CN101627309A - 核糖核酸酶家族的蛋白质的美容用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核糖核酸酶家族的至少一种抗微生物蛋白质,核糖核酸酶7,或衍生自该蛋白质的多肽在美容和治疗学中的用途,尤其是作为用于评价表皮状况的标记物。此外,本发明还涉及至少一种根据本发明的多肽,至少一种编码根据本发明的多肽的核酸序列,或至少一种调节所述多肽的表达或活性(尤其是生物学活性)或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,在制备用于预防和/或治疗皮肤病症的组合物中的用途。
Description
本发明涉及核糖核酸酶家族的至少一种抗微生物蛋白质,核糖核酸酶7,或衍生自该蛋白质的多肽在美容和治疗学中的用途,尤其是作为用于评价表皮状况的标记物。此外,本发明还涉及至少一种根据本发明的多肽,至少一种编码根据本发明的多肽的核酸序列,或至少一种调节所述多肽的表达或活性(尤其是生物学活性)或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,在制备用于预防和/或治疗皮肤病症的组合物中的用途。
在众多的生理学功能中,表皮具有这样的功能,即构成了用于针对微生物侵入生物体的同时为生物的、物理的和化学的屏障。
表皮的物理屏障特性尤其与其结构组构(organisationstructurelle)有关。
因此,常规地将表皮分为下列部分:构成表皮生发层的角质形成细胞基底层;由数层多角细胞构成的棘层;和最后,称为角化层(或角质层)的全体上层,所述角化层由在其分化的终末阶段被称为角质细胞(cornéocyte)的角质形成细胞构成。
表皮的化学屏障特性尤其依赖于众多抗微生物蛋白质在表皮表面上的释放,所述抗微生物蛋白质例如为导管素(cathélicidines)、抑制丝氨酸蛋白酶的抗白细胞蛋白酶、dermcidine或β-防卫素家族的蛋白质。
皮肤或头皮的许多病症或病理学状态可以起因于表皮细胞的结构组构的功能障碍,或者表皮化学屏障功能的缺损,例如皮肤干燥、银屑病、特应性皮炎、鱼鳞病、角化过度、由于微生物感染而引起的炎症反应、或头皮屑状况。
迄今为止,人们只掌握了几种这样的生物学标记物,所述生物学标记物使得能够有效且精确地确定表皮状况,尤其是使得能够将皮肤或头皮的病症与皮肤或头皮的生理学功能的功能障碍相联系。
因此,存在这样的需要,即拥有使得能够精确地表征表皮状况的生物学标记物。
还存在这样的需要,即拥有可以可靠地在皮肤或头皮病症的诊断方法中使用的生物学标记物。
还存在这样的需要,即在表皮中鉴定出新型美容或治疗靶标。
还存在这样的需要,即拥有用于筛选能够在表皮上或者一般地在角蛋白材料上发挥美容或治疗作用的分子的新型工具。在本发明的范围内,“表皮”意指皮肤以及头皮。
还存在这样的需要,即拥有可用于治疗由于上述功能障碍所导致的皮肤或头皮病症的新型美容或治疗组合物。
本发明的目标在于满足所有这些需要。
因此,根据一个方面,本发明涉及至少一种多肽或至少一种编码所述多肽的核酸序列作为用于评价表皮状况的工具的用途,所述多肽的氨基酸序列由完全或部分地由SEQ ID NO 1所示序列、其类似物或其片段所呈现的核酸序列编码。
特别地,所述评价可以在体内,和更特别地在体外或离体地进行。
根据另一个方面,本发明涉及至少一种根据本发明的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,在制备用于预防和/或治疗皮肤病症的组合物(尤其是美容或治疗组合物)的用途。
特别地,根据本发明的多肽、核酸序列或调节试剂可以用作用于改善皮肤的美学外观的活性试剂。
在本发明的范围内,表述“调节试剂”或“能够或有能力调节生物学活性和/或表达和/或与细胞外基质组成成分的相互作用的化学或生物学化合物”,是指能够或有能力对于至少一种根据本发明的多肽、编码该多肽的核酸序列,对于细胞内或细胞外信号传导途径或代谢途径(涉及所述多肽)的要素,对于细胞外基质的组成成分,或者对于在调控编码所述多肽的核酸序列的转录和/或翻译中所牵涉的要素直接或间接地起作用的任何化合物。
下面更具体地描述此类调节试剂。
根据另一个方面,本发明涉及至少一种根据本发明的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种如上所定义的调节试剂,在制备用于预防和/或治疗头皮病症(例如头皮屑状况)的组合物(尤其是美容或治疗组合物)中的用途。
根据另一个方面,本发明涉及至少一种根据本发明的多肽、或至少一种编码所述多肽的核酸序列,作为用于筛选生物学或化学化合物或者物理处理的工具的用途,所述生物学或化学化合物或者物理处理能够调节所述多肽的生物学活性和/或表达,和/或调节其与细胞外基质组成成分的相互作用,和/或调节其与其他蛋白质的相互作用。
根据另一个方面,本发明涉及用于评价表皮状况的方法,其至少包括下列步骤:
a)测定在表皮样品中根据本发明的多肽或编码所述多肽的核酸的含量,和
b)将在步骤a)中测得的所述含量与参照值进行比较。
所述方法可以在体外或离体地进行。
根据另外一个方面,本发明涉及至少一种根据本发明的多肽、或至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种如上所定义的或所述多肽与细胞外基质组成成分的相互作用的调节试剂,用于制备分离的重构皮肤(peau reconstruite)的用途。
特别地,本发明涉及用于制备分离的重构皮肤的方法,其至少包括下列步骤:使至少一种根据本发明的多肽、编码所述多肽的核酸序列、或至少一种如上所定义的或所述多肽与细胞外基质组成成分的相互作用的调节试剂与能够产生分离的重构皮肤的细胞,尤其是角质形成细胞相接触。
根据另外一个方面,本发明涉及非治疗方法,其用于证明能够使皮肤病症消退的治疗的效果,或者用于评价用于改善个体中干燥和/或年老的皮肤的状况的美容方法的效果。所述评价方法尤其包括下列步骤:
a)在所述治疗和/或应用所述美容方法之前,在取自所述个体的第一表皮样品中进行至少一次根据本发明的多肽的生物学活性和/或表达的第一测定,
b)在所述治疗和/或应用所述美容方法之后,在取自所述个体的第二表皮样品中进行至少一次在步骤a)中所测定的多肽的所述生物学活性和/或所述表达的第二测定,和
c)将所述第一和第二测定进行比较,尤其以便推断出至少关于所述治疗和/或应用所述美容方法的效果的信息。
特别地,其效果待评价的治疗可以是与角质形成细胞的增殖和/或分化的功能障碍相关的皮肤或头皮病症的治疗。
更特别地,本发明的用途和/或方法可以在体外和/或离体地进行。
根据另一个方面,本发明涉及美容处理的方法,其至少包括下列步骤:将至少一种根据本发明的美容组合物应用在皮肤、头皮、粘膜和/或角蛋白纤维的至少一部分上。
根据另一个方面,本发明涉及至少一种根据本发明的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或如上所定义的调节试剂,在用于治疗和/或预防和/或减少与干燥的皮肤相关的皮肤征候的组合物中的美容用途。
在本发明的范围内,术语“美容的”应当根据Directive76/768/EEC所给出的定义来理解,和特别是意指这样的组合物或处理,所述组合物或处理用于应用在角蛋白材料例如皮肤、粘膜、毛和头发上,以便清洁它们、使它们芳香、修饰它们的外观(尤其是美学外观)、和/或保护它们或维持它们处于良好的状态。
因此,更具体地,本发明建立于下列基础之上:本发明者将核糖核酸酶7鉴定为在表皮的角质层水平上以及在毛囊水平上的美容或药学的试剂和/或靶标。
特别地,这一鉴定是由于出人意料的观察结果而导致的,根据所述观察结果,RNA酶7在正常和年轻的表皮的角质层中和在干的表皮(特别是衰老的表皮)的角质层中差异表达。
因此,如从下文给出的实施例中所得出的,本发明者测定了RNA酶7这种蛋白质在年轻个体和年老个体(尤其是未绝经的年轻女性和已绝经的年老女性)的表皮中的含量,所述RNA酶7的氨基酸序列由序列SEQ ID NO 5所示。令人吃惊地,他们观察到,该蛋白质的含量在年轻女性的表皮中比在年老女性的表皮中更高,并且同样地,在正常水化的表皮中比在干的表皮中更高。
