CN101632704B - 一种抗疲劳提高免疫力的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗疲劳、提高免疫力的中药组合物及其制备方法，具体地涉及中药材女贞子和黄芪经姬松茸发酵后的组合物、其制备方法及其在抗疲劳、提高免疫力方面的作用。本发明中药组合物的药用价值可以和人参皂苷这种价格昂贵的保健产品相当，而其各项抗疲劳、提高免疫力的评价指标均明显高于贞芪扶正颗粒，从而提高了药材的价值，降低了成本。

Description

一种抗疲劳提高免疫力的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于中药领域，具体地涉及一种抗疲劳、提高免疫力的中药组合物及其制备方法，更具体地涉及中药材女贞子和黄芪经姬松茸发酵后的组合物及其制备方法。

背景技术

随着社会的进步、生活节奏及工作强度的不断加快和加大，“疲劳”和“过劳”日益受到重视。疲劳发生后如果得不到及时消除，将会逐渐积累，最终导致过劳，出现过度训练综合症和慢性疲劳综合症等，使机体发生内分泌紊乱、免疫力下降，甚至出现器质性病变，成为威胁人类身心健康的重要因素。因此，延缓疲劳的发生和促进疲劳的恢复一直是是航天医学、军事医学和运动医学等学科的研究热点。

人参(panax ginsen C.A)是被列为上品的补益中药，其主补五脏，安精神，安魂魄，止惊悸，除邪气，明目开心益智，久服轻身延年，其大补元气为人们所公认。人参皂苷是人参的有效成份，是抗疲劳，增强免疫力之佳品，但是人参皂苷制品的价格非常昂贵，阻碍了其普及使用。

黄芪(Astragalus membranaceus)和女贞子(Ligustrum lucidum)都是我国常见的廉价中药材。黄芪补气为君，既能抗疲劳又能提高免疫；女贞子滋润养阴为佐，起到辅助君臣抗疲劳的作用，并抑制君臣温热之性，以防上火，有一定的保健作用。黄芪的特征性功效成份为黄芪甲苷，女贞子的特征性功效成份为齐墩果酸。以黄芪和女贞子为主要成份的制剂作为保健品和临床药物，已广泛用于增强免疫，提升白细胞，减轻放化疗反应等多方面。例如，贞芪扶正胶囊由黄芪、女贞子等药材制成，具有滋阴补气、补肾健脾、扶正补虚之功效，临床上常用于治疗肿瘤放、化疗引起的白细胞减少症，疗效显著，并有相关研究表明，其亦有一定的抗疲劳功效。

真菌姬松茸(Agaricusb lazeiM urill)又名巴西蘑菇，是一种药食同源的真菌，其含有大量的多糖、凝集素、幽醇类物质、氨基酸、脂质和维生素等生理活性物质，具有免疫增强、促进骨髓造血、抗肿瘤等多重作用。

利用传统的廉价中药材，通过新的提取或炮制方法，从中制得堪比人参皂苷等昂贵中药制品的高效抗疲劳及提高机体免疫能力的中药制剂，是一个很有意义的研究课题。

近年来，中药的生物转化技术崭露头角，中药生物转化技术是目前全新的中药炮制方法，即将中药原药材通过微生物进行转化，生物转化过程中微生物细胞产生一种或多种酶，把原药材的成份分解，或利用中药成份为底物合成新的化合物，使原中药成份发生药效变化，通过这种生物转化的方法可能会制得高效、低毒或有新疗效的产品。

本发明人经过长期实验研究，利用生物转化方法，将女贞子和黄芪经姬松茸发酵，从女贞子和黄芪两种传统中药材组合中制得高效抗疲劳和提高免疫的中药组合物，并基于此完成本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗疲劳、提高免疫力的中药组合物；本发明的另一目的在于提供一种抗疲劳、提高免疫力的中药组合物的制备方法；本发明的目的还在于提供一种抗疲劳提高免疫力的中药组合物在制备抗疲劳、提高免疫力的药物中的用途。

