CN103063785A - 氨基酸分析用多功能前处理设备及前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种氨基酸分析用多功能前处理设备，以及应用这种前处理设备的一种前处理方法。这种氨基酸前处理设备，其结构简单，设计巧妙，集多种前处理功能于一体，基本上具备了氨基酸分析的全部前处理功能，操作起来方便快捷，并且这种设备的制作工艺简单，制造成本低廉，可以说具备了多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场前景十分广阔。而本发明所提出的氨基酸前处理方法，与传统的方法相比，具备较为优异的重复性，其稳定性和准确性都较高，同时还有较好的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸分析用前处理设备，以及利用这种设备对待测样品进行氨基酸分析的前处理方法。
背景技术
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物、医药、卫生、农牧业、食品、饮料及饲料等行业生产和科研中必须的分析测试项目。
目前，氨基酸分析方法主要有化学分析法、电化学方法、分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等，其中高效液相色谱法（HPLC）是使用最为普遍的方法之一。高效液相色谱法包括离子交换和反相两种模式。离子交换使用仪器为氨基酸分析仪，成本高、专属性强、普及率低。反相模式使用通用型高效液相色谱梯度系统，成本低、普适性强、一机多用。
采用反相液相色谱分析氨基酸，一般需要将样品中蛋白质水解成为氨基酸， 传统的水解方式为酸水解法，也是目前使用最广泛的方法。
氨基酸在HPLC分析前，需要大量的前处理工作。前处理过程的重复性和准确性，是最终氨基酸分析结果准确性的首要决定因素。氨基酸分析前处理过程使用的前处理设备包括烘箱、氮吹议、恒温水浴装置等。前处理设备过多会使操作过程繁琐，影响方法稳定性和准确性，同时造成成本的提高。目前只有Waters公司推出PICO.TAGTM水解装置，可用于苯异硫氰酸酯（PITC）衍生氨基酸分析方法的酸水解和衍生过程。虽然该装置具有操作方便，安全可靠等优点，但成本非常高。
同时由于大部分氨基酸没有紫外吸收或荧光响应，无法直接进行高效液相色谱分析，因此需要进行衍生，引入有紫外吸收或荧光响应的基团。PITC是目前最具吸引力的氨基酸衍生试剂之一，它可以同时与一级和二级氨反应，且衍生产物稳定，方法灵敏度高。但过量的衍生试剂会影响色谱柱寿命，因此进样前需尽量去除过量的衍生试剂。目前最常用的方法是正己烷萃取法，该方法操作简便，但PITC与氨基酸的衍生反应在碱性条件下（pH=9.0）进行，衍生后样品呈碱性，直接进样分析会影响色谱峰型，因此还需要将样品稀释2-4倍，而样品的稀释过程会导致方法敏度降低。《黄酒中氨基酸测定方法》行业标准征求意见稿中采用加入一定体积的10%乙酸水溶液调节样品pH值，但该方法不稳定，当乙酸放置时间过长，浓度发生微小变化时，样品pH值相应改变，会严重影响色谱峰型，出现峰分叉现象。
综上所述，现阶段氨基酸分析的前处理步骤较为繁琐，操作复杂，需要应用较多的设备进行操作，并且其稳定性和准确性都有待提高。因此现在需要一种能够解决上述问题的新处理方法以及相应的处理设备。
本发明装置集多种前处理功能于一体，具备氨基酸分析全部前处理功能，且安全可靠、成本低，操作方便，适合推广，同时能够提供更佳的方法稳定性、准确性以及灵敏度。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种集多种前处理功能于一体，具备氨基酸分析全部前处理功能的设备，同时还提出一种氨基酸前处理的方法，该方法安全可靠、成本低，操作方便，适合推广，同时这种方法还具备较高的稳定性、准确性和灵敏度。
本发明的技术解决方案是：一种氨基酸分析用多功能前处理设备，其特征在于：所述的处理设备包括透明的箱体1，箱体1的上部设置有可开启的上盖2，上盖2与箱体1之间设置有密封垫3，在箱体1内设置有样品架4，在箱体1内还设置有加热管5和测温管6，加热管5通过设置在箱体1外部的温控表7进行控制，在上盖2上设置有带有流速调节阀9的氮吹管8，氮吹管8可以相对于上盖2纵向移动并固定，在上盖2上还设置有抽真空管10。
所述的氮吹管8为多个，并且均匀分布在上盖2上，所有的氮吹管8的入口都与设置在上盖2上的多通11连接，多通11的通道数量与氮吹管8的数量相配。