已知,常常随着年龄增长而观察到皮肤干燥性的增加,然而这样的皮肤干燥状况也可以出现在年轻受试者中。这是因为,皮肤干燥状况是一种生理学状态,其可以存在于年轻受试者中,而没有任何病理学的(至少是明显的病理学的)原因。这种干燥的起因可以是体质上的或获得性的。因此,许多外部因素可以导致皮肤变干或加重已经干燥的皮肤的状况。在这些因素中,可以提及恶劣的气候条件、太阳辐射、暴露于某些化学或治疗试剂(例如维甲类)。这种干燥通常表现为拉扯和/或绷紧的感觉。其触摸起来是粗糙的并且看起来似乎覆盖着鳞片。
因此,出人意料地,本发明者证实,核糖核酸酶7构成了用于对这些皮肤病症有效地起作用的靶标。
核糖核酸酶7(RNA酶7)是属于核糖核酸酶家族(尤其是超家族A)的核酸内切酶,目前包括有十三个成员(Cho等人,Genomics,2005,85:208-220)。
核糖核酸酶是能够切割核苷酸键的水解酶。
特别地,RNA酶7具有抗微生物活性。
核糖核酸酶7已由HARDER和SCHROEDER在表皮的角质层中和从角质形成细胞的原代培养物中进行了鉴定和定位(J.Biol.Chem.,2002,277:46779-46784)。后者也显示,该蛋白质具有抗微生物特性。
以具有156个氨基酸的前蛋白(proprotéine)的形式(SEQ ID NO4)合成RNA酶7,其包含胰核糖核酸酶类型的催化位点和在N-末端的具有28个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO 6)。该信号肽的去除导致产生具有128个氨基酸的活性酶(蛋白质SEQ ID NO 5)。
在本发明的范围内,除非另外说明,RNA酶7一般意指前蛋白的形式(SEQ ID NO 4)和蛋白质的形式(SEQ ID NO 5)。
根据本发明的多肽
根据一个实施方案,适合于本发明的多肽可以具有由完全或部分地由选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的序列,或其类似物,或其片段所呈现的核酸序列编码的氨基酸序列。
根据另一个实施方案,适合于本发明的多肽可以具有完全或部分地由选自SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7的序列,或其类似物,或其片段所呈现的氨基酸序列。
“多肽的类似物”意指具有序列同源性(特别是相关于所述多肽的特征序列)以及相同性质的生物学活性(例如由肽模拟序列所携带的)的任何多肽。
同源性可以为至少85%,例如至少90%,和例如至少95%。同源性可以通过目视比较或者任何本领域中通常使用的信息学手段来确定。
序列的同源性可以由于在根据本发明的肽序列中源自突变或变异的改变而产生,所述突变或变异源自在根据本发明的多肽的特征序列中一个或多个氨基酸的缺失,或一个或多个氨基酸的插入,或一个或多个氨基酸的置换。
“多肽的特征序列”,尤其是就RNA酶7而言,意指前蛋白(SEQID NO 4)、活性蛋白质(SEQ ID NO 5)、信号肽(SEQ ID NO 6)、活性位点(其包含第43和151位处的氨基酸,和在需要时包含在这些氨基酸周围的氨基酸,例如在所述活性位点两侧的1个、甚至2个、甚至3个、甚至4个、甚至5个、甚至6个、甚至7个、甚至8个氨基酸)、底物结合位点(其由氨基酸66至70的序列和第91位的氨基酸所示,和在需要时包含该结合位点两侧的氨基酸,例如在这些位点两侧的1个、甚至2个、甚至4个、甚至8个氨基酸)、以及序列SEQID NO 7(其代表了衍生自RNA酶7的表位)。
通常,多肽类似物可以包含相对于天然多肽的氨基酸序列而言保守的置换。
可以将几种这些修饰相组合。
作为在本发明中可以考虑的突变的例子,可以提及用具有相似亲水指数的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基而不因此明显地影响该多肽的生物学特性,尤其是其生物学活性,例如其核糖核酸酶活性。
亲水指数是根据其疏水性和其电荷的赋予氨基酸的指数(Kyte和Doolittle(1982),J.Mol.Biol.,157:105)。
本发明所涉及的多肽或类似物可以是经历一种或多种翻译后修饰的多肽。
“翻译后修饰”意在包括肽或蛋白质在细胞中合成之后可能经历的所有修饰,例如一次或多次磷酸化、一次或多次糖基化、一次或多次脂质化(例如法呢基化或棕榈酰化)、二硫键形成和/或肽序列内部切割类型的结构重排。
此外,所述类似物可以具有与天然多肽基本上相同的生物学活性。
根据一个实施方案,适合于实施本发明的多肽还可以是:天然或合成的多肽,在需要时所述多肽能够在RNA酶7的蛋白水解后获得,或通过化学或生物合成而获得,或通过从生物组织例如皮肤中提取而获得,所述生物组织天然地或在转导后表达该多肽以及该多肽的各种翻译后形式;或者其序列全部或部分地(完全或部分地)包含前述氨基酸序列的任何天然或合成的多肽,例如变体和类似物。
根据另一个实施方案,适合于实施本发明的多肽还可以是如前面所定义的多肽,其与另一个多肽,亲水或疏水性靶向试剂,生物转化的前体,发光、放射性或比色标记试剂相融合。
以非限制性的方式,作为能够与根据本发明的多肽相偶联的化合物的例子,可提及荧光蛋白例如绿色荧光蛋白,荧光化学化合物例如罗丹明、荧光素或德克萨斯红,磷光化合物,放射性元素例如3H、35S、121I或125I,或者比色标记试剂例如对于半乳糖苷酶、过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或碱性磷酸酶的作用敏感的生色底物。
依照能够与根据本发明的多肽相偶联的化合物的性质,偶联可以通过化学方法,尤其是借助于反应性化学官能团,或者通过本领域技术人员已知的分子生物学方法来进行。
根据本发明的核酸
在本发明的范围内,“核酸序列的片段”意指编码根据本发明的多肽、其类似物或其片段的全部或部分的核酸序列,特别是选自SEQ IDNO:1(其编码前蛋白形式)、SEQ ID NO:2(其编码活性蛋白形式)、SEQ ID NO 3(其编码信号肽)的核酸序列,其类似物,或其片段。
“核酸序列的类似物”意指任何这样的核酸序列,其任选地由于核酸密码的简并性而产生,并且编码与由所述核酸所编码的多肽序列相同或类似的多肽序列。
根据本发明的核酸序列可以是有义、反义或干扰序列,其相应于编码根据本发明的多肽的序列。
因此,本发明还涉及编码根据本发明的多肽的核酸(尤其是脱氧核糖核酸或核糖核酸)序列的用途。
在这种情况下,本发明还涉及编码所要求保护的多肽的经分离和纯化的核酸片段的用途。
根据本发明的核酸序列可以尤其用于制备相应的有义或反义核糖核酸序列。
本发明的目标还在于任何多核苷酸,有义或反义的核糖核酸或脱氧核糖核酸序列(尤其是“小干扰RNA”)的用途,所述序列至少相应于编码性核酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO 3或其类似物。
适合于本发明的核酸序列可以尤其是例如前面所定义的。
根据一个实施方案,核酸序列可以具有有义、反义或干扰核酸序列,其相应于所述编码根据本发明的多肽的核酸序列。
核酸序列可以源自任何可能的来源,即动物来源(特别是哺乳动物,和更特别是人)、植物来源、微生物来源(尤其是病毒、噬菌体、细菌)或者真菌来源,但并不预先判断它们是否天然地存在或不存在于所述源生物体中。
根据本发明的用于评价表皮状况的方法
根据一个实施方案,本发明涉及用于评价表皮状况的方法,其至少包括下列步骤:
a)测定在表皮样品中根据本发明的多肽或编码所述多肽的核酸的含量,和
b)将在步骤a)中测得的所述含量与参照值进行比较。
根据本发明的方法可以在体外或离体地进行。
根据一个实施方案,根据本发明的方法可以在取自个体的表皮样品上进行。
根据本发明的方法还可以在表皮样品上进行,所述样品获取自重构的分离的皮肤,以便对其状况进行定性。
表皮状况的测定可以为可能的皮肤或头皮病症的指示。特别地,表皮状况可以为可能的皮肤病症的指示,所述皮肤病症尤其选自表皮的过度干燥、干燥病、鱼鳞病、特异反应性(atopie)、特应性皮炎、银屑病、角化过度、湿疹、酒渣鼻、苔癣(lichen)、瘙痒症、痤疮、脂溢性皮炎、掌跖角化病和痒疹。
