CN101632877B - 一种低聚木糖各组分的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用活性炭对低聚木糖各单一组分分离纯化的方法，其步骤为吸附、解析、冲洗、纯化、浓缩、冷冻、冻干。因各种糖分子的聚合度不同，活性炭对其的吸附能力不同，解析后在流动相中的分布不同，分子量较小的木二糖先被解析下来，然后以木三糖至木七糖的顺序各木糖逐渐被解析下来，因而能使各种单体得到分离。本发明制备方法以价廉易得的活性炭为吸附介质，操作简单易掌握，所得到的低聚木糖单一组分的纯度≥98％。

Description

一种低聚木糖各组分的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种低聚木糖各单一组分的分离纯化方法，具体是用一种活性炭分离纯化低聚木糖各单一组分的方法。

背景技术

低聚木糖是由2-7个木糖分子以β-1，4糖苷键结合而成的功能性聚合糖。与其他功能性低聚糖相比，它具有可以选择性地促进肠道双歧杆菌的增殖活性，难为人体消化酶所分解，酸、热稳定性好，难发酵，有效摄入量少等优良特性。目前主要用于保健食品、医药、饲料等方面。

低聚木糖其成分有木二糖-木七糖。目前制备的大都是低聚木糖的混合物，制备的各组分较少，且其中大多数是作为标准品使用，其价格昂贵。中国发明专利“一种聚合度为2～8的低聚木糖各组分的制备分离方法”(申请号：200510094118.6，申请日2005.8.30，申请人：南京林业大学)公开了一种采用超滤膜技术和聚丙烯酰胺凝胶柱色谱进行分离低聚木糖各组分，分离纯度为90％以上。但超滤是一种以压力作为推动力的物理分离技术它是通过不同孔径的膜在常温下对不同成分的物质进行分离，他对复杂组分的分离比较困难，而且超滤膜抗污染性能差，使用寿命短。另外由于凝胶价格昂贵，再生困难，目前仅用在实验室研究上，很难用于低聚木糖单一组分的规模化生产。

发明内容

本发明是一种利用活性炭对低聚木糖各单一组分分离纯化的方法，其步骤为吸附、解析、冲洗、纯化、浓缩、冷冻、冻干。因各种糖分子的聚合度不同，活性炭对其的吸附能力不同，解析后在流动相中的分布不同，分子量较小的木二糖先被解析下来，然后以木三糖至木七糖的顺序各木糖逐渐被解析下来，因而能使各种单体得到分离。

本发明的技术方案是：一种低聚木糖各组分的分离纯化方法，步骤如下：

(1)煮炭：取活性炭，缓缓倒入烧杯中，加纯水至淹没活性炭，用电炉加热至沸腾，恒沸30分钟，期间不停搅拌，目的是将经过高温蒸煮排出活性炭空隙中的空气，以更加利于吸附、洗脱；

(2)装炭：蒸煮完毕后将上述冷却后的活性炭与水的混合液缓缓倒入层析柱内，柱体下部要打开阀门将多余水流出，但不要低于活性炭炭面，期间用软木塞或者胶体塞不停敲打柱体，使活性炭沉降均匀和密实，然后在活性炭表面盖一层普通滤纸；

(3)洗炭：打开蠕动泵用纯水冲洗活性炭，调节柱流速为0.8-3mm/min，冲洗时间为24-48小时(注：冲洗时间越长越好，若时间较紧促可加大流速，冲洗24小时)；

(4)进样：取活性炭质量1/25的低聚木糖溶于纯净水中(要求：水越少越好，能充分溶解即可)，缓缓倒入柱内活性炭上部，打开下部阀门，使低聚木糖溶液缓缓下降至高于活性炭面2-3ml处，然后打开蠕动泵，开始用纯水冲洗，流速与步骤(3)洗炭时的流速相同，冲洗时间为22-26小时，期间保持柱液面高于活性炭上表面，流出液用苯酚硫酸法进行检测，流出液经苯酚硫酸法显色后从浅黄色至无色后开始取样；