一种抗疲劳、提高免疫力的中药组合物，其特征在于采用中药材女贞子和黄芪通过真菌发酵的方法获得。

本发明所述的真菌选自姬松茸。

本发明再一方面提供上述中药组合物的制备方法，其包括如下步骤：

a.按照重量比1∶1取中药材女贞子和黄芪作为固体培养基；

b.在培养基上接种真菌进行发酵；

c.收集发酵产物，经50-70℃烘干、粉碎，制成超细粉即得。

其中步骤b中所述的真菌为姬松茸，其发酵条件为：温度为20-33℃、含水量为45-60％，发酵时间为20-45天；优选的温度为30℃，优选的含水量为55％，优选的发酵时间为40天。

本发明提供的上述中药组合物的具体制备方法为：

a.按照重量比1∶1取中药材女贞子和黄芪作为固体培养基；

b.在培养基上接种姬松茸，在温度为30℃、含水量为55％，的条件下发酵40天；

c.收集步骤b中的发酵产物，经70℃烘干、粉碎，制成超细粉。

本发明的中药组合物的制备流程图表示在附图1中。

本发明再一方面提供上述方法制得的女贞子和黄芪的姬松茸发酵产物在抗疲劳、提高免疫力方面的作用。

本发明的中药组合物可以制备成超细粉直接口服使用，该组合物是女贞子和黄芪经姬松茸发酵后的产物，有一定香味，直接入口大多数人是能接受的；同时超细粉作为20世纪80年代后期出现的新技术，能使细胞内活性成份充分暴露出来，大大提高了生物活性的利用程度。可以将本产品使用九号筛过筛后直接装入小包装袋中供使用。也可以制备成胶囊制剂，将超细粉经胶囊机灌入硬质胶囊中，这样更便于日常食用和在旅行中食用。

业已知道用真菌使药材发酵会引起其组织成份变化，导致性味功能改变，这是中药生物转化的理想方法。我们经过筛选，选定姬松茸(Agaricusb lazeiM urill)作为发酵菌种，用特选的中药材黄芪、女贞子作为培养基质，双方共构一个发酵组合，在特定条件下进行固体发酵，能得到新型高功效发酵物。经过实验研究，以上两种中药材为基质，姬松茸为生物转化媒介，通过一定条件，获得本发明的中药组合物，其有关各项动物实验评价指标均明显优于药材基质和转化媒介(姬松茸)，更喜人的是本发明中药组合物的药用价值可以和人参皂苷这种价格昂贵的保健产品相当，而各项评价指标均明显高于贞芪扶正颗粒，从而提高了药材的价值，降低了成本。

本发明的制备工艺简单，充分利用中草药本身的作用，并在此基础上，增加其药用价值，达到昂贵药材的功效，并且大胆的利用了姬松茸作为生物转化媒介分解原有药材成份，提高其功效。整个流程价格低廉，绿色环保，可产生良好的经济效益。

附图说明

图1女贞子和黄芪经姬松茸发酵的流程图

图2葡萄糖标准曲线

具体实施方式

具体实施例是为了更好地说明本发明的内容，并不意味着对本发明进行限制，本发明中使用的中药材黄芪购于山西沁源县绵山区，女贞子购于江苏沭阳县，姬松茸购于中科院微生物所。

实施例1.女贞和黄芪的姬松茸发酵物的制备

取中药材女贞1公斤和黄芪1公斤过20目筛粉碎，向其中加入1.2升水，搅拌均匀，作为生长姬松茸的培养基，将搅拌均匀的培养基装入若干个食用菌菌种袋中，装料高度为20厘米，用颈圈及透气膜封口；放入高压锅中，121℃灭菌2小时，取出放凉，在无菌接种台上接入10％姬松茸的液体摇瓶菌种，放入培养室，调节发酵25±3℃，含水量为60％，发酵40天；取出后，收集发酵产物，在烘箱中70℃烘干，经粉碎机粉碎至200目，即得女贞和黄芪的姬松茸发酵物超细粉。