一种利用如权利要求1所述的氨基酸分析用多功能前处理设备对氨基酸进行分析前处理的方法，该方法包括酸水解、除酸、样品衍生化和干燥四个步骤，其特征在于：
所述的酸水解步骤为：将需分析样品放入安瓿瓶，并向安瓿瓶中加入过量的6mol/L的盐酸，配制成样品溶液，安瓿瓶高温拉丝封口后，放入样品架4上，开启加热管5，对样品溶液在110±3℃的条件下水解24h，
所述的除酸步骤为：安瓿瓶自然冷却至室温后，将其封口开启，利用上盖2上的抽真空管10对箱体1内腔抽真空，同时通过氮吹管8向样品架4上安瓿瓶中的样品溶液进行氮吹，直至吹干，然后将安瓿瓶取出，用水充分洗涤安瓿瓶，合并洗涤液，在容量瓶中定容，定容体积至多为25mL，
所述的样品衍生化步骤为：利用针筒式滤膜对容量瓶中的样品溶液进行过滤，将过滤后的样品溶液放置在离心管中，加入1mol/L的三乙胺乙腈溶液和0.2mol/L的异硫氰酸苯酯乙腈溶液，且样品溶液与三乙胺乙腈溶液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液的体积比为2:1:1，涡旋混匀，将离心管放入样品架4，开启加热管5，对样品混合溶液在30±1℃的条件下衍生1h，
所述的干燥步骤为：利用上盖2上的抽真空管10对箱体1内腔抽真空，同时通过氮吹管8向样品架4上离心管中的样品溶液进行氮吹至干，向离心管中加入100-400μL 、0.05mol/L的乙酸钠水溶液，涡旋混匀。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
本发明所提出的氨基酸前处理设备，其结构简单，设计巧妙，集多种前处理功能于一体，基本上具备了氨基酸分析的全部前处理功能，操作起来方便快捷，并且这种设备的制作工艺简单，制造成本低廉，可以说具备了多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场前景十分广阔。而本发明所提出的氨基酸前处理方法，与传统的方法相比，具备较为优异的重复性，其稳定性和准确性都较高，同时还有较好的灵敏度。
附图说明
图1为本发明多功能前处理设备的结构示意图。
具体实施方式
下面将说明本发明的具体实施方式。
如图1所示，一种氨基酸分析用多功能前处理设备，它包括一个透明的箱体1，箱体1最好采用耐高温玻璃制作；在箱体1的上部设置有可开启和关闭的上盖2，为了保证箱体1关闭状态下的密闭性，在上盖2与箱体1之间还设置有密封垫3；在箱体1内部设置有样品架4，根据所需放置的样品瓶的规格不同，样品架4可以为与样品瓶相配的结构或样式；在箱体1内还设置有加热管5和测温管6，而加热管5通过设置在箱体1外部的温控表7进行控制；在上盖2上设置有带有流速调节阀9的氮吹管8，氮吹管8可以相对于上盖2纵向移动并固定，为了方便氮吹步骤，氮吹管8可以为多个，并且均匀地分布在上盖2上，所有的氮吹管8的入口都与设置在上盖2上部的多通11相连，而这个多通11的通道数量则与氮吹管8的数量相配；在上盖2上还设置有抽真空管10。
本发明所用的仪器设备与试剂。
UV1201紫外-可见检测器，P1201高压恒流泵，AS1201自动进样器，EliteAAP色谱柱，EC2006色谱工作站（以上均为大连依利特分析仪器有限公司产品），漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，QL-861）等。
氨基酸标准品（SIGMA ALDRICH），异硫氰酸苯酯（PITC，纯度＞98%，百灵威科技有限公司），无水乙酸钠，冰醋酸，三乙胺，盐酸、乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），去离子水等（除特别标注外，其它均为分析纯）。
主要试剂及配制方法
0.2mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液：移取0.24 mL异硫氰酸苯酯至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。
1.0mol/L三乙胺乙腈溶液：移取1.45 mL三乙胺至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。
标准储备液：Amino Acid Standard，SIGMA ALDRICH，AAS-18-10×1mL，2.5μmol/mL。
标准工作液：准确量取标准储备液1mL至10 mL容量瓶中，加水稀释并定容。