根据本发明的方法还可以在头皮上进行。
-获取样品的方式
表皮样品的获取可以用本领域技术人员已知的任何方法来进行。
这些方法可以通过所谓的剥离(stripping)技术来进行。
这些剥离为施加至表皮表面的粘性表面,例如3M的blenderm、D′squam(CuDERM的商业粘合剂)、氰基丙烯酸酯胶水或涂料剥离(stripping vernis)方法。借助于这些剥离,可以获取粘着的角质细胞和其细胞间间隙的内含物,并随后进行提取,该提取使得能够获得蛋白质内含物。
适合于该方法的样品获取也可以更直接地通过借助于例如与射流线路相联合的叶片涡轮型附属装置、螺旋小室型附属装置(如在专利FR 2 667 778中所描述的)对皮肤表面进行“清洗”,或者简单地通过向皮肤表面添加/吸取缓冲液液滴来进行。
作为适合于施行本发明的其他取样方法的举例说明,可以提及用双金属片系统来刮取角质层的上面部分的方法。该技术使得能够收集鳞屑,其随后可通过不同的技术直接进行分析以确定矿物质、氨基酸或脂质的比率。所获取的样品可以保存在冷冻箱中,然后通过本领域技术人员已知的技术(例如LC/ESI/MS分析)来进行分析。
-参照值
参照值可以是例如在取自表现出正常水化的皮肤(特别是年轻的皮肤)的表皮样品上测得的多肽或核酸序列的含量。在本发明的范围内,观察到,RNA酶7型多肽的比率可以在年龄大于45岁的受试者的皮肤中(特别是在女性中)生理性地减少。
因此,年轻的皮肤是指年龄小于大约45岁的受试者的皮肤,其与成熟的皮肤相对。
RNA酶7的值可以表示为任意单位,或者可以通过借助于重组的或从表皮中纯化出的蛋白质建立校准曲线来进行计算。在所有情况中,所测量的RNA酶7的比率可以表示为相对于在提取物中存在的蛋白质的总量。蛋白质的总量可以通过例如Bradford方法来测量。
参照值的测量可以与测定多肽或核酸序列的所述含量平行地或顺次地进行。
所测得的含量与参照值的比较可以使得能够评价相对于该值的偏差。
分析该偏差的程度和/或性质(负的或正的)可以提供关于表皮状况的信息。
因此,例如,5至10次测得的、低于从正常皮肤获得的参照值的多肽含量可以是皮肤病症的指示。常规地,将正常皮肤视为健康皮肤,其既不干燥,也不油腻。
更具体地,能够通过采用根据本发明的评价方法来鉴定的皮肤或头皮病症可以是由于RNA酶7这种蛋白质的缺乏或过表达而导致的那些,例如在下文中所指明的那些。
-测定多肽的方式
有利地,适合于施行根据本发明的方法的多肽可以是RNA酶7这种蛋白质。
表皮样品中根据本发明的多肽或根据本发明的核酸的含量的测定可以通过本领域技术人员已知的任何实验方案来进行。
作为多肽的检测方法,可以提及Western印迹,狭线印迹,斑点印迹,单重或多重类型的ELISA(酶联免疫吸附测定法)方法,蛋白质组学方法,用基于银的染色剂、考马斯蓝或SYPRO在聚丙烯酰胺凝胶中对多肽进行染色,免疫荧光,UV吸收,使用常规显微术、电子显微术或共聚焦显微术的免疫组织化学方法,FRET(荧光共振能量转移),TR-FRET(时间分辨FRET)方法,FLIM(荧光寿命成像显微术)方法,FSPIM(荧光光谱成像显微术)方法,FRAP(荧光漂白恢复)方法,通过报告基因的方法,AFM(原子力显微术)方法,表面等离子共振方法,微量量热法,流式细胞术方法,生物传感器方法,放射免疫测定法(RIA),使用肽芯片、糖芯片、抗体芯片的方法,质谱法,SELDI-TOF型光谱方法(Ciphergen)。
更一般地,特别可以使用更加定量和灵敏的、从蛋白质溶液开始的免疫酶含量测定法。这些ELISA类型的方法联合了特异于靶抗原的捕获和检测抗体对。可以使用商业的抗体,或者特别形成的多克隆、单克隆或重组抗体。还可以采用大容量的多重ELISA技术。因此,可以提及在Luminex珠粒上的抗体(例如Bio-Rad的Bioplex)类型的多重方法、在平面上的抗体(“抗体阵列”)类型的多重方法(例如由Meso scale Discovery公司所建议的方法)。
特别地,有利的是,用抗体(在需要时以经标记的形式)来检测根据本发明的多肽的存在。这样的抗体可以用可直接检测的或通过与其他试剂的反应可检测的物质来标记。
“抗体”,通常意指单克隆或多克隆抗体,以及免疫球蛋白的片段,其能够与抗原结合并且可以通过本领域技术人员已知的任何基因工程技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。
因此,根据一个方面,本发明还涉及与根据本发明的多肽特异性地结合的抗体作为用于评价表皮状况的工具的用途。
根据一个实施方案,适合于本发明的抗体可以特异性地结合序列SEQ ID NO 4所示的多肽,或者该序列中所存在的表位或其类似物,尤其是序列SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列的表位或其类似物。
能够用作用于评价表皮状况的工具的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何方法来获得,例如在“Antibodies:A LaboratoryManual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1990)中所描述的方法。
因此,根据一个方面,本发明还涉及单价或二价类型的重组抗体的用途,所述抗体可以通过由Antibodies By Design公司所提出的噬菌体展示方法而获得。
-测定核酸的方式
有利地,适合于施行根据本发明的方法的核酸序列可以是编码RNA酶7的核酸序列,例如mRNA类型的核酸序列。
作为核酸序列的检测方法的例子,可提及聚合酶链式反应(PCR)、反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量或实时聚合酶链式反应(Q-PCR)、Northern印迹、RPA(核糖核酸酶保护测定法)、DNA芯片、寡核苷酸芯片、转录物组学芯片、原位杂交法。
作为适合于检测核酸序列,特别是mRNA的试剂的例子,可提及可以与所述序列杂交的经标记的核酸探针。
这样的核酸探针可以通过本领域技术人员已知的任何方法容易地获得。
因此,根据本发明的核酸序列可以用于制备有义和/或反义寡核苷酸引物,所述引物可以与序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3,或其片段,或其类似物杂交。
根据实施方案的其他变化形式,本发明涉及用于评价表皮状况的方法,其至少包括下列步骤:
a)测定在表皮样品中根据本发明的多肽的生物学活性值,和
b)将在步骤a)中测得的所述值与参照值进行比较。
有利地,其值可以被测定的生物学活性可以是核糖核酸酶类型的酶促活性。
在根据本发明的方法中可以采用本领域技术人员已知的任何酶活性测量方法。
例如,可以使用这样的方法,其采用了测量特异于核糖核酸酶的荧光底物的水解,其中使用了从角质层(SC)中纯化出的RNA酶7制备物。所述荧光底物的水解的测量为“终点”类型的或者“动力学”类型的,并且可以相对于样品的总蛋白量来报告所述酶活性。
根据本发明的筛选方法
根据另一个方面,本发明涉及根据本发明的肽或编码所述肽的核酸序列,作为用于筛选生物学或化学化合物或者物理处理的工具的用途,所述生物学或化学化合物或者物理处理能够调节根据本发明的多肽(特别是核糖核酸酶7)的生物学活性和/或表达,和/或调节其与细胞外基质组成成分的相互作用。
在本发明的范围内,表述“能够或有能力调节根据本发明的多肽的生物学活性和/或表达,和/或调节其与细胞外基质组成成分的相互作用的化学或生物学化合物或者物理处理”,是指能够或有能力对于至少一种根据本发明的多肽、或编码该多肽的核酸序列,或者对于细胞内或细胞外信号传导途径或代谢途径(涉及所述多肽)的要素,或者对于细胞外基质的组成成分,或者对于在调控编码所述多肽的核酸序列的转录和/或翻译中所牵涉的要素直接或间接地起作用的任何化合物或物理现象。
作为能够适合于本发明的物理处理的例子,可提及光辐射,例如UV或IR,尤其是使用LED(发光二极管)处理。
-根据本发明的调节试剂