(5)洗脱：用乙醇进行梯度洗脱，流速与步骤(3)洗炭时的流速相同，自动收集器收集，自动收集器收集时间优选为1小时，在整个洗脱过程中乙醇的重量百分浓度要从0至45％以0.1％的速度线性上升，随着乙醇的重量百分浓度的上升，分子量较小的木二糖先被解析下来，然后以木三糖至木七糖的顺序各糖逐渐被解析下来；

(6)检测：将自动收集器收集的各瓶样品与木二糖-木七糖各木糖标准品点在硅胶板，放入层析缸中用展开剂(展开剂为正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1)展开，晾干，再展开(目的是达到一个更好的展开及分离效果)，再晾干，然后用喷雾器将5％的硫酸(浓硫酸∶乙醇＝v/v)喷到硅胶板上，要喷匀，放入通风橱内晾干，再放入电热箱中110℃加热5分钟，将硅胶板取出，将样品和标准品的展开及显色效果进行对比，把各单一组分的最纯的样品分别收集起来进行浓缩；

(7)浓缩：由于收集的样品为水、乙醇和低聚木糖的各单一组分，用旋转蒸发仪蒸发出乙醇和水分，各浓缩液放入冰箱冷冻成冰，以便于冻干；

(8)冻干：将冷冻成冰的各浓缩液，在容器口用保鲜膜封好，并在保鲜膜上用针或牙签扎几个洞，便于水分扩散到容器外，然后放入冻干机，开启真空泵，打开制冷开关，制冷温度调到-47.5℃，冻干时间为50-72小时，得到各单一样品；

(9)纯化：对于收集的产品中纯度小于98％(重量比)的样品，还将进一步分离纯化，分离纯化使用硅胶柱即可。

通过此法得到的单一组分为木二糖-木七糖共六种。各种组分收率(占原料低聚木糖的的重量比例)为：木二糖25-31％、木三糖29-35％、木四糖14-18％、木五糖6-8％、木六糖3-6％、木七糖6-10％，各种组分纯度≥98％(重量比)。

本发明可用于工业化规模生产。本发明用于工业化规模生产时，只需将试验用的设备转化为相应的工业用生产设备即可，如：用薄膜蒸发器代替旋转蒸发仪，不锈钢层析柱代替实验室用玻璃层析柱等。

本发明的有益效果是：它是分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。此法主要是以价廉易得的活性炭为吸附介质，操作简单易掌握，分离纯度高可以得到纯度大于98％的低聚木糖单一组分，并且可以反复使用。

具体实施方式

实施例1：

1.煮炭

取750克活性炭，缓缓倒入5L烧杯中，加纯水至淹没活性炭，用电炉加热至沸腾，恒沸30分钟，期间不停搅拌，目的是将经过高温蒸煮排出活性炭空隙中的空气，以更加利于吸附、洗脱。

2.装炭

蒸煮完毕后将上述冷却后的活性炭与水的混合液缓缓倒入柱子内部，期间用软木塞或者胶体塞不停敲打柱体，使活性炭沉降均匀和密实。

3.洗炭

打开蠕动泵，调节好流速，本次实验柱流速为2.5ml/min(层析柱直径为57mm)，冲洗时间24-48小时。

4.进样

取30克低聚木糖溶于水中，缓缓倒入柱内活性炭上部，打开下部阀门，使低聚木糖溶液缓缓下降至高于活性炭面2-3ml处，然后打开蠕动泵，开始用纯水冲洗，时间为24小时，流出液经苯酚硫酸法显色后从浅黄色至无色后开始取样。

5.取样

用乙醇进行洗脱，自动收集器收集，柱流速为2.5ml/min，设定自动收集器收集时间为1小时，1小时收集量为150ml，在整个洗脱过程中乙醇的浓度要从0～45％线性以0.1％的速度缓慢线形上升。

6.检测

用硅胶板进行点板，放入层析缸中，用展开剂展开(展开剂为正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1)，晾干，再展开，再晾干，然后用喷雾器将5％硫酸(浓硫酸∶乙醇＝v/v)喷到硅胶板上，放入通风橱内晾干，再放入电热箱中110℃加热5分钟，取出硅胶板，将样品和标准品的展开效果及显色效果进行对比，将各单一组分的最纯的样品分别收集起来进行浓缩。