实施例2.女贞和黄芪的姬松茸发酵物的制备

取中药材女贞1公斤和黄芪1公斤过20目筛粉碎，向其中加入1.2升水，搅拌均匀，为生长姬松茸的培养基，将搅拌均匀的培养基装入若干个食用菌菌种袋中，装料高度为20厘米，用颈圈及透气膜封口；放入高压锅中，121℃灭菌2小时，取出放凉，在无菌接种台上接入10％姬松茸的液体摇瓶菌种，放入培养室，调节发酵温度为30±3℃、含水量为60％，发酵40天；取出后，收集发酵产物，在烘箱中70℃烘干，经粉碎机粉碎至200目，即得女贞和黄芪的姬松茸发酵物超细粉。

实施例3.女贞和黄芪的姬松茸发酵物的制备

取中药材女贞1公斤和黄芪1公斤过20目筛粉碎，向其中加入1.2升水，搅拌均匀，为生长姬松茸的培养基，将搅拌均匀的培养基装入若干个食用菌菌种袋中，装料高度为20厘米，用颈圈及透气膜封口；放入高压锅中，121℃灭菌2小时，取出放凉，在无菌接种台上接入10％姬松茸的液体摇瓶菌种，放入培养室，调节发酵温度为30±3℃、含水量为55％，发酵40天；取出后，收集发酵产物，在烘箱中70℃烘干，经粉碎机粉碎至200目，即得女贞和黄芪的姬松茸发酵物超细粉。

实施例4.女贞和黄芪的姬松茸发酵物的制备

取中药材女贞1公斤和黄芪1公斤过20目筛粉碎，向其中加入1.2升水，搅拌均匀，为生长姬松茸的培养基，将搅拌均匀的培养基装入若干个食用菌菌种袋中，装料高度为20厘米，用颈圈及透气膜封口；放入高压锅中，121℃灭菌2小时，取出放凉，在无菌接种台上接入10％姬松茸的液体摇瓶菌种，放入培养室，调节发酵温度为30±3℃、含水量为55％，发酵50天；取出后，收集发酵产物，在烘箱中60℃烘干，经粉碎机，粉碎至200目，即得女贞和黄芪的姬松茸发酵物超细粉。

实施例5.女贞和黄芪的姬松茸发酵物中指标成份的检测

采用高效液相色谱法检测本发明的女贞和黄芪的姬松茸发酵物中以下指标成份：黄芪甲苷、异黄芪甲苷、齐墩果酸、活性多糖。

(一)黄芪甲苷、异黄芪甲苷

异黄芪甲苷在高效液相色谱图中为特征峰，只有经过此发酵过程才有此峰出现，未经发酵的女真子和黄芪组合物的图谱中没有此特征峰。

高效液相色谱法测定黄芪甲苷和异黄芪甲苷的方法参照《中华人民共和国药典》05版，第一部“黄芪”项下“含量测定”方法。

1色谱条件

色谱柱：5uAnalytical XDB-C18分析柱，4.6x250mm；流动相：甲醇-水＝80∶20(V/V)等度洗脱；柱温：25℃；流速：0.6ml/minELSD；漂移管温度：42℃；氮气流速：3.01/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

2对照品溶液的制备

精密称定黄芪甲苷对照品5.3mg，加甲醇溶解，定容至10ml即得。

3供试品的制备

取实施例1中制得的女贞和黄芪的姬松茸发酵物超细粉约30g，精密称定，加入300ml水，超声提取30分钟，过滤，滤液备用。残留物加入300ml水，超声提取30分钟，过滤，滤液与第一次的滤液合并，浓缩至约30ml，转移至分液漏斗中，用水饱合的正丁醇提取6次，每次20ml，合并正丁醇液，用1％NaOH溶液洗涤2次，每次60ml，弃去碱液，用正丁醇饱合的水60ml洗1次，弃去水层，正丁醇层水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至2ml。