关于调节试剂,根据第一个实施方案,其涉及能够抑制根据本发明的多肽的生物学活性、和/或表达、和/或其与细胞外基质组成成分或与其他蛋白质的相互作用的化学或生物学化合物。
根据该实施方案,抑制剂可以选自蛋白酶,肝素及其衍生物例如硫酸乙酰肝素,和能够以共价或非共价方式与本发明多肽的活性位点结合的肽片段。
多肽或蛋白质的一级氨基酸序列可以决定被一种或多种蛋白酶所特异性地识别的位点,一旦这些位点被识别,所述蛋白酶就能诱导所述多肽或蛋白质的通过蛋白水解的切割。
此类切割可以导致所考虑的多肽或蛋白质的生物学活性的激活或抑制。
适合于实施本发明的所谓抑制性蛋白酶可以具有对于识别和/或结合根据本发明的多肽的氨基酸序列以及在根据本发明的多肽的氨基酸序列内进行切割来说特异的位点。
通过本领域技术人员已知的任何酶学实验方案可以容易地鉴定出此类蛋白酶。
“肝素衍生物,或者硫酸乙酰肝素”,是指由于置换和/或删除一部分糖胺聚糖而产生的化合物,条件是,这些化合物依然能够与根据本发明的多肽相互作用和调节其生物学活性。
例如,为了实施本发明,可以设想使用低分子量的乙酰肝素或高分子量的乙酰肝素,其制备方法是本领域技术人员熟知的。
此外,还涉及所谓的模拟分子,即具有不同的但却与已知调节试剂的化学结构类似的化学结构的分子,例如在硫酸乙酰肝素的情况下,依然具有在与所述多肽相互作用方面所牵涉的功能的多糖。
作为能够以共价或非共价方式与本发明多肽(尤其是RNA酶7)的活性位点结合的化合物或肽片段的例子,可提及完全或部分地由SEQ ID NO 6所呈现的RNA酶7的信号肽序列,或拥有相似功能的其片段。
根据另一个实施方案,适合于本发明的生物学或化学调节试剂可以是根据本发明的多肽的生物学活性和/或表达的激活剂,和/或与细胞外基质组成成分的相互作用的抑制剂,或与其他蛋白质的相互作用的调节剂。
作为适合于实施本发明的激活剂的例子,以非穷尽的方式,可以提及选自蛋白酶、肝素或肝素衍生物的激活剂。
激活剂还可以是有能力或能够与底物或受体分子相互作用的RNA酶7的模拟物。
如前面所指出的,鉴定出适合于采用的所谓激活性蛋白酶在本领域技术人员的常规实践范围之内。
根据第一个变化形式,根据本发明的筛选方法涉及表征能够调节根据本发明的多肽的生物学活性的生物学或化学化合物或者物理处理,并且至少包括下列步骤:
a)在适宜于表现出其生物学活性的条件下,使至少一种根据本发明的多肽与至少一种待测试的化学或生物学化合物相接触,或者用物理方法处理至少一种根据本发明的多肽,和
b)测定所述多肽的生物学活性。
“生物学活性”,就RNA酶7而言,尤其意指前蛋白(SEQ ID NO4)、信号肽(SEQ ID NO 6)的生物学活性,表现为核酸内切酶活性的RNA酶7这种蛋白质(SEQ ID NO 5)的生物学活性,以及由序列SEQ ID NO 7所鉴定的表位的免疫原性特性。
在根据本发明的此类筛选方法中,所述多肽的生物学活性,特别是核糖核酸酶活性,可以例如通过本领域技术人员已知的任何方法来测定。
根据一个实施方案,可以将所述多肽的生物学活性与参照值进行比较。
可以通过在不存在任何待测试的生物学或化学化合物的情况下施行根据本发明的方法来获得参照值。
根据另一个实施方案,化学或生物学化合物调节根据本发明的多肽的生物学活性的特性还可以通过测定所述化合物调节所述多肽与底物的结合的能力来测定。
根据另一个实施方案,能够调节根据本发明的多肽活性的生物学或化学化合物的筛选可以通过测量与如前所指出的所述多肽的直接相互作用,或者通过测量属于所述多肽可能牵涉其中的信号传导途径或代谢途径的靶分子的生物学活性或表达(例如报告基因系统)来进行。
根据第二个变化形式,根据本发明的筛选方法旨在表征能够调节根据本发明的多肽与细胞外基质组成成分的相互作用的生物学或化学化合物或者物理处理,并且至少包括下列步骤:
a)在适宜于根据本发明的多肽和细胞外基质组成成分之间的相互作用的条件下,使至少一种细胞外基质组成成分与至少一种待测试的化学或生物学化合物相接触,或者用物理方法处理所述组成成分,和
b)测定游离多肽的存在和/或含量。
可以将该游离多肽的存在和/或含量与在不存在待测试的生物学或化学化合物或者物理处理的情况下,在将细胞外基质组成成分和根据本发明的多肽相接触之后所测得的游离多肽的存在和/或含量进行比较。
游离多肽的存在和/或含量的测定可以通过如前面所描述的方法来进行。
作为能够适合于本发明方法的细胞外基质组成成分的例子,可以提及蛋白聚糖-硫酸乙酰肝素复合物,特别是硫酸乙酰肝素。
适合于本发明的细胞外基质组成成分可以例如通过体内取样来获得,或者从成纤维细胞、角质形成细胞类型的细胞培养物或能够产生细胞外基质组成成分的表皮培养物模型获得。
根据前两个变化形式,根据本发明的筛选方法可以在细胞样品或无细胞样品(例如细胞裂解物,角质层(SC)、汗、头发或血清的丙酮制粉制备物)上进行,所述细胞样品从皮肤活组织检查或从通过corneodiscs(D-Squam)或通过涂料剥离(“胶带剥离(tapestripping)”)而获取的角质细胞的提取物获得,或者从培养中的细胞获得。
例如,可以采用被调整至从SC的丙酮制粉开始的提取方法(Mehul等人,J.Biol Chem.,2000,275(17):12841-7),以便优化SC的细胞内蛋白质的量并同时使角蛋白的提取最小化,角蛋白是SC的主要基质蛋白质,并且如果它们以非常大的量存在于样品中,则可能限制对于其他蛋白质的鉴定。
所使用的鉴定方法为这样的方法:通过2D电泳或1D电泳分开从SC中提取的蛋白质,随后通过胰蛋白酶解(trypsinolyse)来产生肽并通过LC-MSMS来鉴定所述肽;或者从蛋白质提取物开始通过直接的胰蛋白酶解来产生肽,然后通过阳离子交换色谱法或IEF来分开,最后通过LC-MSMS来进行鉴定。
有利地,作为细胞样品,可提及分化的角质形成细胞。
有利地,在根据本发明的方法中所采用的多肽可以是RNA酶7这种蛋白质。
根据第三个变化形式,根据本发明的筛选方法旨在表征能够调节根据本发明的多肽的表达的生物学或化学化合物或者物理处理,并且至少包括下列步骤:
a)在适宜于表达编码根据本发明的多肽的核酸序列的条件下,使至少一种编码根据本发明的多肽的核酸序列与至少一种待测试的化学或生物学化合物相接触,或者用物理方法处理所述序列,和
b)测定所述序列的表达。
核酸序列的表达可以,例如借助于寡核苷酸探针,通过本领域技术人员已知的实验方案来测定。
可以将根据本发明的核酸序列的表达与参照值进行比较,所述参照值例如通过在不存在待测试的化合物的情况下施行根据本发明的方法来获得。
根据本发明的组合物
根据另一个方面,本发明涉及至少一种根据本发明的多肽、或编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,在制备用于预防和/或治疗皮肤或头皮病症的组合物中的用途。
特别地,所述组合物可以是美容的或治疗的。
在本发明的范围内,“预防病症”意指降低所考虑的病症(尤其是如前面所定义的病症)突然出现的风险。
根据本发明的组合物的各种组分的量为在所考虑的领域中常规使用的量。
在根据本发明的组合物中所包含的化学或生物学化合物或者多肽或者核酸序列的量(也称为“有效量”),当然取决于所述化合物的性质和所寻求的效应,并因此可以在大的范围内变动。
在本发明的范围内,“有效量”这一表述意指对于观察到所期望的效果,即美容效果或治疗效果而言所必需的最小量,应当理解对于获得美容效果或治疗效果而言所必需的有效量可以,在需要时,是相同的或不同的。
为了给出大概的数量级,组合物所包含的化学或生物学化合物或者多肽的量可以为所述组合物总重量的0.00001%至50%,特别地0.001%至10%,和更特别地0.1%至1%。
应当理解,根据本发明所考虑的所有组合物采用生理学上可接受的介质。
在本发明的范围内,“生理学上可接受的介质”意指这样的介质,其适合于将组合物应用在角蛋白材料(例如,皮肤,头皮,嘴唇,粘膜,以及角蛋白纤维例如头发、指(趾)甲和毛)上。
在本发明的范围内,“治疗的”意指可以在皮肤或头皮病症的预防性和/或治疗性治疗的范围内,或者在皮肤或头皮病症的诊断方法的范围内使用的组合物。
根据一个特别的实施方案,根据本发明的组合物此外还可以包含至少一种在皮肤方面的活性试剂。
