高度的特异性结合力、桥联作用以及多级放大作用，可以使多数蛋白质、酶、抗体、DNA等较容易的生物素化，且生物素化并不降低其生物活性。因此，生物素-链亲和素系统成为现代生物技术领域最有力的工具之一，在生物学、分子生物学、生物化学、临床医学等领域广泛应用。一些研究者应用生物素-亲和素系统固定化酶制备的生物传感器取得较好的效果。该系统与固相载体的结合应用，更是具有潜在的发展前景。本研究在磁性琼脂糖微球表面上偶联上亲和素，用生物素标记糖化酶，利用亲和素和生物素的高特异性牢固结合，将糖化酶固定在磁性琼脂糖微球表面上。

糖化酶(Glucoamylase EC3.2.1.3)是由微生物分泌产生的具有外切酶活性的胞外酶，催化淀粉从非还原端水解α-1，4糖苷键逐个释放出单个β-D-葡萄糖。此外，还能水解α-1，6糖苷键和α-1，3糖苷键，能将支链淀粉彻底水解为葡萄糖，是水解淀粉的主要酶类，现已被广泛的应用于白酒、酒精、食醋、氨基酸、有机酸和抗生素等发酵工业。但是游离糖化酶在使用过程中存在着酶活力较低、易失活、不能重复使用、糖化时间长、不易与产物分离等缺点。而固定化酶则弥补了游离酶的这些不足，具有稳定性好、可反复使用、适应连续化自动化的工业生产、酶的使用效率提高和成本降低等优点。

发明内容

本发明提供生物素-亲和素系统固定化糖化酶，由以下方法制得：

1.磁性琼脂糖微球的制备

①Fe₃O₄磁性微球的制备

按照Fe³⁺∶Fe²⁺＝1.75∶1的质量比，分别加入35mL 0.5mol/L FeCl₃和20mL 0.5mol/L FeCl₂溶液于200mL烧杯中，用电动搅拌器搅拌，使溶液混合均匀，置60℃水浴锅中，然后快速滴入2mol/L NaOH溶液直至pH＝6.5(此为Fe₃O₄胶状物的等电点)15min后继续缓慢加入NaOH溶液调pH至10～11，其余条件不变，液体由棕色变为黑色即可，再升温至80℃恒温保持1h，停止加热，搅拌冷却，待降至室温后，分别用蒸馏水和乙醇洗涤数次，直至中性，室温下进行真空干燥，干燥温度60℃时间24hr，即得Fe₃O₄纳米粒子。

②磁性琼脂糖微球的制备

采用反相悬浮包埋法。分别将28mL三氯甲烷和72mL甲苯混合，搅拌，加入1.0mL Span-80混匀，50℃水浴预热。取2g琼脂糖粉、溶入25mL自制Fe₃O₄磁流体中，加热溶解后将其均匀分散在有机相中，搅拌冷却，过滤，用石油醚清洗3次，用蒸馏水大量冲洗。

2.亲和素-磁性琼脂糖微球的制备

取1mg磁性琼脂糖微球，在磁场下用0.01mol/L、pH6.0磷酸二氢钠缓冲液洗涤，在50mL烧杯中加入4ml pH7.1连接液，混匀。室温下摇床中振荡15min，避免磁性微球沉淀，并起混匀作用，磁场下用2mmol/L盐酸溶液洗涤，再用0.02mol/L、pH6.2磷酸盐缓冲液重悬磁性微球。立即加入30μg亲和素，混匀，室温下振荡20min。磁场下用0.02mol/L、pH6.2磷酸盐缓冲液洗涤磁性微球，并重悬在该磷酸盐缓冲液中。

所述连接液的配制：准确称量30mg EDC、18mg NHS，溶于3mL 0.01mol/LpH6.0的磷酸二氢钠缓冲液中。

3.生物素标记糖化酶的制备

称取1mg生物素溶于2mL、pH4.6醋酸缓冲液中，然后取浓度为4mg/mL糖化酶液2.0ml加入到溶液中，20℃时搅拌2.5h后静置24h。用透析袋进行透析，除去未反应的生物素，得到生物素标记糖化酶。