4测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪测定。以外标两点法对数方程计算黄芪甲苷的含量为0.2％左右。

5“异黄芪甲苷”的定性检测

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪测定。在与对照品色谱峰相对应的位置上，供试品图谱上有黄芪甲苷色谱峰出现；在比对照品色谱峰晚约2分钟的位置上，供试品图谱上有异黄芪甲苷色谱峰出现。

(二)齐墩果酸：高效液相色谱法测定齐墩果酸的方法参考《中华人民共和国药典》05版，中药材“女贞”项下“齐墩果酸含量测定”方法。

1色谱条件

色谱柱：5u Analytical XDB-C18分析柱，4.6x250mm；流动相：甲醇∶己啨∶水＝90∶90∶10(V/V)等度洗脱；柱温：25℃；流速：0.6ml/minELSD；漂移管温度：42℃；氮气流速：3.01/min。

2对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品5.0mg，加甲醇溶解，定容至10ml即得。

3供试品的制备

取实施例1中制得女贞和黄芪的姬松茸发酵物超细粉约3g，精密称定，加入300ml己醇，超声提取1小时，过滤，滤液备用。残留物加入300ml己醇，超声提取1小时，过滤，残留物共提取四次，四次滤液合并，浓缩至约30ml，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至2ml。

4测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪测定，以外标两点法对数方程计算齐墩果酸的含量约为1.38％左右。

(三)活性多糖：采用蒽酮法测定活性多糖的方法参考《中华人民共和国药典》05版，中药材灵芝及黄芪中多糖的提取方法。

1对照品溶液的制备

取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含对照品0.106mg的溶液，即得。

2标准曲线的绘制

分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml，置10ml具塞试管中，加水至2.0ml，加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加80％的硫酸溶液100ml使溶解)6ml，摇匀，置沸水浴中加热15分钟。取出，放入冰浴中冷却，以相应的试剂为空白对照，在625nm波长处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，对照品溶液质量为横坐标，绘制标准曲线，见图2。

3供试品的制备

取实施例1中制得女贞和黄芪的姬松茸发酵物超细粉约10g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水200ml，加热回流1小时。过滤，滤液备用。残渣加水150ml，加热回流1小时。过滤，弃去滤渣，合并两次滤液，浓缩至20ml，加入95％乙醇，静置过夜。抽滤，滤饼干燥至无醇味，转移至烧杯中，分次加入少量水，超声使溶解，转移至100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，从中精密量取适量溶液(2.5～5ml)转移至25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

4测定

精密量取供试品溶液适量(0.4～0.5ml)，至10ml具塞试管中，按照“标准曲线的绘制”项下的方法，自“加水至2.0ml”起，依法测定吸光值，计算，发酵物中含活性多糖约为14.8％。

实施例6.不同菌种在女贞和黄芪培养基中的生长情况

采用实施例1中的方法，在重量比为1∶1的黄芪和女贞子中加水搅拌均匀作为培养基，分别将灵芝、香菇、桑黄、姬松茸等菌种接种于上述培养基中，每种菌种接种10袋培养基，观察各种真菌的生长情况，直到菌丝长满袋为止，结果见表1。

表1.各种真菌在培养基中的生长情况

菌种	灵芝	香菇	桑黄	姬松茸
					生长天数(T)	45	45	70	40

由表1可知，姬松茸菌在黄芪和女贞子培养基中的生长速度最快，为40天，灵芝、香菇菌在培养基中的生长速度次之，为45天，桑黄菌在培养基中的生长速度最慢为70天。由于发酵时间越长成本越高，所以从成本的角度考虑姬松茸菌是较好的发酵媒介。