-活性物质
作为在本发明范围内可使用的活性试剂的例子,可提及美容用油,例如硅油、甘油三酯类型的植物油、烃油例如parleam油以及脂肪酸和脂肪醇的酯。
还可以使用使得能够改善皮肤状况的活性物质,例如水化活性物质和润湿活性物质,或使得能够改善天然脂质屏障的活性试剂,例如神经酰胺、硫酸胆固醇和/或脂肪酸以及它们的混合物。
还可以使用对皮肤具有活性的酶,例如蛋白酶、脂肪酶、脑苷酶、酰胺酶和/或mélanases以及它们的混合物。
还可以使用微生物(尤其是益生微生物)类型的活性物质,例如在申请WO 2006/000992和WO 2006/037922中所描述的那些。
在本发明的范围内,“益生微生物”意指活的微生物,当它们以适当的量被消费时,对于其宿主的健康具有有益效应(根据“JointFAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health andNutritional Properties of Probiotic in Food Including PowderMilk with Live Lactic Acid Bacteria,2001年10月6日”);并且,特别地,它们可以改善肠道微生物平衡。
适合于本发明的微生物可以尤其选自:子囊菌,例如糖酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium);双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、微球菌属(Micrococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属(Aerococcus)、酒球菌属(Oenococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)的细菌;以及它们的混合物。
作为非常特别地适合于本发明的子囊菌,特别地可提及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis),以及酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、有孢园酵母属、粟酒裂殖酵母、假丝酵母属和毕赤酵母属。
益生微生物的具体例子为双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)(GG乳杆菌(Lactobacillus GG)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)以及他们的混合物。
更特别地,涉及来自乳酸细菌类群的益生微生物,例如尤其是乳杆菌属和/或双歧杆菌属。作为这些乳酸细菌的举例说明,可更具体地提及约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧双歧杆菌、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)或假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)以及它们的混合物。
乳双歧杆菌的菌株可以在Hansen(Chr.Hansen A/S,10-12BoegeAlle,P.O.Box 407,DK-2970Hoersholm,Denmark)中以Bb 12的名称而获得。
所述微生物可以以活的、半活性的或灭活的、死的形式包含在根据本发明的组合物中。
还可以以细胞组分的级分的形式或者以代谢产物的形式包含它们。还可以以冻干的粉末形式,以培养物上清液的形式,和/或在需要时,以浓缩形式引入所述微生物、代谢产物或级分。
在局部组合物的特定情况下,采用灭活的、甚至死的形式的这些微生物可以是有利的。
关于益生微生物,通常使用下列的细菌和酵母类别:
-乳酸细菌:其通过使糖发酵而产生乳酸。根据其形态,将它们分为两个类群:
·乳杆菌属物种:嗜酸乳杆菌(LC1、NCFB 1748)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、干酪乳杆菌(L.casei)(Shirota)、鼠李糖乳杆菌(GG菌株)、短乳杆菌(L.brevis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)(德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckiisubsp bulgaricus)、德氏乳杆菌乳亚种(L.delbrueckiisubsp lactis))、发酵乳杆菌(L.fermentum)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、鸡乳杆菌(L.gallinarum)、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、类干酪乳杆菌(L.paracasei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌(L.salivarius),
·球菌:肠球菌属(粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium))、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(乳酸乳球菌乳亚种(L.lactis subspp lactis)或乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subspp cremoris))、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subspdextranicum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici(动物食用)、菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivarius subsp.Thermophilus)。
-双歧杆菌或双歧杆菌属物种:青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、双岐双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌,
-酵母:糖酵母属(酿酒糖酵母或者布拉糖酵母(S.boulardii)),
-其他形成孢子的细菌:芽孢杆菌属(蜡状芽孢杆菌toyo变种(B.cereus var toyo)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、大肠杆菌(Escherichia coli)nissle菌株、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)。
乳酸细菌和双歧杆菌是最经常使用的益生菌。
非常特别地适合于本发明的益生微生物的具体例子为双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、消化乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.Casei)、干酪乳杆菌Shirota、类干酪乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、路式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(GG乳杆菌)、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌以及它们的混合物。