4.生物素-亲和素系统固定化糖化酶

将1mg亲和素-磁性琼脂糖微球载体加入到5mL pH6.1乙酸乙-酸钠缓冲溶液中，再加入40μL生物素标记的糖化酶液，20℃振荡20min，用磁铁收集，倒出上清液，用乙酸-乙酸钠缓冲液充分洗涤，于4℃冰箱中保存，即得固定化糖化酶。

有益效果

本发明在磁性琼脂糖微球表面上偶联上亲和素，用生物素标记糖化酶，利用亲和素和生物素的高特异性牢固结合，将糖化酶固定在磁性琼脂糖微球表面上加工而成的生物素-亲和素系统固定糖化酶，克服了传统游离糖化酶在使用过程中存在着酶活力较低、易失活、不能重复使用、糖化时间长、不易与产物分离等缺点。该产品稳定性好、可反复使用、适应连续化、自动化的工业生产、酶的使用效率高、成本低，在食品、制药、化学分析、环境保护等领域具有很好的发展前景。其酶活力为1629.7U/g，活力回收率为56.3％，固定化酶相对活力为64.7％；固定化酶连续使用5次，酶活仍保持了77.8％。固定化酶的半衰期为84d，固定化酶的最适作用温度为65℃，最适pH为5.1，米氏常数K_m为2.28mg/mL，较游离糖化酶的米氏常数Km(5.56mol/L)小，说明其与底物的亲和力提高，有利于酶与底物的作用。

附图说明

图1葡萄糖标准曲线

图2固定化对酶表观Km值的影响

图3固定化酶的重复使用稳定性

相关的检测方法：

1.生物素结合糖化酶及亲和素的测定方法

①生物素结合糖化酶的测定

紫外可见分光光度计测定生物素与糖化酶反应后的溶液在210nm处的OD值。

②亲和素结合量的测定

紫外可见分光光度计测定亲和素与磁性微粒充分反应前后溶液在210nm处的OD值。通过测定其偶联效率计算在磁性琼脂糖微粒表面亲和素的结合容量。

2.游离酶及固定化酶活性的测定

2.1葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取于105～110℃干燥后的葡萄糖50mg，用蒸馏水溶解，定容至50mL容量瓶中，配成1mg/mL标准溶液。按表1比例操作后，开水煮沸15min冷却，加入10.5 mL蒸馏水，摇匀，于WFJ2100型可见分光光度计0.5cm比色皿，550nm比色。

表1葡萄糖标准曲线表

空白：蒸馏水代替葡萄糖

以OD值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，作标准曲线，求出K值。

2.2糖化酶活力的测定

糖化酶活力定义：在40℃ pH4.6条件下，每小时水解淀粉产生1mg葡萄糖作为一个酶活力单位。

(1)游离糖化酶活力的测定

在25mL磨口塞试管中，加入2％可溶性淀粉9.8mL，于40℃水浴锅中，预热3～5min钟，加入稀释一定倍数的酶液0.2mL，准确反应20min，立刻取出0.5mL反应液于预先吸有1.5mLDNS液的试管中，开水煮沸15min，冷却后加10.5mL蒸馏水，摇匀，比色测定。条件与标准曲线一致。空白用高温灭活酶液，其余操作同上。酶活力用如下公式计算：

酶活力＝OD×n×k×5×20×3

式中：OD——吸光度               5——将0.2mL酶液换算成1mL酶液

      k——比色常数

      n——酶稀释倍数            20——将0.5mL反应液换算成10mL

      3——将20min按换算成1h

(2)固定化酶活力测定

加入固定化酶0.05g替代0.2mL的酶液，其余条件同上。

3.蛋白质的测定

采用微量凯式定氮法(见国标GB/T 5009.5-2003)分别测定固定化酶中酶蛋白的含量。

$X=\frac{(V_1-V_2)\×c\×0.0140}{m\×10/100}\×F\×100$

式中：X-试样中蛋白质的含量，  g/100g或g/100mL；

V₁-试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

V₂-空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

c-硫酸或盐酸标准滴定液浓度，mol/L

0.0140-1.0mL硫酸[c(1/2H₂SO₄)＝1.000mol/L]或盐酸[c(HCL)＝1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

m-试样的质量或体积，g或mL；

F-蛋白质转换系数，为6.25。

4.固定化酶表观米氏常数Km值的测定

取1mg固定化酶，以浓度分别为2、3、4、5、10mg/mL的淀粉溶液作为底物，于pH4.6、温度40℃下保温反应1h，测定其酶活力，以相对酶活力代表酶反应的速度，按Line weaver-Burk作图法以反应速度的倒数对底物浓度的倒数作图，所得直线在x轴上的截距即为-1/Km，如图1所示。