实施例7.不同菌种的发酵产物中特定成份的含量测定

用高效液相色谱仪对实施例6中各菌种的发酵产物进行分析，测定发酵产物中黄芪甲苷和齐墩果酸的含量，并检测产物中是否有新物质6-O-β-D-葡萄糖基-3，6，16，25-四羟基环菠萝蜜烷(以下简称异黄芪甲苷)出现。不同菌种的发酵产物中特定成份的含量见表2和表3。

表2.不同真菌发酵产物中齐墩果酸的含量

样品名	齐墩果酸含量(％)
		桑黄发酵产物	1.3692
灵芝发酵产物	1.3742
		香菇发酵产物	1.2311
姬松茸发酵产物	1.3811
		女贞子药材标准品	1.0661

注：每种样品测定三次，最终含量取三次的平均值。

由表2可知，黄芪和女贞子经各种菌种发酵后，产物中的齐墩果酸含量都比未发酵的女贞子中的含量高，其中姬松茸发酵产物中齐墩果酸含量最高；桑黄、灵芝发酵产物中齐墩果酸含量比姬松茸略低；香菇发酵产物中齐墩果酸含量最低。

表3.不同发酵产物中黄芪甲苷及异黄芪甲苷的含量

样品名	黄芪甲苷含量(％)	异黄芪甲苷含量(％)
			黄芪药材标准品	0.1505	0
姬松茸发酵产物	0.1968	0.0756
			香菇发酵产物	0.1605	0.0016
桑黄发酵产物	0.1857	0.0416
			灵芝发酵产物	0.0555	0.3424

注：每种样品测定三次，最终含量取三次的平均值。

由表3可知，与未经发酵的黄芪相比，姬松茸发酵产物中黄芪甲苷的含量增加最多，且有异黄芪甲苷成份出现；桑黄、香菇发酵产物中黄芪甲苷含量的增加仅次于姬松茸，且在桑黄发酵产物有异黄芪甲苷出现，香菇发酵产物中异黄芪甲苷量极少为0.0016％；灵芝发酵物中黄芪甲苷含量比未经发酵的黄芪中大为降低，但其中异黄芪甲苷含量增加最多为0.3424％。

由于发酵产物中黄芪甲苷和齐墩果酸以及异黄芪甲苷的含量越高，其抗疲劳、提高免疫力的效果越好，从这个角度看，姬松茸菌是较好的发酵媒介。

实施例8.各种真菌发酵物抗疲劳和提高机体免疫力的效果实验

以贞芪扶正胶囊、人参总皂苷为对照品，对实施例6中制得的姬松茸发酵产物、桑黄发酵产物、灵芝发酵产物进行抗疲劳作用和提高机体免疫力作用的评价，其中抗疲劳作用采用小鼠力竭游泳实验来评价，提高机体免疫力作用采用溶菌酶实验来评价。

8.1实验材料

贞芪扶正胶囊(产自甘肃扶正药业科技股份有限公司，以下简称CA)：每粒相当于84mg生药提取物，稀释成22ml混悬液，即约2mg/0.5ml，此量约为正常人口服剂量的十倍；

人参总皂苷(以下简称R)：1mg/0.5ml，此量约为正常人口服剂量的十倍；

姬松茸菌发酵物(FHM)：分低剂量组(FHM1)0.5ml悬浮液，含12.5mg FHM超细粉；中剂量组(FHM2)0.5ml悬浮液，含25mg FHM超细粉；高剂量组(FHM3)0.5ml悬浮液，含50mg FHM超细粉。灵芝菌发酵物(CHM)：分低剂量组(CHM1)0.5ml悬浮液，含12.5mg CHM超细粉；中剂量组(CHM2)0.5ml悬浮液，含25mg CHM超细粉；高剂量组(CHM3)0.5ml悬浮液，含50mg CHM超细粉。桑黄菌发酵物(SHM)：分低剂量组(SHM1)0.5ml悬浮液，含12.5mg SHM超细粉；中剂量组(SHM2)0.5ml悬浮液，含25mg SHM超细粉；高剂量组(SHM3)0.5ml悬浮液，含50mg SHM超细粉。