一种氨基酸进行分析前处理的方法，该方法包括酸水解、除酸、样品衍生化和干燥四个步骤，其特征在于：
所述的酸水解步骤为：将需分析样品放入安瓿瓶，（如需分析样品为固态，需要先用粉碎设备将其粉碎），并向安瓿瓶中加入过量的6mol/L的盐酸，配制成样品溶液，将装有样品溶液的安瓿瓶高温拉丝封口后，放入样品架4上，开启加热管5，而测温管6检测箱体1内油的温度，并将温度值反馈给温控表7，温控表7根据箱体1内的油温对加热管5进行控制，保持油温在110±3℃，让样品溶液在该温度条件下水解24h；
所述的除酸步骤为：水解工作完成后，让安瓿瓶和其内的样品溶液自然冷却至室温，并将安瓿瓶的封口开启，关闭上盖2，利用上盖2上的抽真空管10对箱体1内腔抽真空，调节氮吹管8的高度，使其与安瓿瓶中的液面高度相适应，并向多通11内填充氮气，氮气通过多通11和氮吹管8后进入箱体1，对安瓿瓶中的样品溶液进行氮吹，直至吹干，然后将安瓿瓶取出，用水充分洗涤安瓿瓶，合并洗涤液，在容量瓶中定容，定容体积不超过25mL；
所述的样品衍生化步骤为：利用针筒式滤膜对容量瓶中的样品溶液进行过滤，滤除混合溶液中的固态物质，将过滤后的样品溶液放置在离心管中，加入1mol/L的三乙胺乙腈溶液和0.2mol/L的异硫氰酸苯酯乙腈溶液，保证样品溶液与三乙胺乙腈溶液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液的体积比为2:1:1，涡旋混匀，将离心管放入样品架4，开启加热管5，对样品混合溶液在30±1℃的条件下衍生1h；
所述的干燥步骤为：利用上盖2上的抽真空管10对箱体1内腔抽真空，同时仍然通过多通11和氮吹管8向样品架4上离心管中的样品溶液进行氮吹至干，向离心管中加入一定量的0.05mol/L乙酸钠水溶液（体积为100-400μL），涡旋混匀。可根据实际样品氨基酸含量减小定容体积，最小可减至100μL。然后取10μL的待测样品溶液进行高效液相色谱（HPLC）分析。
HPLC分析色谱条件
流动相A：0.05 mol/L乙酸钠（冰醋酸调节pH=6.5±0.05）
流动相B：乙腈:甲醇:水=60:20:20
色谱柱：Elite AAP，5μm，4.6×150mm
检测波长：254nm
流速：1.0mL/min
柱温：42℃
梯度条件：
| 时间(min) | 0.05 mol/L乙酸钠 | 乙腈/甲醇/水=60/20/20 |
| 0 | 95 | 5 |
| 39 | 55 | 45 |
| 40 | 0 | 100 |
| 50 | 0 | 100 |
| 51 | 95 | 5 |
| 65 | 95 | 5 |
检测结果
衍生产物稳定性
衍生后的样品于4℃冰箱冷藏保存，进样前恢复至室温。样品连续4天进样分析，每天进样3次。计算各氨基酸12次进样的峰面积RSD值。结果如表1。
表1衍生产物稳定性
衍生产物稳定性实验数据表明，除胱氨酸峰面积RSD值较大外，其它氨基酸峰面积RSD值在0.73～2.09之间，说明各氨基酸衍生产物在4天内是稳定的。PITC衍生氨基酸分析方法固有的缺陷即为胱氨酸衍生产物不稳定，线性不好。文献报道氨基酸PITC衍生产物的稳定性为3天，本发明所采用的方法衍生产物稳定性可达到4天。
方法重复性
定容体积为400μL，平行5份氨基酸样品进行前处理及HPLC分析，方法重复性结果如表2。
表2 定容体积为400μL时方法重复性数据
定容体积为100μL，平行5份氨基酸样品进行前处理及HPLC分析，方法重复性结果如表3。
表3 定溶体积为100μL时方法重复性数据
方法重复性实验结果表明，定溶体积为400μL和100μL时，除胱氨酸外，各氨基酸峰面积RSD值均小于5%。氨基酸分析为微量分析，方法重复性RSD值范围为小于10%，本发明涉及前处理设备及方法能够使氨基酸分析方法更加稳定。
线性相关性
以2.5μmol/mL 17种氨基酸混标溶液为母液，逐级稀释，分别配制浓度为0.0125μmol/mL、0. 025μmol/mL、0.05μmol/mL、0.1μmol/mL、0.25μmol/mL、1.0μmol/mL的17种氨基酸系列标准工作液。衍生后，按浓度由低至高进样分析。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制校准曲线，计算线性相关系数R值，上述浓度范围内各氨基酸线性相关性结果表4所示。
表4 17种氨基酸线性相关性结果
| 氨基酸 | 线性方程 | R |
| 天冬氨酸 | y = 7,145.78 x - 103.85 | 0.9996 |