更特别地,涉及来自乳酸细菌类群的益生微生物,例如尤其是乳杆菌属和/或双歧杆菌属。作为这些乳酸细菌的举例说明,可更具体地提及约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、干酪乳杆菌,或者双歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌或假小链双歧杆菌,以及它们的混合物。
非常特别合适的种类为约氏乳杆菌、类干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和乳双歧杆菌NCC 2818(也被命名为Bb12 ATCC 27536),它们按照布达佩斯条约分别于30/06/92、12/01/99、15/04/99、15/04/99、07/06/05以下列编号CNCM I-1225、CNCM I-2116、CNCMI-2168和CNCM I-2170和CNCM I-3446保藏于巴斯德研究所(28ruedu Docteur Roux,F-75024Paris cedex 15);以及长双歧杆菌(BB536)。乳双歧杆菌菌株CNCM I-3446可以从Hansen(Chr.HansenA/S,10-12Boege Alle,P.O.Box 407,DK-2970 Hoersholm,Denmark)获得。
适用于实施本发明的活性试剂的其他例子包括:止痛活性物质、抗酵母活性物质、抗细菌活性物质、抗寄生虫活性物质、抗真菌活性物质、抗病毒活性物质、类固醇抗炎活性物质、麻醉活性物质、止痒活性物质、角质层分离活性物质、抗自由基活性物质、抗皮脂溢活性物质、去头屑活性物质、抗痤疮活性物质、旨在防止皮肤衰老和/或改善其状况的活性物质、抗皮炎活性物质、抗刺激物活性物质、免疫调节活性物质、用于治疗干燥的皮肤的活性物质、抗出汗活性物质、抗银屑病活性物质、针对UV的保护性活性物质、抗组胺活性物质、瘢痕形成活性物质、自晒黑活性物质、抗氧化剂例如绿茶或其活性级分、甘油、laponite、咖啡因、芳香精油、着色剂、去色素活性物质、脂调节剂、柔软化活性物质、提神活性物质、祛臭活性物质、脱敏活性物质、漂白活性物质、营养活性物质、减少皮肤的分化和/或增殖和/或色素沉着的活性物质以及它们的混合物。
特别地,在适合于本发明的其他在皮肤方面的活性试剂之中,可提及水化和/或脱屑活性试剂,例如甘油、尿素或其衍生物、HEPES、螯合剂、去污剂、茉莉酮酸的衍生物,以及它们的混合物。
-盖仑氏形式
为了通过口服途径施用,本发明的组合物可以为所有适合的形式,特别是口服溶液、糖浆、片剂、糖衣丸剂、明胶胶囊(gélule)、胶囊(capsule)或者营养食品或营养补充物。
此外,根据本发明的组合物还可以包含至少一种适合于通过口服途径施用的合适的赋形剂。
一般地,可以将本发明的任何组合物应用于皮肤(身体的任何皮肤区域)上或者粘膜(颊的、颧的、牙龈的、生殖器的、结膜的...)上。
正如已经知道的,美容组合物还可以含有美容学领域的常规辅助剂,例如亲水或亲脂的凝胶剂、亲水或亲脂的添加剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、过滤剂、气味吸收剂和着色物质。
根据本发明的多肽或编码所述多肽的核酸序列、根据本发明的调节试剂、或者根据本发明的组合物经证实对于改善皮肤的水化、屏障功能,预防和/或治疗表皮衰老的征候是特别有利的,所述表皮衰老的征候例如为皱纹,细小皱纹,表皮的紧实度(fermeté)、弹性、密度和/或张力的丧失。
因此,所述美容组合物和/或如前面所定义的多肽和/或编码所述多肽的核酸序列可以特别适合于作为用于敏感皮肤和/或干燥、非常干燥或脱水的皮肤(其中包括混合性皮肤的干燥区域)的美容处理的试剂。
根据另一个方面,可以将根据本发明的多肽或编码所述多肽的核酸序列用于制备组合物,所述组合物用于治疗和/或预防诸如下列的病症:角化过度、鱼鳞病、银屑病、特应性皮炎、特异反应性、湿疹、酒渣鼻、苔癣、瘙痒症、痤疮、脂溢性皮炎、掌跖角化病和痒疹。
根据本发明的组合物可以是美容的或治疗的。
在本发明的范围内,美容组合物为主要用于获得美学效果的组合物。
根据本发明的组合物也可以用于烧伤或其后遗症的补充治疗,或者用于治疗和/或预防皮肤轻度发炎。
根据本发明的多肽或编码所述多肽的核酸序列、或者根据本发明的组合物还可以用于治疗头发或毛的中等程度的脱落和/或刺激头发或毛的生长的目的。
更特别地,本发明所涉及的皮肤病症可以为干燥的皮肤、非常干燥的皮肤,并且是在其皮肤呈现出年老外观的个体中,尤其是在超过45岁和/或停经的女性,甚至非常年老的女性中。此外,根据本发明的多肽、核酸序列、调节试剂和组合物还可以适合于治疗干燥病和受到UV损害的皮肤。
在本发明的范围内,除非另外说明,“un”应当理解为“至少一(种、个)”的意思。
下面给出的实施例是为了举例说明而非限制本发明的目的而呈现的。
附图
图1:图示了直方图,所述直方图显示了RNA酶7在4种不同类型的表皮(左边的灰色柱:干燥的年老皮肤;黑色柱:正常的年老皮肤;白色柱:干燥的年轻皮肤;右边的灰色柱:正常的年轻皮肤)中的平均表达。
以相对单位表示的表达代表了在WESTERN印迹上被鉴定为相应于RNA酶7的条带的强度,相对于内部对照而言。
实施例
实施例I-评价核糖核酸酶7在表皮中表达
招募具有正常皮肤或干燥皮肤、处于良好健康状态的女性自愿者参与该研究,并根据年龄将它们分为两组:所谓的绝经后年龄(55-60岁)和所谓的绝经前年龄(35-40岁)。
由此获得了四组:具有正常皮肤的处于所谓绝经后年龄的女性(n=13),具有干燥皮肤的处于所谓绝经后年龄的女性(n=15),具有正常皮肤的处于所谓绝经前年龄的女性(n=14),和具有干燥皮肤的处于所谓绝经前年龄的女性(n=16)。
借助于所谓的“涂料剥离”技术在每个个体上获取角质层样品,其中使用了经修改的LUNDSTROM和EGELRUD的实验方案(Acta DermVenereol,1991,71:471)。
用在冰上冷却的丙酮洗涤这些“涂料剥离物”,并在过滤和离心之后收集角质细胞。
在PBS-0.1%TX-100缓冲液中提取可溶性蛋白质。
在通过WESTERN印迹法进行分析之前,将每个样品调整至0.15mg/ml的浓度。
将10μg蛋白质在4-20%SDS-NuPage凝胶(InVitrogen)上进行分开。
然后,按照制造商的说明书,使用X-cell Blot系统(InVitrogen),将分开的蛋白质转移到PDVF膜(Millipore)上。
然后,在环境温度下,用在TBS-0.05%Tween(TBS-T)中的1%脱脂乳使所述膜饱和1小时。
然后,在4℃下,将所述膜与以1∶1000稀释的抗-RNA酶7多克隆抗体一起孵育过夜。
所述抗-RNA酶7多克隆抗体通过用RNA酶7这种蛋白质的N-末端肽序列SEQ ID NO 7对兔进行免疫接种来获得。
使用与用于对兔进行免疫接种的肽相同的肽来纯化所获得的抗体。
然后,用TBS-T缓冲液洗涤所述膜,随后将所述膜在环境温度下在以1∶4000稀释的、偶联至过氧化物酶的抗兔二抗存在下孵育1小时。
然后,如前面所描述的,洗涤所述膜。
按照制造商的说明书,用ECLplus(GE Healthcare)来检测化学发光。
用Multi-imager Fluor-S max(BIORAD)在一分钟的时段内获得图像。
通过使用Quantity One(BIORAD)来定量每个条带的强度。
将数据相对于在同一膜上的经酰胺黑标记的蛋白质内部对照进行标准化,并且以目的蛋白质条带的强度与内部对照条带的强度之比的形式进行计算。
图1中所显示的结果表明,在干燥的皮肤的角质层中并且也在处于所谓绝经后年龄的女性的皮肤的角质层中,RNA酶7这种蛋白质的表达强烈地减少。
序列表
SEQ ID NO 1
1atggcaccgg ccagagcagg attctgcccc cttctgctgc ttctgctgct ggggctgtgg
61gtggcagaga tcccagtcag tgccaagccc aagggcatga cctcatcaca gtggtttaaa
121attcagcaca tgcagcccag ccctcaagca tgcaactcag ccatgaaaaa cattaacaag
181cacacaaaac ggtgcaaaga cctcaacacc ttcctgcacg agcctttctc cagtgtggcc