8.2实验动物

120只健康雄性昆明小鼠由军事医学科学院动物中心提供，体重20±0.7g，自由饮水、饮食，动物实验前观察适应5天，复查合格后开始进入正式实验。

8.3实验方法

(1)实验分组：

小鼠随机均分为12组，即CHM1、CHM2、CHM3、FHM1、FHM2、FHM3、SHM1、SHM2、SHM3、CA、R、生理盐水对照组(以下简称：C)，每组10只小鼠；在整个实验期内，CHM1、CHM2、CHM3、FHM1、FHM2、FHM3、SHM1、SHM2、SHM3各组每天各灌服0.5ml的CHM1、CHM2、CHM3、FHM1、FHM2、FHM3、SHM1、SHM2、SHM3超微粉悬液，CA组每天各灌服0.5mlCA悬浮液，R组每天均灌服0.5mlR悬浮液，C组每天均灌服0.5ml生理盐水。小鼠自由采食、饮水，饲养过程中，每天换水，隔日换笼中的木屑垫料以保持清洁。环境温度20-25℃，至灌胃起到实验结束共15天。实验开始及实验结束分别对每组小鼠称重。

表4.各实验组小鼠灌胃剂量

实验分组

灌胃剂量

CHM1	0.5ml悬浮液，含12.5mg CHM
		CHM2	0.5ml悬浮液，含25mg CHM
CHM3	0.5ml悬浮液，含50mg CHM
		FHM1	0.5ml悬浮液，含12.5mg FHM
FHM2	0.5ml悬浮液，含25mg FHM
		FHM3	0.5ml悬浮液，含50mg FHM
SHM1	0.5ml悬浮液，含12.5mg SHM
		SHM2	0.5ml悬浮液，含25mg SHM
SHM3	0.5ml悬浮液，含50mg SHM
		CA	0.5mlCA悬浮液
R	0.5mlR悬浮液
		C	0.5ml生理盐水

(2)鼠血清的制备：末次灌胃后24h，各组小鼠摘除眼球后眼眶取血1～2ml，置于事先装有肝素的试管中，3000rpm，离心10min，取上清夜作为待测血清备用。

(3)测定指标和方法：

力竭游泳实验

末次灌胃30min后称量小鼠体重，然后在各组小鼠尾根部负荷体重5％的铅丝，将负荷小鼠放入50cm×40cm×40cm的水箱中游泳，水温30±2℃。参照保健食品检验与评价技术规范(2003版)推荐的力竭判断标准，即小鼠头部沉入水中，经10s仍不能返回水面视为力竭，记录从游泳开始到力竭的时间作为小鼠游泳时间。

溶菌酶测定

采用南京建成生物工程研究所的A050-1溶菌酶(LZM)测试盒(带标准)测定各组小鼠血清溶菌酶含量。

8.4实验结果

表5.小鼠力竭游泳实验结果

实验分组	小鼠力竭游泳时间(s)
		CHM1	1640±423
CHM2	1524±313
		CHM3	1420±322
FHM1	2720±423**
		FHM2	2222±313**
FHM3	2080±322**
		SHM1	2762±423**
SHM2	2222±313**
		SHM3	2121±322**
CA	1977±356*
		R	2244±371**
C	1161±256

由表5可知，各样品抗疲劳作用均好于空白对照，其中，SHM1抗疲劳作用最强，超过CA和R；FHM1与SHM1结果相似，均超过CA和R；CHM组均不理想。

表6.溶菌酶测定结果

实验分组	血清溶菌酶含量(ug/ml)
		CHM1	10.53
CHM2	10.22
		CHM3	11.52
FHM1	15.78
		FHM2	13.93
FHM3	12.59
		SHM1	11.63
SHM2	12.37
		SHM3	13.04
CA	14.44
		R	13.54
C组	10.37