从图2中求出固定化酶的米氏常数Km为2.28mg/mL，较游离酶的米氏常数Km(5.56mg/mL)小，说明固定化酶对底物的亲和力远远大于游离酶，即使用含较低底物浓度的反应系统便可以获得最大的反应速度。

5.固定化酶重复使用稳定性的测定

将1mg固定化酶在相同条件下连续反应5个批次，每批次反应后分别测定酶活力，结果如图3所示，固定化酶反复使用5次后酶活仍保持了77.8％。

6.固定化酶保存半衰期的测定

固定化酶的保存稳定性通常以半衰期表示，即固定化酶活力下降为初活力一半时所经历的时间。假定活力损失与时间成指数关系，半衰期可用下式表达：

$t_{1/2}=\frac{0.693}{K_D}$

其中K_D是衰减常数，可用下式计算：

$K_D=\frac{2.303}{t}\log \left(\frac{E_0}{E}\right)$

E/E₀是在时间t后，酶活力残留的分数。

具体操作是将固定化酶放在4℃冰箱保存，每隔15大测定一次固定化酶活力，代入上述公式计算得固定化酶的保存半衰期为84d。

7.固定化酶活力回收率和固定化酶相对活力测定

酶活力回收率是指偶联反应后，固定化酶所显示的活力占加入偶联液中酶的总活力的百分数。

即

固定化酶相对活力是指固定化了的酶活力与同样蛋白量的自然酶的活力的比值。计算公式：

按上述方法计算最佳工艺制备的固定化酶的活力回收率为56.3％，固定化酶相对活力为64.7％。

8.固定化酶的最适作用温度及最适作用pH

8.1最适作用温度的测定

称1mg固定化酶，于pH4.6，温度分别取40、45、50、55、60、65、70、75℃的各10mL的2％可溶性淀粉溶液中，按常规方法测定固定化酶活力得知，随着温度的升高，固定化酶活力增加；当温度为65℃时，固定化酶的活力最高，比游离酶的最适作用温度提高了5℃，这是由于固定化酶具有更加稳定的空间立体结构，酶蛋白耐受热变性的能力提高。酶最适反应温度的提高，使酶催化反应能在较高温度下进行，加快反应速度，从而提高酶催化作用效率。

8.2最适pH值的测定

称1mg固定化酶，置于pH分别为3.6、4.1、4.6、5.1、5.6、6.1、6.6，温度为40℃的10mL的2％可溶性淀粉中，按常规方法测定固定化酶活力得知，随着pH的增加固定化酶的相对活力逐渐升高，pH5.1时相对酶活达到最高，随后开始下降。故固定化酶的最适作用pH为5.1。

9.生物素-亲和素系统固定化糖化酶活力的测定

按常规方法测定固定化糖化酶的活力为1629.7U/g。

Claims (2)

1.生物素-亲和素系统固定化糖化酶，由以下方法制得

(1)磁性琼脂糖微球的制备

①Fe₃O₄磁性微球的制备

分别加入35mL 0.5mol/L FeCl₃和20mL 0.5mol/L FeCl₂溶液于200mL烧杯中，用电动搅拌器搅拌，使溶液混合均匀，置60℃水浴锅中，然后快速滴入2mol/L NaOH溶液直至pH＝6.5，15min后继续缓慢加入NaOH溶液调pH至10～11，其余条件不变，液体由棕色变为黑色即可，再升温至80℃恒温保持1h，停止加热，搅拌冷却，待降至室温后，分别用蒸馏水和乙醇洗涤数次，直至中性，室温下进行真空干燥，干燥温度60℃时间24hr，即得Fe₃O₄纳米粒子；