241gccacctgcc agacccccaa aatagcctgc aagaatggcg ataaaaactg ccaccagagc
301cacgggcccg tgtccctgac catgtgtaag ctcacctcag ggaagtatcc gaactgcagg
361tacaaagaga agcgacagaa caagtcttac gtagtggcct gtaagcctcc ccagaaaaag
421gactctcagc aattccacct ggttcctgta cacttggaca gagtccttta g
SEQ ID NO 2
1aagcccaagg gcatgacctc atcacagtgg tttaaaattc agcacatgca gcccagccct
61caagcatgca actcagccat gaaaaacatt aacaagcaca caaaacggtg caaagacctc
121aacaccttcc tgcacgagcc tttctccagt gtggccgcca cctgccagac ccccaaaata
181gcctgcaaga atggcgataa aaactgccac cagagccacg ggcccgtgtc cctgaccatg
241tgtaagctca cctcagggaa gtatccgaac tgcaggtaca aagagaagcg acagaacaag
301tcttacgtag tggcctgtaa gcctccccag aaaaaggact ctcagcaatt ccacctggtt
361cctgtacact tggacagagt cctttag
SEQ ID NO 3
1atggcaccgg ccagagcagg attctgcccc cttctgctgc ttctgctgctggggctgtgg
61gtggcagaga tcccagtcag tgcc
SEQ ID NO 4
1MAPARAGFCP LLLLLLLGLW VAEIPVSAKP KGMTSSQWFK IQHMQPSPQA CNSAMKNINK
61HTKRCKDLNT FLHEPFSSVA ATCQTPKIAC KNGDKNCHQS HGPVSLTMCK LTSGKYPNCR
121YKEKRQNKSY VVACKPPQKK DSQQFHLVPV HLDRVL
SEQ ID NO 5
1KPKGMTSSQW FKIQHMQPSP QACNSAMKNI NKHTKRCKDL NTFLHEPFSS VAATCQTPKI
61ACKNGDKNCH QSHGPVSLTM CKLTSGKYPN CRYKEKRQNK SYVVACKPPQ KKDSQQFHLV
121PVHLDRVL
SEQ ID NO 6
1MAPARAGFCP LLLLLLLGLW VAEIPVSA
SEQ ID NO 7
1SAKPKGMTSS QWFKI
序列表
<110>L’OREAL
<120>核糖核酸酶家族的蛋白质的美容用途
<130>BR80830/CR/HG/klp
<140>06 54965
<141>2006-11-17
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>471
<212>DNA
<213>智人
<400>l
atggcaccgg ccagagcagg attctgcccc cttctgctgc ttctgctgct ggggctgtgg 60
gtggcagaga tcccagtcag tgccaagccc aagggcatga cctcatcaca gtggtttaaa 120
attcagcaca tgcagcccag ccctcaagca tgcaactcag ccatgaaaaa cattaacaag 180
cacacaaaac ggtgcaaaga cctcaacacc ttcctgcacg agcctttctc cagtgtggcc 240
gccacctgcc agacccccaa aatagcctgc aagaatggcg ataaaaactg ccaccagagc 300
cacgggcccg tgtccctgac catgtgtaag ctcacctcag ggaagtatcc gaactgcagg 360
tacaaagaga agcgacagaa caagtcttac gtagtggcct gtaagcctcc ccagaaaaag 420
gactctcagc aattccacct ggttcctgta cacttggaca gagtccttta g 471
<210>2
<211>387
<212>DNA
<213>智人
<400>2
aagcccaagg gcatgacctc atcacagtgg tttaaaattc agcacatgca gcccagccct 60
caagcatgca actcagccat gaaaaacatt aacaagcaca caaaacggtg caaagacctc 120
aacaccttcc tgcacgagcc tttctccagt gtggccgcca cctgccagac ccccaaaata 180
gcctgcaaga atggcgataa aaactgccac cagagccacg ggcccgtgtc cctgaccatg 240
tgtaagctca cctcagggaa gtatccgaac tgcaggtaca aagagaagcg acagaacaag 300
tcttacgtag tggcctgtaa gcctccccag aaaaaggact ctcagcaatt ccacctggtt 360
cctgtacact tggacagagt cctttag 387
<210>3
<211>84
<212>DNA
<213>智人
<400>3
atggcaccgg ccagagcagg attctgcccc cttctgctgc ttctgctgct ggggctgtgg 60
gtggcagaga tcccagtcag tgcc 84
<210>4
<211>156
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Ala Pro Ala Arg Ala Gly Phe Cys Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Leu Trp Val Ala Glu Ile Pro Val Ser Ala Lys Pro Lys Gly
20 25 30
Met Thr Ser Ser Gln Trp Phe Lys Ile Gln His Met Gln Pro Ser Pro
35 40 45
Gln Ala Cys Asn Ser Ala Met Lys Asn Ile Asn Lys His Thr Lys Arg
50 55 60
Cys Lys Asp Leu Asn Thr Phe Leu His Glu Pro Phe Ser Ser Val Ala
65 70 75 80
Ala Thr Cys Gln Thr Pro Lys Ile Ala Cys Lys Asn Gly Asp Lys Asn
85 90 95
Cys His Gln Ser His Gly Pro Val Ser Leu Thr Met Cys Lys Leu Thr
100 105 110
Ser Gly Lys Tyr Pro Asn Cys Arg Tyr Lys Glu Lys Arg Gln Asn Lys
115 120 125
Ser Tyr Val Val Ala Cys Lys Pro Pro Gln Lys Lys Asp Ser Gln Gln
130 135 140
Phe His Leu Val Pro Val His Leu Asp Arg Val Leu
145 150 155
<210>5
<211>128