由表6可知，FHM1组小鼠溶菌酶含量最高，提高免疫力的作用也最强，超过CA和R；SHM1次之，CHM组均不理想。

通过以上实验，结合发酵效率、抗疲劳作用和提高机体免疫力，姬松茸发酵产物效果最好，且发酵时间最短，经发酵新产生的齐墩果酸平均含量和异黄芪甲苷平均含量都较多，是理想的发酵菌种；桑黄发酵产物效果与姬松茸发酵产物相当，但发酵时间太长，不宜发酵；灵芝发酵产物效果不理想，不适合作为女贞子和黄芪组合物的发酵菌种。

因此，女真子和黄芪经姬松茸发酵后，其产物抗疲劳作用和提高免疫力的作用明显优于未发酵的组合物，效果与价格昂贵的人参皂苷类补品相当，甚至更好。

实施例9.姬松茸发酵产物抗疲劳作用综合评价

9.1实验材料

贞芪扶正胶囊(CA)、人参总皂苷(R)、姬松茸发酵物(FHM)

9.2实验动物

60只健康雄性昆明小鼠由东南大学医学院实验动物中心提供，体重20±0.7g，自由饮水、饮食，动物实验前观察适应5d，复查合格后开始进入正式实验。

9.3实验方法

(一)分组

小鼠随机均分为6组，即低剂量组FHM1、中剂量组FHM2、高剂量组FHM3、CA、R、生理盐水对照组(C)，每组10只小鼠，在整个实验期内，灌服方式与上述实施例3中相同。

表7.实验分组

实验分组	灌胃剂量
		低剂量组(FHM1)	0.5ml悬浮液，含12.5mg FHM
中剂量组(FHM2)	0.5ml悬浮液，含25mg FHM
		高剂量组(FHM3)	0.5ml悬浮液，含50mg FHM
贞芪扶正胶囊组(CA)	0.5ml稀释液，含2mg生药提取物
		人参皂苷组(R)	0.5ml稀释液，含1mg人参皂苷
生理盐水对照组(C)	0.5ml生理盐水

(二)测定指标和方法：

称量体重：

实验开始及结束时分别用电子天平称量小鼠体重。

力竭游泳实验：

与实施例8中小鼠力竭游泳实验方法相同。

运动后小鼠肝糖原、肌糖原测定：

灌胃给药15天后，在末次给药后30分钟，无负重游泳90分钟，捞出小鼠擦干，安静60分钟后处死小鼠，迅速取小鼠肝脏及股四头肌，按照南京建成生物工程研究所糖原检测试剂盒方法测定小鼠体内肝糖原、肌糖原的含量。

小鼠全血乳酸测定：

灌胃给药15天后，末次给药后30分钟及负重游泳(体重的2％)30分钟后，分别眼眶采血，按照南京建成生物工程研究所全血乳酸检测试剂盒的方法检测小鼠体内全血乳酸的含量。

丙二醛(MDA)含量测定：

按照南京建成生物工程研究所测试试剂盒方法测定。

脂肪酶测定：

按照南京建成生物工程研究所脂肪酶测试盒的方法测定。

统计方法：

采用SPSS1.00统计软件进行处理，所有数据均以X士S表示，组间差异用方差分析；P＜.005，差异显著；P＜0.001，差异非常显著。

9.4实验结果

表8.各实验组小鼠灌胃剂量

组别	开始体重	结束体重
			FHM1	23.05±2.04	27.83±3.89
FHM2	23.56±2.44	27.95±2.54
			FHM3	23.53±1.97	29.03±3.09
CA	24.62±1.37	27.74±3.59
			R	23.52±1.97	27.73±3.09
C	24.33±1.43	28.20±2.97