| 谷氨酸 | y = 7,210.30 x - 92.165 | 0.9997 |
| 丝氨酸 | y = 8,117.37 x - 64.25 | 0.9997 |
| 甘氨酸 | y = 8,205.19 x - 41.035 | 0.9996 |
| 组氨酸 | y = 7,843.39 x - 107.435 | 0.9996 |
| 精氨酸 | y = 5,985.01 x - 46.955 | 0.9997 |
| 苏氨酸 | y = 5,590.62 x - 42.57 | 0.9998 |
| 丙氨酸 | y = 12,971.29 x - 99.51 | 0.9997 |
| 脯氨酸 | y = 8,871.93 x + 9.20 | 0.9994 |
| 酪氨酸 | y = 8,884.1849 x - 102.57 | 0.9997 |
| 缬氨酸 | y = 8,591.62 x - 67.24 | 0.9996 |
| 蛋氨酸 | y = 9,276.57 x - 85.38 | 0.9997 |
| 胱氨酸 | 线性不好 | |
| 异亮氨酸 | y = 8,946.21 x - 65.14 | 0.9996 |
| 亮氨酸 | y = 9,131.72 x - 90.24 | 0.9997 |
| 苯丙氨酸 | y = 8,837.57 x - 63.08 | 0.9997 |
| 赖氨酸 | y = 16,817.23 x - 94.68 | 0.9997 |
线性实验结果表明，17种氨基酸除胱氨酸外，其它氨基酸在测定浓度范围内线性相关系数在0.9994-0.9997之间。通常情况下，线性相关系数范围为大于0.99，本发明涉及前处理设备及方法能够得到更为优异的线性关系。
方法准确性
以奶粉为实际样品，加标浓度为0.25μmol/mL，加标回收率结果如表5。
表5 加标回收率实验结果
除胱氨酸外，16种氨基酸加标回收率在91.34%～100.39%之间。氨基酸分析加标回收率的限定范围为80%-110%之间，本发明涉及的设备及前处理方法使氨基酸分析结果更加准确。
Claims (3)
1.一种氨基酸分析用多功能前处理设备，其特征在于：所述的处理设备包括透明的箱体（1），箱体（1）的上部设置有可开启的上盖（2），上盖（2）与箱体（1）之间设置有密封垫（3），在箱体（1）内设置有样品架（4），在箱体（1）内还设置有加热管（5）和测温管（6），加热管（5）通过设置在箱体（1）外部的温控表（7）进行控制，在上盖（2）上设置有带有流速调节阀（9）的氮吹管（8），氮吹管（8）可以相对于上盖（2）纵向移动并固定，在上盖（2）上还设置有抽真空管（10）。
2.根据权利要求1所述的氨基酸分析用多功能前处理设备，其特征在于：所述的氮吹管（8）为多个，并且均匀分布在上盖（2）上，所有的氮吹管（8）的入口都与设置在上盖（2）上的多通（11）连接，多通（11）的通道数量与氮吹管（8）的数量相配。
3.一种利用如权利要求1所述的氨基酸分析用多功能前处理设备对氨基酸进行分析前处理的方法，该方法包括酸水解、除酸、样品衍生化和干燥四个步骤，其特征在于：
所述的酸水解步骤为：将需分析样品放入安瓿瓶，并向安瓿瓶中加入过量的6mol/L的盐酸，配制成样品溶液，安瓿瓶高温拉丝封口后，放入样品架（4）上，开启加热管（5），对样品溶液在110±3℃的条件下水解24h，
所述的除酸步骤为：安瓿瓶自然冷却至室温后，将其封口开启，利用上盖（2）上的抽真空管（10）对箱体（1）内腔抽真空，同时通过氮吹管（8）向样品架（4）上安瓿瓶中的样品溶液进行氮吹，直至吹干，然后将安瓿瓶取出，用水充分洗涤安瓿瓶，合并洗涤液，在容量瓶中定容，定容体积至多为25mL，
所述的样品衍生化步骤为：利用针筒式滤膜对容量瓶中的样品溶液进行过滤，将过滤后的样品溶液放置在离心管中，加入1mol/L的三乙胺乙腈溶液和0.2mol/L的异硫氰酸苯酯乙腈溶液，且样品溶液与三乙胺乙腈溶液、异硫氰酸苯酯乙腈溶液的体积比为2:1:1，涡旋混匀，将离心管放入样品架（4），开启加热管（5），对样品混合溶液在30±1℃的条件下衍生1h，
所述的干燥步骤为：利用上盖（2）上的抽真空管（10）对箱体（1）内腔抽真空，同时通过氮吹管（8）向样品架（4）上离心管中的样品溶液进行氮吹至干，向离心管中加入100-400μL 、0.05mol/L的乙酸钠水溶液，涡旋混匀。
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