7.浓缩

由于收集的样品为水、乙醇和各单一组分，所以用旋转蒸发仪蒸发出乙醇和水分，浓缩至10-20ml，放入冰箱冷冻成冰，以便于冷干。

8.冷干

将冷冻成冰的各浓缩液，在容器口用保鲜膜封好，并在保鲜膜上用针或牙签扎几个洞，便于水分扩散到容器外，然后放入冷干机，开启真空泵，打开制冷开关，制冷温度调到-47.5℃，冷干时间至少50小时，得到各单一组分样品。

9.纯化

(1)处理样品

将混合样品置于烧杯中，按每1克样品(干基)加入1.4-1.7ml的纯水的比例加入纯水溶解，称取样品(干基)重量0.9-1.2倍的干硅胶倒入溶液中，搅拌均匀后放入通风橱内风干(约8～10小时就能够达到效果)。

在本次试验中，取1.0克的混合样品(干基)于小烧杯中，用1.5ml纯水溶解，称取1.0克干硅胶倒入溶液中，搅拌均匀后放入通风橱内风干。

(2)装柱

装柱时要使用真空泵从底部抽气，使硅胶倒入柱内后不飘散。在整个装柱过程以及装柱完毕后都需要不停的敲打，使硅胶在柱内堆积紧密。(柱颈比为1∶10左右，视样品的纯度而定)

对于两种糖混合且含糖量比较多的样品，需要用硅胶柱分离的方法，将干硅胶缓缓倒入纯化柱(离交柱即可)，用软木塞或胶体塞不断敲打柱壁，待硅胶面平整后用剪刀剪与柱内壁直径大小相同的滤纸盖在硅胶面上，然后倒入风干之后的含有样品的硅胶。

(3)开始洗脱

洗脱剂为正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1的混合液，洗脱液在干硅胶柱中开始运行，用自动收集器进行收集。

(4)检测

将收集的洗脱液点在硅胶板上，用吹风机吹干放入层析缸中展开，(展开剂为正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1)，等展开剂上升到距离硅胶板顶端2-3cm处，取出硅胶板，于通风橱内晾干并用喷壶喷上5％的硫酸溶液(浓硫酸/乙醇＝v/v)，在通风橱内晾干，放入烘箱110℃烘烤5分钟。

(5)浓缩

将单一组分最纯的样品的收集起来，于旋转蒸发仪中蒸发浓缩，将正丁醇和乙酸蒸出，浓缩液中含有有机溶剂越少越好。

(6)冷冻

将蒸馏后的浓缩液放入冰箱中冷冻成冰。

(7)冻干

将冷冻成冰的浓缩液，在容器口用保鲜膜封好，并在保鲜膜上用针或牙签扎几个洞，便于水分扩散到容器外，然后放入冷干机，开启真空泵，打开制冷开关，制冷温度调到-47.5℃，冷干时间至少50小时，得到单一组分样品。

所得产品收率及纯度：木二糖和木三糖为主要产物。木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖和木七糖单一组分的重量百分收率分别为30.37％，31.65％，16.14％，7.76％，3.55％，7.33％。对各种单一组分按化合物纯度熔点测定法计算，木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖及木七糖的纯度都≥98％(重量比)。

实施例2：

1.煮炭

取1kg活性炭，缓缓倒入烧杯中，加纯水至淹没活性炭，用电炉加热至沸腾，恒沸30分钟，期间不停搅拌，目的是将经过高温蒸煮排出活性炭空隙中的空气，以更加利于吸附、洗脱。

2.装炭

蒸煮完毕后将冷却后的活性炭与水的混合液缓缓倒入柱子内部，期间用软木塞或者胶体塞不停敲打柱体，使活性炭沉降均匀和密实。

3.洗炭

打开蠕动泵，调节好流速，本次实验流速为3ml/min(层析柱直径为57mm)，冲洗时间24-48小时。

4.进样

取40克低聚木糖溶于水中，缓缓倒入柱内活性炭上部，打开下部阀门，使低聚木糖溶液缓缓下降至高于活性炭面2-3ml处，然后打开蠕动泵，开始用纯水冲洗，时间为23小时，期间用苯酚硫酸法进行检测，流出液经苯酚硫酸法显色后从浅黄色至无色后开始取样。