由表8看出，各实验组小鼠体重没有明显变化。

表9.小鼠力竭游泳时间

组别	力竭游泳时间(s)
		FHM1	2740±423**#
FHM2	2122±313**
		FHM3	2020±322**
CA	1967±356*
		R	2247±371**
C	1162±256

^**代表各组与C组相比P＜0.01，^*代表P＜0.05；#代表FHM1组与R组相比，P＜0.01

由表9看出，FHM1抗疲劳效果最好，明显优于CA和R组。

表10.运动后小鼠肝、肌糖原含量

组别

肝糖原

肌糖原

FHM1	10.42±0.18	3.04±0.32**#
			FHM2	11.46±0.32**	2.87±0.35**
FHM3	13.76±0.79**	2.61±0.24*
			CA	11.03±0.29*	2.56±0.12
R	11.17±0.23**	2.68±0.39**
			C	8.68±0.34	1.09±0.19

^**代表各组与C组相比P＜0.01，^*代表P＜0.05；#代表FHM1组与R组相比，P＜0.01

从表10可以看出，小鼠运动后肝糖原储备在FHM中、高剂量组和R组相当，都比C组明显增高(^**P＜0.01)，肌糖原储备在FHM低剂量组最高，且高于R组(#P＜0.05)。

表11.小鼠运动前后全血乳酸含量

组别	运动前全乳酸含量(mmol/L)	运动后2分钟全乳酸含量(mmol/L)	运动后50分钟全乳酸含量(mmol/L)
				FHM1	1.72±0.05	2.78±0.12	1.77±0.09
FHM2	1.74±0.08	2.78±0.08	1.84±0.06
				FHM3	1.72±0.05	3.38±0.08	1.84±0.05
CA	1.63±0.09	2.66±0.08	1.84±0.08
				R	1.68±0.05	2.64±0.07	1.82±0.07
C	1.69±0.06	2.04±0.09	1.92±0.06

表12.小鼠血乳酸生成速率

组别	血乳酸生成速率
		FHM1	0.048
FHM2	0.047
		FHM3	0.075
CA	0.047
		R	0.048
C	0.016

表13.小鼠血乳酸清除速率

组别	血乳酸清除速率
		FHM1	0.021
FHM2	0.020
		FHM3	0.032
CA	0.017
		R	0.019
C	0.002

从表11-表13中可见，与对照组比较，所有实验组小鼠乳酸生成率都得到提高，同时乳酸清除率也得到提高，能量代谢效率加速，FHM各组的效果更加明显。

由本实验可知，女真子和黄芪经姬松茸发酵后，其产物抗疲劳作用明显优于未发酵的中药组合物，效果与价格昂贵的人参皂苷类补品相当，甚至更好。

Claims (4)

1.一种抗疲劳提高免疫力的中药组合物的制备方法，其特征在于采用中药材女贞子和黄芪通过真菌固体发酵的方法获得，所述的真菌选自姬松茸；而所述的固体发酵的方法包括以下步骤：

a.按照重量比1∶1取中药材女贞子和黄芪作为固体培养基；

b.在培养基上接种真菌进行发酵；

c.收集发酵产物，经50-70℃烘干、粉碎，制成超细粉，

所述的步骤b的发酵条件为：温度为20-33℃、含水量为45-60％，发酵时间为20-45天。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤b的发酵条件为温度为30℃、含水量为55％，发酵时间为40天。

3.根据权利要求1所述的抗疲劳提高免疫力的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

a.按照重量比1∶1取中药材女贞子和黄芪作为固体培养基；

b.在培养基上接种姬松茸，在温度为30℃、含水量为55％的条件下发酵40天；

c.收集步骤b中的发酵产物，经70℃烘干、粉碎，制成超细粉。

4.权利要求1所述的抗疲劳提高免疫力的中药组合物在制备抗疲劳、提高免疫力的药物中的用途。

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