②磁性琼脂糖微球的制备

采用反相悬浮包埋法。分别将28mL三氯甲烷和 72mL甲苯混合，搅拌，加入1.0mL Span-80混匀，50℃水浴加热，在快速搅拌下加入8％琼脂糖溶液，使琼脂糖在有机相中分散均匀，减慢搅拌速度，自然冷却，过滤，用石油醚清洗3次，用蒸馏水大量冲洗；

(2)生物素标记糖化酶的制备

称取1mg生物素溶于2mL、pH4.6醋酸缓冲液中，然后取浓度为4mg/mI糖化酶液2.25ml加入到溶液中，20℃时搅拌3h后静置24h。用透析袋进行透析，除去未反应的生物素，得到生物素标记糖化酶；

(3)亲和素-磁性琼脂糖微球的制备

取1mg磁性琼脂糖微球，在磁场下用磷酸二氢钠缓冲液洗涤，在50mL烧杯中加入连接液，混匀。室温下摇床中振荡15min，避免磁性微球沉淀，并起混匀作用，磁场下用盐酸缓冲液洗涤，再用磷酸盐缓冲液重悬磁性微球。立即加入亲和素30μg，混匀，室温下振荡20min。磁场下用磷酸盐缓冲液洗涤磁性微球，重悬在磷酸盐缓冲液中；

(4)糖化酶的固定化

将1mg亲和素-磁性琼脂糖微球载体加入到5mL pH6.1乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，再加入生物素标记的糖化酶液40μL，20℃振荡30min，用磁铁收集，倒出上清液，用缓冲液充分洗涤，最后于4℃冰箱中保存，即得固定化糖化酶。

2.根据权利要求1所述生物素-亲和素系统固定化糖化酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)磁性琼脂糖微球的制备

①Fe₃O₄磁性微球的制备

分别加入35mL 0.5mol/LFeCl₃和20mL 0.5mol/L FeCl₂溶液于200mL烧杯中，用电动搅拌器搅拌，使溶液混合均匀，置60℃水浴锅中，然后快速滴入2mol/L NaOH溶液直至pH＝6.5，15min后继续缓慢加入NaOH溶液调pH至10～11，其余条件不变，液体由棕色变为黑色即可，再升温至80℃恒温保持1h，停止加热，搅拌冷却，待降至室温后，分别用蒸馏水和乙醇洗涤数次，直至中性，室温下进行真空干燥，干燥温度60℃时间24hr，即得Fe₃O₄纳米粒子；

②磁性琼脂糖微球的制备

采用反相悬浮包埋法。分别将28mL三氯甲烷和 72mL甲苯混合，搅拌，加入1.0mL Span-80混匀，50℃水浴加热，在快速搅拌下加入8％琼脂糖溶液，使琼脂糖在有机相中分散均匀，减慢搅拌速度，自然冷却，过滤，用石油醚清洗3次，用蒸馏水大量冲洗； 

(2)生物素标记糖化酶的制备

称取1mg生物素溶于2mL、pH4.6醋酸缓冲液中，然后取浓度为4mg/mL糖化酶液2.25ml加入到溶液中，20℃时搅拌3h后静置24h。用透析袋进行透析，除去未反应的生物素，得到生物素标记糖化酶；

(3)亲和素-磁性琼脂糖微球的制备

取1mg磁性琼脂糖微球，在磁场下用磷酸二氢钠缓冲液洗涤，在50mL烧杯中加入连接液，混匀。室温下摇床中振荡15min，避免磁性微球沉淀，并起混匀作用，磁场下用盐酸缓冲液洗涤，再用磷酸盐缓冲液重悬磁性微球。立即加入亲和素30μg，混匀，室温下振荡20min。磁场下用磷酸盐缓冲液洗涤磁性微球，重悬在磷酸盐缓冲液中；

(4)糖化酶的固定化

将1mg亲和素-磁性琼脂糖微球载体加入到5mL pH6.1乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，再加入生物素标记的糖化酶液40μL，20℃振荡30min，用磁铁收集，倒出上清液，用缓冲液充分洗涤，最后于4℃冰箱中保存，即得固定化糖化酶。 

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