5.取样

用乙醇进行洗脱，自动收集器收集，柱流速为3ml/min，设定自动收集器收集时间为1小时，1小时收集量为180ml，在整个洗脱过程中乙醇的浓度要从0～45％线性以0.1％的速度线形缓慢上升。

纯化步骤(1)取1.1克的混合样品(干基)于小烧杯中，用1.7ml纯水溶解，称取1.2克干硅胶倒入溶液中，搅拌均匀后放入通风橱内风干。

其余各步骤同实施例1。

所得产品收率及纯度：木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖和木七糖单一组分的重量百分收率分别为29.53％，32.26％，15.32％，7.52％，4.21％，8.25％。对各种单一组分按化合物纯度熔点测定法计算，木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖及木七糖的纯度≥98％(重量比)。

Claims (2)

1.一种低聚木糖各组分的分离纯化方法，步骤如下：

(1)煮炭：取活性炭，缓缓倒入烧杯中，加纯水至淹没活性炭，用电炉加热至沸腾，恒沸30分钟，期间不停搅拌，排出活性炭空隙中的空气；

(2)装炭：蒸煮完毕后将上述冷却后的活性炭与水的混合液缓缓倒入层析柱内，柱体下部要打开阀门将多余水流出，但要保持柱液面高于活性炭炭面，期间用软木塞或者胶体塞不停敲打柱体，使活性炭沉降均匀和密实，然后在活性炭表面盖一层普通滤纸；

(3)洗炭：打开蠕动泵用纯水冲洗活性炭，调节柱流速为0.8-3mm/min，冲洗24-48小时；

(4)进样：取活性炭质量1/25的低聚木糖溶于纯净水中，缓缓倒入柱内活性炭上部，打开下部阀门，使低聚木糖溶液缓缓下降至高于活性炭面2-3ml处，然后打开蠕动泵，开始用纯水冲洗，柱流速与步骤(3)洗炭时的流速相同，冲洗时间为22-26小时，期间保持柱液面高于活性炭上表面，流出液经苯酚硫酸法显色后从浅黄色至无色后开始取样；

(5)洗脱：用乙醇进行梯度洗脱，柱流速与步骤(3)洗炭时的流速相同，自动收集器收集，在整个洗脱过程中乙醇的重量百分浓度要从0至45％以0.1％的速度线性上升，随着乙醇的重量百分浓度的上升，分子量较小的木二糖先被解析下来，然后以木三糖至木七糖的顺序各木糖逐渐被解析下来；

(6)检测：将自动收集器收集的各瓶样品与木二糖-木七糖各木糖标准品点在硅胶板，放入层析缸中以正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1为展开剂展开，晾干，再展开，再晾干，然后用喷雾器将体积百分数为5％的硫酸喷到硅胶板上，要喷匀，放入通风橱内晾干，再放入电热箱中110℃加热5分钟，将硅胶板取出，将样品和标准品的展开及显色效果进行对比，将各单一组分的最纯的样品分别收集起来进行浓缩；

(7)浓缩：由于收集的样品为水、乙醇和低聚木糖的各单一组分，用旋转蒸发仪蒸发出 乙醇和水分，各浓缩液放入冰箱冷冻成冰，以便于冻干；

(8)冻干：将冷冻成冰的各浓缩液，在容器口用保鲜膜封好，并在保鲜膜上用针或牙签扎几个洞，便于水分扩散到容器外，然后放入冻干机，开启真空泵，打开制冷开关，制冷温度调到-47.5℃，冻干时间为50-72小时，得到各单一样品；

(9)纯化：对于收集的产品中纯度小于98wt％的样品，使用硅胶柱继续分离纯化；

所述低聚木糖是由2-7个木糖分子以β-1，4糖苷键结合而成的功能性聚合糖。

2.如权利要求1所述的一种低聚木糖各组分的分离纯化方法，其特征是，所述步骤(5)的自动收集时间设定为1小时。