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Lys Pro Lys Gly Met Thr Ser Ser Gln Trp Phe Lys Ile Gln His Met
1 5 10 15
Gln Pro Ser Pro Gln Ala Cys Asn Ser Ala Met Lys Asn Ile Asn Lys
20 25 30
His Thr Lys Arg Cys Lys Asp Leu Asn Thr Phe Leu His Glu Pro Phe
35 40 45
Ser Ser Val Ala Ala Thr Cys Gln Thr Pro Lys Ile Ala Cys Lys Asn
50 55 60
Gly Asp Lys Asn Cys His Gln Ser His Gly Pro Val Ser Leu Thr Met
65 70 75 80
Cys Lys Leu Thr Ser Gly Lys Tyr Pro Asn Cys Arg Tyr Lys Glu Lys
85 90 95
Arg Gln Asn Lys Ser Tyr Val Val Ala Cys Lys Pro Pro Gln Lys Lys
100 105 110
Asp Ser Gln Gln Phe His Leu Val Pro Val His Leu Asp Arg Val Leu
115 120 125
<210>6
<211>28
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Ala Pro Ala Arg Ala Gly Phe Cys Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Leu Trp Val Ala Glu Ile Pro Val Ser Ala
20 25
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Ser Ala Lys Pro Lys Gly Met Thr Ser Ser Gln Trp Phe Lys Ile
1 5 10 15
Claims (22)
1.至少一种多肽或至少一种编码所述多肽的核酸序列作为用于在体外或离体地评价表皮状况的工具的用途,所述多肽的氨基酸序列由完全或部分地由SEQ ID NO 1所示序列、其类似物或其片段所呈现的核酸序列编码。
2.根据前一项权利要求的用途,其中所述多肽具有由完全或部分地由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示序列,其类似物,或其片段所呈现的核酸序列编码的氨基酸序列。
3.根据前一项权利要求的用途,其中所述多肽具有完全或部分地由SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示序列,其类似物,或其片段所呈现的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的用途,其中所述核酸序列完全或部分地由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示序列,其类似物,或其片段来呈现。
5.与依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽特异性地结合的抗体作为用于在体外或离体地评价表皮状况的工具的用途。
6.根据前一项权利要求的用途,其中所述抗体与由序列SEQ IDNO 7或其类似物所呈现的氨基酸序列的表位特异性地结合。
7.根据前述权利要求中任一项的用途,其中所述表皮状况为可能的皮肤病症的指示,所述皮肤病症尤其选自干燥病、鱼鳞病、特异反应性、特应性皮炎、银屑病、角化过度、湿疹、酒渣鼻、苔癣、瘙痒症、痤疮、脂溢性皮炎、掌跖角化病和痒疹。
8.在体外或离体地评价表皮状况的方法,其至少包括下列步骤:
a)测定在表皮样品中依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽或编码所述多肽的核酸的含量,和
b)将在步骤a)中测得的所述含量与参照值进行比较。
9.在体外或离体地评价表皮状况的方法,其至少包括下列步骤:
a)测定在表皮样品中依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽的生物学活性值,和
b)将在步骤a)中测得的所述值与参照值进行比较。
10.根据前一项权利要求的方法,其中所述生物学活性为核糖核酸酶活性。
11.至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、或至少一种编码所述多肽的核酸序列,作为用于筛选生物学或化学化合物或者物理处理的工具的用途,所述生物学或化学化合物或者物理处理能够调节所述多肽的生物学活性和/或表达,和/或调节其与细胞外基质组成成分的相互作用,和/或调节其与其他蛋白质的相互作用。
12.至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,在制备用于预防和/或治疗皮肤病症的组合物中的用途。
13.根据权利要求12的用途,其中所述组合物用于治疗和/或预防诸如下列的病症:角化过度、鱼鳞病、银屑病、特应性皮炎、特异反应性、湿疹、酒渣鼻、苔癣、瘙痒症、痤疮、脂溢性皮炎、掌跖角化病和痒疹。
14.至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,在制备用于预防和/或治疗头皮病症的组合物中的用途。
15.根据前一项权利要求的用途,其中所述病症为头皮屑状况。
16.至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,用于改善皮肤的水化、屏障功能,预防和/或治疗表皮衰老的征候的美容用途,所述表皮衰老的征候例如为皱纹,细小皱纹,表皮的紧实度、弹性、密度和/或张力的丧失。
17.至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,在用于治疗和/或预防和/或减少与干燥的皮肤相关的皮肤征候的组合物中的美容用途。
18.根据权利要求12至15中任一项的用途,其中至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂与至少一种其他在皮肤方面的活性试剂相联合。
19.根据前一项权利要求的用途,其中所述其他活性试剂选自水化和/或脱屑活性试剂,例如甘油、尿素或其衍生物、HEPES、螯合剂、去污剂、茉莉酮酸的衍生物。
20.至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、或至少一种编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂,用于制备分离的重构皮肤的用途。
21.用于制备分离的重构皮肤的方法,其至少包括下列步骤:使至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽、或编码所述多肽的核酸序列、或至少一种调节所述多肽的表达或活性或其与细胞外基质组成成分的相互作用的试剂与能够产生分离的重构皮肤的细胞,尤其是角质形成细胞相接触。
22.非治疗方法,其用于证明能够使皮肤病症消退的治疗的效果,或者用于评价用于改善个体中干燥和/或年老的皮肤的状况的美容方法的效果,所述评价方法至少包括下列步骤:
a)在所述治疗和/或应用所述美容方法之前,在取自所述个体的第一表皮样品中进行至少一次根据本发明的多肽的生物学活性和/或表达的第一测定,
b)在所述治疗和/或应用所述美容方法之后,在取自所述个体的第二表皮样品中进行至少一次在步骤a)中所测定的多肽的所述生物学活性和/或所述表达的第二测定,和
c)将所述第一和第二测定进行比较,尤其以便推断出至少关于所述治疗和/或应用所述美容方法的效果的信息。
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